Summary
O presente protocolo estabelece e caracteriza um modelo de xenoenxerto derivado do paciente (PDX) de carcinoma anaplásico de tireoide (ATC) e carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço (CECP), uma vez que os modelos PDX estão rapidamente se tornando o padrão no campo da oncologia translacional.
Abstract
Os modelos de xenoenxerto derivado do paciente (PDX) preservam fielmente as características histológicas e genéticas do tumor primário e mantêm sua heterogeneidade. Os resultados farmacodinâmicos baseados em modelos PDX são altamente correlacionados com a prática clínica. O carcinoma anaplásico de tireoide (ATC) é o subtipo mais maligno de câncer de tireoide, com forte invasividade, prognóstico ruim e tratamento limitado. Embora a taxa de incidência de ATC seja responsável por apenas 2%-5% do câncer de tireoide, sua taxa de mortalidade é tão alta quanto 15%-50%. O carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço (CECP) é uma das neoplasias malignas mais comuns de cabeça e pescoço, com mais de 600.000 novos casos em todo o mundo a cada ano. Neste trabalho, são apresentados protocolos detalhados para estabelecer modelos PDX de ATC e CECP. Neste trabalho, os principais fatores que influenciam a taxa de sucesso de construção do modelo foram analisados, e as características histopatológicas foram comparadas entre o modelo PDX e o tumor primário. Além disso, a relevância clínica do modelo foi validada pela avaliação da eficácia terapêutica in vivo de fármacos representativos de uso clínico nos modelos PDX construídos com sucesso.
Introduction
O modelo PDX é um modelo animal no qual o tecido tumoral humano é transplantado em camundongos imunodeficientes e cresce no ambiente fornecido pelos camundongos1. Os modelos tradicionais de linhagens celulares tumorais sofrem de várias desvantagens, como a falta de heterogeneidade, a incapacidade de reter o microambiente tumoral, a vulnerabilidade a variações genéticas durante repetidas passagens in vitro e a pobre aplicaçãoclínica2,3. As principais desvantagens dos modelos animais geneticamente modificados são a perda potencial das características genômicas dos tumores humanos, a introdução de novas mutações desconhecidas e a dificuldade em identificar o grau de homologia entre tumores de camundongos e tumoreshumanos4. Além disso, a preparação de modelos animais geneticamente modificados é cara, demorada e relativamente ineficiente4.
O modelo PDX tem muitas vantagens sobre outros modelos tumorais em termos de refletir a heterogeneidade tumoral. Do ponto de vista histopatológico, embora a contraparte do camundongo substitua o estroma humano ao longo do tempo, o modelo PDX preserva bem a estrutura morfológica do tumor primário. Além disso, o modelo PDX conserva a identidade metabolômica do tumor primário por pelo menos quatro gerações e reflete melhor as complexas inter-relações entre as células tumorais e seu microambiente, tornando-o único na simulação do crescimento, metástase, angiogênese e imunossupressão do tecido tumoralhumano5,6,7. Em nível celular e molecular, o modelo PDX reflete com precisão a heterogeneidade inter e intratumoral de tumores humanos, bem como as características fenotípicas e moleculares do câncer original, incluindo padrões de expressão gênica, status de mutação, número de cópias, metilação e proteômica do DNA 8,9. Modelos PDX com passagens diferentes têm a mesma sensibilidade à terapia medicamentosa, indicando que a expressão gênica de modelos PDX é altamente estável10,11. Estudos têm demonstrado excelente correlação entre a resposta do modelo PDX a um fármaco e as respostas clínicas dos pacientes a esse fármaco12,13. Portanto, o modelo PDX emergiu como um poderoso modelo de pesquisa pré-clínica e translacional, particularmente para triagem de drogas e predição de prognóstico clínico.
O câncer de tireoide é um tumor maligno comum do sistema endócrino e é uma neoplasia maligna humana que tem mostrado um rápido aumento na incidência nos últimosanos14. O carcinoma anaplásico de tireoide (ATC) é o câncer mais maligno da tireoide, com sobrevida mediana de apenas 4,8meses15. Embora apenas uma minoria dos pacientes com câncer de tireoide seja diagnosticada com ATC a cada ano na China, a taxa de mortalidade é próxima de 100%16,17,18. A ATC geralmente cresce rapidamente e invade os tecidos adjacentes do pescoço, bem como os linfonodos cervicais, e cerca de metade dos pacientes apresenta metástases àdistância19,20. O carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço (CECP) é o sexto câncer mais comum no mundo e uma das principais causas de morte por câncer, estimando-se que 600.000 pessoas sofram de CEC de cabeça e pescoço a cada ano21,22,23. O CEC de cabeça e pescoço inclui um grande número de tumores, incluindo nariz, seios da face, boca, amígdalas, faringe e laringe24. ATC e CEC de cabeça e pescoço são duas das principais neoplasias malignas de cabeça e pescoço. Para facilitar o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos e tratamentos personalizados, é necessário desenvolver modelos animais pré-clínicos robustos e avançados, como os modelos PDX de ATC e HNSCC.
Este artigo apresenta métodos detalhados para estabelecer o modelo PDX subcutâneo de ATC e CEC de cabeça e pescoço, analisa os principais fatores que afetam a taxa de tomada tumoral na construção do modelo e compara as características histopatológicas entre o modelo PDX e o tumor primário. Enquanto isso, neste trabalho, testes farmacodinâmicos in vivo foram realizados utilizando os modelos PDX construídos com sucesso para validar sua relevância clínica.
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Protocol
Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes e protocolos da Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do West China Hospital, Sichuan University. Camundongos imunodeficientes NOD-SCID com idade entre 4-6 semanas de idade (de ambos os sexos) e camundongos fêmeas Balb/c nude com idade entre 4-6 semanas foram usados para o presente estudo. Os animais foram obtidos de fonte comercial (ver Tabela de Materiais). O comitê de ética do West China Hospital autorizou o estudo com seres humanos (protocolo número 2020353). Cada paciente assinou o termo de consentimento livre e esclarecido.
1. Preparação experimental
- Arrume lâminas descartáveis, tesouras e pinças esterilizadas e outros instrumentos necessários para o transplante de tumor, coloque-os na bancada ultralimpa e irradie-os com luz ultravioleta com antecedência.
- Preparar soro fisiológico estéril e placas de Petri para uso durante o teste.
2. Aquisição e transporte de tecido tumoral fresco
- Obter amostras tumorais frescas (geralmente maiores que 5 mm x 5 mm de tamanho) da sala de cirurgia e colocá-las em um tubo centrífugo de 15 mL ou 50 mL contendo solução HTK estéril (ver Tabela de Materiais) ou soro fisiológico. Rotule os tubos de centrífuga.
OBS: Amostras tumorais frescas foram obtidas por remoção cirúrgica ou punção de pacientes com CTA ou CEC de cabeça e pescoço. - Coloque os tubos da centrífuga em uma caixa de gelo preparada com antecedência.
NOTA: Durante este tempo, o operador de transplante deve preparar os itens necessários para o transplante (ver Tabela de Materiais). - Certifique-se de que o tempo entre a coleta da amostra e o transporte para o laboratório para a construção do PDX não exceda 2 h. Durante o transporte, envolva os tubos que contêm os tecidos com uma mistura de água gelada ou bolsas de gelo para preservar a atividade do tecido.
3. Transplante de tumor
- Assim que os tecidos tumorais chegarem ao laboratório, registre-os e renumere-os.
OBS: Para o presente estudo, as informações dos pacientes foram mantidas em absoluto sigilo. As demais etapas do procedimento foram realizadas em laboratório de nível de biossegurança 2 (BSL-2). Ao entrar no laboratório, recomenda-se o uso de um smock sobre a roupa de trabalho ou de proteção, um chapéu e uma máscara. O tratamento do tecido tumoral é realizado em um gabinete de biossegurança. - Desinfetar os tubos de centrífuga contendo os tecidos tumorais com álcool 75% e colocá-los na mesa de operação. Transfira os tecidos tumorais para placas de Petri de 6 cm preenchidas com soro fisiológico utilizando pinça oftálmica esterilizada. Em seguida, corte-os em pequenos pedaços de cerca de 2 mm x 2 mm e 3 mm x 3 mm usando uma lâmina.
- Transfira os pedaços de tecidos tumorais para uma placa de Petri de 6 cm contendo a quantidade adequada de soro fisiológico, envolva a placa com o filme selante, coloque-a em uma caixa de gelo e leve-a para a sala de animais específica livre de patógenos (FPS) juntamente com os instrumentos necessários (uma tesoura, pinça e agulhas de inoculação).
- Prepare o animal seguindo os passos abaixo.
- Remova os pelos no tórax lateral direito de camundongos imunodeficientes NOD-SCID fêmeas ou machos de 4-6 semanas de idade e desinfete a pele com álcool a 75%. Anestesiar os ratos através de uma injeção intraperitoneal de 80 mg/kg de quetamina e 10 mg/kg de xilazina (ver Tabela de Materiais) e manchar os olhos com pomada veterinária para evitar o ressecamento. Confirme a profundidade da anestesia através da perda do reflexo pedal.
- Faça uma incisão de 2 mm com tesoura através da pele no meio do tórax lateral direito de camundongos.
- Pegue um pedaço de tumor da placa de Petri e coloque-o na agulha do trocarte de 2,4 mm x 2,0 mm (ver Tabela de Materiais) com pinças.
- Segure o rato, aperte a pele no local da punção, use o trocarte contendo as peças do tumor para inserir o tumor através da incisão inicial de 2 mm na pele, mova-se para a parte de trás do ombro e empurre o núcleo do trocarte.
- Certifique-se de que o pedaço do tumor seja empurrado para fora e seja deixado no seio transicional formado pela punção do trocarte e, em seguida, puxe o trocarte.
- Se o tumor se mover com a agulha quando for retirado, use o trocarte para resetá-lo e suturar a incisão.
OBS: Neste estudo, cada camundongo foi inoculado nos membros dorsais anteriores e posteriores. Um a três camundongos foram inoculados por amostra tumoral de cada paciente com base no tamanho do tumor.
4. Preservação, fixação e congelamento de tecidos tumorais
OBS: Os demais tecidos tumorais foram utilizados para preservação, fixação e congelamento de DNA/RNA/proteínas, respectivamente.
- Remova o soro fisiológico da superfície do tumor com uma gaze estéril antes de colocá-lo no tubo de criopreservação para garantir que a superfície do tumor não esteja excessivamente úmida.
- Colocar quatro a seis pedaços de tecido tumoral de 2 mm x 2 mm em um tubo de criopreservação de células de 2 mL, adicionar 1 mL de solução de criopreservação composta de soro fetal bovino (FBS) a 90% e dimetilsulfóxido (DMSO) a 10% no tubo, colocar o tubo em uma caixa de resfriamento gradiente, congelá-lo a -80 °C durante a noite e, finalmente, transferi-lo para nitrogênio líquido.
- Colocar os blocos de tecido tumoral de 3 mm x 3 mm em formalina tamponada a 10% para fixação do tecido para exame anatomopatológico.
- Coloque o bloco de tecido de 3 mm x 3 mm em um tubo de criopreservação de células de 2 mL, congele-o rapidamente em nitrogênio líquido e, em seguida, transfira para um refrigerador de -80 °C para extração de DNA/RNA e proteína.
- Coletar as informações clínicas dos pacientes, como história tabágica, tamanho do tumor, diferenciação, subtipo patológico, grau de câncer, estádio do câncer, metástase à distância, origem, história clínica, imunohistoquímica, infecção pelo papilomavírus humano (HPV) em pacientes com CEC de cabeça e pescoço e medicação de tratamento.
5. Passaging, criopreserva e ressuscitação de tumores modelo PDX
- Medir o comprimento e a largura dos tumores subcutâneos em camundongos usando paquímetro vernier uma vez por semana e calcular o volume tumoral de acordo com a fórmula: volume tumoral = 0,5 × comprimento × largura2. Desenhar a curva de crescimento do tumor.
- Quando o tumor PDX atingir 2.000 mm3, passe-o para a próxima geração de camundongos e realize o retransplante do tumor. Realizar a preparação dos instrumentos seguindo o passo 4.
- Eutanásia dos camundongos por deslocamento cervical após anestesia com 80 mg/kg de cetamina.
- Desinfetar a pele com álcool a 75%. Em seguida, corte a pele ao redor do tumor usando uma tesoura, depois remova o tumor com pinça e coloque-o em uma placa de Petri.
- Realizar o procedimento de transplante de tumor seguindo o passo 3.
- Realizar a preservação e criopreservação dos tumores modelo PDX seguindo o passo 4.
- Para a ressuscitação do tecido tumoral, siga o princípio de congelamento lento e dissolução rápida. Depois de retirar os crióvios do azoto líquido, coloque-os rapidamente num banho-maria a 37 °C para uma rápida dissolução.
- Agite suavemente os crióvios em banho-maria para acelerar o processo de descongelamento.
- Descongelar, transferir os pedaços do tumor para o soro fisiológico preparado para lavagem e, em seguida, inocular a próxima geração de camundongos. Para a operação específica, consulte o procedimento de transplante de tecido na etapa 3.
6. Determinação da eficácia terapêutica do lenvatinibe e da cisplatina no modelo ATC PDX
OBS: O modelo ATC PDX foi utilizado para testar o efeito terapêutico do inibidor de tirosina quinase lenvatinibe e do quimioterápico cisplatina25,26,27.
- Selecionar o tecido tumoral da geração P5 de um modelo ATC PDX (THY-017), cortar em pedaços de tecido de 2-4 mm 3 e inocular subcutaneamente (passo3 ) no dorso direito de dez camundongos Balb/c nus fêmeas de 4-6 semanas.
- Selecionar 15 camundongos com volumes tumorais entre 50-150 mm3 e dividi-los em três grupos.
- Administrar lenvatinib (10 mg/kg) por via intragástrica a um grupo uma vez por dia durante 15 dias, administrar cisplatina (3 mg/kg) por via intraperitoneal a um grupo a cada 3 dias, num total de seis doses, e administrar o grupo controlo com o mesmo volume de solução salina normal.
- Medir o peso corporal e o volume tumoral dos ratos duas vezes por semana.
- No final do teste, eutanasiar os camundongos (etapa 5.3) e pesar os tumores.
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Representative Results
Um total de 18 espécimes de câncer de tireoide foram transplantados, e cinco modelos PDX de câncer de tireoide foram construídos com sucesso (taxa de tomada tumoral de 27,8%), incluindo quatro casos de câncer indiferenciado de tireoide e um caso de câncer anaplásico de tireoide. A correlação entre a taxa de sucesso de construção do modelo e a idade, sexo, diâmetro do tumor, grau e diferenciação tumoral foram analisadas. Embora a taxa de sucesso do modelo de amostras tumorais de grau 4 tenha sido maior do que a de amostras com graus mais baixos, e a taxa de sucesso de amostras tumorais indiferenciadas também tenha sido maior do que a de amostras altamente diferenciadas, os resultados da análise de correlação mostraram que esses fatores não foram associados com a taxa de sucesso do modelo PDX (Tabela 1). Dezessete amostras de CEC de cabeça e pescoço foram inoculadas e quatro modelos PDX de CECP foram construídos com sucesso. A análise de correlação entre a taxa de tomada do tumor na construção do modelo e os parâmetros clínicos das amostras tumorais demonstrou que o grau de diferenciação foi associado com a taxa de sucesso do modelo, enquanto idade, sexo, história tabágica, diâmetro do tumor, grau de câncer, metástase e infecção pelo HPV não afetaram a taxa de tomada do tumor (Tabela 2).
As curvas de crescimento tumoral para cada modelo PDX foram construídas para melhor compreensão das taxas de crescimento dos modelos PDX de diferentes pacientes (Figura 1, Figura 2 e Tabela 3). Os ciclos tumorigênicos médios (tempo desde a inoculação até o tamanho do tumor de 1.000 mm3) de THY-004 das gerações P0 a P5 foram de 68 dias, 87 dias, 29 dias, 34 dias, 28 dias e 26 dias, respectivamente. Os ciclos tumorigênicos médios do THY-012 das gerações P0 a P5 foram de 119 dias, 61 dias, 66 dias, 55 dias, 87 dias e 116 dias, respectivamente. Os ciclos tumorigênicos médios de THY-017 das gerações P0 a P5 foram de 27 dias, 17 dias, 30 dias, 13 dias, 22 dias e 15 dias, respectivamente. Os ciclos tumorigênicos médios de THY-018 das gerações P0 a P3 foram de 134 dias, 70 dias, 48 dias e 48 dias, respectivamente. Os ciclos tumorigênicos médios do THY-021 das gerações P0 a P3 foram de 53 dias, 66 dias, 35 dias e 49 dias, respectivamente. Os ciclos tumorigênicos médios da OTO-017 das gerações P0 a P4 foram de 118 dias, 86 dias, 67 dias, 129 dias e 88 dias, respectivamente. Os ciclos tumorigênicos médios da OTO-022 das gerações P0 a P5 foram de 155 dias, 55 dias, 32 dias, 37 dias, 27 dias e 46 dias, respectivamente. Os ciclos tumorigênicos médios da OTO-030 das gerações P0 a P2 foram de 133 dias, 93 dias e 104 dias, respectivamente. Os ciclos tumorigênicos médios do OTO-031 das gerações P0 a P5 foram de 144 dias, 58 dias, 33 dias, 34 dias, 52 dias e 50 dias, respectivamente. As amostras de ATC foram passadas de forma estável para a geração P3 e mais tarde, enquanto dois casos de amostras de CEC de cabeça e pescoço não conseguiram formar tumores após passarem para a geração P1. As taxas de crescimento de algumas amostras foram relativamente lentas na geração P0, mas suas taxas de crescimento foram aceleradas após a passagem para a geração P1 e gerações posteriores. As características histopatológicas dos tumores dos pacientes com as de diferentes gerações de modelos PDX foram comparadas. Os resultados mostraram que os tumores PDX e os tumores primários derivados de pacientes eram morfologicamente quase semelhantes (Figura 3), com pequenas diferenças que podem ser devidas à heterogeneidade na área de amostragem entre os pacientes e as diferentes gerações de PDX.
A eficácia antitumoral do lenvatinibe (um inibidor de tirosina quinase multialvo aprovado para o tratamento do câncer avançado de tireoide28) foi avaliada no modelo PDX de ATC. Como mostrado na Figura 4A, o tratamento com lenvatinibe inibiu significativamente o crescimento tumoral no modelo ATC PDX em comparação com o grupo controle salino normal (P < 0,05). Ao final do experimento, o tecido tumoral foi excisado e pesado para determinação do peso tumoral. Em comparação com o grupo controle, o peso tumoral do grupo de tratamento com lenvatinibe foi menor, embora não tenha sido obtida diferença estatística (Figura 4B). Além disso, não foram observadas alterações óbvias no estado geral e no peso corporal nos ratinhos tratados com lenvatinib (Figura 4C). Devido à excessiva frequência de administração de cisplatina durante os experimentos, os camundongos apresentaram toxicidade significativa, manifestada por perda de peso e até morte. A eficácia antitumoral da cisplatina é demonstrada na Figura 1 Suplementar.
Figura 1: Curva de crescimento tumoral dos modelos ATC PDX de diferentes pacientes. Cada cor representa a geração especificada, e cada curva representa um único tumor. Um a três camundongos foram inoculados na passagem 0 (P0) da geração, e cinco camundongos foram inoculados nas passagens subsequentes (P1-P5). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Curva de crescimento tumoral dos modelos de CEC de cabeça e pescoço PDX de diferentes pacientes. Cada cor representa a geração especificada, e cada curva representa um único tumor. Um a três camundongos foram inoculados na geração P0, e cinco camundongos foram inoculados na geração P1 e gerações posteriores. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Estudo histopatológico. Comparação histopatológica entre os tumores primários dos pacientes e as PDXs correspondentes (passagem 1 e passagem 3) de ATC (THY-012, THY-017) e CEC de cabeça e pescoço (OTO-017) (coloração hematoxilina-eosina, 100x). Os subtipos patológicos de THY-012 e THY-017 foram carcinoma anaplásico de tireoide, e o subtipo patológico de OTO-017 foi carcinoma de células escamosas. Barras de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Eficácia terapêutica do lenvatinibe no modelo ATC PDX. Alterações no (A) volume tumoral, (B) peso tumoral e (C) peso corporal de camundongos portadores de ATC PDX após tratamento com lenvatinibe (10 mg/kg). As análises estatísticas foram realizadas por meio do teste T para comparar levatinibe com controle. *P < 0,05 versus controle foi considerado estatisticamente significativo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Parâmetros | Classe | Taxa de tomada tumoral (%) | P |
| Idade (anos) | <60 | 16.67 (1/6) | 0.615 |
| ≥60 | 33.33 (4/12) | ||
| Gênero | Macho | 16.67 (1/6) | 0.615 |
| Fêmea | 33.33 (4/12) | ||
| Diâmetro do tumor | <6cm | 37.50 (3/8) | 0.608 |
| ≥6cm | 20.00 (2/10) | ||
| Estágio patológico do TNM | Eu | 0.00 (0/1) | 1 |
| Ш | 0.00 (0/1) | ||
 |
31.25 (5/16) | ||
| Diferenciação | Alto | 0.00 (0/7) | 0.059 |
| Pobre | 25.00 (1/4) | ||
| Indiferenciado | 57.14 (4/7) |
Tabela 1: Correlação entre a taxa de tomada tumoral do CTA e as características clínicas dos pacientes.
| Parâmetros | Classe | Taxa de tomada tumoral (%) | P |
| HPV | Negativo | 33.33 (2/6) | 1 |
| Desconhecido ou positivo | 36.36 (4/11) | ||
| Idade (anos) | <60 | 33.33 (3/9) | 1 |
| ≥60 | 37.50 (3/8) | ||
| Gênero | Macho | 50.00 (5/10) | 0.304 |
| Fêmea | 14.29 (1/7) | ||
| Tabagismo | Alguma vez | 44.44 (4/9) | 0.62 |
| Nunca | 25.00 (2/8) | ||
| Diâmetro do tumor | <3cm | 40.00 (4/10) | 1 |
| ≥3cm | 28.57 (2/7) | ||
| Estágio patológico do TNM | Eu | 75.00 (3/4) | 0.423 |
 |
25.00 (2/8) | ||
| Ш | 0.00 (0/1) | ||
|
33.33 (1/3) | ||
| Metástase à distância | Y | 28.57 (2/7) | 0.633 |
| N | 44.44 (4/9) | ||
| Diferenciação | Alto | 12.50 (1/8) | 0.036* |
| Moderada a alta | 100.00 (2/2) | ||
| Moderado | 0.00 (0/2) | ||
| Moderado a ruim | 66.67 (2/3) | ||
| * P < 0,05 |
Tabela 2: Correlação entre a taxa de tomada tumoral de CEC de cabeça e pescoço e as características clínicas dos pacientes. *P < 0,05.
| Nome do exemplo | Geração P a P0 | Geração P0 a P1 | Geração P1 a P2 | Geração P2 a P3 | Geração P3 a P4 | Geração P4 a P5 |
| THY-004 | 68 | 87 | 29 | 34 | 28 | 26 |
| THY-012 | 119 | 61 | 66 | 55 | 87 | 116 |
| THY-017 | 27 | 17 | 30 | 13 | 22 | 15 |
| THY-018 | 134 | 70 | 48 | 48 | - | - |
| THY-021 | 53 | 66 | 35 | 49 | - | - |
| OTO-017 | 118 | 86 | 67 | 129 | - | - |
| OTO-022 | 155 | 55 | 32 | 37 | 27 | 46 |
| OTO-030 | 133 | 93 | 104 | - | - | - |
| OTO-031 | 144 | 58 | 33 | 34 | 52 | 50 |
Tabela 3: Ciclo tumorigênico médio (tempo desde a inoculação até o tamanho do tumor de 1.000 mm3) dos modelos ATC e CEC de cabeça e pescoço.
Figura suplementar 1: Eficácia terapêutica da cisplatina no modelo ATC PDX. Alterações no (A) volume tumoral, (B) peso do tumor e (C) peso corporal de camundongos portadores de ATC PDX após tratamento com cisplatina (3 mg/kg). As análises estatísticas foram realizadas por meio do teste T para comparar a cisplatina com o controle. *P < 0,05 versus controle foi considerado estatisticamente significativo. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Este estudo estabeleceu com sucesso os modelos PDX subcutâneos de ATC e CEC de cabeça e pescoço. Há muitos aspectos a serem observados durante o processo de construção do modelo PDX. Quando o tecido tumoral é separado do paciente, ele deve ser colocado na caixa de gelo e enviado ao laboratório para inoculação o mais rápido possível. Depois que o tumor chega ao laboratório, o operador deve se atentar para manter um campo estéril e praticar procedimentos assépticos. Para amostras de biópsia por agulha, como o tecido tumoral é particularmente pequeno, a inoculação após a mistura da amostra com o gel de matriz seria mais propícia para estabelecer o modelo. O tecido tumoral primário também deve ser preservado, fixado e congelado tanto quanto possível para pesquisas futuras. Durante a inoculação, o ar no trocarte precisa ser expelido o máximo possível depois que os pedaços do tumor foram colocados no trocarte antes do uso. Após a inoculação do tumor, o crescimento tumoral deve ser observado em camundongos por 1-4 meses, e camundongos sem crescimento tumoral por mais de 6 meses podem ser eutanasiados29.
Camundongos imunodeficientes são geralmente escolhidos como hospedeiros para a construção do modelo PDX29,30. Da geração P0 à geração P2, camundongos não obesos diabéticos-gravemente comprometidos imunodeficientes (NOD-SCID) ou camundongos NOD Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) são geralmente usados. Na geração P3 e além, as amostras são consideradas de forma estável, então camundongos nus geralmente também podem servir como hospedeiro, e os tumores também podem crescer normalmente. Além disso, o tempo total de operação, o tempo de isolamento tumoral, a sobrevida livre de doença e a sobrevida global dos pacientes, o grau de malignidade tumoral e o subtipo histológico foram associados à tumorigenicidade do modelo PDX31,32,33,34. O local de transplante também tem impacto na taxa de sucesso da modelagem PDX, e estudos têm demonstrado que cápsula renal e transplante ortotrópico têm alta taxa tumorigênica33,35. Além disso, o uso de Matrigel também pode melhorar a taxa tumorigênica36,37. Tem sido relatado que a infecção pelo papilomavírus humano (HPV) afeta a taxa de sucesso do transplante em tumores de CEC de cabeça e pescoço; Os tumores HPV-negativos têm uma taxa de tomada superior aos tumores HPV-positivos38,39. Este estudo não chegou à mesma conclusão, provavelmente devido ao pequeno número de amostras e informações incompletas sobre a infecção pelo HPV.
Diferente dos modelos de transplante ortotópico e de cápsula renal, o modelo subcutâneo é mais conveniente para observar o crescimento de tumores e também é propício à operação40,41,42. Com base nos dados de crescimento tumoral do modelo ATC e HNSCC PDX, observamos que as taxas de crescimento dos tumores de diferentes pacientes foram inconsistentes, refletindo heterogeneidade intertumoral. A taxa de crescimento tumoral da geração P0 da maioria dos modelos PDX foi relativamente mais lenta do que para as últimas passagens, o que provavelmente se deveu à adaptação do microambiente de camundongos. Notavelmente, a taxa de crescimento de alguns tumores derivados de pacientes aumentou em diferentes passagens após a geração P1, consistente com o intervalo de passagem encurtado relatado por Pearson et al.43. O exame histopatológico demonstrou que os tumores PDX mantiveram as características morfológicas dos tumores primários. A correlação entre o modelo PDX e os pacientes clínicos com CTA também se refletiu nos resultados dos testes farmacodinâmicos in vivo, que demonstraram que o lenvartinibe exibiu um bom efeito antitumoral, consistente com relatos clínicos25,26,27.
No entanto, o modelo PDX também tem certas desvantagens. Por exemplo, o tempo de formação do tumor é relativamente longo, o que é inadequado para pacientes com tumores avançados ou agressivos. Além disso, os custos monetários e de tempo do rastreamento de drogas de alto rendimento são muito altos44. De fato, combinar o modelo PDX com organoides tumorais e estabelecer um modelo organoide derivado do paciente (DOP) correspondente ao modelo PDX compensaria essa deficiência44,45,46. Modelos de transplante ortotópico podem ser utilizados para estudar a patogênese e os mecanismos metastáticos dos tumores40,41,47. A falta de um sistema imunológico funcional é outra desvantagem do modelo PDX, de modo que um número crescente de experimentos está usando camundongos humanizados para construir o modelo PDX para pesquisa em imunologia tumoral48,49,50.
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Disclosures
Não são divulgados potenciais conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Apoio à Ciência e Tecnologia da Província de Sichuan (Grant Nos. 2019JDRC0019 e 2021ZYD0097), o projeto 1.3.5 para disciplinas de excelência, West China Hospital, Sichuan University (Grant No. ZYJC18026), o projeto 1.3.5 para disciplinas de excelência-Projeto de Incubação de Pesquisa Clínica, West China Hospital, Sichuan University (Grant No. 2020HXFH023), os Fundos de Pesquisa Fundamental para as Universidades Centrais (SCU2022D025), o Projeto de Cooperação Internacional do Escritório de Ciência e Tecnologia de Chengdu (Processo nº 2022-GH02-00023-HZ), o Projeto Centelha de Inovação da Universidade de Sichuan (Bolsa nº 2019SCUH0015) e o Fundo de Treinamento de Talentos para a Integração de Engenharia Médica do Hospital da China Ocidental - Universidade de Ciência e Tecnologia Eletrônica (Bolsa nº. HXDZ22012).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.4 mm x 2.0 mm trocar | Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd | 18-9065 | |
| Balb/c nude mice | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | 401 | |
| Biosafety cabinet | Suzhou Antai | BSC-1300IIA2 | |
| Blade | Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd | 18-0823 | |
| Centrifuge tube | Corning | 430791/430829 | |
| Cryopreservation tube | Chengdu Dianrui Experimental Instrument Co., Ltd | / | |
| Custodiol HTK-Solution | Custodiol | 2103417 | |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | SIGMA-ALORICH | D5879-500mL | |
| Electronic balance | METTLER | ME104 | |
| Electronic digital caliper | Chengdu Chengliang Tool Group Co., Ltd | 0-220 | |
| fetal bovine serum(FBS) | VivaCell | C04001-500 | |
| IBM SPSS Statistics 26 | IBM | ||
| Ketamine | Jiangsu Zhongmu Beikang Pharmaceutical Co., Ltd | 100761663 | |
| Lenvatinib | ApexBio | A2174 | |
| NOD-SCID immunodeficient mice | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | 406 | |
| Pen-Strep Solution | Biological Industries | 03-03101BCS | |
| Petri dish | WHB | WHB-60/WHB-100 | |
| Saline | Sichuan Kelun | W220051705 | |
| Scissor | Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd | 18-0110 | |
| Tweezer | Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd | 18-1241 | |
| Vet ointment | Pfizer Inc. | P10015353 | |
| Xylazine | Dunhua Shengda Animal Medicine Co., Ltd | 070031777 |
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