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Neuroscience

경미한 외상성 뇌 손상의 깨어 있는 폐쇄 두부 손상 모델을 사용하여 시냅스 가소성의 변화 평가

Published: January 20, 2023 doi: 10.3791/64592
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Division of Medical Sciences, University of Victoria, 2Island Medical Program, University of British Columbia

Summary

여기에서는 해마의 시냅스 가소성에 대한 반복적인 경미한 외상성 뇌 손상(r-mTBI)의 영향을 조사하기 위해 깨어 있는 폐쇄두부 손상 모델을 사용할 수 있는 방법을 보여줍니다. 이 모델은 환자에서 r-mTBI의 중요한 특징을 복제하고 시험관 내 전기생리학과 함께 사용됩니다.

Abstract

경미한 외상성 뇌 손상(mTBI)은 북미에서 만연한 건강 문제입니다. 임상 인구에 대한 번역 가능성을 높이기 위해 전임상 환경에서 폐쇄 헤드 mTBI의 생태학적으로 유효한 모델을 활용해야 한다는 압력이 증가하고 있습니다. 깨어 있는 폐쇄 머리 손상(ACHI) 모델은 수정된 제어된 피질 충격기를 사용하여 폐쇄 머리 손상을 전달하여 개두술이나 마취제 사용 없이 임상적으로 관련된 행동 결함을 유도합니다.

이 기술은 일반적으로 사망, 두개골 골절 또는 뇌출혈을 유발하지 않으며 경미한 부상과 더 일치합니다. 실제로 ACHI 절차의 온화한 특성으로 인해 반복적인 mTBI(r-mTBI)를 조사하는 연구에 이상적입니다. r-mTBI가 행동 증상, 신경병리학적 변화 및 신경퇴행을 유발하는 누적 손상을 초래할 수 있다는 증거가 증가하고 있습니다. r-mTBI는 스포츠를 하는 청소년에게 흔하며, 이러한 부상은 강력한 시냅스 재구성 및 수초화 기간 동안 발생하므로 젊은 인구는 특히 r-mTBI의 장기적인 영향에 취약합니다.

또한, r-mTBI는 객관적인 선별 조치가 거의없는 친밀한 파트너 폭력의 경우에 발생합니다. 이 실험에서, 시냅스 기능은 ACHI 모델을 사용하여 r-mTBI를 경험한 어린 쥐의 해마에서 평가되었습니다. 손상 후, 조직 슬라이서를 사용하여 해마 슬라이스를 만들어 r-mTBI 후 1일 또는 7일에 해마의 양방향 시냅스 가소성을 평가했습니다. 전반적으로, ACHI 모델은 연구자들에게 mTBI 및 r-mTBI에 따른 시냅스 가소성의 변화를 연구하기 위해 생태학적으로 유효한 모델을 제공합니다.

Introduction

외상성 뇌 손상(TBI)은 캐나다와 미국에서 매년 ~200만 건의 사례가 발생하는 심각한 건강 문제입니다 1,2. TBI는 모든 연령대와 성별에 영향을 미치며 유방암, AIDS, 파킨슨병, 다발성 경화증 등 다른 어떤 질병보다 발병률이 높다3. TBI의 유병률에도 불구하고 병태생리학은 잘 이해되지 않고 있으며 치료 옵션은 제한적입니다. 부분적으로, 이것은 모든 TBI의 85%가 경증(mTBI)으로 분류되고, mTBI는 이전에 장기적인 신경정신과적 결과 없이 제한적이고 일시적인 행동 변화만을 일으키는 것으로 생각되었기 때문입니다 4,5. mTBI 회복은 몇 주에서 몇 년이 걸릴 수 있으며5,6 더 심각한 신경학적 상태를 촉발할 수 있으며4, 반복적인 "준충격" 충격도 뇌에 영향을 미친다는 것이 인식되고 있다7. 하키/축구와 같은 스포츠의 선수들은 경기/연습 세션 7,8,9,10당 >10번의 머리 뇌진탕 충격을 받기 때문에 이것은 놀라운 일입니다.

청소년은 mTBI의 발병률이 가장 높으며 캐나다에서는 십대 10명 중 약 1명이 매년 스포츠 관련 뇌진탕으로 치료를 받습니다11,12. 실제로, 뇌진탕 하 두부 충격 또는 mTBI는 뇌에 확산 손상을 일으킬 수 있으며, 이는 또한 후속 부상 및 / 또는 더 심각한 신경 학적 상태 13,14,15,16,17에 대해 더 취약한 상태를 만들 수 있습니다. 캐나다에서는 로완의 법칙을 통해 이전의 손상이 추가 손상에 대한 뇌의 취약성을 증가시킬 수 있다는 것이 법적으로 인정되지만18, r-mTBI에 대한 기계론적 이해는 여전히 비참할 정도로 부적절합니다. 그러나 단일 및 r-mTBI는 학년도 동안 학습 능력에 영향을 미칠 수 있음이 분명합니다 19,20, 성별에 따른 결과 21,22,23,2 4, 그리고 나중에 인지 능력을 손상시킬 수 있습니다16,25,26. 실제로, 코호트 분석은 생애 초기의 r-mTBI를 나중에 치매와 강하게 연관시킵니다27,28. r-mTBI는 또한 잠재적으로 만성 외상성 뇌병증 (CTE)과 관련이 있으며, 이는 과인산화된 타우 단백질의 축적 및 진행성 피질 위축을 특징으로 하고 상당한 염증에 의해 침전된다 27,29,30,31. r-mTBI와 CTE 사이의 연관성은 현재 논란의 여지가 있지만32개, 이 모델을 통해 전임상 환경에서 더 자세히 탐색할 수 있습니다.

mTBI는 닫힌 두개골 내에서 발생하고 현대 영상 기술로도 감지하기 어렵기 때문에 종종 "보이지 않는 손상"으로 설명됩니다33,34. mTBI의 정확한 실험 모델은 두 가지 원칙을 준수해야합니다. 첫째, 임상 집단에서 일반적으로 관찰되는 생체역학적 힘을 요약해야 한다35. 둘째, 모델은 이질적인 행동 결과를 유도해야 하며, 이는 임상 집단에서도 매우 널리 퍼져 있습니다(36,37,38). 현재, 대부분의 전임상 모델은 개두술, 정위 머리 보호, 마취 및 조절된 피질 충격(CCI)을 포함하여 더 심각한 경향이 있으며, 이는 일반적으로 임상적으로 관찰되는 것보다 심각한 구조적 손상과 더 광범위한 행동 결함을 유발한다33. 두개골 절개술과 관련된 뇌진탕의 많은 전임상 모델에 대한 또 다른 우려는 이 절차 자체가 뇌에 염증을 일으키고 이것이 후속 손상으로 인한 mTBI 증상 및 신경병리를 악화시킬 수 있다는 것입니다39,40. 마취는 또한 염증감소 41,42,43, 소교 세포 기능 조절 44, 글루타메이트 방출 45, NMDA 수용체를 통한 Ca2+ 진입 46, 두개 내압 및 뇌 대사 47를 포함하여 몇 가지 복잡한 혼란을 유발합니다. 마취는 혈액뇌장벽(BBB) 투과성, 타우 과인산화 및 코르티코스테로이드 수치를 증가시키는 동시에 인지 기능을 감소시켜 혼란을 더욱 유발합니다 48,49,50,51. 또한, 미만성 폐쇄성 손상은 임상적 mTBI의 대다수를 차지한다52. 또한 성별21, 53세, 부상 간 간격15, 중증도54, 부상 횟수23 등 행동 결과에 영향을 미칠 수 있는 다양한 요인을 더 잘 연구할 수 있다.

가속력/감속력(수직 또는 수평)의 방향도 행동 및 분자 결과에 대한 중요한 고려 사항입니다. Mychasiuk와 동료들의 연구는 확산 폐쇄 머리 mTBI의 두 가지 모델, 즉 체중 낙하 (수직 힘)와 측면 충격 (수평 힘)을 비교했습니다 55. 행동 및 분자 분석 모두 mTBI 후 이질적인 모델 및 성별 의존적 결과를 나타냈다. 따라서, 선형 및 회전력을 통합하면서 수술 절차를 피하는 데 도움이 되는 동물 모델은 이러한 손상이 일반적으로 발생하는 생리학적 조건을 더 잘 나타냅니다33,56. ACHI 모델은 이러한 요구에 부응하여 만들어졌으며, 성별 차이를 편향시키는 것으로 알려진 절차(즉, 마취)를 피하면서 쥐에서 mTBI의 신속하고 재현 가능한 유도를 가능하게 했습니다57.

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Protocol

모든 동물 절차에 대한 승인은 CCAC(Canadian Council on Animal Care) 표준에 따라 빅토리아 대학교 동물 관리 위원회에서 제공했습니다. 모든 수컷 Long-Evans 쥐는 사내에서 사육되거나 구입되었습니다( 재료 표 참조).

1. 주거 및 사육 조건

  1. 동물들이 1주일 동안 주거 환경에 적응할 수 있도록 한 후 출생 후(PND) 21에 젖을 뗀다.
  2. 표준 케이지 하우징의 쥐를 22.5°C ± 2.5°C로 유지하고 음식과 물에 임의 로 접근할 수 있도록 12시간 명암 주기로 유지합니다.
  3. 성별이 일치하는 새끼 두세 마리와 함께 동물을 그룹화하고 수용하고 무작위로 가짜 또는 r-mTBI 조건에 할당합니다.
  4. 오전 7시 30분에서 오후 11시 30분 사이에 모든 절차를 수행합니다.

2. 깨어 있는 폐쇄두부 부상 절차 설정

  1. 2.75인치를 배치합니다. 임팩터 아래에 저밀도 폼 패드(100cm x 15cm x 7cm)가 있어 헤드를 회전식으로 움직일 수 있습니다.
    알림: 폼 패드의 스프링 상수는 ~2,500N/m이지만 3,100에서 5,600N/m 사이로 변할 수 있습니다58. 견고성의 수준(낮음, 중간, 높음)은 부상 결과를 예측하지 못하는 것으로 나타났다59. 폼 패드는 비소모성 재료입니다. 일반적으로 매년 또는 더러워지거나 손상된 경우 교체됩니다.
  2. 수정된 피질 충격 장치(그림 1A)를 켜고 속도를 6m/s로 설정합니다.
    참고: 이러한 사양은 mTBI의 특징과 유사한 청소년 및 청소년 노령 쥐에서 급성 신경학적 장애를 유발하도록 설계되었지만 이러한 매개변수는 나이든 동물이나 다른 종(예: 생쥐 또는 흰 족제비)에는 적합하지 않을 수 있습니다. 일반적인 ACHI 매개 변수에 대한 검토는60을 참조하십시오.

3. mTBI의 유도

  1. 쥐가 PND 24에 도달하면 절차가 수행될 시술실로 옮깁니다. 이 방이 정상적인 주거 환경과 분리되어 있는지 확인하십시오.
  2. 쥐를 구속 원뿔에 부드럽게 놓고 주둥이와 콧구멍이 원뿔의 작은 구멍에 가까워지도록 하여 적절한 환기를 허용합니다. 플라스틱 머리핀을 사용하여 꼬리 끝에서 원뿔을 닫은 상태로 유지하여 쥐가 구속 원뿔에 놓인 후 움직임을 방지합니다.
    1. 구속 점수를 사용하여 구속 콘 및 ACHI 절차에 대한 동물의 순응도 또는 내성을 기록합니다.
      참고: 구속 점수는 동물의 스트레스 평가로 사용할 수 있습니다. 따라서, 과도한 스트레스 반응으로 인해 발생하는 피험자 간의 변동성을 줄이기 위해 억제 점수를 사용하여 제외 기준을 개발할 수 있습니다.
      1. 원뿔에 들어가려는 동물의 의지, 움직임 및 발성에 따라 0에서 4까지의 점수를 부여합니다. 구속에 대한 저항이 없으면 0점을 주고, 1점은 동물이 1-2배 회전하고 발성이나 꿈틀거림이 거의 또는 전혀 없는 것에 해당합니다. 동물이 2-3 배로 변하고 약간의 발성이나 꿈틀 거리는 모습을 보이면 2 점을줍니다. 동물이 5-10x로 변하고 더 많은 발성과 꿈틀거림을 보이는 경우 구속 점수 3을 줍니다. 마지막으로, 동물이 잦은 발성과 꿈틀거림으로 10배 이상 변한 경우 4점을 줍니다.
        참고: 이 정보는 채점표 자체(보충 표 S1 및 보충 표 S2)에도 있습니다.
  3. 쥐가 제지되는 동안 헬멧(그림 1B)을 정중선 위에 수동으로 배치하고 표적 디스크를 왼쪽 두정엽 위에 놓습니다(그림 1C,D).
  4. 쥐를 폼 패드에 놓고 임팩터 를 확장 위치로 수동으로 설정합니다. 임팩터 팁이 헬멧의 타겟팅 디스크와 접촉하도록 수동으로 내립니다. 임팩터 를 수동으로 후퇴 위치로 설정하여 임팩터가 헬멧 위로 10mm 뒤로 물러나도록 합니다.
  5. 스테트탁시컬 암의 다이얼을 사용하여 임팩트 팁을 10mm 낮추어 헬멧의 타겟팅 디스크에 다시 닿도록 합니다. 임팩트 스위치를 뒤집어 동물의 머리가 10m/s에서 6mm 동안 빠르게 가속되도록 합니다.
  6. 장치가 활성화되면 즉시 구속 콘에서 동물을 제거하고 즉각적인 신경학적 평가 프로토콜(NAP)을 수행합니다.
    참고: 현재 실험의 경우 이 프로토콜을 2시간 간격으로 총 8회 반복했습니다.

4. 가짜 부상의 유도

  1. 섹션 3에서 위에서 설명한 모든 실험 절차를 따르되 쥐를 임팩트 피스톤 경로에 인접하게 배치하여 부상을 입지 않도록 합니다.

5. 신경학적 평가 프로토콜

참고: NAP는 의식 수준과 인지 및 감각 운동 기능을 측정하는 데 사용할 수 있습니다.

  1. 기준선에서 mTBI 또는 가짜 손상의 유도 직후,56,61에 기재된 바와 같이 NAP를 사용하여 래트를 평가한다. 테이블 위에 쥐의 집 케이지와 회복 케이지를 100cm 간격으로 놓습니다. 밸런스 빔을 양쪽 케이지 위에 고르게 중앙에 놓습니다. 또한 밸런스 빔 아래에 접힌 수건이나 추가 쿠션을 놓습니다.
  2. 필요한 경우 의식 수준을 평가하십시오. mTBI 후 동물이 반응이 없는 경우 스톱워치를 사용하여 동물이 호흡을 재개하거나 앙와위에서 엎드린 자세로 몸을 바로잡는 데 걸리는 시간을 기록하여 무호흡( 호흡 중단) 및 교정 반사 의 지연을 평가합니다.
    참고: ACHI 모델에서는 교정 반사 및 무호흡 상실이 드물지만 어린 동물에서 때때로 관찰될 수 있습니다.
  3. 다음 테스트 순서를 사용하여 쥐의 인지 및 감각 운동 기능을 평가합니다. 의식 평가 후 이러한 테스트를 연속적으로 신속하게 시행하십시오.
    참고: 이 네 가지 테스트의 합계는 관찰된 행동 결함이 없는 경우 12점 만점의 총점을 산출합니다. 적자는 이 점수를 떨어뜨립니다.
    1. 깜짝 놀랄 반응
      1. 빈 회복 케이지에 쥐를 넣고 케이지 위에서 큰 소리로 (50cm) 박수를 치십시오. 다음 점수 시스템을 사용하여 소음에 대한 동물의 반응을 기록하십시오.
        3 = 소리에 대한 빠른 놀람 반응(예: 귀 움직임/경련, 점프, 전신 정지).
        2 = 소리에 대한 느린 반응 또는 약간의 동결 반응.
        1 = 귀의 움직임만 관찰됨.
        0 = 소리에 반응하지 않음.
    2. 사지 확장
      1. 들보(길이 100cm x 너비 2cm x 두께 0.75cm)를 쥐의 집과 회복 케이지를 가로질러 수평으로 놓고 꼬리 밑으로 쥐를 들어 올려 들보 근처에 잡습니다. 쥐가 쉽게 잡을 수 있을 만큼 가까이 있는지 확인하십시오. 다음 점수 시스템을 사용하여 양쪽 팔다리를 빔까지 확장하는 쥐의 능력을 평가합니다.
        3 = 양쪽 앞다리를 완전히 확장하고 빔을 잡습니다.
        2 = 한쪽 팔다리만 확장됩니다.
        1 = 앞다리의 간헐적 확장 또는 후퇴.
        0 = 앞다리가 절뚝거리거나 확장되지 않음.
    3. 빔 워크
      1. 홈 케이지를 향한 50cm 표시의 수평 빔 중앙에 동물을 놓습니다. 빔이 쥐의 집 케이지와 회복 케이지 사이에 균등하게 배치되었는지 확인합니다(~80cm 간격으로 배치). 쥐가 들보를 가로질러 걸을 수 있도록 합니다. 다음 점수 시스템으로 쥐의 균형 잡기 및 보행 능력을 평가하십시오.
        3 = 10초 이내에 2피트 미만의 미끄러짐으로 빔을 가로질러 성공적으로 걸었습니다.
        2 = 빔을 성공적으로 걸었지만 2개 이상의 풋 슬립이 관찰됩니다.
        1 = 비기관차 운동, '수영' 운동.
        0 = 빔을 따라 걸을 수 없거나 10초 이내에 이동할 수 없습니다.
    4. 회전 빔
      1. 쥐가 균형을 이루도록 빔 중앙에 쥐를 재배치합니다. 수건이나 푹신한 표면 위로 빔을 80cm 들어 올리고 4초 동안 초당 1회전(총 4회 회전)의 속도로 빔을 수동으로 회전하기 시작합니다. 다음 점수 시스템을 사용하여 빔이 회전할 때 빔에 남아 있는 쥐의 능력을 평가합니다.
        3 = 쥐는 네 번의 회전 모두에 대해 빔에 남아 있습니다.
        2 = 쥐가 네 번째 회전에 해당합니다.
        1 = 쥐가 두 번째 또는 세 번째 회전에 해당합니다.
        0 = 쥐가 첫 번째 회전 중에 떨어집니다.
  4. 낮잠이 끝나면 mTBI와 가짜 쥐를 집 케이지로 돌려 보냅니다. r-mTBI 절차에 대해 필요에 따라 반복합니다. 케이지 측 모니터링 체크리스트(보충 파일 1)를 사용하여 부상 후 동물의 웰빙을 모니터링합니다. 케이지 측 모니터링 중에 이상 징후(N이 아닌 점수)가 있는 경우 머리 충격 후 통증 척도 및 고급 모니터링 체크리스트(보충 파일 2)를 사용하여 전체 통증 점수를 가져와야 합니다.

6. 슬라이스 준비

참고: 현재 연구에서 시냅스 가소성은 mTBI 후 1일 또는 7일에 r-mTBI 후 동물에서 평가되었습니다. 이 날, 동물들은 희생 전에 덮개가 있는 우리에 넣어 실험실로 개별적으로 옮겨졌습니다.

  1. 해마 조각을 만드는 데 필요한 모든 수술 도구(그림 2A)를 밤새 냉장(-20°C) 합니다: 표준 가위, 해부 가위, 집게, 롱거, 주걱 및 냉각 블록.
    알림: 조직 접착제와 배양 챔버는 냉장 보관해서는 안 됩니다.
  2. 125 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaHPO4, 25 mM NaHCO3, 2 mM CaCl2, 1.3 mM MgCl2 및 10 mM 포도당 (300 ± 10 mOsm; pH 7.2-7.4)을 포함하는 인공 뇌척수액 (aCSF)을 준비한다.
    참고: aCSF의 주요 용액은 프로토콜 기간 동안 카보겐(95% O 2/5% CO2)으로 지속적으로 버블링되어야 합니다.
  3. 동물을 안락사시키기 전에 (단계 6.8), 12.5 mL의 아가로스를 준비한다. 0.25 g의 아가로스를 12.5 mL의 인산염 완충 식염수 (1x PBS)에 용해시키고, 50 mL 원뿔형 튜브에서 10 초 단위로 전자레인지에 돌린다.
  4. 아가로스를 따뜻하게 유지(42°C)하고 가열판에서 흔들어 응고되지 않도록 합니다.
  5. 페트리 접시와 얼음처럼 차가운 aCSF(50°C)로 채워진 작은 비커(4mL)와 위에 젖은 여과지가 있는 뒤집힌 페트리 접시를 포함하여 얼음 위에 절단 스테이션을 설치합니다(그림 2A). 작은 비커에 aCSF를 카보겐으로 지속적으로 버블링합니다.
  6. 수조를 32°C로 데우십시오. 회수 챔버를 aCSF로 채우고 카보겐으로 지속적으로 버블링합니다(그림 2B).
  7. 동물을 실험실로 옮깁니다.
  8. 흡입제로 5 % 이소 플루 란을 사용하여 동물을 마취시킨 다음 (금단 반사가 없을 때까지) 작은 단두대를 사용하여 신속하게 목을 베십시오.
  9. 얼음처럼 차가운(4°C) aCSF로 채워진 페트리 접시에서 두개골에서 뇌를 해부하고 두개골을 aCSF에 잠긴 상태로 유지하여 조직을 빠르게 냉각시킵니다.
    참고: 이 절차는 일반적으로 5분 미만이 필요하지만 뇌가 냉장된 aCSF에 잠겨 있는 경우 뇌 제거 속도는 중요한 요소가 아닙니다.
  10. 뇌를 냉각 및 탄소화 aCSF의 작은 비커에 넣어 샘플을 추가로 세척하고 냉각시킵니다.
  11. 뇌를 거꾸로 된 페트리 접시로 옮기고 여과지 위에 놓습니다. 날카로운 메스를 사용하여 소뇌와 전두엽 피질을 제거하여 뇌를 "차단"합니다. 뇌의 정중선을 잘라내어 두 반구를 분리합니다.
    참고: 다음 프로토콜은 한 번에 한 반구에서 수행됩니다. 현재 준비되지 않은 반구는 얼음처럼 차가운(4°C) 탄수화물 aCSF의 비커에 잠겨 있어야 합니다.
  12. 횡단 해마 슬라이스를 만들려면 반구를 내측 표면에 놓습니다. 메스 칼날을 안쪽으로 ~30° 기울이고 뇌의 등쪽 표면에서 얇은 슬라이스를 제거하여 슬라이서가 사용하는 피스톤에 뇌를 장착할 수 있는 평평한 표면을 제공합니다. 뇌를 등쪽 표면으로 뒤집고 마른 여과지에 조직을 부드럽게 두드려 과도한 aCSF를 제거합니다. 시아노아크릴레이트 접착제를 사용하여 뇌의 등쪽 표면을 피스톤에 부착하고 복부 표면을 똑바로 세웁니다.
    알림: 접착제가 피스톤 가장자리 위로 흐르지 않도록 하면 접착제가 아가로스를 포함하는 데 사용되는 금속 튜브에 달라붙어 피스톤의 움직임을 방지할 수 있습니다.
  13. 피스톤의 바깥 쪽 튜브를 뇌 위로 확장하고 뇌가 완전히 덮일 때까지 액체 아가로스를 튜브에 붓습니다. 피스톤 튜브 위에 냉각 블록을 클램핑하여 아가로스를 빠르게 응고시킵니다(그림 2A).
  14. 피스톤을 슬라이서의 챔버에 놓고 나사로 챔버를 고정합니다. 블레이드를 고정하고 얼음처럼 차갑고 산소가 함유된 aCSF를 슬라이서 챔버에 추가합니다.
  15. 슬라이서(그림 2B)에서 절단 속도를 4로, 진동을 6으로 설정하고, 연속/단일 슬라이싱 스위치를 연속으로 전환합니다. 400 μm에서 뇌 절편을 시작하기 시작합니다.
  16. 슬라이서가 뇌를 절개할 때 큰 직경의 파스퇴르 피펫을 사용하여 각 절편을 절개할 때 산소가 함유된 aCSF의 회수조로 옮깁니다(그림 2C).
    알림: 각 슬라이스를 절단할 때 회수 수조의 다른 웰에 순차적으로 배치할 수 있습니다. 이 프로토콜은 일반적으로 각 반구에 대한 해마를 포함하는 6-8 개의 슬라이스를 생성합니다. 래트 아틀라스(62 )는 래트 뇌에서 개별 슬라이스의 등쪽-복부 위치를 식별하기 위해 사용될 수 있다.
  17. 슬라이스를 32°C에서 30분 동안 회복시킨 다음 실온(23°C)에서 추가로 30분 동안 회복되도록 둡니다.
  18. 이 단계를 반복하여 두 번째 반구에서 슬라이스를 만듭니다.

7. 현장 전기생리학

참고: 치아이랑(DG)에서 세포외 현장 기록을 얻으려면 다음 단계를 수행하십시오. 60분 회복 후, 개별 해마 절편은 세포외 현장 기록을 위한 준비가 됩니다.

  1. 시판되는 마이크로피펫 풀러를 사용하여 외경 1.5mm, 내경 1.1mm의 10cm 붕규산 유리 모세관에서 기록 전극(1-2MΩ)을 당깁니다.
    알림: 기록 전극의 저항은 ~1MΩ이어야 하고 팁의 크기는 ~1mm여야 합니다. 전극 파라미터의 일관성은 좋은 녹음을 위해 중요합니다.
  2. 녹음에 사용할 컴퓨터와 장비를 켭니다: ampliifier, 디지타이저, 자극기, 미세 조작기, 온도 조절기, 현미경 조명 및 진공 펌프.
  3. 비커에 aCSF를 채우고 중력 제어 관류 시스템에 연결합니다. 관류 시스템의 aCSF 밸브를 열어 관류 챔버를 통해 aCSF의 흐름을 시작합니다. 약 1-2 drips/s 또는 2 mL/min의 유속을 유지합니다. 전기생리학적 기록 기간 동안 지속적으로 aCSF를 탄산화합니다.
    참고: 현장 기록 중에 탄수화물 aCSF의 일정한 적하 속도를 유지하는 것이 필수적입니다. 또한 기준 전극이 aCSF에 완전히 잠겨 있어야 합니다.
  4. 파스퇴르 피펫을 사용하여 해마 절편을 회수욕에서 관류 챔버로 옮기고, 이 챔버는 탄소화한 aCSF로 지속적으로 관류되고 30 ± 0.5°C로 유지됩니다. 치상회와 과립 세포층이 시야에서 보이도록 뇌 절편의 방향을 지정합니다. 구부러진 와이어 무게로 슬라이스를 안정화합니다. 데이터 수집을 위해 컴퓨터 소프트웨어를 시작합니다.
    알림: 이 단계에서 진공 펌프를 끄면 조직을 자유롭게 조작할 수 있습니다. 너무 많은 조작은 조직을 손상시킬 수 있으므로 신속하게 수행해야합니다. 또한 관류 챔버에 aCSF가 너무 오래 걸리면 넘칠 수 있습니다. 조직의 방향이 적절하고 안정화되면 진공 펌프를 켭니다.
  5. 정립 현미경을 사용하여 경사 광학 장치로 DG를 시각화합니다. 동심 양극성 자극 전극을 배치하여 분자층의 중간 1/3에 내측 천공 경로(MPP) 섬유를 활성화합니다. 그런 다음 MPP에 aCSF로 채워진 유리 마이크로피펫을 배치합니다(그림 3A, B). 조직을 만지면 섬유가 손상될 수 있으므로 전극을 더 멀리 떨어진 상태에서 시작하십시오(즉, CA3 근처의 자극 전극과 DG 속 바로 위의 기록 전극).
    알림: 최적으로 모든 기록에는 전극이 세포층에서 약 200μm 떨어진 곳에 배치되어야 합니다.
  6. 자극 전극과 기록 전극이 배치되면 증폭기, 디지타이저 및 기록 소프트웨어를 사용하여 유발된 필드 응답을 시각화합니다.
  7. 적절한 현장 흥분성 시냅스 후 전위(fEPSP)를 찾으려면 사용자가 반응을 찾는 데 능숙할 때 0.2Hz(5초마다)에서 0.12ms 전류 펄스로 조직을 자극하거나 덜 능숙한 사용자의 경우 0.067Hz(15초마다)에서 과도한 자극을 피하기 위해. fEPSP의 최소 진폭이 0.7mV이고 fEPSP보다 작은 투명 파이버 발리가 있는지 확인합니다.
    참고: 최대 필드 응답을 얻기 위해 두 전극을 세포층에서 등거리에 배치하고 작은 광섬유 발리를 생성할 수 있을 만큼 충분히 멀리 떨어져(즉, ~200μm) 배치하는 것이 중요합니다. 전극 위치를 약간만 조정하면 반응의 진폭을 향상시키는 데 도움이 될 수 있지만 조직 손상을 방지하기 위해 최소한으로 유지해야 합니다.
  8. 자극 강도를 높여 최대 fEPSP 진폭을 결정한 다음 fEPSP가 최대 진폭의 70%가 되도록 시뮬레이션 강도를 설정합니다.
    참고: 최대 진폭은 장기 우울증(LTD) 연구의 경우 70%, 장기 강화(LTP) 연구의 경우 50%로 설정됩니다. 최대 진폭은 fEPSP의 진폭이 더 이상 증가하지 않을 때까지 자극 강도를 조정하여 결정됩니다. 최대 진폭이 2mV인 fEPSP의 경우 반응 크기를 LTD 연구의 경우 1.4mV, LTP 연구의 경우 1.0mV로 조정하여 fEPSP가 (각각) 억제되거나 강화될 수 있는 공간을 허용합니다.
  9. 0.067Hz에서 전달되는 0.12ms 펄스로 20분 동안 안정적인 프리컨디셔닝 기준선을 설정합니다. 슬라이스가 안정적인 것으로 간주되려면 fEPSP의 초기 기울기에서 <10%의 변동성을 찾고 표시된 fEPSP 기울기를 통과하는 최적선의 기울기가 <0.5인지 확인합니다. EPSP가 20분 동안 안정적인 것으로 확인되면 기록의 다음 단계를 진행합니다.
    참고: 다양한 수용체 길항제를 aCSF에 추가하여 LTD 및 LTP를 차단하거나 향상시킬 수 있습니다. 필요한 경우 이 기준 기간 동안 슬라이스가 이러한 약리학적 제제에 노출되고 안정적인 기록에 대한 요구 사항이 충족되는지 확인합니다. 예를 들어63,64,65를 참조하십시오.
  10. 먼저, paired-pulse 자극을 사용하고 자극-반응 입력-출력 곡선을 구성하여 기본 시냅스 특성의 변화를 결정합니다. 쌍 펄스 테스트의 경우, 0.033Hz에서 50ms의 인터펄스 간격으로 일련의 쌍을 이루는 펄스를 적용합니다. 입력-출력 곡선의 경우, 0.033Hz에서 자극 강도가 증가하는 시리즈(10)를 0.033Hz에서 적용하여 fEPSP 응답 크기 변화를 플로팅합니다.
  11. 주로 CB1 수용체64,66의 활성화에 의존하는 LTD를 연구하려면 10Hz 프로토콜(10Hz에서 6,000펄스)을 사용합니다. 이 프로토콜은 관리하는 데 10분이 걸립니다.
  12. 후처리 기록의 경우 추가 60분 동안 단일 펄스 자극(0.067Hz 주파수에서 0.12ms)을 사용하여 다시 시작합니다.
  13. 후조절 녹음 후, 쌍을 이루는 펄스 자극을 다시 투여한 다음 입력-출력 곡선을 투여합니다. 이를 기준선 기록과 비교하여 시냅스전 방출 특성의 변화를 관찰하고 장기 기록을 위해 슬라이스의 상태를 평가하는 데 도움이 됩니다.
  14. 분석하는 동안 개별 슬라이스의 데이터를 시냅스 가소성 데이터 세트에 유지해야 하는지 여부를 결정할 때 보수적이고 제외 기준을 준수하십시오. 프리컨디셔닝 베이스라인(기울기 >0.5), 프리컨디셔닝 베이스라인의 불안정성(>10% 변화) 및 사후 컨디셔닝 기간의 불안정성(사후 컨디셔닝 50-60분 동안 기울기 >1.5)에 가장 적합한 선에서 큰 기울기를 표시하는 슬라이스는 제외합니다.

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Representative Results

깨어 있는 폐쇄 머리 손상 모델은 어린 쥐에서 r-mTBI를 유도하는 실행 가능한 방법입니다. ACHI 모델로 r-mTBI에 노출된 쥐는 명백한 행동 결함을 나타내지 않았습니다. 이 실험의 피험자는 r-mTBI 절차 중 어느 시점에서도 우측 또는 무호흡에 대한 잠복기를 나타내지 않았으며, 이는 이것이 실제로 경미한 TBI 절차임을 나타냅니다. NAP에서 미묘한 행동 차이가 나타났습니다. 위에서 설명한 바와 같이, 쥐는 0에서 3까지의 척도로 4개의 감각 운동 작업(놀람 반응, 사지 확장, 빔 보행 및 회전 빔)에 대해 점수를 매겼으며, 3은 작업에 장애가 없음을 나타냅니다. 따라서 NAP 점수가 낮을수록 동물이 더 손상되었습니다. 기준선에서 가짜 쥐와 r-mTBI 쥐 사이의 NAP 점수에는 차이가 없었습니다. 모든 ACHI 세션 후, r-mTBI 쥐는 가짜와 비교할 때 NAP 작업 내에서 상당한 장애를 보였습니다(그림 4). 그러나 여러 날(즉, 2일 또는 4일)에 걸쳐 전달된 영향에 대해 이전에 보고된 바와 같이, 하루 동안 부상이 추가되어도 추가적인 행동 결손이 복합화되거나 생성되지 않았습니다. 따라서 r-mTBI의 ACHI 모델은 이러한 급성 손상 후 시점 동안 미묘하지만 중요한 행동 결함을 생성합니다.

손상 프로토콜에 따라, 손상 후 1일차(PID1) 및 PID7에 해마의 DG에 대한 MPP 입력에서 유발된 필드 반응과 시냅스 가소성을 조사했습니다. 슬라이스 상태는 각 슬라이스의 오름차순 펄스 폭에 대한 응답으로 fEPSP를 사용하여 검사되었습니다. 도 3C에 나타낸 바와 같이, 가짜 및 r-mTBI 래트로부터 얻어진 슬라이스에서 생성된 입출력 곡선에는 차이가 없었다. 시냅스전 송신기 방출을 검사하기 위해 일련의 쌍 펄스(50ms 펄스 간격)를 투여하고 첫 번째 fEPSP에 대한 두 번째 fEPSP의 크기 비율을 계산했습니다. 쌍을 이룬 펄스 비율은 가짜 쥐와 r-mTBI 쥐 간에 차이가 없었습니다(그림 3D). 따라서, 이들 데이터는 r-mTBI가 DG에 대한 MPP 입력에서 기본 시냅스 생리학을 변경하지 않았음을 나타낸다. LTD를 조사하기 위해 엔도카나비노이드 64에 의존하는 LTD를 유도하기 위해10Hz LTD 프로토콜을 투여했습니다. PID1에서는 LTD를 유지하기 위해 DG에 대한 MPP 입력 용량이 크게 감소했습니다(그림 3E). 그러나 LTD의 이러한 감소는 일시적이었고 PID7에 의해 가짜 및 r-mTBI 동물의 조각은 동등한 LTD를 나타냈지만(그림 3F), r-mTBI 동물의 조각이 LTD의 증가를 나타내는 약간의 경향이 있음을 나타냅니다.

Figure 1
그림 1: r-mTBI를 모델링하는 데 사용되는 ACHI 절차 설정 . (A) 수정된 제어된 피질 충격기를 사용하여 동물의 머리를 6.0m/s의 속도로 10mm 빠르게 이동시켰습니다. (B,C) 왼쪽 두정엽 피질 표적 부위가 있는 맞춤형 3D 프린팅 헬멧. (D) 피험자는 폼 플랫폼의 플라스틱 구속 가방에 넣고 헬멧을 구속 원뿔 주위에 배치하고 대상 부위가 임팩터 팁 바로 아래에 오도록 배치했습니다. 약어: ACHI = 깨어 있는 폐쇄 머리 부상; r-mTBI = 반복되는 경미한 외상성 뇌 손상. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 슬라이스 준비에 필요한 재료 및 설정. (A) 뇌 추출, 장착, 슬라이싱 및 배양에 사용되는 도구: (a) 여과지가 있는 배양 접시; (b) 표준 가위, 해부 가위, 집게, 롱거 및 주걱을 포함한 다양한 해부 도구; (c) 조직 접착제; (d) 압축 피스톤 및 시편 튜브; (e) 깃털 블레이드 및 블레이드 홀더; (f) 냉각 블록; (g) 슬라이스 배양 챔버. (B) 압축 조직 슬라이서. (C) 95 % O 2 / 5 % CO2 로 지속적으로 산소가 공급되는 인공 뇌척수액이 들어있는 욕조에서 배양하는 조각. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: ACHI 모델을 사용한 r-mTBI로 인한 어린 수컷 쥐의 시냅스 가소성의 급성 손상 . (A) 주요 해마 경로. 내측 천공 경로는 내후각 피질에서 치아이랑(파란색)으로의 입력으로 구성됩니다. 내측 천공 경로는 치아이랑(보라색)의 과립 세포에 시냅스를 입력합니다. (B) 치상회(dentate gyrus)의 내측 수행 경로에 양극성 자극 전극(왼쪽)과 유리 기록 전극 피펫(오른쪽)의 실제 배치를 보여주는 해마 뇌 절편의 명시야 현미경 사진(4x 배율). (C) 가짜 및 r-mTBI 쥐에 대한 PID1 및 PID7에서 다양한 시뮬레이션 강도(10-300μs)에 대한 입력-출력 플롯(fEPSP 기울기). (D) 가짜 및 r-mTBI 쥐에 대한 쌍 펄스 비율(50ms 인터펄스 간격). (E) PID1에서 가짜 및 r-mTBI 쥐로부터 얻은 해마 조각에서 LTD 유도 패러다임의 투여 전과 이후의 fEPSP 변화의 시간 경과. (F) PID7에서 가짜 및 r-mTBI 쥐로부터 얻은 해마 조각에서 LTD 유도 패러다임을 투여하기 전과 후의 fEPSP 변화의 시간 경과. 약어: ACHI = 깨어 있는 폐쇄 머리 부상; r-mTBI = 반복되는 경미한 외상성 뇌 손상; PID = 부상 후 일; fEPSP = 현장 흥분성 시냅스 후 전위. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: ACHI 모델을 사용한 r-mTBI로 인한 어린 수컷 쥐의 급성 신경학적 손상. 쥐는 1일 동안 2시간 간격으로 8개의 ACHI 절차를 거쳤으며, 기준선과 각 손상 후에 신경학적 평가 프로토콜이 수행되었습니다. NAP는 놀람 대응, 사지 확장, 빔 워크 및 회전 빔의 네 가지 작업으로 구성되었습니다. 각 과제는 3점 만점으로 각 세션에 대해 총 12점을 받았습니다. 데이터는 평균 ± SEM으로 제시된다. (*)는 p < 0.05를 나타낸다. 약어: ACHI = 깨어 있는 폐쇄 머리 부상; r-mTBI = 반복되는 경미한 외상성 뇌 손상; NAP = 신경학적 평가 프로토콜. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 S1: ACHI 절차 동물 및 영향 정보. 약어: ACHI = 깨어 있는 폐쇄 머리 부상. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 S2: 깨어 있는 mTBI에 대한 구속 점수. 약어: mTBI = 경미한 외상성 뇌 손상. "구속 된 상태로 돌아 서십시오"는 연구원이 꼬리 주위의 가방을 닫기 전에 동물을 구속 장치에 두는 것을 말합니다. 가방을 닫은 후에는 동물이 돌아 다닐 수 없어야합니다. 발성과 꿈틀거림은 가방을 닫은 후에 채점해야 합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1: 케이지 측 모니터링 체크리스트. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 2: 통증 척도 및 고급 모니터링 체크리스트. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

대부분의 전임상 연구는 임상 모집단에서 볼 수 있는 생체역학적 힘을 요약하지 않는 mTBI 모델을 활용했습니다. 여기서, ACHI 모델이 어린 쥐에서 r-mTBI를 유도하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 보여줍니다. r-mTBI의 이 폐쇄형 모델은 보다 침습적인 절차에 비해 상당한 이점이 있습니다. 첫째, ACI는 일반적으로 두개골 골절, 뇌출혈 또는 사망을 일으키지 않으며, 이 모든 것은 임상 집단에서 "경미한" TBI의 금기 사항이 될 것입니다61. 둘째, ACI는 두개골 절개술을 사용할 필요가 없으며, 이는 증상 및 신경 병리를 악화시킬 수있는 염증 반응을 유발하는 것으로 알려져 있기 때문에 중요합니다67. 셋째, ACI는 마취를 필요로하지 않습니다. 이것은 또한 마취가 신경 보호 특성을 가질 수 있고 학습 및 기억 성능 48,49,50,51,68 외에도 시냅스 가소성을 손상시킬 수 있기 때문에 중요합니다. 마지막으로, ACI는 부상 직후 평가할 수 있는 신경 기능의 미묘한 일시적인 변화를 생성할 수 있습니다.

ACI는 일반적으로 의식 상실이나 무호흡을 유발하지 않기 때문에 이 모델은 임상 인구 69,70,71의 상당 부분에서 mTBI를 모방합니다. 그럼에도 불구하고 ACHI 모델은 NAP 점수를 크게 줄였습니다. 이러한 감소는 ACHI 절차의 반복 투여로 지속되었지만 r-mTBI 그룹 내에서 감각 운동 장애를 악화시키지는 않았습니다. 이는 ACHI 모델이 임상 집단에서 뇌진탕 또는 뇌진탕 두부 충격 후 관찰된 것과 유사한 경미한 부상을 유발한다는 것을 나타냅니다72,73. NAP의 주요 이점은 r-mTBI 이후 급성기에 나타나는 미묘한 행동 결함을 감지한다는 것입니다. 이 빠른 검사를 통해 연구자들은 행동 반응에 따라 쥐를 분류할 수 있습니다. 그러나 아 급성 및 만성 시점에서보다 강력한 행동 테스트를 사용하여 운동,인지 및 정서적 증상을 감지해야 할 수 있습니다74,75,76. 8 개의 부상에 대한 NAP 점수에는 차이가 없었지만 설치류 행동은 환경 변화와 실험자77,78에 대한 친숙도에 의해 영향을받을 수 있습니다. 쥐는 r-mTBI 또는 가짜 부상을 투여하기 전에 시술실에 적응할 수 있어야 합니다. 또한 일관성을 보장하기 위해 한 개인이 영향을 관리할 책임이 있는 것이 중요합니다.

앞서 언급 한 ACHI 모델의 이점에도 불구하고 제한이없는 것은 아닙니다. 첫째, 패러다임은 회복 기간 후 반복적인 부상이 아닌 단일 세션에서 충격의 누적을 모방하도록 설계되었습니다. 손상 후, 뇌는 설치류 15,79,80에서 손상 후 1 일에서 5 일까지 연장되는 뇌 취약성의 창에 있습니다. 하루에 8 건의 부상을 입으면 급성 및 아 급성 부상 캐스케이드가 발생하지 않습니다. 따라서 관심 있는 연구 질문에 따라 부상 패러다임은 취약성 범위 내에서 조정되어야 할 수 있습니다. 둘째, 마취제의 사용을 제한하는 것이 유익하지만, ACHI 모델의 의도하지 않은 결과는 쥐에게 억제 스트레스를 가하는 것입니다. 급성 및 만성 스트레스 요인에 노출되면 염증 반응이 시작되고 다양한 행동에 영향을 미치며 해마의 시냅스 가소성을 변화시킬 수 있는 것으로 나타났습니다81,82,83.

상기 기술된 프로토콜은 ACHI 모델을 사용하여 r-mTBI 투여 동물로부터 고품질 횡방향 해마 절편을 생산하기 위한 명확한 방법을 제공한다. 또한, 이 프로토콜은 안정적인 전기생리학적 기록을 가능하게 하고 일시적인 중단이 있을 수 있지만 해마가 r-mTBI 후에도 여전히 시냅스 가소성을 나타낼 수 있음을 보여줍니다. 모든 전기생리학적 기록에서 슬라이스 상태는 적절한 fEPSP를 기록하는 능력에 가장 중요합니다. 뇌 조직을 보존하려면 슬라이싱하기 전에 뇌가 탄수화물 화 된 aCSF에서 얼음처럼 차갑게 유지되어야합니다. 뇌의 제거와 절단은 신속하게 이루어져야 하지만, 이것이 보살핌을 희생해야 하는 경우에는 그렇지 않습니다. 어린 동물에 대한 이 프로토콜은 aCSF를 절단 용액으로 사용하지만, 동물의 연령에 따라 보호 절단 용액(예: 콜린-, 수크로스-, NMDG- 또는 글리세롤계 용액)이 필요할 수 있다84,85,86.

현장 전기생리학적 기록을 통해 연구자들은 해마 시냅스 가소성을 측정할 수 있습니다. 그러나 이 기술에는 여러 가지 제한 사항이 있습니다. 뇌를 절단하는 과정은 시냅스 가소성에 영향을 줄 수 있는 척추 번호87의 변화를 일으키는 것으로 나타났습니다. 생체 내 기록의 사용은 경로를 보존하고 마취된 동물 또는 살아있는 동물에서 시냅스 가소성을 측정할 수 있게 한다88. 또한 현장 기록을 사용하면 뉴런 그룹의 특성을 조사할 수 있지만 개별 뉴런의 변화에 대해서는 알려주지 않습니다. 전세포 패치-클램프 기록의 사용은 약리학적 또는 광유전학적 조작에 대한 반응으로 뉴런 특성에 대한 시간적으로 상세한 정보를 제공할 수 있다89. 또한 칼슘 이미징, 웨스턴 블로팅, 면역조직화학 또는 전자 현미경과 같은 보완 기술과 전기생리학적 기록을 결합하면 연구자들이 작용 메커니즘에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

인지 결핍은 일반적으로 r-mTBI 이후에 보고되며 현재 프로토콜은 이러한 결핍과 관련된 근본적인 생리학적 과정 중 일부를 조사하는 데 도움이 될 수 있습니다. 특히, ACHI 절차의 온화한 특성은 r-mTBI를 발생시킨 동물의 수명 전반에 걸쳐 시냅스 생리학의 변화를 조사할 수 있는 가능성을 열어줍니다. ACHI 모델은 r-mTBI를 연구하는 데 사용할 수 있는 것보다 생태학적으로 유효한 mTBI 모델인 것으로 보입니다. ACHI 모델을 활용한 예비 연구에서는 명백한 구조적 손상 없이 급성 신경학적 손상이 나타났으며, 1, 4, 8개의 반복 손상 패러다임을 투여했습니다61,90. 향후 연구에서는 are-mTBI가 발달 기간과 노화 뇌에서 시냅스 가소성에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 조사할 것입니다. 시냅스 기능에 대한 mTBI 및 r-mTBI의 병태생리학을 더 잘 이해함으로써 인지 기능을 감소시키는 데 도움이 되는 잠재적인 치료 개입을 더 잘 지시할 수 있기를 바랍니다.

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Disclosures

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgments

이 프로토콜의 개발에 기여한 과거와 현재의 빅토리아 대학교 크리스티 연구소의 모든 구성원에게 감사드립니다. 이 프로젝트는 캐나다 보건 연구소(CIHR: FRN 175042) 및 NSERC(RGPIN-06104-2019)의 자금으로 지원되었습니다. Figure 1 두개골 그래픽은 BioRender로 제작되었습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D-printed helment  Designed and constructed by Christie laboratory (See Specifications in Christie et al. (2019), Current Protocols in Neuroscience) 
Agarose  Fisher Scientific (BioReagents) BP160500
Anesthesia chamber Home Made N/A Plexiglass Container
Automatic Heater Controller Warner Electric TC-324B
Axon Digidata Molecular Devices 1440A Low-noise Data Acquisition System
Balance beam  Can be constructed or purchased (100 cm long x 2 cm wide x 0.75 cm thick)
Calcium Chloride Bio Basic Canada Inc.  CD0050 For aCSF
Camera Dage MTI NC-70
Carbogen tank Praxair MM OXCD5C-K Carbon Dioxide 5%, Oxygen 95%
Clampex Software Molecular Devices Clampex 10.5 Version
Compresstome Vibrating Microtome Precisionary VF 310-0Z
Concentric Bipolar Electrode FHC Inc. CBAPC75
Dextrose (D-Glucose) Fisher Scientific (Chemical) D16-3 aCSF
Digital Stimulus Isolation Amplifier   Getting Instruments, Inc.  Model 4D
Disodium Phosphate Fisher Scientific (Chemical) S373-500 PBS
Dissection Tools
Feather Double Edge Blade Electron Microscopy Sciences 72002-10
Filter Paper Whatman 1 1001-055
Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter Instrument P-1000
Hair Claw Clip Can be obtained from any department store
Home and Recovery Cages Normal rat cages from animal care unit.
Hum Bug Noise Eliminator Quest Scientific  726300
Isoflurane USP Fresenius Kabi CP0406V2
Isotemp 215 Digital Water Bath Fisher Scientific  15-462-15
Leica Impact One CCI unit Leica Biosystems Tip is modified to hold 7mm rubber impact tip
Long-Evans rats, male Charles River Laboratories (St. Constant, PQ)
Low-Density Foam Pad 3" polyurethane foam sheet 
Magnesium Chloride Fisher Scientific (Chemical) M33-500 aCSF
Male Long Evans Rats Charles River Laboratories Animals ordered from Charles River Laboratories, or pups bred at the University of Victoria
MultiClamp 700B Amplifier Molecular Devices Model 700B
pH Test Strips VWR Chemicals BDH BDH83931.601
Potassium Chloride Fisher Scientific (Chemical) P217-500 aCSF, PBS
Potassium Phosphate Sigma P9791-500G PBS
Push Button Controller Siskiyou Corporation  MC1000e Four-axis Closed Loop Controller Push-Button
Sample Discs ELITechGroup SS-033 For use with Vapor Pressure Osmometer
Small towel
Sodium Bicarbonate Fisher Scientific (Chemical) S233-500 aCSF
Sodium Chloride Fisher Scientific (Chemical) S271-3 For aCSF, PBS
Sodium Phosphate Fisher Scientific (Chemical) S369-500 aCSF
Soft Plastic Restraint Cones Braintree Scientific model DC-200
Stopwatch Many lab members use their iPhone for this
Table or large cart with raised edges  For NAP and ACHI
Thin Wall Borosilicate Glass (with Filament) Sutter Instrument BF150-110-10 Outside diameter: 1.5 mm; Inside diameter: 1.10 mm; Length: 10 cm
Upright Microscope Olympus Olympus BX5OWI 5x MPlan 0.10 NA Objective lens
Vapor Pressure Osmometer Vapro Model 5600 aCSF should be 300-310 mOSM
Vetbond Tissue Adhesive 3M 1469SB
Vibraplane Vibration Isolation Table Kinetic Systems 9101-01-45

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References

  1. Fu, T. S., Jing, R., McFaull, S. R., Cusimano, M. D. Health & economic burden of traumatic brain injury in the emergency department. Canadian Journal of Neurological Sciences. 43 (2), 238-247 (2016).
  2. Chen, C., Peng, J., Sribnick, E., Zhu, M., Xiang, H. Trend of age-adjusted rates of pediatric traumatic brain injury in US emergency departments from 2006 to 2013. International journal of environmental research and public health. 15 (6), 1171 (2018).
  3. Prins, M., Greco, T., Alexander, D., Giza, C. C. The pathophysiology of traumatic brain injury at a glance. Disease Models & Mechanisms. 6 (6), 1307-1315 (2013).
  4. Mayer, A. R., Quinn, D. K., Master, C. L. The spectrum of mild traumatic brain injury: a review. Neurology. 89 (6), 623-632 (2017).
  5. Kara, S., et al. Less than half of patients recover within 2 weeks of injury after a sports-related mild traumatic brain injury: a 2-year prospective study. Clinical Journal of Sport Medicine. 30 (2), 96-101 (2020).
  6. Chung, A. W., Mannix, R., Feldman, H. A., Grant, P. E., Im, K. Longitudinal structural connectomic and rich-club analysis in adolescent mTBI reveals persistent, distributed brain alterations acutely through to one year post-injury. arXiv. , (2019).
  7. Crisco, J. J., et al. Frequency and location of head impact exposures in individual collegiate football players. Journal of Athletic Training. 45 (6), 549-559 (2010).
  8. Wilcox, B. J., et al. Head impact exposure in male and female collegiate ice hockey players. Journal of Biomechanics. 47 (1), 109-114 (2014).
  9. Daniel, R. W., Rowson, S., Duma, S. M. Head impact exposure in youth football. Annals of Biomedical Engineering. 40 (4), 976-981 (2012).
  10. Snowden, T., et al. Heading in the right direction: a critical review of studies examining the effects of heading in soccer players. Journal of Neurotrauma. 38 (2), 169-188 (2021).
  11. Zemek, R. L., et al. Annual and seasonal trends in ambulatory visits for pediatric concussion in Ontario between 2003 and 2013. The Journal of Pediatrics. 181, 222-228 (2017).
  12. Zhang, A. L., Sing, D. C., Rugg, C. M., Feeley, B. T., Senter, C. The rise of concussions in the adolescent population. Orthopaedic Journal of Sports Medicine. 4 (8), (2016).
  13. Broglio, S. P., Eckner, J. T., Paulson, H. L., Kutcher, J. S. Cognitive decline and aging: the role of concussive and subconcussive impacts. Exercise and Sport Sciences Reviews. 40 (3), 138 (2012).
  14. Greco, T., Ferguson, L., Giza, C., Prins, M. Mechanisms underlying vulnerabilities after repeat mild traumatic brain injuries. Experimental Neurology. 317, 206-213 (2019).
  15. Longhi, L., et al. Temporal window of vulnerability to repetitive experimental concussive brain injury. Neurosurgery. 56 (2), 364-374 (2005).
  16. Snowden, T. M., Hinde, A. K., Reid, H. M., Christie, B. R. Does mild traumatic brain injury increase the risk for dementia? A systematic review and meta-analysis. Journal of Alzheimer's Disease. 78 (2), 757-775 (2020).
  17. Guskiewicz, K. M., et al. Association between recurrent concussion and late-life cognitive impairment in retired professional football players. Neurosurgery. 57 (4), 719-726 (2005).
  18. McCradden, M. D., Cusimano, M. D. Staying true to Rowan's Law: how changing sport culture can realize the goal of the legislation. Canadian Journal of Public Health. 110 (2), 165-168 (2019).
  19. Carson, J. D., et al. Premature return to play and return to learn after a sport-related concussion: physician's chart review. Canadian Family Physician. 60 (6), 310-315 (2014).
  20. McClincy, M. P., Lovell, M. R., Pardini, J., Collins, M. W., Spore, M. K. Recovery from sports concussion in high school and collegiate athletes. Brain Injury. 20 (1), 33-39 (2006).
  21. Covassin, T., Savage, J. L., Bretzin, A. C., Fox, M. E. Sex differences in sport-related concussion long-term outcomes. International Journal of Psychophysiology. 132, 9-13 (2018).
  22. Frommer, L., et al. Sex differences in concussion symptoms of high school athletes. Journal of Athletic Training. 46 (1), 76-84 (2011).
  23. Wright, D., O'Brien, T., Shultz, S. R., Mychasiuk, R. Sex matters: Repetitive mild traumatic brain injury in adolescent rats. Annals of Clinical and Translational Neurology. 4 (9), 640-654 (2017).
  24. Stone, S., Lee, B., Garrison, J. C., Blueitt, D., Creed, K. Sex differences in time to return-to-play progression after sport-related concussion. Sports Health. 9 (1), 41-44 (2017).
  25. Cunningham, J., Broglio, S. P., O'Grady, M., Wilson, F. History of sport-related concussion and long-term clinical cognitive health outcomes in retired athletes: a systematic review. Journal of Athletic Training. 55 (2), 132-158 (2020).
  26. Montenigro, P. H., et al. Cumulative head impact exposure predicts later-life depression, apathy, executive dysfunction, and cognitive impairment in former high school and college football players. Journal of Neurotrauma. 34 (2), 328-340 (2017).
  27. Lee, E. B., et al. Chronic traumatic encephalopathy is a common co-morbidity, but less frequent primary dementia in former soccer and rugby players. Acta Neuropathologica. 138 (3), 389-399 (2019).
  28. Di Virgilio, T. G., et al. Evidence for acute electrophysiological and cognitive changes following routine soccer heading. EBioMedicine. 13, 66-71 (2016).
  29. Cherry, J. D., et al. Microglial neuroinflammation contributes to tau accumulation in chronic traumatic encephalopathy. Acta Neuropathologica Communications. 4 (1), 1-9 (2016).
  30. Smith, D. H., Johnson, V. E., Stewart, W. Chronic neuropathologies of single and repetitive TBI: substrates of dementia. Nature Reviews Neurology. 9 (4), 211 (2013).
  31. Coughlin, J. M., et al. Neuroinflammation and brain atrophy in former NFL players: an in vivo multimodal imaging pilot study. Neurobiology of Disease. 74, 58-65 (2015).
  32. Wu, L., et al. Repetitive mild closed head injury in adolescent mice is associated with impaired proteostasis, neuroinflammation, and tauopathy. Journal of Neuroscience. 42 (12), 2418-2432 (2022).
  33. Shultz, S. R., et al. The potential for animal models to provide insight into mild traumatic brain injury: translational challenges and strategies. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 76, 396-414 (2017).
  34. Sharp, D. J., Jenkins, P. O. Concussion is confusing us all. Practical Neurology. 15 (3), 172-186 (2015).
  35. Chen, Y., Huang, W., Constantini, S. The differences between blast-induced and sports-related brain injuries. Frontiers in Neurology. 4, 119 (2013).
  36. Collins, M. W., Kontos, A. P., Reynolds, E., Murawski, C. D., Fu, F. H. A comprehensive, targeted approach to the clinical care of athletes following sport-related concussion. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 22 (2), 235-246 (2014).
  37. Hiploylee, C., et al. Longitudinal study of postconcussion syndrome: not everyone recovers. Journal of Neurotrauma. 34 (8), 1511-1523 (2017).
  38. Rabinowitz, A. R., Fisher, A. J. Person-specific methods for characterizing the course and temporal dynamics of concussion symptomatology: a pilot study. Scientific Reports. 10 (1), 1-9 (2020).
  39. Shultz, S. R., et al. Tibial fracture exacerbates traumatic brain injury outcomes and neuroinflammation in a novel mouse model of multitrauma. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35 (8), 1339-1347 (2015).
  40. McDonald, S. J., Sun, M., Agoston, D. V., Shultz, S. R. The effect of concomitant peripheral injury on traumatic brain injury pathobiology and outcome. Journal of Neuroinflammation. 13 (1), 1-14 (2016).
  41. Statler, K. D., et al. Isoflurane exerts neuroprotective actions at or near the time of severe traumatic brain injury. Brain Research. 1076 (1), 216-224 (2006).
  42. Rowe, R. K., et al. Using anesthetics and analgesics in experimental traumatic brain injury. Lab Animal. 42 (8), 286-291 (2013).
  43. Luh, C., et al. Influence of a brief episode of anesthesia during the induction of experimental brain trauma on secondary brain damage and inflammation. PLoS One. 6 (5), 19948 (2011).
  44. Madry, C., et al. Microglial ramification, surveillance, and interleukin-1β release are regulated by the two-pore domain K+ channel THIK-1. Neuron. 97 (2), 299-312 (2018).
  45. Patel, P. M., Drummond, J. C., Cole, D. J., Goskowicz, R. L. Isoflurane reduces ischemia-induced glutamate release in rats subjected to forebrain ischemia. The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 82 (4), 996-1003 (1995).
  46. Gray, J. J., Bickler, P. E., Fahlman, C. S., Zhan, X., Schuyler, J. A. Isoflurane neuroprotection in hypoxic hippocampal slice cultures involves increases in intracellular Ca2+ and mitogen-activated protein kinases. The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 102 (3), 606-615 (2005).
  47. Flower, O., Hellings, S. Sedation in traumatic brain injury. Emergency Medicine International. 2012, 637171 (2012).
  48. Wagner, M., Ryu, Y. K., Smith, S. C., Mintz, C. D. Effects of anesthetics on brain circuit formation. Journal of Neurosurgical Anesthesiology. 26 (4), 358 (2014).
  49. Leikas, J. V., et al. Brief isoflurane anesthesia regulates striatal AKT-GSK3β signaling and ameliorates motor deficits in a rat model of early-stage Parkinson′ s disease. Journal of Neurochemistry. 142 (3), 456-463 (2017).
  50. Turek, Z., Sykora, R., Matejovic, M., Cerny, V. Anesthesia and the microcirculation. in Seminars in Cardiothoracic and Vascular Anesthesia. , Sage CA. Los Angeles, CA. 249-258 (2009).
  51. Yang, S., et al. Anesthesia and surgery impair blood-brain barrier and cognitive function in mice. Frontiers in Immunology. 8, 902 (2017).
  52. Bodnar, C. N., Roberts, K. N., Higgins, E. K., Bachstetter, A. D. A systematic review of closed head injury models of mild traumatic brain injury in mice and rats. Journal of Neurotrauma. 36 (11), 1683-1706 (2019).
  53. Mannix, R., et al. Adolescent mice demonstrate a distinct pattern of injury after repetitive mild traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 34 (2), 495-504 (2017).
  54. Viano, D. C., Hamberger, A., Bolouri, H., Säljö, A. Evaluation of three animal models for concussion and serious brain injury. Annals of Biomedical Engineering. 40 (1), 213-226 (2012).
  55. Mychasiuk, R., Hehar, H., Candy, S., Ma, I., Esser, M. J. The direction of the acceleration and rotational forces associated with mild traumatic brain injury in rodents effect behavioural and molecular outcomes. Journal of Neuroscience Methods. 257, 168-178 (2016).
  56. Christie, B. R., et al. A rapid neurological assessment protocol for repeated mild traumatic brain injury in awake rats. Current Protocols in Neuroscience. 89 (1), 80 (2019).
  57. Buchanan, F. F., Myles, P. S., Leslie, K., Forbes, A., Cicuttini, F. Gender and recovery after general anesthesia combined with neuromuscular blocking drugs. Anesthesia & Analgesia. 102 (1), 291-297 (2006).
  58. Zhang, L., Gurao, M., Yang, K. H., King, A. I. Material characterization and computer model simulation of low density polyurethane foam used in a rodent traumatic brain injury model. Journal of Neuroscience Methods. 198 (1), 93-98 (2011).
  59. Kikinis, Z., et al. Diffusion imaging of mild traumatic brain injury in the impact accelerated rodent model: A pilot study. Brain Injury. 31 (10), 1376-1381 (2017).
  60. Talty, C. -E., Norris, C., VandeVord, P. Defining experimental variability in actuator-driven closed head impact in rats. Annals of Biomedical Engineering. 50 (10), 1187-1202 (2022).
  61. Meconi, A., et al. Repeated mild traumatic brain injury can cause acute neurologic impairment without overt structural damage in juvenile rats. Plos One. 13 (5), (2018).
  62. Zilles, K. The Cortex of the Rat: a Stereotaxic Atlas. , Springer Science & Business Media. (2012).
  63. Fontaine, C. J., et al. Impaired bidirectional synaptic plasticity in juvenile offspring following prenatal ethanol exposure. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 43 (10), 2153-2166 (2019).
  64. Fontaine, C. J., et al. Endocannabinoid receptors contribute significantly to multiple forms of long-term depression in the rat dentate gyrus. Learning & Memory. 27 (9), 380-389 (2020).
  65. Grafe, E. L., Wade, M. M., Hodson, C. E., Thomas, J. D., Christie, B. R. Postnatal choline supplementation rescues deficits in synaptic plasticity following prenatal ethanol exposure. Nutrients. 14 (10), 2004 (2022).
  66. Peñasco, S., et al. Intermittent ethanol exposure during adolescence impairs cannabinoid type 1 receptor-dependent long-term depression and recognition memory in adult mice. Neuropsychopharmacology. 45 (2), 309-318 (2020).
  67. Cole, J. T., et al. Craniotomy: true sham for traumatic brain injury, or a sham of a sham. Journal of Neurotrauma. 28 (3), 359-369 (2011).
  68. Long, R. P., et al. Repeated isoflurane exposures impair long-term potentiation and increase basal GABAergic activity in the basolateral amygdala. Neural Plasticity. 2016, (2016).
  69. Meehan, W. P., Mannix, R. C., O'Brien, M. J., Collins, M. W. The prevalence of undiagnosed concussions in athletes. Clinical Journal of Sport Medicine. 23 (5), 339 (2013).
  70. Moore, R. D., Lepine, J., Ellemberg, D. The independent influence of concussive and sub-concussive impacts on soccer players' neurophysiological and neuropsychological function. International Journal of Psychophysiology. 112, 22-30 (2017).
  71. Peltonen, K., et al. On-field signs of concussion predict deficits in cognitive functioning: Loss of consciousness, amnesia, and vacant look. Translational Sports Medicine. 3 (6), 565-573 (2020).
  72. Kontos, A. P., Sufrinko, A., Sandel, N., Emami, K., Collins, M. W. Sport-related concussion clinical profiles: clinical characteristics, targeted treatments, and preliminary evidence. Current Sports Medicine Reports. 18 (3), 82-92 (2019).
  73. Eisenberg, M. A., Meehan, W. P., Mannix, R. Duration and course of post-concussive symptoms. Pediatrics. 133 (6), 999-1006 (2014).
  74. Mychasiuk, R., Farran, A., Esser, M. J. Assessment of an experimental rodent model of pediatric mild traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 31 (8), 749-757 (2014).
  75. Malkesman, O., Tucker, L. B., Ozl, J., McCabe, J. T. Traumatic brain injury-modeling neuropsychiatric symptoms in rodents. Frontiers in Neurology. 4, 157 (2013).
  76. Shultz, S. R., MacFabe, D. F., Foley, K. A., Taylor, R., Cain, D. P. A single mild fluid percussion injury induces short-term behavioral and neuropathological changes in the Long-Evans rat: Support for an animal model of concussion. Behavioural Brain Research. 224 (2), 326-335 (2011).
  77. Sorge, R. E., et al. Olfactory exposure to males, including men, causes stress and related analgesia in rodents. Nature Methods. 11 (6), 629-632 (2014).
  78. van Driel, K. S., Talling, J. C. Familiarity increases consistency in animal tests. Behavioural Brain Research. 159 (2), 243-245 (2005).
  79. Mouzon, B. C., et al. Chronic neuropathological and neurobehavioral changes in a repetitive mild traumatic brain injury model. Annals of Neurology. 75 (2), 241-254 (2014).
  80. Mannix, R., et al. Clinical correlates in an experimental model of repetitive mild brain injury. Annals of Neurology. 74 (1), 65-75 (2013).
  81. Bekhbat, M., et al. Chronic adolescent stress sex-specifically alters central and peripheral neuro-immune reactivity in rats. Brain, Behavior, and Immunity. 76, 248-257 (2019).
  82. Pyter, L. M., Kelly, S. D., Harrell, C. S., Neigh, G. N. Sex differences in the effects of adolescent stress on adult brain inflammatory markers in rats. Brain, Behavior, and Immunity. 30, 88-94 (2013).
  83. MacDougall, M. J., Howland, J. G. Acute stress, but not corticosterone, disrupts short-and long-term synaptic plasticity in rat dorsal subiculum via glucocorticoid receptor activation. Cerebral Cortex. 23 (11), 2611-2619 (2013).
  84. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Patch-Clamp Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. 221-242 (2014).
  85. Ting, J. T., Feng, G. Development of transgenic animals for optogenetic manipulation of mammalian nervous system function: progress and prospects for behavioral neuroscience. Behavioural Brain Research. 255, 3-18 (2013).
  86. Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 118-125 (2008).
  87. Trivino-Paredes, J. S., Nahirney, P. C., Pinar, C., Grandes, P., Christie, B. R. Acute slice preparation for electrophysiology increases spine numbers equivalently in the male and female juvenile hippocampus: a DiI labeling study. Journal of Neurophysiology. 122 (3), 958-969 (2019).
  88. Bowden, J. B., Abraham, W. C., Harris, K. M. Differential effects of strain, circadian cycle, and stimulation pattern on LTP and concurrent LTD in the dentate gyrus of freely moving rats. Hippocampus. 22 (6), 1363-1370 (2012).
  89. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024 (2016).
  90. Pham, L., et al. Mild closed-head injury in conscious rats causes transient neurobehavioral and glial disturbances: a novel experimental model of concussion. Journal of Neurotrauma. 36 (14), 2260-2271 (2019).

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신경 과학 문제 191
경미한 외상성 뇌 손상의 깨어 있는 폐쇄 두부 손상 모델을 사용하여 시냅스 가소성의 변화 평가
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Christie, B. R., Gross, A.,… More

Christie, B. R., Gross, A., Willoughby, A., Grafe, E., Brand, J., Bosdachin, E., Reid, H. M. O., Acosta, C., Eyolfson, E. Assessing Changes in Synaptic Plasticity Using an Awake Closed-Head Injury Model of Mild Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (191), e64592, doi:10.3791/64592 (2023).

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