Summary
Het huidige protocol biedt een stapsgewijze procedure voor de reproduceerbare generatie, het onderhoud en de veroudering van cerebrale organoïden afgeleid van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's). Deze methode maakt het kweken en rijpen van cerebrale organoïden gedurende langere perioden mogelijk, wat het modelleren van processen die betrokken zijn bij hersenveroudering en leeftijdsgebonden pathogenese vergemakkelijkt.
Abstract
De momenteel beschikbare dierlijke en cellulaire modellen geven de complexiteit van veranderingen die plaatsvinden in het ouder wordende menselijke brein niet volledig weer. Een recente ontwikkeling van procedures die de generatie van menselijke cerebrale organoïden beschrijven, afgeleid van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's), heeft het potentieel om het vermogen om de veroudering van het menselijk brein en gerelateerde pathogene processen te modelleren en te begrijpen fundamenteel te transformeren. Hier wordt een geoptimaliseerd protocol gepresenteerd voor het genereren, onderhouden, verouderen en karakteriseren van menselijke iPSC-afgeleide cerebrale organoïden. Dit protocol kan worden geïmplementeerd om hersenorganoïden op een reproduceerbare manier te genereren en dient als een stapsgewijze handleiding, waarin de nieuwste technieken zijn opgenomen die resulteren in verbeterde organoïde rijping en veroudering in cultuur. Specifieke problemen met betrekking tot organoïde rijping, necrose, variabiliteit en batcheffecten worden aangepakt. Samen zullen deze technologische ontwikkelingen de modellering van hersenveroudering mogelijk maken in organoïden die zijn afgeleid van een verscheidenheid aan jonge en oudere menselijke donoren, evenals personen die lijden aan leeftijdsgerelateerde hersenaandoeningen, waardoor de fysiologische en pathogene mechanismen van menselijke hersenveroudering kunnen worden geïdentificeerd.
Introduction
Verouderingsziektemodellen zijn steeds relevanter geworden naarmate de levensverwachting van de mens blijft stijgen. Grootschalige genomische studies hebben verouderde populaties blootgelegd met ontregeling van moleculaire processen en genetische veranderingen die de kwaliteit van leven beïnvloeden1. Het verouderingsproces wordt gekenmerkt door een algemeen verlies van functionaliteit van het organisme, waaronder verlies van cognitieve functie, verhoogd risico op neurodegeneratieve aandoeningen en een groot aantal chronische ziekten2.
De huidige celkweektechnieken vertegenwoordigen niet op de juiste manier de multifactoriële aard van veroudering, omdat deze disfuncties niet goed kunnen worden gerepliceerd door mutaties, toxines of infectieste gebruiken 3. Diermodellen die het verouderingsproces onderzoeken, worden vaak geassocieerd met lange experimentele tijden en hoge kosten, maar brengen ook ethische overwegingen met zich mee. Het gebruik van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) van patiënten kan de moleculaire mechanismen ophelderen die ten grondslag liggen aan ziekteprogressie, aangezien iPSC's de natuurlijke ontwikkeling van cellen tot volwassen weefsel mogelijk maken3. iPSC's zijn het werkpaard geworden van veel laboratoria die neurodegeneratieve aandoeningen onderzoeken, omdat de cellulaire herprogrammering van geoogste cellen de ziekte of verouderingsafdrukken van de donoren niet lijkt te wissen4. Deze afdrukken recapituleren cellulaire fenotypes die zijn aangetoond in menselijke en dierlijke modellen, waardoor iPSC's geschikt zijn voor het onderzoeken van individuele cellulaire achteruitgang van het zeer dichte hersenweefsel 5,6. IPSC-afgeleide organoïden zijn het meest vooraanstaande model geworden voor driedimensionale kweek van weefsel, waardoor complexere cel-tot-cel interacties en een verbeterde ontwikkelingsrecapitulatie mogelijk zijn. Hoewel voornamelijk gebruikt voor ontwikkelingsgegevens, zijn organoïden in toenemende mate toegepast op ziektemodellering, met name modellen voor ontsteking, neurodegeneratie en veroudering7. Voortbouwend op eerdere iPSC-studies behouden organoïden ziektefenotypen en cellulaire fenotypen binnen de fysiologische context van weefselachtige netwerkverbindingen 8,9. Het kweken van driedimensionaal weefsel van bepaalde dimensies kan echter een uitdaging zijn, vooral voor langere tijd.
Dit werk presenteert een gedetailleerde methode voor de reproduceerbare generatie van cerebrale organoïden waarmee het weefsel gedurende langere perioden aanzienlijk in omvang kan rijpen. Cerebrale organoïde creatie is relatief gestandaardiseerd gebleven, waarbij methoden uit verschillende prominente protocollen10,11 zijn overgenomen. Er zijn echter verschillende wijzigingen voorgesteld voor een betere differentiatie en onderhoud. Deze alternatieve methoden omvatten het gebruik van neurogene factoren om neurale differentiatiete verbeteren 12, extra steigers voor verbeterde uitwisseling van voedingsstoffen die de cellulaire levensduur bevorderen 13, en low-sheer stress agitatie voor langdurige cultuur en groei14. Deze verbeteringen zijn opgenomen in deze methode om volwassen organoïden te ontwikkelen die in staat zijn om neurodegeneratieve en verouderende fenotypen tot expressie te brengen.
Protocol
Patiëntenstudies werden goedgekeurd door de Institutional Review Board. Alle deelnemers ondertekenden schriftelijke geïnformeerde toestemming en toestemming voor de opslagplaats om hun gegevens en biospecimen te hergebruiken. iPSC-lijnen werden gegenereerd volgens IRB- en institutionele richtlijnen. Figuur 1 illustreert een schematisch overzicht van de workflow van dit protocol.
1. iPSC herprogrammering en onderhoud
- Verzamel 8 ml van het bloed van de proefpersoon (oudere of ziektepatiënt; leeftijd 65 en ouder) in celvoorbereidingsbuizen (CPT) met natriumcitraat of in EDTA of gehepariniseerde buizen.
- Centrifugeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT) op 1.800 x g om pellets te verzamelen die alleen perifeer bloed en geen serum15 bevatten.
- Gebruik gespecialiseerde herprogrammeringsvectoren volgens het protocol van de fabrikant (zie Materiaaltabel) om iPSC's16 te verkrijgen.
- Kweek iPSC's in feedervrije, lactosedehydrogenase elevating virus (LDEV)-vrije keldermembraanmatrix met verlaagde groeifactor gecoate 6-well kweekplaten in Essential 8 (E8) media (zie Materiaaltabel) bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2.
- Houd iPSC's gedurende 3-4 dagen in E8-media om overbevolking of spontane differentiatie te voorkomen.
- Valideer de pluripotentie van de iPSC-lijnen met behulp van immunofluorescente markers (stap 2) en test op mycoplasma (stap 3).
2. Pluripotentiekleuring
- Om oplossingen en antilichamen te behouden, zaait u de cellen 3-4 dagen vóór de analyse op gecoate (stap 1.4) 24-well kweekplaten. Zuig het medium op met een pipet en fixeer de cellen met 4% formaldehyde in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (1x PBS) gedurende 15-20 minuten bij RT.
- Was de cellen 3x met 1x PBS en permeabiliseer met 0,1% Triton-X 100 in 1% runderserumalbumine (BSA) in PBS gedurende ten minste 15 minuten, maar niet meer dan 1 uur bij RT.
- Was 3x met 1x PBS en blok met 5% BSA in PBS gedurende 30 min bij RT.
- Was opnieuw 3x met 1x PBS en voeg de antilichamen Sox2 en Oct3/4 (1:100 verdunning; zie Tabel van Materialen), en de nucleïnekleuring DAPI in 1% BSA (1:4.000 verdunning) 's nachts toe bij 4 °C. Wikkel in aluminiumfolie ter bescherming tegen licht.
- Was 3x met 1x PBS en laat de cellen in PBS staan. Beeld met een fluorescentiemicroscoop bij een vergroting van 10-20x. Zorg ervoor dat de pluripotentiemarkers Sox2 en Oct3/4 gelokaliseerd zijn in de kernen van de cellen17,18.
3. Mycoplasma testen
OPMERKING: Raadpleeg het protocol van de detectiekit (zie Materiaaltabel) voor gedetailleerde testuitvoerings- en analysestappen. De detectiekit biedt het reagens, het substraat en de testbuffer voor mycoplasma-testen.
- Voordat u cellen of verversingsmedium passeert, verzamelt u 2-3 ml celkweekmedium in een centrifugebuis en pellets u cellen of puin bij 200 x g gedurende 5 minuten bij RT. Bewaar het supernatant bij 4 °C gedurende ≤5 dagen. Incubeer de cellen met het medium gedurende ten minste 24 uur om een detecteerbaar signaal te garanderen.
- Voeg 100 μL celsupernatant toe aan een verse buis of put van een witwandige plaat met 96 putten (ondoorzichtige bodem aanbevolen, zie materiaaltabel). Reconstitueer het reagens en substraat in de testbuffer en balanceer gedurende 15 minuten bij RT.
- Voeg 100 μL van het reagens toe aan het monster en incubeer gedurende 5 minuten bij RT. Meet de luminescentie met een luminometer (meting #1).
- Voeg 100 μL van het substraat toe aan het monster en incubeer gedurende 10 minuten bij RT. Meet de luminescentie (meting #2).
- Bepaal de mycoplasmabesmetting door de verhouding van meting #2 tot #1. Raadpleeg de handleiding van de kit voor de interpretatie van de resultaten.
4. Microfilament voorbereiding
- Begin met de bereiding van de poly (melkzuur-co-glycolzuur) (PLGA, zie tabel met materialen) microfilamenten door de hechtstreng te rafelen met het stompe uiteinde van een scalpel. Steriliseer de gerafelde vezel licht met 70% ethanol.
- Begin onder de microscoop en met behulp van een liniaal de PLGA-vezel in fragmenten van 500 μm tot 1 mm lange strengen te snijden. Snijd in totaal ongeveer 25 mm van de vezel. Bewaar de filamenten in een buis van 15 ml met een antibiotische antimycotische oplossing van 1 ml.
- Verdun de vezeloplossing in de kap met 10 ml DMEM/F-12 (tabel 1). Vortex goed om de oplossing te mengen.
OPMERKING: Werk in een celkweekstroomkap in een steriele omgeving.
- Verdun de vezeloplossing in de kap met 10 ml DMEM/F-12 (tabel 1). Vortex goed om de oplossing te mengen.
- Voeg 20 μL van de vezeloplossing toe aan drie embryoïde lichamen (EB) die putten vormen van een plaat met 96 putten. Tel en gemiddeld onder brightfield microscopie de vezels per put. Verdun of concentraat tot gemiddeld 5-10 PLGA microfilamenten per put. Bereid elk goed op deze manier voor.
- De putten zijn nu klaar om te worden bezaaid met cellen. Bewaar de plaat bij kamertemperatuur tot het nodig is of bij 4 °C voor de volgende dag.
5. Embryoïde lichaam (EB) vorming
OPMERKING: Alle media en oplossingen moeten worden opgewarmd tot RT.
- Zodra de iPSC's 70% -80% confluentie hebben bereikt (figuur 2A), zijn ze klaar om te worden gepasseerd en gebruikt voor EB-vorming. Controleer de cellen met een microscoop bij 10x-20x vergroting. Zorg ervoor dat de kolonies minimale (<10%) gebieden van spontane differentiatie vertonen.
- Zuig het medium op met een pipet en was de cellen eenmaal met DPBS. Dissocieer de kolonies door toevoeging van 500 μL celloslatingsoplossing (zie tabel met materialen) of 0,5 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) en incubeer gedurende 3-5 minuten bij 37 °C.
OPMERKING: Werk in een celkweekstroomkap in een steriele omgeving. - Verzamel de vrijgekomen cellen door 1 ml verse E8-media aan elk putje toe te voegen en pipetteer voorzichtig totdat alle cellen zijn losgemaakt.
- Breng 1,5 ml celsuspensie over in een buis van 15 ml en voeg nog eens 1 ml verse E8-media toe om een totaal volume van 2,5 ml te bereiken.
- Centrifugeer op 290 x g gedurende 3 minuten bij RT.
- Zuig het supernatant op met een pipet, resuspensie van de celpellet in 1 ml Essential 6 (E6, zie Tabel met materialen) media aangevuld met 50 μM ROCK-remmer en tel de cellen met behulp van een hemocytometer19.
- Bereid een celsuspensie van 60.000-90.000 cellen/ml, afhankelijk van de gewenste zaaidichtheid, in E6-media aangevuld met 50 μM ROCK-remmer (zie tabel met materialen).
- Voeg 150 μL van de celsuspensie toe aan elk putje van een 96-well ULA-plaat (of een voorbereide concave plaat20). Zaai 9.000-11.000 cellen per put.
- Centrifugeer de plaat om de cellen geforceerd te aggregeren bij 290 x g gedurende 1 min bij RT. Plaats de plaat in de incubator bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2.
6. Neuro-epitheliale inductie
- Zuig na 24 uur voorzichtig 120 μL van het medium op met een pipet. Zorg ervoor dat u de EB niet opzuigt door de pipetpunt te ver in de put te laten zakken.
- Voeg 150 μL E6-media (bij RT) toe, aangevuld met 2 μM XAV939 en de SMAD-remmers: 10 μM SB431542 en 500 nM LDN 193189 per put (zie Materiaaltabel).
- Vervang het medium dagelijks met vers bereide E6-media aangevuld met 2 μM XAV939, 10 μM SB431542 en 500 nM LDN-193189.
OPMERKING: Op dag 6 (DIV6) moeten de EB's een diameter van 550-600 μm hebben en klaar zijn voor verdere differentiatie.
7. Organoïde differentiatie en rijping
OPMERKING: Alle media moeten worden opgewarmd tot RT.
- Controleer bij ongeveer DIV7 of alle EB's een diameter van 550-600 μm hebben bereikt en een gladde en duidelijke rand vertonen (figuur 2B); in dit stadium zijn ze klaar om te worden ingebed in een extracellulaire matrix (ECM).
OPMERKING: Werk in een steriele omgeving. - Bereid gerimpelde insluitvellen voor van de thermoplastische afdichtingsfolie (zie materiaaltabel) door een filmvel (ongeveer 4 in lang) op een lege P200-doos te plaatsen. Gebruik een conische buis van 15 ml of een microcentrifugebuis van 500 μL en druk de filmplaat voorzichtig in de gaten om 12 kuiltjes te maken. Spuit het filmvel in met 70% ethanol en laat het drogen in de stroomkap met het UV-licht ingeschakeld gedurende ten minste 30 minuten.
- Ontdooi een voldoende hoeveelheid keldermembraanmatrix (Matrigel, zie Materiaaltabel) op ijs en plaats deze in de stroomkap.
OPMERKING: Per EB is ongeveer 30 μL onverdunde membraanmatrix nodig. Houd de membraanmatrix altijd onder de 4 °C om te voorkomen dat deze gaat geleren. Voorgekoelde pipetpunten worden ook aanbevolen omdat ze de matrix vertragen van polymerisatie in de tip tijdens pipetteren, waardoor materiaalverlies wordt verminderd. - Gebruik een P200-punt met brede boring, breng één EB over op elk kuiltje en verwijder zoveel mogelijk media met een normale pipetpunt. Let op dat je de EB's niet laat drogen. Voeg met behulp van een gewone P200-tip ~ 30 μL onverdunde membraanmatrix toe aan elke organoïde, zodat de EB zich in het midden van de druppel bevindt.
- Zodra alle EB's in de matrix zijn ingebed, plaatst u het filmvel met de EB's in een steriele petrischaal.
OPMERKING: Optioneel kan een kleine petrischaal gevuld met steriel water in de grotere petrischaal naast het folievel worden geplaatst om verdamping te voorkomen.- Breng de schaal over naar een incubator en incubeer bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2 gedurende ongeveer 10 minuten om de membraanmatrix te laten stollen.
- Bereid voor elke set van 12 ingebedde organoïden 5 ml differentiatiemedia met B27 zonder vitamine A (tabel 1) in één putje van een ULA 6-putplaat. Verwarm de plaat voor tot 37 °C in een incubator.
- Zodra de incubatietijd is voltooid, brengt u de ingebedde EB's over naar de ULA 6-putplaat door het filmvel te nemen en de kuiltjes van de achterkant van het vel naar buiten te duwen. Neem indien nodig 1 ml uit de put en pipetteer deze op het vel om de druppels los te maken van de film.
OPMERKING: Belangrijke morfologische veranderingen zijn 1 dag na inbedding te zien; EB's gaan van gladde randen naar uitpuilende uitsteeksels die knoppen vormen (figuur 2C). - Voer na 2 dagen (DIV9) een halve mediawissel uit. Zorg ervoor dat u de membraanmatrixdruppels tijdens het proces niet opzuigt of beschadigt.
- Voer na nog eens 2 dagen (DIV11) een volledige mediawissel uit, waarbij de media worden aangevuld met 3 μM CHIR99021 (zie Materiaaltabel).
- Verander bij DIV14 de media in differentiatiemedia met B27 met vitamine A (tabel 1) voor een geleidelijke toename van de organoïdegrootte.
- Bij DIV16 plaatst u de putplaat op een orbitale schudder bij 90 tpm in een incubator. Verander de media om de 2 dagen.
- Verdun elke 40 DIV 500 μL van de membraanmatrix voor elke 50 ml media voor extra voedingsstoffen in de media.
Representative Results
Het integreren van PLGA-vezels, kuiltjesinbedding en agitatie leidt tot een robuuste generatie cerebrale organoïden waarmee iPSC-afgeleide culturen gedurende langere tijd kunnen worden gehandhaafd (figuur 1).
Figuur 1: Schematische illustratie van de workflow en tijdlijn van deze methode. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De initiële neurale inductieperiode is vergelijkbaar met eerder gepubliceerde procedures11. De embryoïde lichamen (EB) beginnen als cirkelvormige aggregaten (figuur 2B) met witte of transparante randen. Als de EB bij DIV7 wordt veranderd van neurale inductiemedia naar neurale onderhoudsmedia, komen uitsteeksels en ontluikingen binnen 24 uur uit het cirkelvormige weefsel tevoorschijn (figuur 2C). Bovendien, terwijl de organoïde blijft groeien, helpt het oppervlak van de PLGA-vezel de organoïde om uit te rekken (figuur 2D). Tijdens de rijping moeten de randen van de organoïde intact blijven, omdat het een goed teken is van gezonde cellen en ontwikkeling; anders moeten extra voedingsstoffen worden verstrekt13 (figuur 2E). De groei van de organoïden wordt verder vergemakkelijkt door de agitatie van de organoïde cultuur, omdat dit de perfusie met voedingsstoffen verbetert.
Figuur 2: Differentiatie en rijping van cerebrale organoïden . (A) Representatief beeld van een iPSC-cultuur bij 70%-80% confluentie. (B) Embryoïde lichamen (EB's) werden gegenereerd en neuro-epitheliale vorming werd geïnduceerd tot DIV7. EB's werden vervolgens ingebed in de membraanmatrix en verder gedifferentieerd naar cerebrale organoïden. (C) Organoïden bij DIV10 die verschillende ontluikende formaties vertonen. Organoïden kunnen verder worden gerijpt in de membraanmatrix met behulp van (D) kuiltje of (E) sandwichinbedding, hier weergegeven bij DIV30. (F) Langetermijncultuur toont cerebrale organoïden die tot aanzienlijke afmetingen groeien (DIV70). Schaalbalk = 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De afmetingen en externe morfologie van de organoïde worden aangevuld door een complexe architectuur binnenin de organoïde. Na het fixeren van het weefsel op DIV7 na de eerste fase van differentiatie, drukken cellen van de EB SOX2 uit, een HMG-boxtranscriptiefactor die fungeert als een marker voor multipotente neurale stamcellen21, evenals gepaarde eiwitdoos Pax-6, wat aangeeft neurale voorlopercellen (figuur 3). Onrijpe neuronen gemarkeerd door TuJ1 (klasse III β-tubuline)22 zijn al verspreid over het weefsel te zien.
In dit stadium wordt een voorbeeld van de zelforganisatie die deze organoïden doormaken duidelijk. De organisatie van radiale structuren, rozetten genaamd, is analoog aan de neurale buis, met SOX2 + -cellen in het rozetcentrum21 en PAX6 naar de rozetrand. Deze rozetten geven aanleiding tot neuronen terwijl ze migreren. Deze uitstralende cellen zijn aanvankelijk dubbel positief voor de neurale stam/voorlopercelmarker Nestin23 en gliaal fibrillair zuur eiwit (GFAP), vergelijkbaar met de radiale glia die worden aangetroffen in neurogene gebieden van de in vivo hersenen. Naarmate deze migrerende neuronen volwassen worden, weerspiegelen de cytoskeletale markers deze verandering22. De neurale differentiatiemarker TuJ1 22 in een vroeg stadium is zichtbaar in de binnenste cirkel van de rozet en verschuift naar microtubule-geassocieerd eiwit 2 (MAP2)24, een neuronspecifieke rijpingsmarker aan de periferie.
Figuur 3: Embryoïde lichamen bij DIV7 vertonen structurele organisatie en onvolwassen karakterisering. Whole mount immunohistochemie beeld van een EB bij DIV7. (A) Een samengesteld beeld van de EB met (B) SOX2+ neurale rozetten, (C) onrijpe neuronen (TUJ1) verspreid over de EB, (D) neurale voorlopercellen (PAX6) en (E) kernen gevisualiseerd door DAPI. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Naarmate de organoïden ouder worden, beginnen de organisatie en markers van de zich ontwikkelende neuronen fysiologische omstandigheden te repliceren. Bij DIV30 kunnen veel rozetten worden waargenomen die aanleiding geven tot neurogene gebieden die gelijkwaardig zijn aan de zich ontwikkelende hersenen25. Door DIV60 zijn deze SOX2+ neurogene gebieden niet-bestaand en worden vervangen door volwassen MAP2 en NeuN26, een neurondifferentiatiemarker en positieve neuronen (figuur 4 en figuur 5).
Figuur 4: Organoïden bij DIV120 vertonen volwassen neuronale karakterisering. Immunohistochemie beeld van een organoïde sectie bij DIV 120. (A) Een samengestelde afbeelding van de sectie met volwassen neuronale markers van (B) MAP2 (paars) en (C) NeuN (groen). (D) Kernen werden gevisualiseerd door DAPI. Schaalbalk = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Digitale druppel PCR van DIV120 organoïden. Digitale druppel PCR-grafieken met de absolute expressiewaarde van (A) MAP2 (boven, blauw) en (B) NeuN (onder, groen). Gesneden gele lijnen scheiden verschillende iPSC-lijnen (A, B, C, enz.) en organoïden zijn samengevoegd. N = 5. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Deze cytoskeletale markers kunnen worden gebruikt in combinatie met andere post-mitotische markers (zoals doublecortin27 en synapsine28) om te onderzoeken op synaptische plasticiteit en andere leeftijdsgerelateerde dalingen (figuur 6), evenals extra hersenweefsel zoals astrocyten en glia (figuur 7).
Figuur 6: Voorbeeld van synaptische terminale analyse. Immunohistochemisch beeld van een deel van de organoïde bij DIV 120. (A) Een samengestelde afbeelding van de sectie gekleurd voor (B) MAP2, (C) doublecortin (DCX) en (D) synapsine I (SYN). (E) Kernen werden gevisualiseerd door DAPI. Schaalbalk = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Bewijs van gliale ontwikkeling. Immunohistochemisch beeld van een deel van de organoïde bij DIV 120. (A) Een samengestelde afbeelding van de sectie gekleurd voor (B) geïoniseerd calciumbindend adaptormolecuul 1 (Iba1) en (C) NeuN. (D) Kernen werden gevisualiseerd door DAPI. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Reagens | Eindconcentratie | Volume (50 ml totaal) |
| DMEM-F12 | 50% | 25 ml |
| Neurobasaal medium | 50% | 25 ml |
| N2 Supplement (100x) | 1x | 0,25 ml |
| B27 Supplement -/+ Vitamine A (50x) | 0,5x | 0,5 ml |
| Insuline | 0.25% | 12,5 μL |
| Glutamax (100x) | 1x | 0,5 ml |
| MEM-NEAA (100x) | 0,5x | 0,25 ml |
| HEPES (1 M) | 10 mM | 0,5 ml |
| Antibioticum / Antimycotica (100x) | 1x | 0,5 ml |
| 2-β-mercaptoethanol | 50 μM | 17,5 μL |
| *OPMERKING: sommige DMEM-F12 bevat al GlutaMAX, het is niet nodig om extra toe te voegen. | ||
Tabel 1: Samenstelling van de differentiatiemedia die in deze studie zijn gebruikt.
Discussion
De gestandaardiseerde vorming van EB's is een cruciale stap in de reproduceerbare omzetting van pluripotente stamcellen in hersenorganoïden. De krachtaggregatie van stamcellen in enkelvoudige weefsels kan variëren afhankelijk van de geometrie van de concave putten, de zaaidichtheid en de putbehandeling. Hoewel de huidige methode na 6 dagen een diameterbereik van 500-600 μm noemt, sluiten deze diameters andere diameters van goede organoïdevorming niet uit, omdat veel andere diameters succesvol zijn gebleken. Het is echter aangetoond dat verschillende diameters de differentiatiesnelheden en het succes beïnvloeden29. Voor reproduceerbaarheidsdoeleinden worden diametervariaties onder 50 μm sterk aanbevolen20. Bovendien kan het aantal neurale inductiedagen worden verlengd van 6 tot 10 dagen om de EB's in diameter te laten groeien, omdat is aangetoond dat het gebruik van SMAD-remmers de vorming van neuro-epithelia efficiënt produceert en handhaaft na slechts 5 dagen blootstelling30. Bij afwezigheid van SMAD-remmers kan neurale inductie inconsistente resultaten opleveren, waardoor langere inductieperioden nodig zijn. SMAD-remmers die in dit werk worden genoemd, zijn het meest effectief, maar andere dorsomorfine en TGF-β kleine moleculen kunnen in hun effectieve concentratie worden gebruikt.
De keldermembraanmatrix biedt een uitstekend substraat voor groei en kan anders worden toegediend. Vroege toepassingen van de matrix omvatten het basale membraan als een putcoating31. Het gebruik van de matrix voor het inbedden van weefsel bleek echter de differentiatie en rijping in deze weefsels te verbeteren32. Voor organoïden is aangetoond dat het gebruik van de matrix de EB-differentiatie in organoïden verbetert, de rijping bevordert en de kweekperioden verlengt33. Hoewel organoïden nog steeds kunnen worden gevormd zonder de matrix, omdat veel groepen hebben gestreefd naar een matrixvrije weefselkweek34,35, hebben studies aangetoond dat de in de matrix ingebedde organoïden een hogere kans hebben op langere kweektijden en minder onderhoud vereisen 36. De kuiltjesmethode van inbedding zorgt voor een gelijke dekking van het organoïde oppervlak, wat zorgt voor vergelijkbare diffusie, toegang tot voedingsstoffen en reproduceerbare differentiatie. Als alternatief kan koepelinbedding worden gebruikt om de organoïden volledig in te kapselen37.
De overdracht van de EB's in de kuiltjes van de membraanmatrix is een cruciale stap. Hoewel een pipetpunt van 1 ml een opening heeft die breed genoeg is om de EB's over te brengen, heeft een punt van 200 μL de voorkeur voor een gemakkelijke overdracht. De 200 μL tips moeten worden gesneden om een opening te creëren die groot genoeg is, waardoor een gladde rand wordt gegarandeerd om de schuifspanning bij het pipetteren te verminderen. Als alternatief zijn er tips met een brede boring van 200 μL voor eenvoudige overdracht. Pipetteren moet langzaam gebeuren, omdat snel pipetteren de organoïde periferie kan verstoren en een goede groei kan belemmeren. Speciale aandacht moet worden besteed om ervoor te zorgen dat voldoende medium wordt overgedragen om voedingsstoffen te leveren. Te weinig medium loopt het risico dat de organoïde uitdroogt, waardoor necrose ontstaat. Het overbrengen van de EB met te veel kweekmedia kan ervoor zorgen dat de matrix te verdund is en de organoïde niet veilig inkapselt. Idealiter mag de matrix niet met meer dan 50% worden verdund om de polymerisatie en functie als ECM voor de EB's te waarborgen. Als de inbedding niet lukt, kan de EB worden hersteld en opnieuw worden ingekapseld. Herinkapseling in de verse matrix kan op elk moment worden gedaan om de organoïde extra ondersteuning te bieden.
Net als matrixinbedding voor steigers bieden PLGA-vezels extra ondersteuning voor driedimensionale groei. Oorspronkelijk opgenomen om langwerpige organoïden te produceren en het oppervlak te vergroten38, is de opname van PLGA-vezels geleidelijk geïdentificeerd als een extra hulpmiddel om de differentiatie en rijping van organoïden te verbeteren39. Naarmate meer laboratoria het gebruik van de matrix willen verminderen of helemaal willen afschaffen, bieden de zelforganiserende eigenschappen van organoïden ondersteund door de opgenomen vezels voldoende steigers voor driedimensionale weefselcreatie en differentiatie39. Hier werden beide methoden gecombineerd om de kans op langdurige cultuur te vergroten38,39. De opname van vezels tijdens de eerste aggregatie is van cruciaal belang, omdat deze mogelijk niet in een later stadium worden geïntroduceerd. Na het centrifugeren zal het controleren of een paar vezels zich tussen de geaggregeerde cellen bevinden, ervoor zorgen dat een vezel in de EB wordt opgenomen. Als dit niet lukt, moet een zachte aspiratie van de put en hercentrifugatie zorgen voor menging.
Een andere cruciale stap in het onderhoud van organoïden is de introductie van een orbitale shaker voor een betere mediaperfusie. In vroege iteraties van organoïde protocollen werd een draaiende bioreactor gebruikt om agitatie te creëren11. Een orbitale schudder bij 90 rpm zorgt voor voldoende agitatie zonder de matrixdruppel te vernietigen of de organoïde morfologie te beschadigen. Sommige groepen zien af van het gebruik van de matrixsteiger, maar behouden schudderagitatie om een geschikte omgeving te bieden34. Zoals bij alle protocollen moet de snelheid van de rotaties worden aangepast afhankelijk van de schudder om de hoeveelheid schuifspanning te verminderen. Als een koepelinbedding werd gekozen, kon een gekantelde schudder worden gebruikt om de hoeveelheid schuifspanning11,34 te verminderen.
Alles bij elkaar biedt de integratie van verschillende geselecteerde technieken een robuuste methode voor iPSC-afgeleide organoïdevorming. Er zijn verschillende manieren om organoïden te creëren en te onderhouden, maar veel van hen richten zich op vroege differentiatietrajecten. In dit werk werden meerdere verschillende technieken gecombineerd om organoïden gedurende langere tijd te kweken, voorbij de differentiatiefase, en in een rijpingsperiode waarin verouderingsfenotypen zich kunnen ontwikkelen. Het opnemen van deze technieken zorgt voor langdurige rijping zonder de noodzaak van exogene biologische factoren om de culturen te behouden, met behoud van de zelforganisatie en natuurlijke progressie van veroudering.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het Netherlands Organ-on-Chip Initiative, een NWO-zwaartekrachtproject (024.003.001) gefinancierd door het Ministerie van Onderwijs, Cultuur en Wetenschap van de Nederlandse overheid. D.C.B. erkent dankbaar de financiële steun van Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) in de vorm van een doctoraatsbeurs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-β-Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 31350010 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindoledihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | 1:4000 |
| 6-well Clear Flat Bottom CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plate | Greiner Bio-One | 657185 | |
| 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Well Plate | Corning | 3471 | |
| 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate | Corning | 7007 | |
| 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate | Thermo Fisher Scientific | 136101 | |
| Accutase | Sigma-Aldrich | 46964 | cell detachment solution |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | |
| B27 Suppement (with Vitamin A) (50x) | Gibco | 17504044 | |
| B27 Supplement (minus Vitamin A) (50x) | Gibco | 12587010 | |
| BD Vacutainer™ Glass Mononuclear Cell Preparation (CPT) Tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-685-125 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | With plate holders |
| CHIR99021 | Selleck Chemicals | S2924 | |
| CytoTune Sendai Reprogramming Vector | Thermo Fisher Scientific | A1378001 | |
| ddPCR primers | human | MAPT | Bio-Rad | dHsaCPE192234 | |
| ddPCR primers | human | RBFOX3 (NeuN) | Bio-Rad | dHsaCPE5052108 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320074 | |
| Doublecortin (DCX) | Santa Cruz Biotechnology | SC-8066 | 1:500 |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | no calcium, no magnesium |
| Eppendorf cups, 1.5 mL | Eppendorf | 0030 125.215 | |
| Essential 6 | Gibco | A1516401 | |
| Essential 8 | Gibco | A1517001 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Invitrogen | 15575020 | |
| Falcon tubes, 15 mL, conical | Greiner Bio-One | 188271-N | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | 37% Stock solution, diluted to 4% in PBS |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413202 | |
| GlutaMax (100x) | Gibco | 35050038 | |
| Hemacytometer cell counter | Hausser scientific | 1490 | |
| HEPES Buffer | Thermo Fisher Scientific | 15-630-080 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| LDN 193189 | StemCell Technologies | 72147 | |
| MAP2 | Abcam | ab32454 | 1:200 |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 356230 | basement membrane matrix |
| MEM-Non Essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA; 100x) | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| Multilabel Counter Victor 3 Plate Reader | Perkin Elmer | 1420 | luminometer |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-318 | |
| N-2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| NeuN | Millipore | MAB377 | 1:500 |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Oct-3/4 Antibody (C-10) Alexa Fluor 647 | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 AF647 | 1:100 |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | thermoplastic film sheet |
| PAX6 | Thermo Fisher Scientific | 42-6600 | 1:200 |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microfilaments | Ethicon | J463 | |
| QX200 Droplet digital PCR system | Bio-Rad | 1864001 | |
| ROCK inhibitor (Y27632) | Selleck Chemicals | S1049 | |
| SB431542 | R&D Systems | 1614/50 | |
| SOX2 Monoclonal Antibody (Btjce), Alexa Fluor 488, eBioscience | Invitrogen | 53-9811-80 | 1:100 |
| Synapsin I (SYN) | Calbiochem | 574777 | 1:200 |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| TUJ1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-80005 | Beta-3-tubulin; 1:500 |
| XAV939 | Tocris Bioscience | 3748 |
References
- Liu, G. H., et al. Aging Atlas: a multi-omics database for aging biology. Nucleic Acids Research. 49, 825-830 (2021).
- Ferrucci, L., et al. Measuring biological aging in humans: A quest. Cell. 19 (2), 13080 (2020).
- Mertens, J., Reid, D., Lau, S., Kim, Y., Gage, F. H. Aging in a dish: iPSC-derived and directly induced neurons for studying brain aging and age-related neurodegenerative diseases. Annu Rev Genet. 52, 271-293 (2018).
- Mertens, J., et al. Age-dependent instability of mature neuronal fate in induced neurons from Alzheimer's patients. Cell Stem Cell. 28 (9), 1533-1548 (2021).
- Lin, Y. T., et al. APOE4 causes widespread molecular and cellular alterations associated with Alzheimer's disease phenotypes in human iPSC-derived brain cell types. Neuron. 98 (6), 1141-1154 (2018).
- Fang, E. F., et al. Mitophagy inhibits amyloid-β and tau pathology and reverses cognitive deficits in models of Alzheimer's disease. Nature Neuroscience. 22 (3), 401-412 (2019).
- Hu, J. L., Todhunter, M. E., LaBarge, M. A., Gartner, Z. J. Opportunities for organoids as new models of aging. Journal of Cell Biology. 217 (1), 39-50 (2018).
- Choi, S. H., et al. A three-dimensional human neural cell culture model of Alzheimer's disease. Nature. 515 (7526), 274-278 (2014).
- Gonzalez, C., et al. Modeling amyloid beta and tau pathology in human cerebral organoids. Molecular Psychiatry. 23 (12), 2363-2374 (2018).
- Yoon, S. -J., et al. Reliability of human cortical organoid generation. Nature Methods. 16 (1), 75-78 (2019).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Muratore, C. R., Srikanth, P., Callahan, D. G., Young-Pearse, T. L. Comparison and optimization of hiPSC forebrain cortical differentiation protocols. PLoS ONE. 9 (8), 105807 (2014).
- Giandomenico, S. L., Sutcliffe, M., Lancaster, M. A. Generation and long-term culture of advanced cerebral organoids for studying later stages of neural development. Nature Protocols. 16 (2), 579-602 (2020).
- Goto-Silva, L., et al. Computational fluid dynamic analysis of physical forces playing a role in brain organoid cultures in two different multiplex platforms. BMC Developmental Biology. 19 (1), 1-10 (2019).
- Sommer, A. G., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector. Journal of Visualized Experiments. (68), e4327 (2012).
- Beers, J., et al. A cost-effective and efficient reprogramming platform for large-scale production of integration-free human induced pluripotent stem cells in chemically defined culture. Scientific Reports. 5 (1), 1-9 (2015).
- Wakao, S., et al. Morphologic and gene expression criteria for identifying human induced pluripotent stem cells. PLoS ONE. 7 (12), e48677 (2012).
- Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2015).
- JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2022).
- Choy Buentello, D., Koch, L. S., Trujillo-De Santiago, G., Alvarez, M. M., Broersen, K. Use of standard U-bottom and V-bottom well plates to generate neuroepithelial embryoid bodies. PLOS ONE. 17 (5), 0262062 (2022).
- Ellis, P., et al. SOX2, a persistent marker for multipotential neural stem cells derived from embryonic stem cells, the embryo or the adult. Developmental Neuroscience. 26 (2-4), 148-165 (2004).
- Lee, S., et al. TuJ1 (class III β-tubulin) expression suggests dynamic redistribution of follicular dendritic cells in lymphoid tissue. European Journal of Cell Biology. 84 (2-3), 453-459 (2005).
- Suzuki, S., Namiki, J., Shibata, S., Mastuzaki, Y., Okano, H. The neural stem/progenitor cell marker nestin is expressed in proliferative endothelial cells, but not in mature vasculature. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (8), 721-730 (2010).
- Soltani, M. H., et al. Microtubule-associated protein 2, a marker of neuronal differentiation, induces mitotic defects, inhibits growth of melanoma cells, and predicts metastatic potential of cutaneous melanoma. The American Journal of Pathology. 166 (6), 1841-1850 (2005).
- Wilson, P. G., Stice, S. S. Development and differentiation of neural rosettes derived from human embryonic stem cells. Stem Cell Reviews. 2 (1), 67-77 (2006).
- Gusel'nikova, V. V., Korzhevskiy, D. E. NeuN as a neuronal nuclear antigen and neuron differentiation marker. Acta Naturae. 7 (25), 42-47 (2015).
- Rao, M. S., Hattiangady, B., Shetty, A. K. The window and mechanisms of major age-related decline in the production of new neurons within the dentate gyrus of the hippocampus. Aging Cell. 5 (6), 545-558 (2006).
- Meng, L., et al. A synapsin I cleavage fragment contributes to synaptic dysfunction in Alzheimer's disease. Aging Cell. 21 (5), 13619 (2022).
- Moon, S. H., et al. Optimizing human embryonic stem cells differentiation efficiency by screening size-tunable homogenous embryoid bodies. Biomaterials. 35 (23), 5987-5997 (2014).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Lee, S. -W., et al. Optimization of Matrigel-based culture for expansion of neural stem cells. Animal Cells and Systems. 19 (3), 175-180 (2015).
- Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: The matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Hocevar, S. E., Liu, L., Duncan, R. K. Matrigel is required for efficient differentiation of isolated, stem cell-derived otic vesicles into inner ear organoids. Stem Cell Research. 53, 102295 (2021).
- Birey, F., et al. Assembly of functionally integrated human forebrain spheroids. Nature. 545 (7652), 54-59 (2017).
- Kozlowski, M. T., Crook, C. J., Ku, H. T. Towards organoid culture without Matrigel. Communications Biology. 4 (1), 1-15 (2021).
- Kaiser, A., Kale, A., Novozhilova, E., Olivius, P. The effects of Matrigel® on the survival and differentiation of a human neural progenitor dissociated sphere culture. The Anatomical Record. 303 (3), 441-450 (2020).
- Kakni, P., et al. Intestinal organoid culture in polymer film-based microwell arrays. Advanced Biosystems. 4 (10), 2000126 (2020).
- Lancaster, M. A., et al. Guided self-organization and cortical plate formation in human brain organoids. Nature Biotechnology. 35 (7), 659-666 (2017).
- Tejchman, A., Znój, A., Chlebanowska, P., Frączek-Szczypta, A., Majka, M. Carbon fibers as a new type of scaffold for midbrain organoid development. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 5959 (2020).
