Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Het beoordelen van veranderingen in synaptische plasticiteit met behulp van een wakker gesloten-hoofdletselmodel van mild traumatisch hersenletsel

Published: January 20, 2023 doi: 10.3791/64592
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Division of Medical Sciences, University of Victoria, 2Island Medical Program, University of British Columbia

Summary

Hier wordt gedemonstreerd hoe een wakker gesloten-hoofdletselmodel kan worden gebruikt voor het onderzoeken van de effecten van herhaald licht traumatisch hersenletsel (r-mTBI) op synaptische plasticiteit in de hippocampus. Het model repliceert belangrijke kenmerken van r-mTBI bij patiënten en wordt gebruikt in combinatie met in vitro elektrofysiologie.

Abstract

Mild traumatisch hersenletsel (mTBI's) zijn een veel voorkomend gezondheidsprobleem in Noord-Amerika. Er is een toenemende druk om ecologisch geldige modellen van gesloten mTBI in de preklinische setting te gebruiken om de vertaalbaarheid naar de klinische populatie te vergroten. Het awake closed-headed injury (ACHI) model maakt gebruik van een gemodificeerde gecontroleerde corticale impactor om geslotenhoofdig letsel te leveren, waardoor klinisch relevante gedragsstoornissen worden geïnduceerd zonder de noodzaak van een craniotomie of het gebruik van een verdovingsmiddel.

Deze techniek veroorzaakt normaal gesproken geen dodelijke slachtoffers, schedelbreuken of hersenbloedingen en is meer consistent met een milde verwonding. Inderdaad, de milde aard van de ACHI-procedure maakt het ideaal voor studies die repetitieve mTBI (r-mTBI) onderzoeken. Groeiend bewijs geeft aan dat r-mTBI kan resulteren in een cumulatief letsel dat gedragssymptomen, neuropathologische veranderingen en neurodegeneratie veroorzaakt. r-mTBI komt vaak voor bij sportende jongeren en deze blessures treden op tijdens een periode van robuuste synaptische reorganisatie en myelinisatie, waardoor de jongere bevolking bijzonder kwetsbaar is voor de langetermijninvloeden van r-mTBI.

Verder komt r-mTBI voor in gevallen van intiem partnergeweld, een aandoening waarvoor weinig objectieve screeningsmaatregelen bestaan. In deze experimenten werd de synaptische functie beoordeeld in de hippocampus bij juveniele ratten die r-mTBI hadden ervaren met behulp van het ACHI-model. Na de verwondingen werd een weefselsnijder gebruikt om hippocampale plakjes te maken om bidirectionele synaptische plasticiteit in de hippocampus te evalueren op 1 of 7 dagen na de r-mTBI. Over het algemeen biedt het ACHI-model onderzoekers een ecologisch geldig model om veranderingen in synaptische plasticiteit na mTBI en r-mTBI te bestuderen.

Introduction

Traumatisch hersenletsel (TBI) is een belangrijk gezondheidsprobleem, met ~ 2 miljoen gevallen in Canada en de Verenigde Staten elk jaar 1,2. TBI treft alle leeftijdsgroepen en geslachten en heeft een incidentie die groter is dan die van welke andere ziekte dan ook, met name borstkanker, aids, de ziekte van Parkinson en multiple sclerose3. Ondanks de prevalentie van TBI blijft de pathofysiologie slecht begrepen en zijn de behandelingsopties beperkt. Voor een deel komt dit omdat 85% van alle TBI's zijn geclassificeerd als mild (mTBI), en mTBI is eerder gedacht dat het slechts beperkte en voorbijgaande gedragsveranderingen veroorzaakt zonder neuropsychiatrische gevolgen op lange termijn 4,5. Het wordt nu erkend dat mTBI-herstel weken tot jaren5,6 kan duren, ernstigere neurologische aandoeningen kan bespoedigen4, en dat zelfs herhaalde "sub-hersenschudding" -effecten de hersenen beïnvloeden7. Dit is alarmerend omdat atleten in sporten zoals hockey / voetbal >10 hoofdsub-hersenschudding hebben per wedstrijd / oefensessie 7,8,9,10.

Adolescenten hebben de hoogste incidentie van mTBI en in Canada zal ongeveer één op de 10 tieners jaarlijks medische zorg zoeken voor een sportgerelateerde hersenschudding11,12. In werkelijkheid kan elke sub-hersenschudding of mTBI diffuse schade aan de hersenen veroorzaken, en dit kan ook een meer kwetsbare toestand creëren voor latere verwondingen en / of ernstigere neurologische aandoeningen 13,14,15,16,17. In Canada wordt wettelijk erkend via de wet van Rowan dat eerder letsel de kwetsbaarheid van de hersenen voor verder letsel kan vergroten18, maar het mechanistische begrip van r-mTBI blijft jammerlijk ontoereikend. Het is echter duidelijk dat single en r-mTBI het leervermogen tijdens schooljaren19,20 kunnen beïnvloeden, geslachtsspecifieke uitkomsten 21,22,23,2 4 kunnen hebben en de cognitieve capaciteit later in het leven kunnen aantasten16,25,26. Inderdaad, cohortanalyses associëren r-mTBI vroeg in het leven sterk met dementie later op27,28. r-mTBI is ook potentieel geassocieerd met chronische traumatische encefalopathie (CTE), die wordt gekenmerkt door de accumulatie van hyperfosforyleerd tau-eiwit en progressieve corticale atrofie en versneld door significante ontsteking 27,29,30,31. Hoewel de verbanden tussen r-mTBI en CTE momenteel controversieel zijn32, zal dit model het mogelijk maken om ze in een preklinische setting in meer detail te onderzoeken.

Een mTBI wordt vaak beschreven als een "onzichtbare verwonding", omdat het optreedt in een gesloten schedel en moeilijk te detecteren is, zelfs met moderne beeldvormingstechnieken33,34. Een nauwkeurig experimenteel model van mTBI moet zich houden aan twee principes. Ten eerste moet het de biomechanische krachten samenvatten die normaal worden waargenomen in de klinische populatie35. Ten tweede moet het model heterogene gedragsuitkomsten induceren, iets dat ook veel voorkomt in klinische populaties36,37,38. Momenteel zijn de meeste preklinische modellen ernstiger, met craniotomie, stereotaxische hoofdsteun, anesthesie en gecontroleerde corticale effecten (CCI) die aanzienlijke structurele schade en uitgebreidere gedragsstoornissen veroorzaken dan normaal klinisch wordt waargenomen33. Een andere zorg bij veel preklinische modellen van hersenschudding waarbij craniotomieën betrokken zijn, is dat deze procedure zelf ontstekingen in de hersenen veroorzaakt, en dit kan mTBI-symptomen en neuropathologie verergeren van elk volgend letsel39,40. Anesthesie introduceert ook verschillende complexe confounds, waaronder het verminderen van ontsteking 41,42,43, modulerende microgliale functie44, glutamaatafgifte 45, Ca2+ toegang via NMDA-receptoren 46, intracraniale druk en cerebraal metabolisme 47. Anesthesie introduceert verder confounds door het verhogen van de bloed-hersenbarrière (BBB) permeabiliteit, tau-hyperfosforylering en corticosteroïde niveaus, terwijl de cognitieve functie wordt verminderd 48,49,50,51. Bovendien vertegenwoordigen diffuse, geslotenhoofdige letsels de overgrote meerderheid van de klinische mTBI's52. Ze stellen iemand ook in staat om de veelheid aan factoren die gedragsuitkomsten kunnen beïnvloeden beter te bestuderen, waaronder geslacht21, leeftijd 53, inter-letsel-interval15, ernst54 en het aantal verwondingen23.

De richting van de acceleratieve/vertragende krachten (verticaal of horizontaal) is ook een belangrijke overweging voor gedrags- en moleculaire uitkomsten. Onderzoek van Mychasiuk en collega's hebben twee modellen van diffuse gesloten mTBI vergeleken: gewichtsval (verticale krachten) en laterale impact (horizontale krachten)55. Zowel de gedrags- als de moleculaire analyses onthulden heterogene model- en geslachtsafhankelijke uitkomsten na mTBI. Diermodellen die chirurgische ingrepen helpen vermijden, terwijl ze lineaire en rotatiekrachten bevatten, zijn dus meer representatief voor de fysiologische omstandigheden waaronder deze verwondingen normaal optreden33,56. Het ACHI-model is gemaakt als reactie op deze behoefte, waardoor de snelle en reproduceerbare inductie van mTBI bij ratten mogelijk is, terwijl procedures (d.w.z. anesthesie) worden vermeden waarvan bekend is dat ze geslachtsverschillen vertekenen57.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Goedkeuring voor alle dierprocedures werd verstrekt door de University of Victoria Animal Care Committee in overeenstemming met de normen van de Canadian Council on Animal Care (CCAC). Alle mannelijke Long-Evans ratten werden in eigen huis gefokt of gekocht (zie de Tabel met Materialen).

1. Huisvestings- en fokomstandigheden

  1. Laat de dieren 1 week wennen aan hun huisvestingsomgeving voordat ze spenen op postnatale dag (PND) 21.
  2. Houd de ratten in een standaard kooibehuizing op 22,5 °C ± 2,5 °C, met ad libitum toegang tot voedsel en water, gedurende een licht/donkercyclus van 12 uur.
  3. Groepeer en huis de dieren met twee of drie op geslacht afgestemde nestgenoten en wijs ze willekeurig toe aan schijn- of r-mTBI-omstandigheden.
  4. Voer alle procedures uit tussen 07:30 en 23:30 uur.

2. Opzetten van een wakkere gesloten hoofdletselprocedure

  1. Positie een 2.75 in. schuimkussen met lage dichtheid (100 cm x 15 cm x 7 cm) onder het botslichaam om rotatiebewegingen van het hoofd mogelijk te maken.
    OPMERKING: De schuimkussen had een veerconstante van ~ 2.500 N / m, maar kan variëren tussen 3.100 en 5.600 N / m58. Het niveau van stevigheid (laag, gemiddeld en hoog) is niet voorspellend gebleken voor de uitkomst van de blessure59. De foam pad is een niet-verbruiksmateriaal. Het wordt normaal gesproken jaarlijks vervangen of als het bevuild of beschadigd is.
  2. Schakel de gewijzigde corticale botsinrichting in (figuur 1A) en stel de snelheid in op 6 m/s.
    OPMERKING: Deze specificaties zijn ontworpen om acute neurologische stoornissen op te wekken bij juveniele en adolescente ratten van leeftijd die analoog zijn aan kenmerken van een mTBI, maar dergelijke parameters zijn mogelijk niet geschikt voor oudere dieren of andere soorten (bijv. Muizen of fretten). Zie60 voor een overzicht van algemene ACHI-parameters.

3. Inductie van mTBI

  1. Wanneer de ratten PND 24 bereiken, verplaatst u ze naar de procedureruimte waar de procedures zullen worden uitgevoerd. Zorg ervoor dat deze kamer gescheiden is van hun normale woonomgeving.
  2. Plaats de rat voorzichtig in een fixatiekegel en zorg ervoor dat de snuit en neusgaten zich dicht bij de kleine opening van de kegel bevinden om voldoende ventilatie mogelijk te maken. Gebruik een plastic haarclip om de kegel aan het caudale uiteinde gesloten te houden om beweging te voorkomen zodra de rat in de fixatiekegel is geplaatst.
    1. Gebruik terughoudendheidsscores om de naleving of tolerantie van de dieren met de fixatiekegel en de AIA-procedure vast te leggen.
      OPMERKING: De terughoudendheidsscore kan worden gebruikt als een beoordeling van stress bij de dieren. Zo kunnen exclusiecriteria worden ontwikkeld met behulp van de terughoudendheidsscore om de variabiliteit tussen proefpersonen te verminderen die ontstaat als gevolg van een overmatige stressrespons.
      1. Geef een score van 0 tot 4 op basis van de bereidheid van het dier om de kegel binnen te gaan, hun bewegingen en vocalisaties. Geef een score van 0 als er geen weerstand is tegen de terughoudendheid, terwijl een score van 1 overeenkomt met het dier dat 1-2x draait en weinig tot geen vocalisatie of kronkelen. Geef een score van 2 als het dier 2-3x is geworden en wat vocalisatie of kronkelen vertoont. Geef een terughoudendheidsscore van 3 als het dier 5-10x is geworden en meer vocalisaties en kronkels vertoont. Geef ten slotte een score van 4 als het dier meer dan 10x is gedraaid met frequente vocalisaties en kronkelen.
        OPMERKING: Deze informatie staat ook op het scoreblad zelf (aanvullende tabel S1 en aanvullende tabel S2).
  3. Terwijl de rat in bedwang wordt gehouden, plaatst u de helm handmatig (figuur 1B) over de middellijn, met de richtschijf over de linker pariëtale kwab (figuur 1C, D).
  4. Plaats de rat op het schuimkussen en stel het botslichaam handmatig in op de stand Uitschuiven. Laat de punt van het botslichaam handmatig zakken zodat deze in contact komt met de richtschijf op de helm. Stel het botslichaam handmatig in op de intrekpositie om het botslichaam 10 mm boven de helm te laten terugtrekken.
  5. Gebruik de draaiknop op de stereotaxische arm om de impactpunt met 10 mm te verlagen, zodat deze opnieuw de richtschijf op de helm raakt. Draai de impactschakelaar om zodat de kop van het dier snel 10 mm wordt versneld bij 6 m/s.
  6. Zodra het apparaat is geactiveerd, verwijdert u het dier onmiddellijk uit de vergrendelingskegel en gaat u over tot het uitvoeren van een onmiddellijk neurologisch beoordelingsprotocol (NAP).
    OPMERKING: Voor de huidige experimenten werd dit protocol in totaal acht keer herhaald met intervallen van 2 uur.

4. Inductie van schijnletsel

  1. Volg alle experimentele procedures zoals hierboven beschreven in rubriek 3, maar plaats de rat naast het pad van de botszuiger, zodat er geen letsel ontstaat.

5. Neurologisch beoordelingsprotocol

OPMERKING: Het NAP kan worden gebruikt om het bewustzijnsniveau te meten, evenals het cognitieve en sensomotorische functioneren.

  1. Bij baseline en onmiddellijk na inductie van de mTBI of schijnletsel, beoordeelt u de ratten met behulp van het NAP zoals beschreven in56,61. Plaats op een tafel de thuiskooi van de ratten en een herstelkooi op 100 cm afstand van elkaar. Centreer de evenwichtsbalk gelijkmatig bovenop beide kooien. Plaats daarnaast een opgevouwen handdoek of extra demping onder de balansbalk.
  2. Beoordeel indien nodig het bewustzijnsniveau. Als dieren niet reageren na de mTBI, beoordeel dan de apneu (stopzetting van de ademhaling) en eventuele vertraging in de rechtrichtreflex door een stopwatch te gebruiken om de tijd te registreren die het dier nodig heeft om de ademhaling te hervatten en / of zichzelf recht te zetten van een rugligging in de buikligging.
    OPMERKING: Verlies van rechtrichtreflex en apneu zijn zeldzaam met het ACHI-model, maar ze kunnen af en toe worden waargenomen bij jonge dieren.
  3. Beoordeel de cognitieve en sensomotorische functie van de rat met behulp van de volgende reeks tests. Dien deze tests snel achter elkaar uit na de beoordeling van het bewustzijn.
    OPMERKING: De optelsom van deze vier tests levert een totale score op van 12, als er geen waargenomen gedragstekorten zijn. Tekorten doen afbreuk aan deze score.
    1. Schrikreactie
      1. Plaats de rat in de lege herstelkooi en klap luid (50 cm) over de kooi. Noteer de reactie van het dier op het geluid met behulp van het volgende scoresysteem:
        3 = Snelle schrikreactie op geluid (bijv. oorbeweging/spiertrekkingen, sprong, bevriest het hele lichaam).
        2 = Langzame reactie of lichte bevriezingsreactie op geluid.
        1 = Alleen waargenomen oorbewegingen.
        0 = Geen reactie op geluid.
    2. Ledemaat extensie
      1. Met de balk (100 cm lang x 2 cm breed x 0,75 cm dik) horizontaal geplaatst over het huis van de rat en de herstelkooien, pak je de rat bij de basis van de staart en houd je hem in de buurt van de balk. Zorg ervoor dat de rat dichtbij genoeg is om hem gemakkelijk te kunnen vastpakken. Beoordeel het vermogen van de rat om beide ledematen uit te strekken naar de balk met het volgende scoresysteem:
        3 = Volledige verlenging van beide voorpoten en grijpt de balk.
        2 = Slechts één ledemaat wordt verlengd.
        1 = Intermitterende extensie of terugtrekking van voorpoten.
        0 = Voorpoten zijn slap/geen extensie.
    3. Balkwandeling
      1. Plaats het dier in het midden van de horizontale balk op het 50 cm-teken tegenover zijn thuiskooi. Zorg ervoor dat de balk gelijkmatig is verdeeld tussen de thuiskooi van de rat en de herstelkooi (~ 80 cm uit elkaar geplaatst). Laat de rat over de balk lopen. Beoordeel het vermogen van de rat om te balanceren en te lopen met het volgende scoresysteem:
        3 = Loopt met succes over de balk met minder dan twee voetslips binnen 10 s.
        2 = Loopt met succes de balk, maar er worden meer dan twee voetverschuivingen waargenomen.
        1 = Niet-locomotiefbeweging, 'zwemmende' beweging.
        0 = Niet in staat om langs de balk te lopen of niet in staat om binnen 10 s te bewegen.
    4. Roterende balk
      1. Plaats de rat in het midden van de balk en zorg ervoor dat de rat in balans is. Til de balk 80 cm boven een handdoek of gewatteerd oppervlak en begin met het handmatig draaien van de balk met een snelheid van één rotatie per seconde gedurende 4 s (in totaal vier rotaties). Beoordeel het vermogen van de rat om op de balk te blijven terwijl deze roteert met het volgende scoresysteem:
        3 = Rat blijft op de balk voor alle vier de rotaties.
        2 = Rat valt op de vierde rotatie.
        1 = Rat valt op de tweede of derde rotatie.
        0 = Rat valt tijdens de eerste rotatie.
  4. Na voltooiing van NAP, breng mTBI en schijnratten terug naar hun thuiskooien. Herhaal indien nodig voor r-mTBI-procedures. Bewaak het welzijn van de dieren na verwondingen met de Controlechecklist kooizijde (Aanvullend Dossier 1). Als er een indicatie is van afwijking (elke score die niet N is) tijdens controle aan de kooizijde, moet een volledige pijnscore worden genomen met de pijnschaal en geavanceerde monitoringchecklist na hoofdbotsing (aanvullend dossier 2).

6. Snijbereiding

OPMERKING: In de huidige studie werd synaptische plasticiteit beoordeeld bij dieren na r-mTBI 1 of 7 dagen na mTBI. Op deze dagen werden de dieren individueel in overdekte kooien naar het laboratorium gebracht voordat ze werden geofferd.

  1. Koel (-20 °C) 's nachts alle chirurgische hulpmiddelen (figuur 2A) die nodig zijn voor het maken van hippocampusplakken: standaardschaar, ontleedschaar, tang, rongeurs, spatels en koelblok.
    OPMERKING: De weefsellijm en incubatiekamer mogen niet worden gekoeld.
  2. Bereid kunstmatige hersenvocht (aCSF) met 125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaHPO 4, 25 mM NaHCO 3, 2 mM CaCl 2,1,3 mM MgCl 2 en 10 mM dextrose (300 ± 10 mOsm; pH 7,2-7,4).
    OPMERKING: De hoofdoplossing van aCSF moet continu worden gebubbeld met carbogen (95% O 2/5% CO2) voor de duur van het protocol.
  3. Voordat u het dier euthanaseert (stap 6.8), bereidt u 12,5 ml agarose voor. Los 0,25 g agarose op in 12,5 ml fosfaat-gebufferde zoutoplossing (1x PBS) door microwaving in een conische buis van 50 ml in stappen van 10 s.
  4. Houd de agarose warm (42 °C) en schud in een verwarmingsplaat om te voorkomen dat deze stolt.
  5. Zet een snijstation op ijs op, inclusief een petrischaaltje en een klein bekerglas (50 ml) gevuld met ijskoud aCSF (4 °C) en een omgevallen petrischaal met daarop een stuk bevochtigd filterpapier (figuur 2A). Laat de aCSF continu bubbelen in het kleine bekerglas met carbogen.
  6. Verwarm het waterbad tot 32 °C. Vul de herstelkamer met aCSF en bubbel continu met carbogen (figuur 2B).
  7. Vervoer het dier naar de proefruimte.
  8. Verdoof het dier met 5% isofluraan als inhalatiemiddel (tot het ontbreken van een ontwenningsreflex) en onthoofd het vervolgens snel met een kleine guillotine.
  9. Ontleed de hersenen van de schedel in de petrischaal gevuld met ijskoude (4 ° C) aCSF en houd de schedel ondergedompeld in de aCSF om het weefsel snel af te koelen.
    OPMERKING: Deze procedure duurt normaal gesproken minder dan 5 minuten, maar de snelheid van hersenverwijdering is geen kritieke factor als de hersenen worden ondergedompeld in gekoelde aCSF.
  10. Plaats de hersenen in het kleine bekerglas van gekoelde en gecarbogeneerde aCSF om het monster verder te reinigen en te koelen.
  11. Beweeg de hersenen naar de omgekeerde petrischaal en plaats deze op het filterpapier. Gebruik een scherp scalpel om het cerebellum en de prefrontale cortex te verwijderen om de hersenen te "blokkeren". Scheid de twee hersenhelften door de middellijn van de hersenen af te snijden.
    OPMERKING: Het volgende protocol wordt één halfrond tegelijk uitgevoerd. Het is absoluut noodzakelijk dat de halve bol die momenteel niet wordt voorbereid, ondergedompeld blijft in het bekerglas van ijskoude (4 °C) gecarboogeneerde aCSF.
  12. Om dwarse hippocampussegmenten te maken, plaatst u de halve bol op het mediale oppervlak. Kantel het blad van een scalpel op ~ 30 ° naar binnen en verwijder een dun plakje van het dorsale oppervlak van de hersenen om een plat oppervlak te bieden voor de hersenen om te worden gemonteerd op de zuiger die door de snijmachine wordt gebruikt. Draai de hersenen op het dorsale oppervlak en dep het weefsel voorzichtig op droog filterpapier om overtollige aCSF te verwijderen. Bevestig met behulp van cyanoacrylaatlijm het dorsale oppervlak van de hersenen aan de zuiger, waardoor het ventrale oppervlak rechtop blijft staan.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de lijm niet over de rand van de zuiger loopt, omdat dit ervoor zorgt dat deze zich hecht aan de metalen buis die wordt gebruikt om de agarose te bevatten en beweging van de zuiger te voorkomen.
  13. Strek de buitenste buis van de zuiger uit over de hersenen en giet de vloeibare agarose in de buis totdat de hersenen volledig bedekt zijn. Stollen de agarose snel door een koelblok over de zuigerbuis te klemmen (figuur 2A).
  14. Plaats de zuiger in de kamer van de snijmachine en zet de kamer vast met een schroef. Zet het mes vast en voeg ijskoude, zuurstofrijke aCSF toe aan de snijkamer.
  15. Stel op de snijmachine (figuur 2B) de snijsnelheid in op 4, oscillatie op 6 en zet de continue/enkele snijschakelaar op continu. Druk op start om te beginnen met het segmenteren van de hersenen op 400 μm.
  16. Terwijl de snijmachine de hersenen doorsnijdt, gebruikt u een Pasteur-pipet met een grote diameter om elke plak over te brengen naar het herstelbad van zuurstofrijk aCSF terwijl het wordt gesegmenteerd (figuur 2C).
    OPMERKING: Als elk plakje wordt gesneden, kan het achtereenvolgens in de verschillende putten van het herstelbad worden geplaatst. Dit protocol levert meestal tussen de zes en acht plakjes op, met daarin de hippocampus voor elke hemisfeer. Een rattenatlas62 kan worden gebruikt om de dorsale-ventrale positie van individuele plakjes in het rattenbrein te identificeren.
  17. Laat de plakjes gedurende 30 minuten herstellen bij 32 °C en laat ze vervolgens nog eens 30 minuten herstellen bij kamertemperatuur (23 °C).
  18. Herhaal deze stappen om segmenten van de tweede hemisfeer te maken.

7. Veldelektrofysiologie

OPMERKING: Om extracellulaire veldopnamen van de gyrus dentate (DG) te verkrijgen, voert u de volgende stappen uit. Na het herstel van 60 minuten zijn individuele hippocampussegmenten klaar voor extracellulaire veldopnamen.

  1. Met behulp van een in de handel verkrijgbare micropipettrekker trekt u opname-elektroden (1-2 MΩ) uit 10 cm borosilicaatglazen haarvaten met een buitendiameter van 1,5 mm en een binnendiameter van 1,1 mm.
    OPMERKING: De opname-elektrode moet een weerstand hebben van ~ 1 MΩ en de uiteinden moeten ~ 1 mm groot zijn. Consistentie in elektrodeparameters is belangrijk voor goede opnames.
  2. Schakel de computer en apparatuur in die moeten worden gebruikt voor opnames: de versterker, digitizer, stimulator, micromanipulator, temperatuurregelaar, microscooplicht en vacuümpomp.
  3. Vul een bekerglas met aCSF en sluit het aan op een zwaartekrachtgestuurd perfusiesysteem. Open de aCSF-klep op het perfusiesysteem om een stroom van aCSF door de perfusiekamer te starten. Houd een debiet aan van ongeveer één of twee druppels/s of 2 ml/min. Continu carbogenaat aCSF voor de duur van elektrofysiologische opnames.
    OPMERKING: Het is noodzakelijk om een constante druppelsnelheid van gecarbogeneerde aCSF te handhaven tijdens veldopnamen. Het is ook noodzakelijk dat de referentie-elektrode volledig wordt ondergedompeld in aCSF.
  4. Gebruik een Pasteurpipet om een hippocampusschijf van het herstelbad over te brengen naar de perfusiekamer die continu wordt doordrenkt met gecarbomeerde aCSF en op 30 ± 0,5 °C wordt gehouden. Oriënteer de hersenschijf zo dat de gyrus dentate en de korrelcellaag zichtbaar zijn in het gezichtsveld. Stabiliseer de plak met gebogen draadgewichten. Start de computersoftware voor gegevensverzameling.
    OPMERKING: Het kan nuttig zijn om de vacuümpomp tijdens deze stap uit te schakelen om vrije manipulatie van het weefsel mogelijk te maken. Dit moet snel gebeuren, omdat te veel manipulatie het weefsel kan beschadigen. Bovendien kan de perfusiekamer overlopen met aCSF als dit te veel tijd kost. Zodra het weefsel goed is georiënteerd en gestabiliseerd, zet u de vacuümpomp aan.
  5. Gebruik een rechtopstaande microscoop om de DG te visualiseren met schuine optiek. Plaats een concentrische bipolaire stimulerende elektrode om de mediale perforante pad (MPP) vezels in het middelste derde deel van de moleculaire laag te activeren. Plaats vervolgens een glazen micropipette, gevuld met aCSF in de MPP (figuur 3A,B). Begin met de elektroden verder uit elkaar (d.w.z. de stimulerende elektrode in de buurt van CA3 en de opname-elektrode net boven de genu van de DG), omdat het aanraken van het weefsel schade aan de vezels zal veroorzaken.
    OPMERKING: Optimaal moeten alle opnamen de elektroden op gelijke afstand van de cellaag plaatsen, ongeveer 200 μm uit elkaar.
  6. Zodra de stimulerende en opname-elektroden zijn geplaatst, visualiseert u de opgeroepen veldreacties met behulp van een versterker, een digitizer en opnamesoftware.
  7. Om een geschikt veld exciterende postsynaptische potentiaal (fEPSP) te vinden, stimuleert u het weefsel met 0,12 ms stroompulsen bij 0,2 Hz (elke 5 s) wanneer de gebruiker bekwaam is in het vinden van reacties, of bij 0,067 Hz (elke 15 s) voor minder bekwame gebruikers om overstimulatie te voorkomen. Zorg ervoor dat de fEPSP een minimale amplitude van 0,7 mV heeft met een heldere vezelvolley die kleiner is dan de fEPSP.
    OPMERKING: Het is van cruciaal belang om beide elektroden op gelijke afstand van de cellaag te plaatsen om maximale veldresponsen te verkrijgen en ver genoeg uit elkaar (d.w.z. ~ 200 μm) om een kleine vezelvolley te genereren. Kleine aanpassingen in de positie van de elektrode kunnen helpen de amplitude van de respons te verbeteren, hoewel deze tot een minimum moeten worden beperkt om weefselschade te voorkomen.
  8. Bepaal de maximale fEPSP-amplitude door de stimulatie-intensiteit te verhogen en stel vervolgens de simulerende intensiteit zo in dat de fEPSP op 70% van de maximale amplitude ligt.
    OPMERKING: De maximale amplitude is ingesteld op 70% voor langdurige depressie (LTD) studies en op 50% voor lange termijn potentiëring (LTP) studies. De maximale amplitude wordt bepaald door de stimulatiesterkte aan te passen totdat de fEPSP niet langer in amplitude toeneemt. Voor een fEPSP met een maximale amplitude van 2 mV zou de responsgrootte dan worden aangepast naar 1,4 mV voor LTD-onderzoeken en 1,0 mV voor LTP-onderzoeken, zodat de fEPSP ruimte heeft om (respectievelijk) te drukken of te versterken.
  9. Zorg voor een stabiele voorconditioneringsbasislijn gedurende 20 minuten met pulsen van 0,12 ms die worden afgeleverd bij 0,067 Hz. Om plakjes als stabiel te beschouwen, moet u zoeken naar <10% variabiliteit in de beginhelling van de fEPSP en naar de helling van de lijn van de beste pasvorm door de uitgezette fEPSP-hellingen <0,5. Ga verder met de volgende stappen van de opname wanneer EPSP's gedurende 20 minuten stabiel zijn geverifieerd.
    OPMERKING: Verschillende receptorantagonisten kunnen aan de aCSF worden toegevoegd om LTD en LTP te blokkeren of te verbeteren. Als ze nodig zijn, zorg er dan voor dat de plakjes tijdens deze basisperiode aan deze farmacologische middelen worden blootgesteld en dat aan de vereisten voor stabiele registraties wordt voldaan. Zie voor voorbeelden63,64,65.
  10. Bepaal eerst veranderingen in elementaire synaptische eigenschappen door gebruik te maken van gepaarde pulsstimuli en door stimulus-respons input-outputcurven te construeren. Pas voor de gepaarde pulstest een reeks gepaarde pulsen toe met een interpulsinterval van 50 ms bij 0,033 Hz. Pas voor de input-outputcurven een reeks (10) toenemende stimulusintensiteiten (0,0-0,24 ms) toe bij 0,033 Hz om de verandering in de fEPSP-responsgrootte te plotten.
  11. Om LTD te bestuderen dat voornamelijk afhankelijk is van de activering van CB1-receptoren64,66, gebruikt u een 10 Hz-protocol (6.000 pulsen bij 10 Hz). Het beheer van dit protocol duurt 10 minuten.
  12. Voor postconditioneringsopnamen hervat u het gebruik van single-pulse stimulatie (0,12 ms bij een frequentie van 0,067 Hz) gedurende nog eens 60 minuten.
  13. Na de postconditioneringsopname dient u opnieuw de gepaarde pulsstimuli toe, gevolgd door een input-outputcurve. Vergelijk deze met basislijnopnamen om veranderingen in presynaptische afgifte-eigenschappen te observeren en de gezondheid van de slice te beoordelen voor langetermijnopnamen.
  14. Wees tijdens de analyse conservatief en houd u aan de uitsluitingscriteria bij het bepalen of de gegevens van afzonderlijke segmenten moeten worden bewaard in de synaptische plasticiteitsgegevensset. Sluit segmenten uit die een grote helling vertonen in een lijn van de beste pasvorm van fEPSP-hellingen tijdens de voorconditioneringsbasislijn (helling >0,5), instabiliteit in de basislijn van de voorconditionering (>10% verandering) en of instabiliteit in de postconditioneringsperiode (helling >1,5 in 50-60 minuten postconditionering).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het model voor wakker gesloten-hoofdletsel is een haalbare methode om r-mTBI bij juveniele ratten te induceren. Ratten blootgesteld aan r-mTBI met het ACHI-model vertoonden geen openlijke gedragstekorten. Proefpersonen in deze experimenten vertoonden op geen enkel moment tijdens de r-mTBI-procedure latentie naar rechts of apneu, wat aangeeft dat dit inderdaad een milde TBI-procedure was. Subtiele gedragsverschillen kwamen wel naar voren in het NAP; Zoals hierboven beschreven, werden de ratten gescoord op vier sensomotorische taken (schrikrespons, ledemaatverlenging, balkloop en roterende straal) op een schaal van 0 tot 3, waarbij 3 geen beperking met de taak vertegenwoordigde. Dus hoe lager de NAP-score, hoe meer het dier werd aangetast. Bij baseline waren er geen verschillen in de NAP-scores tussen sham- en r-mTBI-ratten. Na alle ACHI-sessies vertoonden de r-mTBI-ratten significante beperkingen binnen de NAP-taken in vergelijking met shams (figuur 4). Echter, zoals eerder gemeld voor effecten die gedurende meerdere dagen (d.w.z. 2 of 4 dagen) werden geleverd, verergerde of produceerde de daaropvolgende toevoeging van verwondingen in de loop van de dag geen extra gedragstekorten. Het ACHI-model van r-mTBI produceert dus subtiele, maar significante gedragsstoornissen tijdens deze acute post-blessuretijdpunten.

Volgens het letselprotocol werden opgeroepen veldreacties en synaptische plasticiteit onderzocht in de MPP-input aan de DG van de hippocampus op dag 1 (PID1) na het letsel en PID7. De status van de plak werd onderzocht met behulp van fEPSP's als reactie op een oplopende reeks pulsbreedtes in elk segment. Zoals te zien is in figuur 3C, was er geen verschil in de input-outputcurven gegenereerd in segmenten verkregen van sham- en r-mTBI-ratten. Om de presynaptische afgifte van de zender te onderzoeken, werd een reeks gepaarde pulsen (50 ms interpulsinterval) toegediend en werd de verhouding van de grootte van de tweede fEPSP berekend ten opzichte van de eerste fEPSP. De gepaarde pulsverhoudingen verschilden niet tussen schijn- en r-mTBI-ratten (figuur 3D). Deze gegevens geven dus aan dat r-mTBI de basale synaptische fysiologie in de MPP-invoer bij de DG niet veranderde. Om LTD te onderzoeken, werd een 10 Hz LTD-protocol toegediend om een LTD te induceren die afhankelijk was van endocannabinoïden64. Op PID1 was er een significante afname van de capaciteit van de MPP-input voor de DG om LTD te ondersteunen (figuur 3E). Deze afname van LTD was echter van voorbijgaande aard en door PID7 vertoonden plakjes van schijn- en r-mTBI-dieren gelijkwaardige LTD (figuur 3F), hoewel er een indicatie was van een lichte trend voor plakjes van r-mTBI-dieren om een toename van LTD te vertonen.

Figure 1
Figuur 1: De ACI-procedure die wordt gebruikt om r-mTBI te modelleren . (A) Een gemodificeerd gecontroleerd corticale botslichaam werd gebruikt om het hoofd van het dier snel 10 mm te verplaatsen met een snelheid van 6,0 m / s. (B,C) Aangepaste 3D-geprinte helm met een linker pariëtale cortex doelplaats. (D) De proefpersonen werden in een plastic bevestigingszak op een schuimplatform geplaatst, met de helm rond de bevestigingskegel geplaatst en zo geplaatst dat de doellocatie direct onder de botslichaampunt ligt. Afkortingen: ACHI = wakker gesloten-hoofdletsel; r-mTBI = herhaald licht traumatisch hersenletsel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Materialen en opstelling die nodig zijn voor de voorbereiding van de plak. (A) Gereedschappen die worden gebruikt voor het extraheren, monteren, snijden en incuberen van de hersenen: a) kweekschaal met filtreerpapier; b) diverse versnijdingsgereedschappen, waaronder een standaardschaar, een snijschaar, een tang, een rongeur en spatels; c) weefsellijm; d) compressiezuiger en monsterbuis; e) verenblad en bladhouder; f) koelblok; g) de incubatiekamer in plakjes. (B) Compresstome tissue slicer. (C) Plakjes broeden in een bad met kunstmatige hersenvocht dat continu wordt gevoed met 95% O 2/5% CO2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Acute stoornissen in synaptische plasticiteit bij juveniele mannelijke ratten als gevolg van r-mTBI met behulp van het ACHI-model . (A) De belangrijkste hippocampussen. De mediale perforante route bestaat uit de input van de entorhinale cortex in de gyrus dentate (blauw). Het mediale perforante pad voert synaps in op korrelcellen in de gyrus dentate (paars). (B) Brightfield fotomicrograaf van een hippocampale hersenschijf (4x vergroting), die de werkelijke plaatsing van een bipolaire stimulerende elektrode (links) en een glazen opname-elektrodepipet (rechts) in het mediale performante pad van de gyrus dentate laat zien. (C) Input-output plot (fEPSP-helling) voor verschillende simulatie-intensiteiten (10-300 μs) op PID1 en PID7 voor schijn- en r-mTBI-ratten. (D) Gepaarde pulsverhoudingen voor schijn- en r-mTBI-ratten (interpulsinterval van 50 ms). (E) Tijdsverloop van fEPSP-veranderingen voorafgaand aan en na toediening van een LTD-inductieparadigma in hippocampussegmenten verkregen van schijn- en r-mTBI-ratten bij PID1. (F) Tijdsverloop van fEPSP-veranderingen voorafgaand aan en na toediening van een LTD-inductieparadigma in hippocampussegmenten verkregen van schijn- en r-mTBI-ratten bij PID7. Afkortingen: ACHI = wakker gesloten-hoofdletsel; r-mTBI = herhaald licht traumatisch hersenletsel; PID = dag na de blessure; fEPSP = veld exciterende postsynaptische potentiaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Acute neurologische stoornissen bij juveniele mannelijke ratten als gevolg van r-mTBI met behulp van het ACHI-model. De ratten ondergingen acht ACHI-procedures met tussenpozen van 2 uur gedurende 1 dag, met een neurologisch beoordelingsprotocol uitgevoerd bij baseline en na elk letsel. Het NAP bestond uit vier taken: schrikreactie, ledemaatverlenging, balkloop en roterende balk. Elke taak werd gescoord uit 3, wat een totaal mogelijke score van 12 voor elke sessie opleverde. De gegevens gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. (*) geven p < 0,05 aan. Afkortingen: ACHI = wakker gesloten-hoofdletsel; r-mTBI = herhaald licht traumatisch hersenletsel; NAP = neurologisch beoordelingsprotocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende tabel S1: ACHI-procedure informatie over dieren en effecten. Afkorting: ACHI = awake closed-head injury. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel S2: Terughoudendheidsscore voor wakkere mTBI. Afkorting: mTBI = licht traumatisch hersenletsel. "Draai je om in terughoudendheid" verwijst naar de onderzoeker die het dier in de beugel plaatst, voordat de zak rond de staart wordt gesloten. Nadat de zak is gesloten, mag het dier zich niet kunnen omdraaien. Vocalisatie en kronkelen moeten worden gescoord nadat de zak is gesloten. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 1: Controlelijst voor kooibewaking. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 2: Pijnschaal en geavanceerde monitoring checklist. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het meeste preklinische onderzoek heeft modellen van mTBI gebruikt die de biomechanische krachten in de klinische populatie niet samenvatten. Hier wordt getoond hoe het ACHI-model kan worden gebruikt om r-mTBI's te induceren bij juveniele ratten. Dit gesloten model van r-mTBI heeft aanzienlijke voordelen ten opzichte van meer invasieve procedures. Ten eerste veroorzaakt de ACHI normaal gesproken geen schedelfracturen, hersenbloedingen of sterfgevallen, die allemaal contra-indicaties zouden zijn van een "milde" TBI in klinische populaties61. Ten tweede vereist de ACHI niet het gebruik van craniotomieën, wat belangrijk is omdat bekend is dat ze ontstekingsreacties veroorzaken die symptomologieën en neuropathologie kunnen verergeren67. Ten derde vereist de ACHI geen anesthesie. Dit is ook belangrijk, omdat anesthesie neuroprotectieve eigenschappen kan hebben en de synaptische plasticiteit kan aantasten, naast leer- en geheugenprestaties 48,49,50,51,68. Ten slotte kan de ACHI subtiele voorbijgaande veranderingen in de neurologische functie veroorzaken die onmiddellijk na het letsel kunnen worden beoordeeld.

Aangezien de ACHI normaal gesproken geen bewustzijnsverlies of apneu veroorzaakt, bootst dit model mTBI na in een aanzienlijk deel van de klinische populatie 69,70,71. Desondanks zorgde het ACHI-model voor een aanzienlijke vermindering van de NAP-scores. Deze vermindering hield aan bij herhaalde toedieningen van de ACHI-procedure, maar verergerde de sensomotorische stoornissen binnen de r-mTBI-groep niet. Dit geeft aan dat het ACHI-model een licht letsel induceert analoog aan dat waargenomen na hersenschudding of sub-hersenschudding hoofdinslagen in klinische populaties72,73. Een primair voordeel van het NAP is de detectie van subtiele gedragsstoornissen die worden gezien in het acute tijdsbestek na r-mTBI. Dit snelle onderzoek kan onderzoekers in staat stellen om ratten te categoriseren op basis van hun gedragsreacties. Het gebruik van robuustere gedragstests op subacute en chronische tijdstippen kan echter nodig zijn om motorische, cognitieve en affectieve symptomologieën te detecteren74,75,76. Het is belangrijk op te merken dat hoewel er geen verschillen waren in NAP-scores over de acht verwondingen, het gedrag van knaagdieren kan worden beïnvloed door veranderingen in de omgeving en bekendheid met de experimentator77,78. Ratten moeten kunnen wennen aan de procedurekamer voordat ze r-mTBI of schijnletsels toedienen. Daarnaast is het belangrijk dat één persoon verantwoordelijk is voor het beheer van de effecten om consistentie te helpen waarborgen.

Ondanks de eerder genoemde voordelen van het ACHI-model, is het niet zonder beperkingen. Ten eerste is het paradigma ontworpen om de cumulatie van effecten in een enkele sessie na te bootsen en geen repetitieve verwondingen na een herstelperiode. Na letsel bevinden de hersenen zich in een venster van cerebrale kwetsbaarheid dat zich uitstrekt van 1 tot 5 dagen na het letsel bij knaagdieren 15,79,80. Het ontvangen van acht blessures op een enkele dag laat niet toe dat acute en subacute letselcascades zich ontwikkelen. Afhankelijk van de onderzoeksvraag van belang, moet het letselparadigma daarom mogelijk worden aangepast binnen het venster van kwetsbaarheid. Ten tweede, hoewel het gunstig is om het gebruik van verdovingsmiddel te beperken, is een onbedoeld gevolg van het ACHI-model het blootstellen van de ratten aan terughoudendheidsstress. Het is aangetoond dat blootstelling aan acute en chronische stressoren een ontstekingsreactie kan initiëren, een verscheidenheid aan gedragingen kan beïnvloeden en de synaptische plasticiteit in de hippocampus kan veranderen81,82,83.

Het hierboven beschreven protocol biedt een duidelijke methode om hoogwaardige transversale hippocampusplakken te produceren van r-mTBI-toegediende dieren met het ASA-model. Bovendien maakt het protocol stabiele elektrofysiologische opnames mogelijk en toont het aan dat de hippocampus nog steeds in staat is om synaptische plasticiteit te vertonen na r-mTBI, hoewel er voorbijgaande verstoringen kunnen zijn. Bij alle elektrofysiologische opnames is de gezondheid van de plak van het grootste belang voor de mogelijkheid om geschikte fEPSP's op te nemen. Om hersenweefsel te behouden, is het voorafgaand aan het snijden noodzakelijk dat de hersenen ijskoud blijven in gecarbomeerde aCSF. Het verwijderen en snijden van de hersenen moet snel gebeuren, maar niet als dit ten koste gaat van de zorg. Dit protocol op jonge dieren maakt gebruik van aCSF als snijoplossing, maar afhankelijk van de leeftijd van het dier kunnen beschermende snijoplossingen (zoals choline-, sucrose-, NMDG- of glycerol-gebaseerde oplossingen) nodig zijn84,85,86.

Veldelektrofysiologische opnames stellen onderzoekers in staat om de synaptische plasticiteit van de hippocampus te meten. Er zijn echter een aantal beperkingen aan de techniek. Het proces van het snijden van de hersenen heeft aangetoond dat het veranderingen in wervelkolomnummers87 veroorzaakt, wat de synaptische plasticiteit zou kunnen beïnvloeden. Het gebruik van in vivo opnamen zou paden behouden en het mogelijk maken om synaptische plasticiteit te meten bij verdoofde of levende dieren88. Bovendien onderzoekt het gebruik van veldopnamen de eigenschappen van groepen neuronen, maar informeert het niet over veranderingen in individuele neuronen. Het gebruik van whole-cell patch-clamp opnames kan tijdelijk gedetailleerde informatie geven over neuronale eigenschappen als reactie op farmacologische of optogenetische manipulaties89. Bovendien zou de combinatie van elektrofysiologische opnames met complementaire technieken, zoals calciumbeeldvorming, Western blotting, immunohistochemie of elektronenmicroscopie, onderzoekers in staat stellen inzicht te krijgen in de werkingsmechanismen.

Cognitieve tekorten worden vaak gemeld na r-mTBI en het huidige protocol kan helpen bij het onderzoeken van enkele van de onderliggende fysiologische processen die verband houden met deze tekorten. In het bijzonder opent de milde aard van de ACHI-procedure de mogelijkheid om veranderingen in de synaptische fysiologie gedurende de levensduur van dieren die r-mTBI hebben opgelopen, te onderzoeken. Het ACHI-model lijkt een ecologisch geldig model van mTBI te zijn dat kan worden gebruikt om r-mTBI te bestuderen. Voorbereidende studies met behulp van het ACHI-model hebben acute neurologische stoornissen aangetoond zonder openlijke structurele schade, waarbij één, vier en acht herhaalde letselparadigma's werden toegediend61,90. Toekomstige studies zullen onderzoeken hoe are-mTBI synaptische plasticiteit kan beïnvloeden tijdens ontwikkelingsperioden en in de ouder wordende hersenen. Door de pathofysiologie van mTBI en r-mTBI voor synaptische functie beter te begrijpen, is de hoop om potentiële therapeutische interventies beter te sturen om de cognitieve functie te helpen verminderen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Acknowledgments

We danken alle leden van het Christie Laboratory aan de Universiteit van Victoria, vroeger en nu, voor hun bijdragen aan de ontwikkeling van dit protocol. Dit project werd ondersteund met fondsen van de Canadian Institutes for Health Research (CIHR: FRN 175042) en NSERC (RGPIN-06104-2019). De figuur 1 schedelafbeelding is gemaakt met BioRender.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D-printed helment  Designed and constructed by Christie laboratory (See Specifications in Christie et al. (2019), Current Protocols in Neuroscience) 
Agarose  Fisher Scientific (BioReagents) BP160500
Anesthesia chamber Home Made N/A Plexiglass Container
Automatic Heater Controller Warner Electric TC-324B
Axon Digidata Molecular Devices 1440A Low-noise Data Acquisition System
Balance beam  Can be constructed or purchased (100 cm long x 2 cm wide x 0.75 cm thick)
Calcium Chloride Bio Basic Canada Inc.  CD0050 For aCSF
Camera Dage MTI NC-70
Carbogen tank Praxair MM OXCD5C-K Carbon Dioxide 5%, Oxygen 95%
Clampex Software Molecular Devices Clampex 10.5 Version
Compresstome Vibrating Microtome Precisionary VF 310-0Z
Concentric Bipolar Electrode FHC Inc. CBAPC75
Dextrose (D-Glucose) Fisher Scientific (Chemical) D16-3 aCSF
Digital Stimulus Isolation Amplifier   Getting Instruments, Inc.  Model 4D
Disodium Phosphate Fisher Scientific (Chemical) S373-500 PBS
Dissection Tools
Feather Double Edge Blade Electron Microscopy Sciences 72002-10
Filter Paper Whatman 1 1001-055
Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter Instrument P-1000
Hair Claw Clip Can be obtained from any department store
Home and Recovery Cages Normal rat cages from animal care unit.
Hum Bug Noise Eliminator Quest Scientific  726300
Isoflurane USP Fresenius Kabi CP0406V2
Isotemp 215 Digital Water Bath Fisher Scientific  15-462-15
Leica Impact One CCI unit Leica Biosystems Tip is modified to hold 7mm rubber impact tip
Long-Evans rats, male Charles River Laboratories (St. Constant, PQ)
Low-Density Foam Pad 3" polyurethane foam sheet 
Magnesium Chloride Fisher Scientific (Chemical) M33-500 aCSF
Male Long Evans Rats Charles River Laboratories Animals ordered from Charles River Laboratories, or pups bred at the University of Victoria
MultiClamp 700B Amplifier Molecular Devices Model 700B
pH Test Strips VWR Chemicals BDH BDH83931.601
Potassium Chloride Fisher Scientific (Chemical) P217-500 aCSF, PBS
Potassium Phosphate Sigma P9791-500G PBS
Push Button Controller Siskiyou Corporation  MC1000e Four-axis Closed Loop Controller Push-Button
Sample Discs ELITechGroup SS-033 For use with Vapor Pressure Osmometer
Small towel
Sodium Bicarbonate Fisher Scientific (Chemical) S233-500 aCSF
Sodium Chloride Fisher Scientific (Chemical) S271-3 For aCSF, PBS
Sodium Phosphate Fisher Scientific (Chemical) S369-500 aCSF
Soft Plastic Restraint Cones Braintree Scientific model DC-200
Stopwatch Many lab members use their iPhone for this
Table or large cart with raised edges  For NAP and ACHI
Thin Wall Borosilicate Glass (with Filament) Sutter Instrument BF150-110-10 Outside diameter: 1.5 mm; Inside diameter: 1.10 mm; Length: 10 cm
Upright Microscope Olympus Olympus BX5OWI 5x MPlan 0.10 NA Objective lens
Vapor Pressure Osmometer Vapro Model 5600 aCSF should be 300-310 mOSM
Vetbond Tissue Adhesive 3M 1469SB
Vibraplane Vibration Isolation Table Kinetic Systems 9101-01-45

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fu, T. S., Jing, R., McFaull, S. R., Cusimano, M. D. Health & economic burden of traumatic brain injury in the emergency department. Canadian Journal of Neurological Sciences. 43 (2), 238-247 (2016).
  2. Chen, C., Peng, J., Sribnick, E., Zhu, M., Xiang, H. Trend of age-adjusted rates of pediatric traumatic brain injury in US emergency departments from 2006 to 2013. International journal of environmental research and public health. 15 (6), 1171 (2018).
  3. Prins, M., Greco, T., Alexander, D., Giza, C. C. The pathophysiology of traumatic brain injury at a glance. Disease Models & Mechanisms. 6 (6), 1307-1315 (2013).
  4. Mayer, A. R., Quinn, D. K., Master, C. L. The spectrum of mild traumatic brain injury: a review. Neurology. 89 (6), 623-632 (2017).
  5. Kara, S., et al. Less than half of patients recover within 2 weeks of injury after a sports-related mild traumatic brain injury: a 2-year prospective study. Clinical Journal of Sport Medicine. 30 (2), 96-101 (2020).
  6. Chung, A. W., Mannix, R., Feldman, H. A., Grant, P. E., Im, K. Longitudinal structural connectomic and rich-club analysis in adolescent mTBI reveals persistent, distributed brain alterations acutely through to one year post-injury. arXiv. , (2019).
  7. Crisco, J. J., et al. Frequency and location of head impact exposures in individual collegiate football players. Journal of Athletic Training. 45 (6), 549-559 (2010).
  8. Wilcox, B. J., et al. Head impact exposure in male and female collegiate ice hockey players. Journal of Biomechanics. 47 (1), 109-114 (2014).
  9. Daniel, R. W., Rowson, S., Duma, S. M. Head impact exposure in youth football. Annals of Biomedical Engineering. 40 (4), 976-981 (2012).
  10. Snowden, T., et al. Heading in the right direction: a critical review of studies examining the effects of heading in soccer players. Journal of Neurotrauma. 38 (2), 169-188 (2021).
  11. Zemek, R. L., et al. Annual and seasonal trends in ambulatory visits for pediatric concussion in Ontario between 2003 and 2013. The Journal of Pediatrics. 181, 222-228 (2017).
  12. Zhang, A. L., Sing, D. C., Rugg, C. M., Feeley, B. T., Senter, C. The rise of concussions in the adolescent population. Orthopaedic Journal of Sports Medicine. 4 (8), (2016).
  13. Broglio, S. P., Eckner, J. T., Paulson, H. L., Kutcher, J. S. Cognitive decline and aging: the role of concussive and subconcussive impacts. Exercise and Sport Sciences Reviews. 40 (3), 138 (2012).
  14. Greco, T., Ferguson, L., Giza, C., Prins, M. Mechanisms underlying vulnerabilities after repeat mild traumatic brain injuries. Experimental Neurology. 317, 206-213 (2019).
  15. Longhi, L., et al. Temporal window of vulnerability to repetitive experimental concussive brain injury. Neurosurgery. 56 (2), 364-374 (2005).
  16. Snowden, T. M., Hinde, A. K., Reid, H. M., Christie, B. R. Does mild traumatic brain injury increase the risk for dementia? A systematic review and meta-analysis. Journal of Alzheimer's Disease. 78 (2), 757-775 (2020).
  17. Guskiewicz, K. M., et al. Association between recurrent concussion and late-life cognitive impairment in retired professional football players. Neurosurgery. 57 (4), 719-726 (2005).
  18. McCradden, M. D., Cusimano, M. D. Staying true to Rowan's Law: how changing sport culture can realize the goal of the legislation. Canadian Journal of Public Health. 110 (2), 165-168 (2019).
  19. Carson, J. D., et al. Premature return to play and return to learn after a sport-related concussion: physician's chart review. Canadian Family Physician. 60 (6), 310-315 (2014).
  20. McClincy, M. P., Lovell, M. R., Pardini, J., Collins, M. W., Spore, M. K. Recovery from sports concussion in high school and collegiate athletes. Brain Injury. 20 (1), 33-39 (2006).
  21. Covassin, T., Savage, J. L., Bretzin, A. C., Fox, M. E. Sex differences in sport-related concussion long-term outcomes. International Journal of Psychophysiology. 132, 9-13 (2018).
  22. Frommer, L., et al. Sex differences in concussion symptoms of high school athletes. Journal of Athletic Training. 46 (1), 76-84 (2011).
  23. Wright, D., O'Brien, T., Shultz, S. R., Mychasiuk, R. Sex matters: Repetitive mild traumatic brain injury in adolescent rats. Annals of Clinical and Translational Neurology. 4 (9), 640-654 (2017).
  24. Stone, S., Lee, B., Garrison, J. C., Blueitt, D., Creed, K. Sex differences in time to return-to-play progression after sport-related concussion. Sports Health. 9 (1), 41-44 (2017).
  25. Cunningham, J., Broglio, S. P., O'Grady, M., Wilson, F. History of sport-related concussion and long-term clinical cognitive health outcomes in retired athletes: a systematic review. Journal of Athletic Training. 55 (2), 132-158 (2020).
  26. Montenigro, P. H., et al. Cumulative head impact exposure predicts later-life depression, apathy, executive dysfunction, and cognitive impairment in former high school and college football players. Journal of Neurotrauma. 34 (2), 328-340 (2017).
  27. Lee, E. B., et al. Chronic traumatic encephalopathy is a common co-morbidity, but less frequent primary dementia in former soccer and rugby players. Acta Neuropathologica. 138 (3), 389-399 (2019).
  28. Di Virgilio, T. G., et al. Evidence for acute electrophysiological and cognitive changes following routine soccer heading. EBioMedicine. 13, 66-71 (2016).
  29. Cherry, J. D., et al. Microglial neuroinflammation contributes to tau accumulation in chronic traumatic encephalopathy. Acta Neuropathologica Communications. 4 (1), 1-9 (2016).
  30. Smith, D. H., Johnson, V. E., Stewart, W. Chronic neuropathologies of single and repetitive TBI: substrates of dementia. Nature Reviews Neurology. 9 (4), 211 (2013).
  31. Coughlin, J. M., et al. Neuroinflammation and brain atrophy in former NFL players: an in vivo multimodal imaging pilot study. Neurobiology of Disease. 74, 58-65 (2015).
  32. Wu, L., et al. Repetitive mild closed head injury in adolescent mice is associated with impaired proteostasis, neuroinflammation, and tauopathy. Journal of Neuroscience. 42 (12), 2418-2432 (2022).
  33. Shultz, S. R., et al. The potential for animal models to provide insight into mild traumatic brain injury: translational challenges and strategies. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 76, 396-414 (2017).
  34. Sharp, D. J., Jenkins, P. O. Concussion is confusing us all. Practical Neurology. 15 (3), 172-186 (2015).
  35. Chen, Y., Huang, W., Constantini, S. The differences between blast-induced and sports-related brain injuries. Frontiers in Neurology. 4, 119 (2013).
  36. Collins, M. W., Kontos, A. P., Reynolds, E., Murawski, C. D., Fu, F. H. A comprehensive, targeted approach to the clinical care of athletes following sport-related concussion. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 22 (2), 235-246 (2014).
  37. Hiploylee, C., et al. Longitudinal study of postconcussion syndrome: not everyone recovers. Journal of Neurotrauma. 34 (8), 1511-1523 (2017).
  38. Rabinowitz, A. R., Fisher, A. J. Person-specific methods for characterizing the course and temporal dynamics of concussion symptomatology: a pilot study. Scientific Reports. 10 (1), 1-9 (2020).
  39. Shultz, S. R., et al. Tibial fracture exacerbates traumatic brain injury outcomes and neuroinflammation in a novel mouse model of multitrauma. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35 (8), 1339-1347 (2015).
  40. McDonald, S. J., Sun, M., Agoston, D. V., Shultz, S. R. The effect of concomitant peripheral injury on traumatic brain injury pathobiology and outcome. Journal of Neuroinflammation. 13 (1), 1-14 (2016).
  41. Statler, K. D., et al. Isoflurane exerts neuroprotective actions at or near the time of severe traumatic brain injury. Brain Research. 1076 (1), 216-224 (2006).
  42. Rowe, R. K., et al. Using anesthetics and analgesics in experimental traumatic brain injury. Lab Animal. 42 (8), 286-291 (2013).
  43. Luh, C., et al. Influence of a brief episode of anesthesia during the induction of experimental brain trauma on secondary brain damage and inflammation. PLoS One. 6 (5), 19948 (2011).
  44. Madry, C., et al. Microglial ramification, surveillance, and interleukin-1β release are regulated by the two-pore domain K+ channel THIK-1. Neuron. 97 (2), 299-312 (2018).
  45. Patel, P. M., Drummond, J. C., Cole, D. J., Goskowicz, R. L. Isoflurane reduces ischemia-induced glutamate release in rats subjected to forebrain ischemia. The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 82 (4), 996-1003 (1995).
  46. Gray, J. J., Bickler, P. E., Fahlman, C. S., Zhan, X., Schuyler, J. A. Isoflurane neuroprotection in hypoxic hippocampal slice cultures involves increases in intracellular Ca2+ and mitogen-activated protein kinases. The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 102 (3), 606-615 (2005).
  47. Flower, O., Hellings, S. Sedation in traumatic brain injury. Emergency Medicine International. 2012, 637171 (2012).
  48. Wagner, M., Ryu, Y. K., Smith, S. C., Mintz, C. D. Effects of anesthetics on brain circuit formation. Journal of Neurosurgical Anesthesiology. 26 (4), 358 (2014).
  49. Leikas, J. V., et al. Brief isoflurane anesthesia regulates striatal AKT-GSK3β signaling and ameliorates motor deficits in a rat model of early-stage Parkinson′ s disease. Journal of Neurochemistry. 142 (3), 456-463 (2017).
  50. Turek, Z., Sykora, R., Matejovic, M., Cerny, V. Anesthesia and the microcirculation. in Seminars in Cardiothoracic and Vascular Anesthesia. , Sage CA. Los Angeles, CA. 249-258 (2009).
  51. Yang, S., et al. Anesthesia and surgery impair blood-brain barrier and cognitive function in mice. Frontiers in Immunology. 8, 902 (2017).
  52. Bodnar, C. N., Roberts, K. N., Higgins, E. K., Bachstetter, A. D. A systematic review of closed head injury models of mild traumatic brain injury in mice and rats. Journal of Neurotrauma. 36 (11), 1683-1706 (2019).
  53. Mannix, R., et al. Adolescent mice demonstrate a distinct pattern of injury after repetitive mild traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 34 (2), 495-504 (2017).
  54. Viano, D. C., Hamberger, A., Bolouri, H., Säljö, A. Evaluation of three animal models for concussion and serious brain injury. Annals of Biomedical Engineering. 40 (1), 213-226 (2012).
  55. Mychasiuk, R., Hehar, H., Candy, S., Ma, I., Esser, M. J. The direction of the acceleration and rotational forces associated with mild traumatic brain injury in rodents effect behavioural and molecular outcomes. Journal of Neuroscience Methods. 257, 168-178 (2016).
  56. Christie, B. R., et al. A rapid neurological assessment protocol for repeated mild traumatic brain injury in awake rats. Current Protocols in Neuroscience. 89 (1), 80 (2019).
  57. Buchanan, F. F., Myles, P. S., Leslie, K., Forbes, A., Cicuttini, F. Gender and recovery after general anesthesia combined with neuromuscular blocking drugs. Anesthesia & Analgesia. 102 (1), 291-297 (2006).
  58. Zhang, L., Gurao, M., Yang, K. H., King, A. I. Material characterization and computer model simulation of low density polyurethane foam used in a rodent traumatic brain injury model. Journal of Neuroscience Methods. 198 (1), 93-98 (2011).
  59. Kikinis, Z., et al. Diffusion imaging of mild traumatic brain injury in the impact accelerated rodent model: A pilot study. Brain Injury. 31 (10), 1376-1381 (2017).
  60. Talty, C. -E., Norris, C., VandeVord, P. Defining experimental variability in actuator-driven closed head impact in rats. Annals of Biomedical Engineering. 50 (10), 1187-1202 (2022).
  61. Meconi, A., et al. Repeated mild traumatic brain injury can cause acute neurologic impairment without overt structural damage in juvenile rats. Plos One. 13 (5), (2018).
  62. Zilles, K. The Cortex of the Rat: a Stereotaxic Atlas. , Springer Science & Business Media. (2012).
  63. Fontaine, C. J., et al. Impaired bidirectional synaptic plasticity in juvenile offspring following prenatal ethanol exposure. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 43 (10), 2153-2166 (2019).
  64. Fontaine, C. J., et al. Endocannabinoid receptors contribute significantly to multiple forms of long-term depression in the rat dentate gyrus. Learning & Memory. 27 (9), 380-389 (2020).
  65. Grafe, E. L., Wade, M. M., Hodson, C. E., Thomas, J. D., Christie, B. R. Postnatal choline supplementation rescues deficits in synaptic plasticity following prenatal ethanol exposure. Nutrients. 14 (10), 2004 (2022).
  66. Peñasco, S., et al. Intermittent ethanol exposure during adolescence impairs cannabinoid type 1 receptor-dependent long-term depression and recognition memory in adult mice. Neuropsychopharmacology. 45 (2), 309-318 (2020).
  67. Cole, J. T., et al. Craniotomy: true sham for traumatic brain injury, or a sham of a sham. Journal of Neurotrauma. 28 (3), 359-369 (2011).
  68. Long, R. P., et al. Repeated isoflurane exposures impair long-term potentiation and increase basal GABAergic activity in the basolateral amygdala. Neural Plasticity. 2016, (2016).
  69. Meehan, W. P., Mannix, R. C., O'Brien, M. J., Collins, M. W. The prevalence of undiagnosed concussions in athletes. Clinical Journal of Sport Medicine. 23 (5), 339 (2013).
  70. Moore, R. D., Lepine, J., Ellemberg, D. The independent influence of concussive and sub-concussive impacts on soccer players' neurophysiological and neuropsychological function. International Journal of Psychophysiology. 112, 22-30 (2017).
  71. Peltonen, K., et al. On-field signs of concussion predict deficits in cognitive functioning: Loss of consciousness, amnesia, and vacant look. Translational Sports Medicine. 3 (6), 565-573 (2020).
  72. Kontos, A. P., Sufrinko, A., Sandel, N., Emami, K., Collins, M. W. Sport-related concussion clinical profiles: clinical characteristics, targeted treatments, and preliminary evidence. Current Sports Medicine Reports. 18 (3), 82-92 (2019).
  73. Eisenberg, M. A., Meehan, W. P., Mannix, R. Duration and course of post-concussive symptoms. Pediatrics. 133 (6), 999-1006 (2014).
  74. Mychasiuk, R., Farran, A., Esser, M. J. Assessment of an experimental rodent model of pediatric mild traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 31 (8), 749-757 (2014).
  75. Malkesman, O., Tucker, L. B., Ozl, J., McCabe, J. T. Traumatic brain injury-modeling neuropsychiatric symptoms in rodents. Frontiers in Neurology. 4, 157 (2013).
  76. Shultz, S. R., MacFabe, D. F., Foley, K. A., Taylor, R., Cain, D. P. A single mild fluid percussion injury induces short-term behavioral and neuropathological changes in the Long-Evans rat: Support for an animal model of concussion. Behavioural Brain Research. 224 (2), 326-335 (2011).
  77. Sorge, R. E., et al. Olfactory exposure to males, including men, causes stress and related analgesia in rodents. Nature Methods. 11 (6), 629-632 (2014).
  78. van Driel, K. S., Talling, J. C. Familiarity increases consistency in animal tests. Behavioural Brain Research. 159 (2), 243-245 (2005).
  79. Mouzon, B. C., et al. Chronic neuropathological and neurobehavioral changes in a repetitive mild traumatic brain injury model. Annals of Neurology. 75 (2), 241-254 (2014).
  80. Mannix, R., et al. Clinical correlates in an experimental model of repetitive mild brain injury. Annals of Neurology. 74 (1), 65-75 (2013).
  81. Bekhbat, M., et al. Chronic adolescent stress sex-specifically alters central and peripheral neuro-immune reactivity in rats. Brain, Behavior, and Immunity. 76, 248-257 (2019).
  82. Pyter, L. M., Kelly, S. D., Harrell, C. S., Neigh, G. N. Sex differences in the effects of adolescent stress on adult brain inflammatory markers in rats. Brain, Behavior, and Immunity. 30, 88-94 (2013).
  83. MacDougall, M. J., Howland, J. G. Acute stress, but not corticosterone, disrupts short-and long-term synaptic plasticity in rat dorsal subiculum via glucocorticoid receptor activation. Cerebral Cortex. 23 (11), 2611-2619 (2013).
  84. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Patch-Clamp Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. 221-242 (2014).
  85. Ting, J. T., Feng, G. Development of transgenic animals for optogenetic manipulation of mammalian nervous system function: progress and prospects for behavioral neuroscience. Behavioural Brain Research. 255, 3-18 (2013).
  86. Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 118-125 (2008).
  87. Trivino-Paredes, J. S., Nahirney, P. C., Pinar, C., Grandes, P., Christie, B. R. Acute slice preparation for electrophysiology increases spine numbers equivalently in the male and female juvenile hippocampus: a DiI labeling study. Journal of Neurophysiology. 122 (3), 958-969 (2019).
  88. Bowden, J. B., Abraham, W. C., Harris, K. M. Differential effects of strain, circadian cycle, and stimulation pattern on LTP and concurrent LTD in the dentate gyrus of freely moving rats. Hippocampus. 22 (6), 1363-1370 (2012).
  89. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024 (2016).
  90. Pham, L., et al. Mild closed-head injury in conscious rats causes transient neurobehavioral and glial disturbances: a novel experimental model of concussion. Journal of Neurotrauma. 36 (14), 2260-2271 (2019).

Tags

Neurowetenschappen Nummer 191
Het beoordelen van veranderingen in synaptische plasticiteit met behulp van een wakker gesloten-hoofdletselmodel van mild traumatisch hersenletsel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Christie, B. R., Gross, A.,… More

Christie, B. R., Gross, A., Willoughby, A., Grafe, E., Brand, J., Bosdachin, E., Reid, H. M. O., Acosta, C., Eyolfson, E. Assessing Changes in Synaptic Plasticity Using an Awake Closed-Head Injury Model of Mild Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (191), e64592, doi:10.3791/64592 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter