Summary
Denne protokol beskriver fremstillingen og karakteriseringen af en fotoresponsiv prodrug-dye nanoassembly. Metoden til lægemiddelfrigivelse fra nanopartiklerne ved lysudløst demontering, herunder lysbestrålingsopsætningen, er eksplicit beskrevet. De lægemidler, der blev frigivet fra nanopartiklerne efter lysbestråling, udviste fremragende antispredningsvirkninger på humane kolorektal tumorceller.
Abstract
Selvmontering er en enkel, men pålidelig metode til konstruktion af lægemiddelleveringssystemer i nanoskala. Fotoaktiverbare prodrugs muliggør kontrollerbar lægemiddelfrigivelse fra nanobærere på målsteder moduleret af lysbestråling. I denne protokol præsenteres en let metode til fremstilling af fotoaktiverbare prodrug-dye nanopartikler via molekylær selvsamling. Procedurerne for prodrug syntese, nanopartikel fabrikation, fysisk karakterisering af nanoassembly, photocleavage demonstration, og in vitro cytotoksicitet verifikation er beskrevet detaljeret. Et fotospalterbart bor-dipyrromethen-chlorambucil (BC) prodrug blev først syntetiseret. BC og et nær-infrarødt farvestof, IR-783, i et optimeret forhold, kunne selv samle sig til nanopartikler (IR783 / BC NP'er). De syntetiserede nanopartikler havde en gennemsnitlig størrelse på 87, 22 nm og en overfladeladning på -29, 8 mV. Nanopartiklerne blev adskilt ved lysbestråling, hvilket kunne observeres ved transmission elektronisk mikroskopi. Fotospaltningen af BC blev afsluttet inden for 10 minutter med en 22% genvindingseffektivitet for chlorambucil. Nanopartiklerne udviste øget cytotoksicitet under lysbestråling ved 530 nm sammenlignet med de ikke-bestrålede nanopartikler og bestrålet frit BC-prodrug. Denne protokol giver en reference til konstruktion og evaluering af fotoresponsive lægemiddelafgivelsessystemer.
Introduction
Kemoterapi er en almindelig kræftbehandling, der anvender cytotoksiske midler til at dræbe kræftceller og dermed hæmmer tumorvækst1. Imidlertid kan patienter lide af bivirkninger såsom kardiotoksicitet og hepatotoksicitet på grund af absorptionen uden for målet af kemoterapilægemidlerne 2,3,4. Derfor er lokaliseret lægemiddelafgivelse gennem den rumlige tidsmæssige kontrol af lægemiddelfrigivelse / aktivering i tumorer afgørende for at minimere lægemiddeleksponering i normalt væv.
Prodrugs er kemisk modificerede lægemidler, der udviser reduceret toksicitet i normalt væv, samtidig med at deres virkning i syge læsioner bevares ved aktivering 5,6. Prodrugs kan reagere på en række stimuli, såsom pH7,8, enzymer 9,10, ultralyd 11,12, varme 13 og lys14,15,1 6, og frigive deres modermedicin specifikt i læsionerne. Ikke desto mindre udviser mange prodrugs iboende ulemper, såsom dårlig opløselighed, forkert absorptionshastighed og tidlig metabolisk destruktion, hvilket kan begrænse deres udvikling17. I denne sammenhæng giver dannelsen af prodrug nanosamlinger fordele som reducerede bivirkninger, in situ lægemiddelfrigivelse, bedre tilbageholdelse og kombinationen af behandling og billeddannelse, hvilket indikerer et stort anvendelsespotentiale for disse nanosamlinger. Mange prodrug nanosamlinger er blevet udviklet til sygdomsbehandling, herunder doxorubicin prodrug nanosfærer, curcumin prodrug miceller og camptothecin prodrug nanofibre18.
I denne protokol præsenterer vi en enkel metode til fremstilling af prodrug-dye nanosamlinger, der udviser højt prodrugindhold, god vanddispergerbarhed, langsigtet stabilitet og følsom responsevne. IR783 er et vandopløseligt nær-infrarødt farvestof, der kan tjene som stabilisator af nanosamlingerne19. Den anden komponent i nanosamlingen er bor-dipyrromethen-chlorambucil (BODIPY-Cb, BC), et prodrug, der blev designet af to hovedårsager. Da chlorambucil (Cb) viser systemisk toksicitet in vivo, kan prodrugformen reducere dens toksicitet20. BC-prodrug kan fotospaltes ved hjælp af 530 nm lysbestråling rettet mod sygdomslæsioner, hvilket muliggør lokal frigivelse af Cb. På den anden side er Cb tilbøjelig til hydrolyse i vandige miljøer og kan beskyttes ved at omdanne den til en prodrug form21. Således forventedes samsamlingen af BC-prodrug og IR-783-farvestoffet at danne et stabilt og effektivt lægemiddelleveringsnanosystem (figur 1A). Denne prodrug-dye nanoassembly forbedrer dispergerbarheden og stabiliteten af prodrug molekylerne, hvilket tyder på dets potentiale til anvendelse i lys-kontrollerbar lægemiddelafgivelse. Fotospaltningen af BC-prodrug muliggør demontering af nanopartikler og lysstyret frigivelse af Cb i læsionerne (supplerende figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Syntese af bor-dipyrromethen-chlorambucil (BC) prodrug (figur 2)22
- Syntese af BODIPY-OAc
- 1,903 g 2,4-dimethylpyrrol afvejes og opløses i 20 ml vandfri dichlormethan (DCM) i en rundbundet kolbe under nitrogenatmosfære. Der afvejes 1,638 g acetoxyacetylchlorid og tilsættes dråbevis i opløsningen. Omrør i 10 minutter ved stuetemperatur, og luks derefter opløsningen i 1 time ved 40 °C.
- Afkøl blandingen til stuetemperatur. 5,170 g N,N-diisopropylethylamin (DIPEA) afvejes og tilsættes dråbevis i blandingen under omrøring. Efter 30 minutter afvejes 5,677 g bortrifluoriddiethyletherat (BF3· OEt2), tilsæt det dråbevis i opløsningen, og bliv omrørt i yderligere 30 minutter.
- Der tilsættes 10 g silicagel (200-400 mesh) i blandingen, og opløsningsmidlet fjernes ved rotationsfordampning ved 45 °C. Stop fordampningen, når silicagelen vender tilbage til tørt pulver.
- Tilføj en fritte i bunden af en patron (se Materialetabel). Fyld silicagelen (fra trin 1.1.3) i cylinderampullen, og tilsæt derefter endnu en fritte i cylinderampullen øverst på den fyldte gel.
- Fastgør cylinderampullen i kraven, der er forbundet med flashkromatografisystemet (se materialetabellen), og drej den for at låse den. Installer patronen oven på seksvejsventilen i flashkromatografisystemet, og installer en flashsøjle (se materialetabellen) under ventilen.
- Start kromatografiinstrumentet, og indstil 515 nm og 365 nm som detektionsbølgelængder. Eluering udføres med 4/3 (v/v) hexan/DCM. Elueringsfraktionerne opsamles, når 515 nm-signalet vises.
- Opløsningsmidlet fjernes fra de opsamlede fraktioner ved rotationsfordampning ved 40 °C, indtil der ikke opsamles mere opløsningsmiddel i opløsningsmiddelopsamlingskolben. Anbring det faste produkt i et vakuumtørrekammer natten over for at fjerne resten af opløsningsmidlet.
- Syntese af BODIPY-OH
- Der afvejes 1,120 g BODIPY-OAc (syntetiseret i trin 1.1) og opløses i 70 ml tetrahydrofuran (THF) ved stuetemperatur, fuldt dækket med folie. Tilsæt 70 ml 0,1 M LiOH vandig opløsning dråbevis i BODIPY-OAc-opløsningen.
- Blandingen omrøres i 30 min, og opløsningsmidlet fjernes ved 40 °C ved rotationsfordampning, indtil der ikke opsamles mere opløsningsmiddel i opløsningsmiddelopsamlingskolben. Anbring resten i et vakuumtørrekammer natten over for at fjerne vand.
- Den tørre rest opløses i 30 ml DCM og tilsættes 10 g silicagel i opløsningen. Opløsningsmidlet fjernes ved rotationsfordampning ved 40 °C. Stop fordampningen, når silicagelen vender tilbage til tørt pulver.
- Produktet BODIPY-OH renses ved søjlekromatografi efter trin 1.1.4 til 1.1.6 med DCM alene som elueringsmiddel.
- Sammenlign fraktioner indsamlet på forskellige elueringstidspunkter med en THF-opløsning af BODIPY-OAc på tyndtlagskromatografi (TLC), og identificer produktet23.
- Der anbringes 3-4 μL af den eluerede fraktion og BODIPY-OAc-opløsningen separat på den ene kant af en TLC-plade i samme højde. TLC-pladen anbringes i et glaskammer indeholdende 1 ml DCM, hvorved den plettede kant nedsænkes i DCM-opløsningsmidlet, men med de to pletter ude af opløsningsmidlet.
- Tag TLC-pladen ud, når DCM-opløsningsmidlet når over halvdelen af pladens højde. Vælg den eluerede fraktion med et TLC-punkt i en anden højde end BODIPY-OAc-punktet.
- Opløsningsmidlet fjernes ved rotationsfordampning ved 40 °C (trin 1.1.7) for at opnå produktet BODIPY-OH.
- Syntese af BODIPY-(Me)2-OH
- Der afvejes 313 mg BODIPY-OH og opløses i 35 ml vandfri diethylether i mørke under nitrogenatmosfære. Tilsæt 3,75 ml methylmagnesiumiodid (3 M i diethylether) dråbevis i opløsningen og omrør i 3 timer ved stuetemperatur.
- Sluk reaktionen ved at tilsætte 3,5 ml vand dråbevis.
- Uddrag blandingen med DCM og vand.
- Overfør blandingen til en 125 ml skilletragt. Tilsæt 20 ml DCM i blandingen.
- Luk hætten på separatortragten. Vip tragten omkring 45°, og ryst tragten let. Åbn hætten for at tømme den. Gentag dette trin 3 gange, og lad det stå i 3 min.
- Åbn bundventilen og saml den nedre organiske fase i et bægerglas.
- Tilsæt 30 ml DCM til den vandige fase. Udsugningen (trin 1.3.3.2 og 1.3.3.3) gentages 3 gange med 30 ml DCM hver gang.
- Der tilsættes 10 g fast stofNa2SO4 i den opsamlede organiske fase for at tørre den organiske fase natten over.
- Forbind en filtreringskolbe med en vakuumpumpe med et gummirør. Læg et stykke filterpapir på Büchner-tragten, og sæt tragten i toppen af kolben. Våd filterpapiret med 1 ml DCM, overfør blandingen til tragten, og tænd vakuumpumpen. Opsaml den organiske opløsning i kolben.
- Tilsæt 10 g silicagel i den organiske opløsning. Det organiske opløsningsmiddel fjernes ved rotationsfordampning ved 40 °C, indtil silicagelen vender tilbage til tørt pulver. Produktet BODIPY-(Me)2-OH renses ved søjlekromatografi (trin 1.1.4 til 1.1.6) med hexan/DCM = 1/1 (v/v) som elueringsmiddel.
- De eluerede fraktioner, der indeholder produktet, vælges ved hjælp af TLC-analyse som beskrevet i trin 1.2.5 (TLC-spot i en anden højde end BODIPY-OH). Opløsningsmidlet fjernes ved rotationsfordampning ved 40 °C for at opnå produktet som beskrevet i trin 1.1.7.
- Syntese af BODIPY-(Me)2-I 2-OH
- 41 mg BODIPY-(Me)2-OH afvejes og opløses i 2,5 ml vandfri THF i mørke under nitrogenatmosfære. 74 mg N-iodosuccinimid afvejes og opløses i 1 ml vandfri THF.
- Tilsæt N-iodosuccinimidopløsningen dråbevis i BODIPY-(Me)2-OH-opløsningen. Efter omrøring i 3,5 timer ved stuetemperatur fjernes opløsningsmidlet ved rotationsfordampning ved 40 °C, indtil der ikke opsamles mere opløsningsmiddel i opløsningsmiddelopsamlingskolben på rotationsfordamperen.
- Remanensen opløses i 10 ml DCM og vaskes 3 gange med 30 ml vand hver gang som beskrevet i trin 1.3.3. Den organiske fase tørres medNa2SO4 (trin 1.3.4 og 1.3.5). Opløsningsmidlet fjernes ved rotationsfordampning ved 40 °C (trin 1.1.7) for at opnå produktet BODIPY-(Me)2-I 2-OH.
- Syntese af BODIPY-CB
- Der afvejes 85 mg chlorambucil og opløses i 2 ml vandfri DCM i mørke under nitrogenatmosfære. 69 mg N,N'-dicyclohexylcarbodiimid afvejes og opløses i 1 ml vandfrit DCM. Tilsæt det dråbevis i chlorambucilopløsningen under omrøring i 10 minutter.
- 1,7 mg 4-dimethylaminopyridin opløses i 0,5 ml vandfri DCM. Tilsæt denne opløsning i blandingen og bliv omrørt i 10 minutter ved stuetemperatur. Derefter tilsættes 73 mg BODIPY-(Me)2-I 2-OH opløst i 2 ml vandfri DCM og omrøres i2 timer.
- Der tilsættes 10 g silicagel i blandingen, og opløsningsmidlet fjernes ved rotationsfordampning ved 40 °C. Stop fordampningen, når silicagelen vender tilbage til tørt pulver. Produktet BODIPY-Cb renses ved søjlekromatografi (trin 1.1.4 til 1.1.6, 540 nm og 365 nm signalbølgelængde) med hexan/DCM = 7/3 (v/v) som elueringsmiddel.
- De eluerede fraktioner, der indeholder produktet, er forskellige fra BODIPY-(Me)2-I 2-OH ved hjælp af TLC-analyse (trin 1.2.5). Opløsningsmidlet fjernes ved rotationsfordampning ved 40 °C (trin 1.1.7) for at opnå produktet BODIPY-Cb.
2. Fremstilling af IR783/BC NP'er ved flashudfældningsmetoden
- Der afvejes 10 mg BC-prodrug (BODIPY-Cb) og opløses i 1 ml DMSO i et 1,5 ml mikroglas for at opnå en 10 mg/ml stamopløsning. Dæk BC-opløsningen med folie.
- Forbered 300 μL 0,4 mg / ml IR-783 i filtreret deioniseret vand i et 1,5 ml mikrorør. Placer dette mikrorør på en hvirvelblander ved 1.500 o / min.
- Der tilsættes 20 μL BC-opløsningen i DMSO til IR-783-opløsningen over 10 s med konstant hastighed ved hjælp af en 20 μL pipette. Enden af pipettespidsen skal berøre mikrorørets indre væg (figur 1B).
- Opbevar mikrorøret på hvirvelblanderen i yderligere 30 s for at opnå IR783/BC NP-opløsningen. Placer derefter nanopartikelopløsningen på et stativ, der er helt dækket af folie.
- Den resulterende IR783/BC NP-opløsning centrifugeres i 10 minutter ved 2.000 x g og 4 °C for at fjerne tilslag. Supernatanten opsamles, og der efterlades ~20 μL i røret for at undgå at forstyrre pelletsen. Kassér pelleten.
- Supernatanten centrifugeres to gange i 30 minutter ved 30 000 x g og 4 °C, og nanopartikelbundfaldet opsamles fra begge centrifugeringer. Resuspender nanopartiklerne i 300 μL 1x PBS.
BEMÆRK: Når det hydrofobe BC-prodrug i DMSO spredes i vand med hvirvelstrøm, opløses DMSO'en af vand, og prodrugmolekylerne har tendens til at danne nanoskalasamlinger for at holde sig stabile under den lokale overmætningssituation24. - Kvantificer indholdet af IR-783 og BC ved højtryksvæskekromatografi (HPLC) ved hjælp af elueringsmetoden vist i tabel 1.
BEMÆRK: HPLC-prøven fremstilles ved at blande lige store mængder nanopartikelopløsning og acetonitril. Injektionsvolumenet er 20 μL. Detektionsbølgelængden for chlorambucil og BC prodrug er 260 nm, og detektionsbølgelængden for IR783 er 783 nm. HPLC-søjlen er en analytisk C18-søjle på 4,6 mm (indvendig diameter) x 100 mm (længde) med en partikelstørrelse på 2,7 μm og porestørrelse på 120 Å. - Beregn prodrug indkapslingseffektivitet (EE%) og belastningskapacitet (LC%) i henhold til følgende ligninger:
| Tid (min.) | Acetonitril (%) | Vand (%) |
| 0 | 20 | 80 |
| 5 | 20 | 80 |
| 30 | 95 | 5 |
| 35 | 95 | 5 |
Tabel 1: HPLC-metode til kvalitativ og kvantitativ analyse af BC-prodrug og dets fotospaltning. Gengivet med tilladelse25. Ophavsret 2022, Wiley.
3. Karakterisering af IR783/BC NP'er
- Mål den gennemsnitlige størrelse af IR783/BC NP'erne med et dynamisk lysspredningsinstrument (DLS) (se materialetabel). Tilsæt 200 μL IR783/BC NP-opløsning i en kuvette, og sæt kuvetten i holderen til måling. Indstil måletypen som 'størrelse' og måletemperaturen til 25 °C. Udfør tre målinger med en varighed på 20 s for hver måling.
- Mål overfladeladningen af IR783/BC NP'erne med DLS-instrumentet ved hjælp af en zeta-potentiel testkuvette.
- 25 μL IR783/BC NP-opløsning fortyndes med 725 μL deioniseret vand i et 1,5 ml mikrorør, og opløsningen tilsættes til en zetapotentialetestkuvette. Anbring kuvetten i prøverillen. Sæt låg på prøverillen.
- Indstil måletypen som 'zetapotentiale' og måletemperaturen til 25 °C. Udfør 10 målinger.
- Forbered prøverne til transmissionselektronmikroskopi (TEM) billeddannelse. Der tilsættes 10 μL IR783/BC NP-opløsning på et stykke hullet kulstoffilm på et kobbergitter (300 mesh), og 7 μL fjernes. Lad 3 μL opløsning ligge på filmen natten over til automatisk fordampning.
BEMÆRK: Tilsætning af 10 μL af NP-opløsningen efterfulgt af fjernelse af 7 μL gør det muligt for dråben at dække et bredere område på filmen.
4. Fotoaktivering af NP'er fra IR783/BC
- Opsæt en LED-lampe (530 nm; se Materialetabel) med et strygejernstativ, så lyset vender direkte mod operationsgulvet. Placer et integrerende kuglefotodiodefotometer (se materialetabellen) direkte under LED-lampen.
BEMÆRK: For at forhindre påvirkning af omgivende lys udføres alle lysbestrålingseksperimenter i et mørkekammer. - Tænd LED-lampen, og åbn fotometerets hætte. Registrer bestrålingen, og indstil lampeparametrene ved hjælp af den tilhørende software (se materialetabel). Juster indgangsstrømmen (mA) for at indstille bestrålingen til 50 mW/cm2.
BEMÆRK: Bestrålingen påvirkes også af afstanden mellem LED-lampen og fotometeret. I den opsætning, der bruges her (figur 3A,B), er afstanden fastsat til 5 cm. - IR783/BC NP-opløsningen fortyndes med deioniseret vand til 50 μM baseret på BC-koncentrationen. Der tilsættes 200 μL af IR783/BC NP-opløsningen i et 1,5 ml mikrorør. Røret anbringes på en skumblok med en rilletilpasningsstørrelse på mikrorøret og samme højde som fotometeret i trin 4.1 (figur 3C, D).
- Åbn rørets hætte. Tænd LED-lampen og bestråle nanopartikelopløsningen i 1, 2, 3, 5, 7 og 10 min.
- Kvantificer BC-forbrug og Cb-frigivelse ved HPLC efter lysbestråling. Beregn procentdelen af resterende BC- og Cb-frigivelse ved hjælp af følgende ligninger:
5. Test af cytotoksicitet af IR783/BC NP'er med og uden lysbestråling
- Dyrkning HCT116-celler (human kolorektal tumorcellelinje) i RPMI 1640-medium indeholdende 10% føtalt bovint serum og 1% Penicillin-Streptomycin (komplet medium) i en 5% CO 2 atmosfære ved 37 ° C (~2 x 106 celler pr. Skål i en 90 mm cellekulturskål). Subkultur cellerne rutinemæssigt hver 2-3 dage.
BEMÆRK: HCT116 er en human tyktarmscellelinje. Sammenlignet med andre kræftceller såsom HeLa-, MCF7- og A549-celler udtrykker HCT-116-celler et højere niveau af caveolin-125, som kan målrettes af IR783 og forbedre den cellulære optagelse af IR783 / BC NP'er. - Plade HCT116-cellerne i 96-brønd plader med RPMI 1640 komplet medium ved en densitet på 104 celler pr. Brønd.
- Opsug mediet fra kulturskålen, når cellesammenløbet overstiger 50%. Vask cellerne med 1x PBS og fjern PBS. Tilsæt 1 ml 0,25% trypsinopløsning og inkuber ved 37 °C i en 5% CO2 inkubator.
- Efter 3 minutter tilsættes 2 ml komplet medium for at slukke trypsinfordøjelsen. Resuspender cellerne, overfør cellesuspensionen til et 15 ml centrifugeringsrør, og centrifuger ved 300 x g i 3 min. Supernatanten kasseres, og cellepelletsen resuspenderes i 1 ml hele substrat.
- 10 μL af cellesuspensionen fortyndes til 200 μL med komplet substrat. Placer 10 μL på et hæmocytometer og dæk det med en dæksel.
- Overhold hæmocytometeret under et mikroskop (okular: 10x; objektiv linse: 4x). Tæl og registrer cellenumrene i de fire hjørnefirkanter og midten. Beregn cellekoncentrationen ved hjælp af formlen:
Hvor n = gennemsnittet af cellenumrene i de fem kvadrater. - Fortynd cellesuspensionen til 1 x 105 celler/ml. Tilsæt 100 μL af cellesuspensionen pr. hul i en plade med 96 brønde for at så cellerne. Der tilsættes 100 μL PBS pr. hul i de ikke-seedede huller.
- Behandl cellerne med (1) 0,1-150 μM fri BC, (2) 0,1-150 μM IR783/BC NP'er (baseret på BC-koncentration), (3) 0,1-150 μM fri BC med lysbestråling eller (4) 0,1-150 μM IR783/BC NP'er (baseret på BC-koncentration) med lysbestråling. Cellerne inkuberes ved 37 °C i en 5% CO2 inkubator i 6 timer.
BEMÆRK: De frie BC- og IR783/BC NP-opløsninger fortyndes fra deres respektive stamopløsninger med komplet medium. - Efter 6 timers inkubation erstattes det prodrug/nanopartikler-holdige medium med frisk, komplet medium. De ikke-bestrålede gruppe 1 og 2 inkuberes i mørke i 24 timer. For gruppe 3 og 4 bestråles cellerne med en 530 nm LED-lampe (50 mW/cm2) i 5 minutter og inkuberes i 24 timer.
BEMÆRK: Celleplader placeres på en skumblok for at sikre samme højde som fotometeret i trin 4.1. - Cellelevedygtigheden bestemmes med 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-assay.
- Efter BC- eller nanopartikelbehandlingen tilsættes 10 μL MTT (10 mg/ml i PBS) til hvert hul, og pladerne inkuberes ved 37 °C i 3 timer. Fjern derefter mediet og tilsæt 100 μL DMSO til hvert hul. Absorbansen aflæses med en mikropladelæser ved 490 nm, 570 nm og 630 nm.
- Beregn cellelevedygtigheden ved hjælp af følgende ligning:
BEMÆRK: Fire uafhængige eksperimenter (n = 4) af hver gruppe udføres til analyse. OD490 kan erstattes af OD570-OD 630 ved beregning af cellelevedygtighed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
IR783 / BC NP'er blev med succes fremstillet i denne undersøgelse ved hjælp af en flashudfældningsmetode. De syntetiserede IR783 / BC NP'er præsenteret som en lilla opløsning, mens den vandige opløsning af IR783 var blå (figur 4A). Som vist i figur 4B udviste NP'erne IR783/BC en gennemsnitlig størrelse på ca. 87,22 nm med et polydispersitetsindeks (PDI) på 0,089, hvilket viser en smal størrelsesfordeling. Overfladeladningen af IR783 / NP'erne var ca. -29,8 mV (figur 4C), hvilket kunne tilskrives de negativt ladede sulfonatgrupper af IR783. Figur 4D viser stabiliteten af IR783/BC NP'erne. Nanopartiklernes størrelse blev holdt på omkring 85 nm i mindst 48 timer (i PBS ved 37 °C) efter fremstilling, mens dens PDI også forblev mindre end 0,2. Der blev ikke observeret nogen signifikant ændring i størrelsesfordelingen af IR783/BC NP'er ved 0 timer, 24 timer og 48 timer efter fremstilling (figur 4E).
Figur 5A,B viser morfologien af IR783/BC NP'er før og efter lysbestråling. Både aggregater og fragmenter kunne observeres efter lysbestråling, hvilket indikerer henholdsvis dissociation og aggregering af nanopartiklerne. Figur 5C viser ændringen i nanopartikelstørrelse og dens fordeling efter 3 min og 5 min lysbestråling. Der blev observeret en øget størrelse og bredere fordeling for de bestrålede nanopartikler. Fotofrigivelsesprofilerne for IR783/BC NP'erne blev også målt ved HPLC. Som vist i figur 5D,E blev prodrug BC fotospaltet på 10 minutter. I mellemtiden blev Cb frigivet med en genopretningseffektivitet på omkring 22% inden for samme periode.
IR783/BC NP'erne viste signifikant cytotoksicitet på humane kolorektal tumorceller (HCT116) under lysbestråling ved 530 nm sammenlignet med gruppen uden bestråling (figur 6). IC50 for IR783/BC NP'er med lysbestråling (6,62 μM) var lavere end for fri BC med lysbestråling (9,24 μM), hvilket viser en højere in vitro antitumoreffekt af IR783/BC NP'er med lysbestråling end for fri BC med lysbestråling25. Den præsenterede cytotoksicitet skyldtes både frigivet Cb og genererede reaktive iltarter (ROS) (supplerende figur 1 og supplerende figur 2). Den højere cytotoksicitet af IR783/BC NP'erne under lysbestråling skyldtes hovedsagelig den effektive cellulære optagelse af IR783/BC NP'erne25.
Figur 1: Dannelse af NP'er fra IR783/BC. (A) Selvmontering og lysudløst dissociation af NP'er fra IR783/BC. (B) Fabrikationsskema for NP'er fra IR783/BC ved flashudfældning. Gengivet med tilladelse25. Ophavsret 2022, Wiley. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Syntesevej for prodrug BODIPY-Cb (BC). BODIPY derivater blev først syntetiseret fra acetoxyacetylchlorid og 2,4-dimethylpyrrol og derefter konjugeret med Cb. 1H-NMR spektrum af BC prodrug er vist i supplerende figur 3. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Opsætning af LED-bestråling. (A,B) LED-lampeindstilling til måling af bestråling. (C,D) LED-lampeindstilling til bestråling af IR783/BC NP'er. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Karakterisering af IR783/BC NP'er. (A) Udseende af frie IR783-, frie BC- og IR783/BC NP-løsninger. (B) Størrelsesfordeling af NP'er IR783/BC. (C) Overfladeladning af NP'er IR783/BC. (D) Ændring af størrelsen af NP'er IR783/BC i PBS ved 37 °C i løbet af 48 timer efter fremstilling. (E) Størrelsesfordeling af NP'er IR783/BC ved 0 h, 24 timer og 48 timer efter fremstilling. Gengivet med tilladelse25. Ophavsret 2022, Wiley. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Fotofrigivelse af NP'er fra IR783/BC . TEM-billeder af IR783/BC NP'er (A) før og (B) efter lysbestråling. Skalabjælke = 100 μm. (C) Størrelsesfordeling af IR783/NP'er efter 0 min, 3 minutter og 5 minutters lysbestråling. D) HPLC-analyse af NP'er IR783/BC, der udsættes for øget varighed af lysbestråling indtil 10 min. E) Kvantificering af BC- og IR783-nedbrydning og Cb-frigivelse (n = 3). Fejlbjælker repræsenterer standardafvigelse. Lysbestråling: 530 nm LED-lampe, 50 mW/cm2. Gengivet med tilladelse25. Ophavsret 2022, Wiley. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Cytotoksicitet af IR783/BC NP'er mod HCT116-celler. Signifikant cytotoksicitet forekom ved BC-koncentrationer >1 μM (n = 4). Fejlbjælker repræsenterer standardafvigelse. En uafhængig prøve t-test blev vedtaget for at bestemme den statistiske signifikans af forskelle. *p < 0,05, **p < 0,01. Lysbestråling: 530 nm LED-lampe, 50 mW/cm2. Gengivet med tilladelse25. Ophavsret 2022, Wiley. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1: Fotokemisk mekanisme. (A) Fotospaltning af BC prodrug. (B) Nedbrydning af IR783. Tilpasset med tilladelse25. Ophavsret 2022, Wiley. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 2: ROS-generationsprofil. ROS-generering af forskellige prøver under lysbestråling kvantificeret med en singlet oxygensensor grøn (SOSG) sonde. Lysbestråling: 530 nm LED-lampe, 50 mW/cm2. Tilpasset med tilladelse25. Ophavsret 2022, Wiley. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 3: 1H-NMR-spektrum af BODIPY-Cb. Genoptrykt med tilladelse22. Ophavsret 2022, American Chemical Society. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol skitserer en let flashudfældningsmetode til fremstilling af prodrug-dye nanopartikler, som tilbyder en enkel og bekvem tilgang til nanopartikeldannelse. Der er flere kritiske trin i denne metode. For det første skal beholdere som mikrorør for alle trin i syntese, fabrikation og karakterisering dækkes med folie for at undgå unødvendig fotospaltning af BC-prodrug ved miljølys. Desuden skal mikrorøret indeholdende IR-783-opløsningen i flashudfældningstrinnet placeres stabilt på hvirvelblanderen, mens BC-prodrugopløsningen langsomt tilsættes. På denne måde kan BC-prodrugopløsningen (i DMSO) spredes ensartet i IR-783-opløsningen. I rensningstrinnet anvendes en differentiel centrifugeringsmetode. Den første centrifugering ved 2.000 x g bruges til at fjerne de ubelastede BC-prodrug faste stoffer, mens den anden centrifugering ved 30.000 x g fjerner DMSO og IR783 i supernatanten, der ikke er inkorporeret i nanopartiklerne. IR783/BC NP'er kan derefter opsamles som bundfald og resuspenderes i filtreret deioniseret vand.
Selvmontering er en enkel og effektiv metode til fremstilling af nanopartikler. Selvmonteringsmetoden skal dog optimeres i henhold til faktorer som byggestens hydrofobicitet. I denne protokol er en af komponenterne, IR783, et vandopløseligt farvestof, der opløses i vand. I nogle tilfælde kan alle komponenter dog være hydrofobe. Under en sådan omstændighed bør de opløses i DMSO ligesom BC-prodrug i denne protokol. En stabilisator såsom 1, 2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-Poly (ethylenglycol) (DSPE-PEG) kan bruges til at hjælpe med at danne og stabilisere selvmonterede nanopartikler 14,26,27.
Lys har begrænset vævspenetration, hvilket begrænser anvendelsen af fotoaktiverbare nanopartikler i klinisk brug. En løsning er at udvikle lysaktiverbare systemer med lang bølgelængde, såsom rødt eller nærinfrarødt lys28. Brug af optiske fibre til at levere lys er en anden måde at løse det begrænsede vævsindtrængningsproblem med lys for nogle sygdomslæsioner29. Desuden er samsamlingen af komponenter hovedsageligt afhængig af intermolekylære kræfter såsom hydrofob interaktion, π-π-stabling og hydrogenbinding, hvilket tyder på, at denne metode muligvis ikke er anvendelig på alle prodrug- og farvestofmolekyler30. Muligheden for at samle funktionelle molekyler som lægemidler, prodrugs, farvestoffer, fotosensibilisatorer og fototermiske midler skal evalueres gennem teoretisk beregning og eksperimentel karakterisering.
Det fotoaktiverbare prodrug-dye nanoscale drug delivery system har flere fordele. For det første kan farvestoffer som IR783 nedbrydes under lysbestråling, hvilket efterfølgende muliggør lokal og specifik adskillelse af nanopartiklerne25. Desuden kan det inkorporerede farvestof fungere som et billeddannelsesmiddel til overvågning af lægemiddelafgivelsessystemet, hvor dets fluorescens bruges til at spore akkumulering og demontering af nanopartiklerne. Derudover er indocyaninfarvestoffer med sulfonatgrupper blevet rapporteret at være i stand til at målrette caveolae i nogle kræftformer19, hvilket muliggør effektiv cellulær optagelse af lægemiddelafgivelsessystemerne25. Således har indocyaninfarvestoffer med lignende strukturer stort potentiale for inkorporering i sådanne lægemiddelafgivelsessystemer.
Der har hidtil kun været få publikationer om standardisering af operationer vedrørende fotoaktivering af nano-lægemiddelafgivelsessystemer31. Således kan protokollen beskrevet her tjene som en nyttig reference til udvikling af fotoresponsive lægemiddelafgivelsessystemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Der er indgivet en PCT-ansøgning til nr.PCT/CN2021/081262.
Acknowledgments
Vi anerkender bistand fra University of Hong Kong Li Ka Shing Faculty of Medicine Faculty Core Facility. Vi takker professor Chi-Ming Che ved University of Hong Kong for at levere den menneskelige HCT116-cellelinje. Dette arbejde blev støttet af Ming Wai Lau Center for Reparative Medicine Associate Member Program og Research Grants Council of Hong Kong (Early Career Scheme, nr. 27115220).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1260 Infinity II HPLC | Agilent Technologies | ||
| 2,4-Dimethyl pyrrole | J&K Scientific | 315305 | |
| 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT) | Gibco | M6494 | |
| 4-Dimethylaminopyridine (4-DMAP) | J&K Scientific | 212279 | |
| 90 mm Petri Dish Clear Treated Sterile | SPL | 11090 | |
| 96-well Tissue Culture Plate Clear Treated Sterile | SPL | 30096 | |
| Acetoxyacetyl chloride | J&K Scientific | 192001 | |
| Boron trifluoride diethyl etherate | J&K Scientific | 921076 | |
| Büchner funnel | AS ONE | 3-6466-01 | |
| Chlorambucil | J&K Scientific | 321407-1G | |
| CM100 Transmission Electron Microscope | Philips | ||
| CombiFlash RF chromatography system | Teledyne ISCO | ||
| Dichloromethane | DUKSAN Pure Chemicals | JT9315-88 | |
| Dimethyl sulfoxide | DUKSAN Pure Chemicals | 2762 | |
| Disposable cuvette | Malvern Panalytical | DTS1070 | Zeta potential measurement |
| Disposable cuvette | Malvern Panalytical | ZEN0040 | |
| Empty Disposable Sample Load Cartridges | Teledyne ISCO | 693873225 | can hold up to 65 g |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270106 | |
| Filtering flask | AS ONE | 3-7089-03 | |
| Hexane | DUKSAN Pure Chemicals | 4198 | |
| Holey carbon film on copper grid | Beijing Zhongjingkeyi Technology Co.,Ltd | BZ10023a | |
| HPLC column (InfinityLab Poroshell 120) | Agilent Technologies | 695975-902T | |
| Integrating sphere photodiode power sensor | Thorlabs | S142C | |
| IR783 | Tokyo Chemical Industry (TCI) Co., Ltd | I1031 | |
| LED | Mightex | LCS-0530-15-11 | |
| LED Driver Control Panel V3.2.0 (Software) | Mightex | ||
| Lithium Hydroxide Anhydrous | TCI | L0225 | |
| Methylmagnesium iodide, 3M solution in diethyl ether | Aladdin | M140783 | |
| N,N-Diisopropyl ethyl amine (DIPEA) | J&K Scientific | 203402 | |
| N,N'-Dicyclohexylcarbodiimide (DCC) | J&K Scientific | 275928 | |
| penicillin–streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate-buffered saline (10×) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| Power and energy meter | Thorlabs | PM100 USB | |
| Rotavapor | BUCHI Rotavapor R300 | ||
| RMPI 1640 | Gibco | 21870076 | |
| Separatory funnel (125 mL) | Synthware | F474125L | |
| Silver Silica Gel Disposable Flash Columns, 40 g | Teledyne ISCO | 692203340 | |
| Sodium sulfate, anhydrous | Alfa Aesar | A19890 | |
| SpectraMax M4 | Molecular Devices LLC | ||
| Tetrahydrofuran (THF), anhydrous | J&K Scientific | 943616 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | |
| Vortex | DLAB Scientific Co., Ltd | MX-S | |
| Zetasizer Nano ZS90 | Malvern Instrument |
References
- Chabner, B. A., Roberts, T. G. Chemotherapy and the war on cancer. Nature Reviews Cancer. 5 (1), 65-72 (2005).
- Monsuez, J. -J., Charniot, J. -C., Vignat, N., Artigou, J. -Y.
- Floyd, J., Mirza, I., Sachs, B., Perry, M. C.
- Bar-Joseph, H., Stemmer, S. M., Tsarfaty, I., Shalgi, R., Ben-Aharon, I. Chemotherapy-induced vascular toxicity-real-time in vivo imaging of vessel impairment. Journal of Visualized Experiments. (95), e51650 (2015).
- Denny, W. A.
- Kastrati, I., Delgado-Rivera, L., Georgieva, G., Thatcher, G. R. J., Frasor, J. Synthesis and characterization of an aspirin-fumarate prodrug that inhibits NFκB activity and breast cancer stem cells. Journal of Visualized Experiments. (119), e54798 (2017).
- Mao, J., et al. A simple dual-pH responsive prodrug-based polymeric micelles for drug delivery. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (27), 17109-17117 (2016).
- Li, S. -Y., et al. A pH-responsive prodrug for real-time drug release monitoring and targeted cancer therapy. Chemical Communications. 50 (80), 11852-11855 (2014).
- Andresen, T. L., Thompson, D. H., Kaasgaard, T. Enzyme-triggered nanomedicine: Drug release strategies in cancer therapy (Invited Review). Molecular Membrane Biology. 27 (7), 353-363 (2010).
- Xu, G., McLeod, H. L. Strategies for enzyme/prodrug cancer therapy. Clinical Cancer Research. 7 (11), 3314-3324 (2001).
- Luo, W., et al. Dual-targeted and pH-sensitive doxorubicin prodrug-microbubble complex with ultrasound for tumor treatment. Theranostics. 7 (2), 452 (2017).
- Gao, J., et al. Ultrasound triggered phase-change nanodroplets for doxorubicin prodrug delivery and ultrasound diagnosis: An in vitro study. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 174, 416-425 (2019).
- Brade, A. M., Szmitko, P., Ngo, D., Liu, F. -F., Klamut, H. J. Heat-directed suicide gene therapy for breast cancer. Cancer Gene Therapy. 10 (4), 294-301 (2003).
- Long, K., et al. One-photon red light-triggered disassembly of small-molecule nanoparticles for drug delivery. Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 357 (2021).
- Liu, Y., Long, K., Kang, W., Wang, T., Wang, W. Optochemical control of immune checkpoint blockade via light-triggered PD-L1 dimerization. Advanced NanoBiomed Research. 2 (6), 2200017 (2022).
- Wang, T., et al. Optochemical control of mTOR signaling and mTOR-dependent autophagy. ACS Pharmacology & Translational Science. 5 (3), 149-155 (2022).
- Abet, V., Filace, F., Recio, J., Alvarez-Builla, J., Burgos, C. Prodrug approach: An overview of recent cases. European Journal of Medicinal Chemistry. 127, 810-827 (2017).
- Li, G., et al. Small-molecule prodrug nanoassemblies: an emerging nanoplatform for anticancer drug delivery. Small. 17 (52), 2101460 (2021).
- Shamay, Y., et al. Quantitative self-assembly prediction yields targeted nanomedicines. Nature Materials. 17 (4), 361-368 (2018).
- Sinoway, P. A., Callen, J. P.
- Owen, W. R., Stewart, P. J. Kinetics and mechanism of chlorambucil hydrolysis. Journal of Pharmaceutical Sciences. 68 (8), 992-996 (1979).
- Lv, W., et al. Upconversion-like photolysis of BODIPY-based prodrugs via a one-photon process. Journal of the American Chemical Society. 141 (44), 17482-17486 (2019).
- Silver, J. Let us teach proper thin layer chromatography technique. Journal of Chemical Education. 97 (12), 4217-4219 (2020).
- Saad, W. S., Prud'homme, R. K. Principles of nanoparticle formation by flash nanoprecipitation. Nano Today. 11 (2), 212-227 (2016).
- Long, K., et al. Photoresponsive prodrug-dye nanoassembly for in-situ monitorable cancer therapy. Bioengineering & Translational Medicine. 7 (3), 10311 (2022).
- Zhong, T., et al. A self-assembling nanomedicine of conjugated linoleic acid-paclitaxel conjugate (CLA-PTX) with higher drug loading and carrier-free characteristic. Scientific Reports. 6 (1), 36614 (2016).
- Long, K., et al. Green light-triggered intraocular drug release for intravenous chemotherapy of retinoblastoma. Advanced Science. 8 (20), 2101754 (2021).
- Lv, W., Wang, W. One-photon upconversion-like photolysis: a new strategy to achieve long-wavelength light-excitable photolysis. Synlett. 31 (12), 1129-1134 (2020).
- Rwei, A. Y., Wang, W., Kohane, D. S. Photoresponsive nanoparticles for drug delivery. Nano Today. 10 (4), 451-467 (2015).
- Grzelczak, M., Vermant, J., Furst, E. M., Liz-Marzán, L. M.
- Gnanasammandhan, M. K., Idris, N. M., Bansal, A., Huang, K., Zhang, Y. Near-IR photoactivation using mesoporous silica-coated NaYF4:Yb,Er/Tm upconversion nanoparticles. Nature Protocols. 11 (4), 688-713 (2016).
