Summary
在这里，我们提出了一个详细的方案，概述了使用从啮齿动物或人类脂肪组织中分离的微血管碎片作为设计功能性，血管化米色脂肪组织的直接方法。
Abstract
工程产热脂肪组织（例如，米色或棕色脂肪组织）已被研究为代谢疾病的潜在疗法或用于健康筛查和药物测试的个性化微组织设计。目前的策略通常相当复杂，无法准确完全描述产热脂肪组织的多细胞和功能特性。微血管碎片是由从脂肪组织中分离的小动脉、小静脉和毛细血管组成的完整小血管，作为细胞的单一自体来源，可实现血管化和脂肪组织形成。本文介绍了优化培养条件的方法，以便能够从微血管碎片中生成三维、血管化和功能性产热脂肪组织，包括从脂肪组织和培养条件中分离微血管碎片的方案。此外，还讨论了最佳实践，以及表征工程组织的技术，并提供了啮齿动物和人类微血管碎片的样品结果。这种方法有可能用于理解和开发肥胖和代谢疾病的治疗方法。
Introduction
该协议的目标是描述一种从单一的，潜在的自体来源微血管碎片（MVF）开发血管化米色脂肪组织的方法。棕色和米色脂肪组织已被证明具有与代谢调节相关的有益特性;然而，成人中这些脂肪组织库的小体积限制了对全身代谢的潜在影响，特别是在肥胖或2型糖尿病等疾病条件下1，2，3，4，5，6，7。棕色/米色脂肪作为预防与肥胖及其合并症相关的有害代谢作用的治疗靶点引起了浓厚的兴趣8，9，10，11，12。
MVF是可以直接从脂肪组织中分离，培养并以三维结构长时间保持的血管结构13，14，15。我们小组和其他小组以前的工作已经开始利用MVF的多细胞和多能能力，特别是因为它与脂肪组织形成有关16，17，18。作为这项工作的积累，我们最近证明，来自健康和2型糖尿病19的啮齿动物模型以及来自人类受试者（50岁以上的成年人）20的MVF含有能够被诱导形成产热或米色脂肪组织的细胞。
这是一种利用单一来源MVF的创新方法，不仅能够创建米色脂肪组织，而且还能够创建其相关和关键的血管成分21。该技术的使用对于寻找一种直接的组织工程方法来形成产热脂肪组织的研究可能具有重要价值。与有志于设计米色脂肪组织22，23，24，25，26，27，28的其他方法不同，本研究中描述的过程不需要使用多种细胞类型或复杂的诱导方案。可以使用源自啮齿动物和人类来源的MVF创建血管化的米色和白色脂肪模型，显示出巨大的翻译潜力。该方案的最终产品是一种工程米色产热脂肪组织，其结构和代谢功能与棕色脂肪组织相当。总体而言，该协议提出了这样一种想法，即易于访问且可能自体来源MVF可能是一种有价值的治疗干预和研究代谢紊乱的工具。
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Protocol
本研究是根据《动物福利法》和《动物福利实施条例》根据《实验动物护理和使用指南》的原则进行的。所有动物程序均由德克萨斯大学圣安东尼奥分校的机构动物护理和使用委员会批准。
注意：对于下面描述的步骤，使用雄性刘易斯大鼠。必须对雌性以及小鼠微血管片段（MVF）收集进行轻微的方案调整29。对于使用人MVF（h-MVF）的方案，唯一需要的步骤是按照制造商的方案重悬h-MVF，生长培养基制备（1.3），纤维蛋白水凝胶的形成（5）和培养（6）。有关协议的概述，请参见 图 1。
图 1：实验大纲。 分析前，使用MVF形成产热脂肪组织的六个关键步骤的分解。 请点击此处查看此图的大图。
1. 试剂制备
注意：以下试剂对应于一只大鼠，称重并在生物罩内制成。
- 在PBS中制备牛血清白蛋白（BSA）。
- 在PBS中制备10毫克/毫升（1.0%）BSA，用于洗涤步骤（1毫克/毫升，0.1%）和消化（4毫克/毫升，0.4%）。
- 按照步骤1.1.3-1.1.5制备不同浓度的BSA，如步骤1.1.1-1.1.5所述。
- 10 毫克/毫升 PBS 中的 BSA（PBS 中的 1% BSA）
- 将 500 mg BSA 和 500 mL PBS 加入 50 mL 锥形管中，并涡旋溶液以溶解 BSA。
- 如果形成过多的气泡，则将溶液以350× g 离心2分钟。过滤器用0.22μm尼龙网过滤器对溶液进行灭菌。
- 1 毫克/毫升 PBS 中的 BSA（PBS 中的 0.1% BSA）
- 将 15 mL 10 mg/mL BSA 中的 10 mg/mL BSA 加入 500 mL 无菌瓶中的 135 mL PBS 中，用 PBS 以 1：10 的比例稀释 15 mL 10 mg/mL BSA，轻轻摇动瓶子以确保混合物均匀。
- 4 毫克/毫升 PBS 中的 BSA（PBS 中的 0.4% BSA）
- 在 100 mL 无菌瓶中加入 35 mL 10 mg/mL BSA 中的 PBS + 57.5 mL PBS 溶液，用 PBS 以 1：2.5 的比例稀释 35 mL 10 mg/mL BSA，轻轻摇动瓶子以确保混合物均匀。
- 在BSA中制备胶原酶，用于消化碎脂肪垫。
- 准备6毫克/毫升胶原酶。
- 在 50 mL 锥形管中，称取 72 mg 胶原酶（标签“for Epi”）。
- 在三个 50 mL 锥形管中，分别称取 144 mg 胶原酶（标签“用于 Ing 1”、“用于 Ing 2”和“用于 SubQ”）。
- 将称重的胶原酶储存在4°C直至使用。
注意：在消化之前不要添加BSA / PBS。 - 将 12 mL 的 4 mg/mL BSA 加入含有 72 mg 胶原酶的试管中。
- 将 24 mL 的 4 mg/mL BSA 加入到 PBS 中，加入含有 144 mg 胶原酶的试管中。
- 摇动试管以确保溶液均匀，并用0.22μm尼龙网过滤器过滤溶液。
- 准备6毫克/毫升胶原酶。
- 制备补充有氨基己酸 （ACA） 的生长培养基以补料/分化分离的 MVF。
- 生长培养基 （GM）：用 20% FBS、1% 青霉素-链霉素（笔链球菌）、0.2% 支原体预防性和 1 mg/mL ACA 补充 DMEM。
- 准备白色脂肪培养基（WAM）。
- WAM诱导：用20%FBS，1%笔链球菌，0.2%支原体预防性，10μg/ mL胰岛素，10μm佛司可林，1μm地塞米松和1mg / mL ACA补充DMEM / F12。
注意：对于h-MVF，此外，添加125μM吲哚美辛。 - WAM维持：用20%FBS、1%笔链球菌、0.2%支原体预防、5μg/mL胰岛素和1mg/mL ACA补充DMEM/F12。
注意：对于h-MVF，将胰岛素浓度更改为10μg/ mL。
- WAM诱导：用20%FBS，1%笔链球菌，0.2%支原体预防性，10μg/ mL胰岛素，10μm佛司可林，1μm地塞米松和1mg / mL ACA补充DMEM / F12。
- 准备米色成脂培养基 （BAM）。
- BAM诱导：用20%FBS，1%笔链球菌，0.2%支原体预防，10μg/ mL胰岛素，10μm佛司可林，1μm地塞米松，1μm罗格列酮，20nM 3，3′，5-三碘-L-甲状腺原氨酸（T3）和1mg / mL ACA补充DMEM / F12。
注意：对于h-MVF，将T3的浓度更改为120 nM。 - BAM维持：用20%FBS，1%笔链球菌，0.2%支原体预防，5μg/ ml胰岛素，10μm佛司可林，1μm罗格列酮，20nM T3和1mg / mL ACA补充DMEM / F12。
注意：对于h-MVF，将胰岛素浓度更改为10μg/ mL，将T3浓度更改为120nM。
- BAM诱导：用20%FBS，1%笔链球菌，0.2%支原体预防，10μg/ mL胰岛素，10μm佛司可林，1μm地塞米松，1μm罗格列酮，20nM 3，3′，5-三碘-L-甲状腺原氨酸（T3）和1mg / mL ACA补充DMEM / F12。
- 准备凝血酶（仅在没有原液等分溶液时才需要制作）以制造用于纤维蛋白凝胶的凝血剂。
- 10 U/mL 凝血酶，剂量为ddH 2O：
- 使用制造商提供的1-5 mL ddH2O重悬小瓶中的凝血酶粉末，并将重悬液转移到250 mL烧杯中。
- 将溶液升至 100 mL，并上下移液多次，以确保混合物均匀。将溶液分装到15 mL锥形管（~10 mL /管）中，并将等分试样储存在-20°C冰箱中。
注意：使用时，在室温（RT）下解冻凝血酶。
- 10 U/mL 凝血酶，剂量为ddH 2O：
2. 工具/材料准备
注意：所有仪器在使用前都应进行高压灭菌/灭菌。
- 附睾/腹股沟/皮下脂肪分离（手术在确定的手术区域进行）
- 确保提供一次性垫子、两把剪刀、一个止血器（可选）、两个镊子和四个 50 mL 锥形管，其中 10-15 mL 的 1 mg/mL BSA （0.1%） 在 PBS 中。
- 微血管碎片分离
- 对于切碎（在生物罩中进行），确保提供三个未包被的无菌 100 毫米培养皿、一对镊子和一对弯曲剪刀。
- 对于消化和分离（在生物罩中完成），确保一把剪刀，一对镊子，八个未包被的无菌100毫米培养皿，三个未包被的无菌35毫米培养皿，称量胶原酶并在4°C，四个250毫升烧瓶，一个中心有孔的塑料支架，四个500μM屏幕（切成3个圆形正方形）， 四个 37 μM 屏幕（切成 3 个圆形正方形）和 11 个 50 mL 锥形管。
- 纤维蛋白重悬
- 对于纤维蛋白水凝胶（在生物罩中完成），确保纤维蛋白原、凝血酶和生长培养基（在试剂制备过程中制备）可用。
3. 脂肪分离方案
- 预备步骤
- 在使用手术器械之前，在烧杯中装满乙醇以清洗和消毒手术器械。接下来，准备处理大鼠的桌子，并准备好真空吸出剃须步骤中产生的毛皮。
- 准备一个装有冰的桶，其中将放置先前制备的 50 mL 锥形管，每个锥形管含有 10 mL 的 1 mg/mL BSA。相应地标记管子。
注意：可能需要有两个单独的锥形管用于腹股沟脂肪，因为需要提取两侧，并且与附睾和皮下后相比，从该区域收集的脂肪量往往是最大的。 - 首先使用所需的手术工具在规定的手术区域安乐死大鼠。通常，CO2 用于按照IACUC协议对大鼠实施安乐死。
- 使用理发器，在感兴趣的区域周围剃掉老鼠。具体来说，在腹股沟和腹部一半之间剃须，以隔离附睾和腹股沟脂肪（在该区域使用较小的剃须刀进行皮毛）。剃掉整个背部，使后皮下脂肪位于肩胛骨之间（最好使用较大的剃须刀，因为大鼠背面的皮毛较厚）。
- 通过喷洒70%乙醇无菌制备大鼠。通常，建议清洁将要切割的区域两次。
- 隔离不同的脂肪库
- 腹股沟（皮下）
- 在仰卧位，用一把剪刀抬起阴茎下方的皮肤。用剪刀开始切口，从中心开始横向切割，形成“V”形并循环到老鼠的背部以进入整个脂肪库。记住要表面切割，以使下面的脂肪完好无损。在切割步骤中，通过切割相互连接的筋膜组织来确保皮肤与脂肪分离（图2A）。
- 一旦筋膜被适当切割，确保腹股沟脂肪的两侧是可见的（腹股沟脂肪从腹股沟区域向后延伸）。接下来，在两个单独的锥形管中去除两侧的脂肪，其中包含 10 mL 的 1 mg/mL BSA（图 2B）。
- 附睾（内脏）
- 通过切开腹部皮肤并小心地穿过睾丸周围的薄层来收获附睾脂肪（图2C）。
- 用镊子轻轻拉出脂肪组织并用剪刀将其剪出。避免解剖任何主要的可见血管（如果收获睾丸和附睾，请在生物罩的清洁步骤中将其移除）。
- 小心地将去除的脂肪放入 50 mL 锥形管中，其中 10 mL 的 1 mg/mL BSA 在 PBS 中。
注意：附睾脂肪的去除应在腹股沟脂肪去除后进行。附睾脂肪的体积通常较小，位于腹股沟脂肪下方，睾丸和附睾周围的腹部皮肤下方。
- 后皮下
- 将大鼠俯卧（背侧朝上），并使用大剪刀将背部的皮肤（该区域的皮肤很厚）一直切到头皮，注意不要切得太深，就在皮肤下方（图2D）。
- 切开连接皮肤和组织的筋膜;脂肪位于肩胛间区域。记下区分/分离皮下脂肪和棕色脂肪。棕色脂肪更接近脊柱（图2E）。
- 分离脂肪并将其放入相应的 50 mL 锥形管中，其中 10 mL 的 1 mg/mL BSA 在 PBS 中。
- 腹股沟（皮下）
图2：不同脂肪组织库的分离 。 （A）切除腹股沟脂肪组织所需的初始切口。（B）腹股沟脂肪库的位置。（C）附睾脂肪库的位置，注意进入所需的外皮切口。（D）一旦放置容易获得额外脂肪的小鼠，就需要额外的切口。（E）后皮下脂肪库的位置。 请点击此处查看此图的大图。
4. 微血管碎片分离方案
- 将含有从大鼠切除的脂肪的 50 mL 锥形管放入生物罩中。
- 使用镊子将脂肪放入标准的 100 毫米培养皿中（在 PBS 中加入 ~0.5 mL 的 1 mg/mL BSA 以保持组织水分）。
- 清洁并去除脂肪中任何可见的血管和肌肉/外来组织。
- 用剪刀切碎脂肪~10分钟（切碎，以便可以用10mL移液管转移）。
- 通过在 PBS 中添加 ~0.5 mL 的 1 mg/mL BSA 来检查肿块;如有必要，继续切碎。
- 用 10 mL 移液管将切碎的脂肪转移到无菌 250 mL 烧瓶中。
注意：使用移液管注意体积。 - 添加足够的BSA（1毫克/毫升），使最终体积为20毫升。
- 在胶原酶中加入 4 mg/mL BSA 的 PBS（胶原酶终浓度：6 mg/mL）（即 72 mg 胶原酶为 12 mL，144 mg 胶原酶为 24 mL）。
注意：在切碎完成之前不要添加，因为它对时间敏感。 - 轻轻摇动锥形管以确保溶液均匀，并用0.22μm尼龙网过滤器过滤溶液。
- 对于附睾脂肪，消化~8-10分钟;对于腹股沟和后皮下脂肪，在37°C水浴中消化~15-20分钟，在整个过程中以圆周运动摇动烧瓶（在脂肪到达仅剩几团块的那一刻停止）。
- 将消化的脂肪转移到 50 mL 锥形管中（应有 ~30 mL/管），并将管标记为“消化脂肪”。
- 以400× g 旋转管4分钟;纺纱后，颗粒必须是红色的（图3A）。
- 在旋转过程中，将无菌的 37 μM 屏幕和 500 μM 屏幕放入无菌培养皿中，其中 5 mL 的 1 mg/mL BSA 在 PBS 中预浸泡。
- 旋转后，将上清液倒入标记为“废物”的 50 mL 锥形管中。轻轻地进行倾析以去除浅表脂肪，并且不会干扰由MVF制成的颗粒。
- 将 10 mL 的 1 mg/mL BSA 加入含有沉淀（“消化脂肪”）的试管中。研磨（上下移液）沉淀2倍。
- 避免在颗粒上太粗糙，以免破坏碎片。
- 将500μM屏幕置于塑料屏幕支架上方的新培养皿中（图3B）。
- 使用同心圆从“消化沉淀”管中移取 10 mL 在 500 μM 屏幕上（图 3C）。
- 用另外 5 mL 的 1 mg/mL BSA 在 PBS 中清洗过滤器。所需的细胞将过滤到培养皿中;因此，丢弃500μM屏幕，但将过滤后的液体保存在培养皿内。
- 将37μM屏幕置于塑料屏幕支架上方的新培养皿中。
- 在使用37μM筛网之前更换移液器以消除任何结块。
- 使用同心圆在37μM屏幕上移取从第一次过滤中获得的液体。
- 用另外 5 mL 的 1 mg/mL BSA 在 PBS 中清洗过滤器。所需的细胞将保留在过滤器中，因此丢弃过滤后的液体，但保存37μM屏幕。
- 将 37 μM 屏幕滑动到含有 5 mL 1 mg/mL BSA 的 PBS 的新培养皿中。
- 通过敲击圆锥形支架来摇晃盘子以去除碎片。不要用力摇晃，因为液体/细胞可能会从培养皿中溢出。
- 用另外 5 mL 的 1 mg/mL BSA 在 PBS 中冲洗过滤器。所需细胞将保留在培养皿中的液体溶液中。保存37μM屏幕和培养皿内含有液体的脱落片段，以进行以下步骤。
- 将含有液体的BSA +片段转移到无菌的50 mL锥形管中。
- 重复冲洗37μM屏幕多次（每次用~5mL的1mg / mL BSA在PBS中）并添加到锥形管中。重复直到收集的总体积为 ~15-20 mL。最终，将从培养皿中的液体溶液中收集所需的细胞并放置在锥形管中;此时，在最后一次冲洗后丢弃 37 μM 屏幕，但将脱落的含有液体的碎片保存在 50 mL 锥形管内。
- 用剪刀将 200 μL 移液器吸头的末端夹住。轻轻摇动 50 mL 管，取出两个 20 μL 样品，并将它们放入干净的 35 mm 培养皿中。
- 计算培养皿中每个样品中的片段数，以获得分离的MVF总数。
总片段数 =
- 将剩余的脱落的含有液体的片段在 50 mL 锥形管中以 400 x g 旋转 4 分钟以收集 MVF。
图3：MVF的分离 。 （A）脂肪组织的消化后，描述了旋转后含有颗粒和上清液的MVF的分离。（B）用于过滤和截留MVF的耗材的布局。 （C）过滤/洗涤步骤的同心圆方法的图示。 请点击此处查看此图的大图。
5. 纤维蛋白水凝胶的形成
- 计算示例：
注意：以下是接种在~15，000-20，000 MVF / mL和纤维蛋白原：凝血酶凝胶比值为2：5的MVF的计算，纤维蛋白原在20 mg / mL浓度下使用。- 要制备五块 250 μL 凝胶，需要 1，250 μL 的总体积。始终考虑到移液错误，因此，制备足够 1.5 mL 凝胶。
- 计算所需的纤维蛋白原体积，如下所示：
， X1 = 428.57 μL 纤维蛋白原 - 计算所需的凝血酶体积，如下所示：
， X2 = 1，071.43 μL 凝血酶 - 对于所需的 428.57 μL 体积，按如下方式制备 500 μL 纤维蛋白原：
20毫克/毫升* 0.5毫升=10毫克纤维蛋白原。将其重悬于 500 μL DMEM 中 - 要获得每种凝胶，请按如下方式计算纤维蛋白原和凝血酶的体积：
- 纤维蛋白原：
， X1 = 71.43 μL 纤维蛋白原（在 DMEM 中）+ MVF - 凝血酶：
， X2 = 178.57 μL 凝血酶
- 纤维蛋白原：
- 计算所需的纤维蛋白原体积，如下所示：
- 要制备五块 250 μL 凝胶，需要 1，250 μL 的总体积。始终考虑到移液错误，因此，制备足够 1.5 mL 凝胶。
- MVF 纤维蛋白凝胶铸造
- 倒出 50 mL 锥形管中离心片段中的大部分液体。使用移液器去除残留在锥形管边缘的少量液体。
- 将凝血酶添加到将要制造凝胶的孔中（图4A）。
- 夹住 200 μL 移液器吸头的末端，并使用纤维蛋白原轻轻重悬 MVF，一次在凝胶中获得 ~15，000-20，000 MVF/mL 的最终密度。
- 夹住 200 μL 移液器吸头的末端，然后将 MVF+纤维蛋白原轻轻移入凝血酶溶液中。快速上下移液，以确保混合物均匀。重复直至制成所有凝胶（图4B）。
- 将孔板置于培养箱（37°C，5%CO2）中~15分钟以允许凝胶交联（图4C）。
- 向每个孔中加入 100-150 μL 生长培养基。
， X1 = 428.57 μL 纤维蛋白原
， X2 = 1，071.43 μL 凝血酶
， X1 = 71.43 μL 纤维蛋白原（在 DMEM 中）+ MVF
， X2 = 178.57 μL 凝血酶
图4：MVF纤维蛋白凝胶的形成 。 （A）将5/7份凝血酶混合物移液到相应的孔中。（B）接下来，用夹住的移液器吸头（以免干扰MVF），将2/7份纤维蛋白原+MVF混合物移液到孔中并轻轻混合。（C）最后，将所有完成的凝胶放入37°C的培养箱中，使水凝胶在将培养基置于顶部之前完全固化。 请点击此处查看此图的大图。
6. MVF的培养条件
- 为了培养非血管化的白色和米色脂肪组织（+GM对照），使用图5所示的时间线19。
- 对于血管化的白色和米色脂肪组织的培养（+GM对照），使用图6所示的时间线19。
- 在研究培养期间，水凝胶应保持在培养箱（37°C，5%CO2）中，每隔一天更换一次培养基。有关样品的固定和处理进行分析，请参阅先前发表的著作16，19，20。
图5：非血管化脂肪组织形成的时间。 这一数字是根据阿科斯塔等人19修改的。 请点击此处查看此图的大图。
图6：血管化脂肪组织形成的时间。 这一数字是根据阿科斯塔等人19修改的。 请点击此处查看此图的大图。
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Representative Results
米色/棕色脂肪组织有几个关键的表型形态特征：它是多房/含有小脂滴，具有大量的线粒体（这是其在 体内特征性“褐色”外观的原因），相应地具有高耗氧率/线粒体生物能量，高度血管化，脂肪分解/胰岛素刺激的葡萄糖摄取增加，以及最臭名昭著的， 表达高水平的解偶联蛋白 1 （UCP1），这是一种参与产热呼吸的线粒体蛋白19，30。
因此，在表征MVF分化为米色脂肪组织的能力时，进行了分析，该分析使我们能够可视化（图7，图8），遗传确认（图9，图10）和功能测量（图11）MVF的转化。
在图7和图8中，通过使用BODIPY，脂质染色和使用共聚焦显微镜对水凝胶进行成像，可以看到分化脂肪细胞中脂质的大小和位置的可视化16，17，19。值得注意的是，在该分析中，特别是在条件之间的比较中，BAM组应显示较小的脂质大小（指示米色脂肪组织形成），可通过NIH ImageJ19，20进行量化。
使用RT-qPCR16，19，20，在图9和图10中，最独特的是，UCP1的表达在MVF暴露于BAM时显着增加。
最后，观察线粒体生物能量学（图11），很明显，BAM组具有特征性的更高耗氧率（OCR）水平，使用海马水户压力测试19，20测量。
图 7：r-MVF 组织学评估。 将精益或2型糖尿病衍生的r-MVF暴露于直接（上图，ADIPO）或间接（下图，血管+ADIPO）WAM或BAM脂肪生成介质，分别获得非血管化或血管化的白色或米色脂肪组织（比例尺= 200μm）。这一数字是根据阿科斯塔等人19修改的。 请点击此处查看此图的大图。
图 8：h-MVF 组织学评估。 h-MVF 分别暴露于直接 （ADIPO） WAM 或 BAM 以获得非血管化的白色或米色脂肪组织（比例尺 = 200 μm）。这个数字是从Gonzalez Porras等人20修改而来的。请点击此处查看此图的大图。
图9：通过RT-qPCR进行r-MVF评估。对暴露于（A-C）直接或（E-G）间接WAM或BAM的瘦（L）或2型糖尿病（Db）衍生的r-MVF进行了（A，E）脂肪生成（脂联素），（B，F）产热（UCP1）和（C，G）血管生成（ANGPT1）的评估。结果报告为两个实验重复的平均±标准误差（n = 4）。* = p < 0.05，** = p < 0.01，*** = p < 0.001，**** = p < 0.0001。 D0 = 第 0 天。使用Holm-Sidak的多重比较分析进行双向方差分析（ANOVA）检验，以确定组间差异。统计学意义定义为p < 0.05。这一数字是根据阿科斯塔等人19修改的。请点击此处查看此图的大图。
图10：通过RT-qPCR评估h-MVF。 暴露于直接WAM或BAM的h-MVF评估（A）脂肪生成（脂联素）和（B）产热（UCP1）。结果报告为两个实验重复的平均±标准误差（n = 4）。* = p < 0.05，** = p < 0.01，*** = p < 0.001，**** = p < 0.0001。 单因素方差分析（ANOVA）检验与Holm-Sidak的多重比较分析，以确定组间差异。统计学意义定义为p < 0.05。这个数字是从Gonzalez Porras等人20修改而来的。请点击此处查看此图的大图。
图 11：r-MVF 和 h-MVF 功能评估。 通过测量耗氧率（OCR）对暴露于（A）直接或（B）间接WAM或BAM或（C）暴露于直接WAM或BAM的瘦（L）或2型糖尿病（Db）衍生的r-MVF或（C）暴露于直接WAM或BAM的h-MVF进行功能评估。结果报告为两个实验重复的平均±标准误差（n = 4）。这一数字是根据阿科斯塔等人19修改的。和冈萨雷斯·波拉斯等人20。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
棕色/米色脂肪组织工程领域在很大程度上尚未成熟22，23，24，25，26，27，28，大部分脂肪模型正在开发用于白色脂肪组织8，22，31.工程棕色/米色微组织通常由多个细胞来源或遗传改变组成，以获得天然棕色脂肪组织的表型特征的子集8，11，32。本文描述的方法提出了一种单一来源的、潜在的自体18，33 方法，利用微血管片段 （MVF） 创建功能性、结构相关和血管化的米色脂肪。MVF最着名的是白色脂肪组织形成的来源14，16，17，18，34，尽管我们最近证明了它们从啮齿动物，人类和疾病来源引起的米色脂肪形成的能力，如图所示19，20.鉴于人们对利用米色/棕色脂肪的治疗或疾病建模潜力的极大兴趣，该技术在新陈代谢、肥胖和相关疾病领域具有牵强附会的应用。
协议中描述了几个关键点。首先，大鼠与人类MVF的利用之间存在差异。到目前为止，啮齿动物来源（来自小鼠29或大鼠）的使用在很大程度上主导了MVF的研究，工作在多种情况下研究它们，例如肥胖35，1型糖尿病36，37，2型糖尿病19和衰老38，甚至脂肪库之间的差异39或性别40.尽管鉴于MVF的起源，可以使用标准的微创手术从成人的皮下脂肪库中自体分离41，但基于MVF的血管形成尚未在临床实践中进行。然而，从脂质抽吸物中收获人类MVF的临床前研究已经证明了其可能性18，33。具体到我们小组，如代表性数据所示，血管化米色脂肪组织的形成目前仅限于源自啮齿动物的MVF。正如我们小组和其他人先前证明的18，获得血管生长和脂肪细胞分化的平衡是高度敏感的，证明取决于引入的因素42，并且时间点分化被激发16。所描述的方案的局限性是需要进一步开发以优化有利于血管化h-MVF米色脂肪组织形成的条件。此外，需要进一步研究这些支架在体内的反应以及来自其他疾病状态的反应，以及相关的优化步骤。
此外，这里描述的是用于从雄性大鼠的三个不同的脂肪组织库分离r-MVF的协议。Später等人39 的先前工作讨论了内脏与皮下长效MVF的血管化能力之间的差异，指出皮下贮库MVF的血管化能力降低，他们归因于过量的结缔组织污染。应该注意的是，对于我们的研究，如“代表性数据”所示，仅使用腹股沟皮下和后皮下库。选择仅使用皮下来源的MVF是为了更接近地模拟转化研究，其中脂质抽吸或类似程序仅收集皮下脂肪组织。此外， 在 皮下脂肪组织中正在开发体内精确指向米色脂肪组织的体内研究，其中包含一个独特的前脂肪细胞或转分化的白色脂肪细胞亚群，这一事实为我们的决定提供了进一步的理由43。我们小组先前的工作显示，来自健康啮齿动物的内脏或皮下储存库的MVF之间没有明显的差异，以经历血管生成和白色脂肪组织形成16。在设计未来的研究时，应考虑所有这些变量。
最后，在尝试修改所述方法或对其进行故障排除时，应考虑几个要点。首先，酶消化脂肪组织的步骤极为重要;应特别注意并确保优化，以始终如一地复制具有相似大小和质量的 MVF。鉴于脂肪类型和脂肪量之间存在很大差异（高度依赖于动物的年龄、大小、健康状况和脂肪分离时的注意事项[避免污染物和提取效率]），消化时间可能会有所不同，因此提供了最适合我们的设备/动物的范围。但是，应考虑自定义以获得最佳结果。此外，在处理MVF时，在酶后消化过程中，应特别注意避免不必要的粗糙和进一步破碎的片段。最后，应该意识到，培养基配方、选择的水凝胶44和培养条件可以根据预期结果进行高度定制。如图所示，来自不同来源的MVF（例如，瘦与糖尿病MVF）具有不同程度的差异，因此在设计实验时，应包括适当的对照和实验组。
总之，随着工程产热脂肪组织领域的发展，构建在结构、遗传和功能上模仿天然米色/棕色脂肪组织的生物学相关系统至关重要。MVF为这一挑战提供了一种令人兴奋且独特的方法，因为如此处所述，它们提供了一种简单的单一来源方法来创建米色脂肪的生物模仿。因此，它们在利用对肥胖和代谢疾病治疗的理解或开发方面具有巨大的潜力。
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Disclosures
作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可以解释为潜在的利益冲突。
Acknowledgments
阿科斯塔博士得到了美国国立卫生研究院拨款CA148724和TL1TR002647的支持。Gonzalez Porras博士得到了美国国立卫生研究院国家糖尿病，消化和肾脏疾病研究所的支持，奖励号为F32-0DK122754。这项工作得到了美国国立卫生研究院（5SC1DK122578）和德克萨斯大学圣安东尼奥分校生物医学工程系的部分支持。内容完全由作者负责，并不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。数字部分是用 Biorender.com 创建的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aminocaproic Acid | Sigma Aldrich | A2504-100G | Added in DMEM at the concentration of 1 mg/mL |
| Blunt-Tipped Scissors | Fisher scientific | 12-000-172 | Sterilize in autoclave |
| Bovin Serum Albumin (BSA) | Millipore | 126575-10GM | Diluted in PBS to 4 mg/mL and 1 mg/mL |
| Collagenase Type 1 | Fisher scientific | NC9633623 | Diluted to 6 mg/mL in BSA 4 mg/mL, Digestion of minced fat |
| Dexamethasone | Thermo Scientific | AC230302500 | Diluted in ethanol at a 2 mg/ml stock concentration |
| Disposable underpads | Fisher scientific | 23-666-062 | For fluid absorption during surgery |
| Dissecting Scissors | Fisher scientific | 08-951-5 | Sterilize in autoclave |
| Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium (DMEM) | Fisher scientific | 11885092 | |
| Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM/F12) | Sigma Aldrich | D8062 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher scientific | 16140089 | Added in DMEM to 20% v/v. |
| Fibrinogen | Sigma Aldrich | F8630-25G | Solubilized in DMEM at the concentration of 20 mg/mL, Protein found in blood plasma and main component of hydrogel |
| Flask, 250 mL | Fisher scientific | FB500250 | Allows for digestion of fat using a large surface area |
| Forceps | Fisher scientific | 50-264-21 | Sterilize in autoclave, For handling of tissue and filters |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | Diluted in ethanol at a 10 mM stock concentration |
| Human MVF | Advanced Solutions Life Scienes, LLC | https://www.advancedsolutions.com/microvessels | Human MVFs (hMVFs) isolated from three different patients (52-, 54-, and 56-year old females) were used in the current study. |
| Indomethacine | Sigma Aldrich | I7378 | Diluted in ethanol at a 12.5 mM stock concentration |
| Insulin from porcine pancreas | Sigma Aldrich | I5523 | Diluted in 0.01 N HCl at a 5 mg/ml stock concentration |
| MycoZap | Fisher scientific | NC9023832 | Added in DMEM to 0.2% w/v, Mycoplasma Prophylactic |
| Pennycilin/Streptomycin (10,000 U/mL) | Fisher scientific | 15140122 | Added in DMEM to 1% v/v. |
| Petri dishes, polystyrene (100 mm x 15 mm). | Fisher scientific | 351029 | 3 for removal of blood vessels and mincing, 8 (lid) for presoaking of screens & 8 (dish) for use when filtering with 500 or 37 µM screens |
| Petri dishes, polystyrene (35 mm x 10 mm). | Fisher scientific | 50-202-036 | For counting fragments |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Fisher scientific | 14-190-250 | Diluted to 1x with sterile deionized water. |
| Rat Clippers (Andwin Mini Arco Pet Trimmer) | Fisher scientific | NC0854141 | |
| Rosiglitazone | Fisher scientific | R0106200MG | Diluted in DMSO at a 10 mM stock concentration |
| Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | 1 for initial incision, 1 for epididymal incision, 1 for tip clipping |
| Screen 37 µM | Carolina Biological Supply Company | 652222R | Cut into 3" rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Fragment entrapment and removal of very small fragments/single cells and debris |
| Screen 500 µM | Carolina Biological Supply Company | 652222F | Cut into 3" rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Removes larger fragments/debris |
| Serrated Hemostat | Fisher scientific | 12-000-171 | Sterilize in autoclave, For clamping of skin before incision |
| Steriflip Filter 0.22 μm | Millipore | SE1M179M6 | |
| Thrombin | Fisher scientific | 6051601KU | Diluted in deionzed water to 10 U/mL, Used as a clotting agent turning fibrinogen to fibrin |
| Thyroid hormone (T3) | Sigma Aldrich | T2877 | Diluted in 1N NaOH at a 0.02 mM stock concentration |
| Zucker diabetic fatty (ZDF) rats - obese (FA/FA) or lean (FA/+) male | Charles River | https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-lean-fa?region=3611 https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-obese?region=3611 |
Obtained from Charles River (Wilmington, MA). Rats were acquired at 4 weeks of age and fed Purina 5008 until euthanasia (15-19 weeks of age). Glucose levels (blood from the lateral saphenous vein) were greater than 300 mg/dL in all FA/FA rats used in the study. All animals were housed in a temperature-controlled environment with a 12-h light-dark cycle and fed ad libitum. |
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