Summary
Dit protocol beschrijft de fabricage en karakterisering van een fotoresponsieve prodrug-kleurstof nanoassemblage. De methodologie voor het vrijkomen van geneesmiddelen uit de nanodeeltjes door door licht veroorzaakte demontage, inclusief de lichtbestralingsopstelling, wordt expliciet beschreven. De geneesmiddelen die vrijkwamen uit de nanodeeltjes na lichtbestraling vertoonden uitstekende antiproliferatie-effecten op menselijke colorectale tumorcellen.
Abstract
Zelfassemblage is een eenvoudige maar betrouwbare methode voor het bouwen van medicijnafgiftesystemen op nanoschaal. Foto-activeerbare prodrugs maken een controleerbare medicijnafgifte mogelijk van nanodragers op doellocaties die worden gemoduleerd door lichtbestraling. In dit protocol wordt een eenvoudige methode gepresenteerd voor het fabriceren van foto-activeerbare prodrug-kleurstof nanodeeltjes via moleculaire zelfassemblage. De procedures voor prodrugsynthese, fabricage van nanodeeltjes, fysische karakterisering van de nanoassemblage, demonstratie van fotosplitsing en in vitro cytotoxiciteitsverificatie worden in detail beschreven. Een fotocleavable borium-dipyrrometheen-chloorambucil (BC) prodrug werd voor het eerst gesynthetiseerd. BC en een nabij-infrarode kleurstof, IR-783, met een geoptimaliseerde verhouding, zouden zichzelf kunnen assembleren tot nanodeeltjes (IR783 / BC NPs). De gesynthetiseerde nanodeeltjes hadden een gemiddelde grootte van 87,22 nm en een oppervlaktelading van -29,8 mV. De nanodeeltjes werden gedemonteerd bij lichtbestraling, die kon worden waargenomen door transmissie-elektronische microscopie. De fotosplitsing van BC was binnen 10 minuten voltooid, met een herstelefficiëntie van 22% voor chloorambucil. De nanodeeltjes vertoonden een verhoogde cytotoxiciteit onder lichtbestraling bij 530 nm in vergelijking met de niet-bestraalde nanodeeltjes en bestraalde vrije BC-prodrug. Dit protocol biedt een referentie voor de constructie en evaluatie van fotoresponsieve medicijnafgiftesystemen.
Introduction
Chemotherapie is een veel voorkomende kankerbehandeling die cytotoxische middelen gebruikt om kankercellen te doden en zo de tumorgroei remt1. Patiënten kunnen echter last hebben van bijwerkingen zoals cardiotoxiciteit en hepatotoxiciteit als gevolg van de off-target absorptie van de chemotherapiegeneesmiddelen 2,3,4. Daarom is gelokaliseerde medicijnafgifte door middel van de spatiotemporele controle van medicijnafgifte / activering in tumoren essentieel om de blootstelling aan geneesmiddelen in normale weefsels te minimaliseren.
Prodrugs zijn chemisch gemodificeerde geneesmiddelen die een verminderde toxiciteit vertonen in normale weefsels, terwijl ze hun werking behouden bij zieke laesies bij activering 5,6. Prodrugs kunnen reageren op een verscheidenheid aan stimuli, zoals pH7,8, enzymen9,10, echografie 11,12, warmte 13 en licht14,15,1 6, en geven hun oudergeneesmiddelen specifiek af in de laesies. Niettemin vertonen veel prodrugs inherente nadelen, zoals slechte oplosbaarheid, onjuiste absorptiesnelheid en vroege metabole vernietiging, die hun ontwikkeling kunnen beperken17. In deze context biedt de vorming van prodrug nanoassemblages voordelen zoals verminderde bijwerkingen, in situ medicijnafgifte, betere retentie en de combinatie van behandeling en beeldvorming, wat wijst op een groot toepassingspotentieel voor deze nanoassemblages. Veel prodrug nanoassemblages zijn ontwikkeld voor de behandeling van ziekten, waaronder doxorubicine prodrug nanosferen, curcumine prodrug micellen, en camptothecine prodrug nanovezels18.
In dit protocol presenteren we een eenvoudige methode voor de bereiding van prodrug-kleurstof nanoassemblages die een hoog prodruggehalte, goede waterdispergeerbaarheid, stabiliteit op lange termijn en gevoelig reactievermogen vertonen. IR783 is een in water oplosbare nabij-infrarode kleurstof die kan dienen als stabilisator van de nanoassemblages19. De andere component van de nanoassemblage is boor-dipyrromeheen-chloorambucil (BODIPY-Cb, BC), een prodrug die om twee belangrijke redenen is ontworpen. Aangezien chloorambucil (Cb) in vivo systemische toxiciteit vertoont, kan de prodrugvorm de toxiciteit ervan verminderen20. De BC-prodrug kan worden gefotocleaved met behulp van 530 nm lichtbestraling gericht op ziektelaesies, waardoor de lokale afgifte van Cb mogelijk is. Aan de andere kant is Cb gevoelig voor hydrolyse in waterige omgevingen en kan het worden beschermd door het om te zetten in een prodrugvorm21. Zo werd verwacht dat de co-assemblage van de BC-prodrug en IR-783-kleurstof een stabiel en effectief nanosysteem voor medicijnafgifte zou vormen (figuur 1A). Deze prodrug-kleurstof nanoassemblage verbetert de dispergeerbaarheid en stabiliteit van de prodrugmoleculen, wat suggereert dat het potentieel voor toepassing in licht-controleerbare medicijnafgifte suggereert. De fotosplitsing van de BC-prodrug maakt de demontage van nanodeeltjes en de lichtgestuurde afgifte van Cb in de laesies mogelijk (aanvullende figuur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Synthese van boor-dipyrromeheen-chloorambucil (BC) prodrug (figuur 2)22
- Synthese van BODIPY-OAc
- Weeg 1,903 g 2,4-dimethylpyrrool af en los het op in 20 ml watervrij dichloormethaan (DCM) in een kolf met ronde bodem onder een stikstofatmosfeer. Weeg 1,638 g acetoxyacetylchloride af en voeg het druppelsgewijs toe aan de oplossing. Blijf 10 minuten roeren bij kamertemperatuur en laat de oplossing vervolgens gedurende 1 uur terugvloeien bij 40 °C.
- Laat het mengsel afkoelen tot kamertemperatuur. Weeg 5.170 g N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) af en voeg dit onder roeren druppelsgewijs toe aan het mengsel. Weeg na 30 minuten 5,677 g boortrifluoridediethyletheraat (BF3· OEt2), voeg het druppelsgewijs toe aan de oplossing en blijf nog eens 30 minuten roeren.
- Voeg 10 g silicagel (200-400 mazen) toe aan het mengsel en verwijder het oplosmiddel door roterende verdamping bij 45 °C. Stop de verdamping wanneer de silicagel terugkeert naar droog poeder.
- Voeg een frit toe aan de onderkant van een cartridge (zie Materiaaltabel). Vul de silicagel (vanaf stap 1.1.3) in de cartridge en voeg vervolgens nog een frit toe aan de cartridge aan de bovenkant van de gevulde gel.
- Bevestig de cartridge in de kraag die is aangesloten op het flashchromatografiesysteem (zie materiaaltabel) en draai deze om deze te vergrendelen. Installeer de patroon bovenop de zeswegklep in het flashchromatografiesysteem en installeer een flitskolom (zie materiaaltabel) onder de klep.
- Start het chromatografie-instrument en stel 515 nm en 365 nm in als de detectiegolflengten. Elutie uitvoeren met 4/3 (v/v) hexaan/DCM. Verzamel de eluentfracties als het 515 nm-signaal verschijnt.
- Verwijder het oplosmiddel uit de verzamelde fracties door roterende verdamping bij 40 °C totdat er geen oplosmiddel meer in de oplosmiddelopvangkolf is opgevangen. Plaats het vaste product een nacht in een vacuümdroogkamer om de rest van het oplosmiddel te verwijderen.
- Synthese van BODIPY-OH
- Weeg 1,120 g BODIPY-OAc (gesynthetiseerd in stap 1.1) af en los het op in 70 ml tetrahydrofuraan (THF) bij kamertemperatuur, volledig bedekt met folie. Voeg 70 ml 0,1 M LiOH waterige oplossing druppelsgewijs toe aan de BODIPY-OAc-oplossing.
- Roer het mengsel gedurende 30 minuten en verwijder het oplosmiddel bij 40 °C door roterende verdamping totdat er geen oplosmiddel meer in de oplosmiddelopvangkolf is opgevangen. Plaats het residu een nacht in een vacuümdroogkamer om water te verwijderen.
- Los het droge residu op in 30 ml DCM en voeg 10 g silicagel toe aan de oplossing. Verwijder het oplosmiddel door roterende verdamping bij 40 °C. Stop de verdamping wanneer de silicagel terugkeert naar droog poeder.
- Zuiver het product BODIPY-OH door middel van kolomchromatografie, volgens de stappen 1.1.4 tot en met 1.1.6, met alleen DCM als eluent.
- Vergelijk fracties verzameld op verschillende elutietijdstippen met een THF-oplossing van BODIPY-OAc op dunnelaagchromatografie (TLC) en identificeer het product23.
- Spot 3-4 μL van de geëlueerde fractie en de BODIPY-OAc-oplossing afzonderlijk op één rand van een TLC-plaat op dezelfde hoogte. Plaats de TLC-plaat in een glazen kamer met 1 ml DCM en dompel de gevlekte rand onder in het DCM-oplosmiddel, maar met de twee vlekken uit het oplosmiddel.
- Verwijder de TLC-plaat wanneer het DCM-oplosmiddel meer dan de helft van de hoogte van de plaat bereikt. Selecteer de geëlueerde fractie met een TLC-spot op een andere hoogte dan de BODIPY-OAc-spot.
- Verwijder het oplosmiddel door roterende verdamping bij 40 °C (stap 1.1.7) om het product BODIPY-OH te verkrijgen.
- Synthese van BODIPY-(Me)2-OH
- Weeg 313 mg BODIPY-OH af en los het op in 35 ml watervrije diethylether in het donker onder een stikstofatmosfeer. Voeg druppelsgewijs 3,75 ml methylmagnesiumjodide (3 M in diethylether) druppelsgewijs toe aan de oplossing en blijf 3 uur roeren bij kamertemperatuur.
- Doof de reactie door 3,5 ml water druppelsgewijs toe te voegen.
- Extraheer het mengsel met DCM en water.
- Breng het mengsel over in een 125 ml scheitrechter. Voeg 20 ml DCM toe aan het mengsel.
- Sluit de dop van de scheidingstracht. Kantel de trechter op ongeveer 45° en schud de trechter lichtjes. Open de dop om leeg te lopen. Herhaal deze stap 3 keer en laat 3 minuten staan.
- Open de onderste klep en vang de onderste organische fase op in een bekerglas.
- Voeg 30 ml DCM toe aan de waterige fase. Herhaal de extractie (stappen 1.3.3.2 en 1.3.3.3) 3 keer met telkens 30 ml DCM.
- Voeg 10 g vaste Na2SO4 toe aan de verzamelde organische fase om de organische fase een nacht te drogen.
- Koppel een filterkolf aan een vacuümpomp met een rubberen buis. Leg een stuk filtreerpapier op de Büchner-trechter en steek de trechter in de bovenkant van de kolf. Maak het filtreerpapier nat met 1 ml DCM, breng het mengsel over in de trechter en zet de vacuümpomp aan. Vang de organische oplossing op in de kolf.
- Voeg 10 g silicagel toe aan de organische oplossing. Verwijder het organische oplosmiddel door roterende verdamping bij 40 °C totdat de silicagel terugkeert naar droog poeder. Zuiver het product BODIPY-(Me)2-OH door kolomchromatografie (stappen 1.1.4 tot 1.1.6) met hexaan/DCM = 1/1 (v/v) als eluent.
- Selecteer de geëlueerde fracties die het product bevatten met behulp van TLC-analyse zoals beschreven in stap 1.2.5 (TLC-spot op een andere hoogte dan BODIPY-OH). Verwijder het oplosmiddel door roterende verdamping bij 40 °C om het product te verkrijgen zoals beschreven in stap 1.1.7.
- Synthese van BODIPY-(Me)2-I 2-OH
- Weeg 41 mg BODIPY-(Me)2-OH af en los het op in 2,5 ml watervrij THF in het donker onder een stikstofatmosfeer. Weeg 74 mg N-jodosuccinimide af en los het op in 1 ml watervrij THF.
- Voeg de N-jodosuccinimide-oplossing druppelsgewijs toe aan de BODIPY-(Me)2-OH-oplossing. Verwijder na 3,5 uur roeren bij kamertemperatuur het oplosmiddel door roterende verdamping bij 40 °C totdat er geen oplosmiddel meer wordt opgevangen in de oplosmiddelopvangkolf op de roterende verdamper.
- Los het residu op in 10 ml DCM en was het 3 keer met telkens 30 ml water, zoals beschreven in stap 1.3.3. Droog de organische fase met Na2SO 4 (stappen 1.3.4 en 1.3.5). Verwijder het oplosmiddel door roterende verdamping bij 40 °C (stap 1.1.7) om het product BODIPY-(Me)2-I 2-OH te verkrijgen.
- Synthese van BODIPY-Cb
- Weeg 85 mg chloorambucil af en los het op in 2 ml watervrij DCM in het donker onder een stikstofatmosfeer. Weeg 69 mg N,N'-dicyclohexylcarbodiimide af en los het op in 1 ml watervrij DCM. Voeg het druppelsgewijs toe aan de chloorambuciloplossing met roeren gedurende 10 minuten.
- Los 1,7 mg 4-dimethylaminopyridine op in 0,5 ml watervrij DCM. Voeg deze oplossing toe aan het mengsel en blijf 10 minuten roeren bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 73 mg BODIPY-(Me)2-I 2-OH opgelost in 2 ml watervrij DCM toe en blijf 2 uur roeren.
- Voeg 10 g silicagel toe aan het mengsel en verwijder het oplosmiddel door roterende verdamping bij 40 °C. Stop de verdamping wanneer de silicagel terugkeert naar droog poeder. Zuiver het product BODIPY-Cb door kolomchromatografie (stappen 1.1.4 tot 1.1.6, 540 nm en 365 nm signaalgolflengte) met hexaan/DCM = 7/3 (v/v) als eluent.
- Selecteer de geëlueerde fracties die het product anders bevatten dan BODIPY-(Me)2-I 2-OH met behulp van TLC-analyse (stap 1.2.5). Verwijder het oplosmiddel door roterende verdamping bij 40 °C (stap 1.1.7) om het product BODIPY-Cb te verkrijgen.
2. Bereiding van IR783/BC NP's volgens de flash-neerslagmethode
- Weeg 10 mg van de BC-prodrug (BODIPY-Cb) af en los deze op in 1 ml DMSO in een microbuis van 1,5 ml om een stamoplossing van 10 mg / ml te verkrijgen. Bedek de BC-oplossing met folie.
- Bereid 300 μL van 0,4 mg/ml IR-783 in gefilterd gedeïoniseerd water in een microbuis van 1,5 ml. Plaats deze microbuis op een vortexmixer bij 1.500 tpm.
- Voeg 20 μL van de BC-oplossing in DMSO toe aan de IR-783-oplossing gedurende 10 s met een constante snelheid met behulp van een pipet van 20 μL. Het uiteinde van de pipetpunt moet de binnenwand van de microbuis raken (figuur 1B).
- Houd de microbuis nog eens 30 s op de vortexmenger om de IR783/BC NP-oplossing te verkrijgen. Plaats vervolgens de nanodeeltjesoplossing op een rek dat volledig is bedekt met folie.
- Centrifugeer de resulterende IR783/BC NP-oplossing gedurende 10 minuten bij 2.000 x g en 4 °C om aggregaten te verwijderen. Verzamel het supernatant en laat ~ 20 μL in de buis achter om te voorkomen dat de pellet wordt verstoord. Gooi de pellet weg.
- Centrifugeer het supernatant tweemaal gedurende 30 minuten bij 30.000 x g en 4 °C en verzamel het neerslag van het nanodeeltje uit beide centrifugaties. Resuspendie van de nanodeeltjes in 300 μL van 1x PBS.
OPMERKING: Wanneer de hydrofobe BC-prodrug in DMSO wordt gedispergeerd in water met vortexing, wordt de DMSO opgelost door water en hebben de prodrugmoleculen de neiging om assemblages op nanoschaal te vormen om zichzelf stabiel te houden onder de lokale oververzadigingssituatie24. - Kwantificeer het gehalte aan IR-783 en BC door middel van high performance liquid chromatography (HPLC), met behulp van de elutiemethode in tabel 1.
OPMERKING: Het HPLC-monster wordt bereid door gelijke volumes nanodeeltjesoplossing en acetonitril te mengen. Het injectievolume is 20 μL. De detectiegolflengte voor chloorambucil en BC-prodrug is 260 nm en de detectiegolflengte voor IR783 is 783 nm. De HPLC-kolom is een analytische C18-kolom van 4,6 mm (binnendiameter) x 100 mm (lengte), met een deeltjesgrootte van 2,7 μm en een poriegrootte van 120 Å. - Bereken de prodrug inkapselingsefficiëntie (EE%) en laadcapaciteit (LC%) volgens de volgende vergelijkingen:
| Tijd (min) | Acetonitril (%) | Water (%) |
| 0 | 20 | 80 |
| 5 | 20 | 80 |
| 30 | 95 | 5 |
| 35 | 95 | 5 |
Tabel 1: HPLC-methode voor kwalitatieve en kwantitatieve analyse van BC-prodrug en zijn fotosplitsing. Gereproduceerd met toestemming25. Auteursrecht 2022, Wiley.
3. Karakterisering van IR783/BC NP's
- Meet de gemiddelde grootte van de IR783/BC NP's met een dynamisch lichtverstrooiingsinstrument (DLS) (zie materiaaltabel). Voeg 200 μL IR783/BC NP-oplossing toe in een cuvette en steek de cuvette in de houder voor meting. Stel het meettype in op 'grootte' en de meettemperatuur op 25 °C. Voer drie metingen uit met een duur van 20 s voor elke meting.
- Meet de oppervlaktelading van de IR783/BC NP's met het DLS-instrument met behulp van een zeta-potentiaaltestcuvet.
- Verdun 25 μL IR783/BC NP-oplossing met 725 μL gedeïoniseerd water in een microbuis van 1,5 ml en voeg de oplossing toe aan een zeta-potentiaaltestcuvet. Plaats de cuvette in de monstergroef. Sluit de monstergroef af.
- Stel het meettype in op 'zeta-potentiaal' en de meettemperatuur op 25 °C. Voer 10 metingen uit.
- Bereid de monsters voor op beeldvorming van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). Voeg 10 μL IR783/BC NP-oplossing toe aan een stuk gatkoolstoffilm op een koperen rooster (300 mazen) en verwijder 7 μL. Laat 3 μL oplossing een nacht op de film zitten voor automatische verdamping.
OPMERKING: Door 10 μL van de NP-oplossing toe te voegen, gevolgd door de verwijdering van 7 μL, kan de druppel een groter gebied op de film bedekken.
4. Fotoactivering van IR783/BC NP's
- Plaats een LED-lamp (530 nm; zie Materiaaltabel) met een ijzeren standaard zodat het licht direct naar de bedieningsvloer is gericht. Plaats een geïntegreerde bolfotodiodefotometer (zie materiaaltabel) direct onder de LED-lamp.
OPMERKING: Om de invloed van omgevingslicht te voorkomen, worden alle lichtbestralingsexperimenten uitgevoerd in een donkere kamer. - Schakel de LED-lamp in en open de dop van de fotometer. Noteer de bestralingssterkte en stel de lampparameters in met behulp van de bijbehorende software (zie Materiaaltabel). Stel de ingangsstroom (mA) in om de bestralingssterkte in te stellen op 50 mW/cm2.
OPMERKING: De bestraling wordt ook beïnvloed door de afstand tussen de LED-lamp en de fotometer. In de hier gebruikte opstelling (figuur 3A,B) is de afstand vastgesteld op 5 cm. - Verdun de IR783/BC NP-oplossing met gedeïoniseerd water tot 50 μM op basis van BC-concentratie. Voeg 200 μL van de IR783/BC NP-oplossing toe aan een microbuis van 1,5 ml. Plaats de buis op een schuimblok met een groefmaat van de microbuis en dezelfde hoogte als de fotometer in stap 4.1 (figuur 3C,D).
- Open de dop van de buis. Zet de LED-lamp aan en bestraal de nanodeeltjesoplossing gedurende 1, 2, 3, 5, 7 en 10 minuten.
- Kwantificeer bc-verbruik en Cb-afgifte door HPLC na lichtbestraling. Bereken het percentage resterende BC- en Cb-vrijgave met behulp van de volgende vergelijkingen:
5. Testen van de cytotoxiciteit van IR783/BC NP's met en zonder lichtbestraling
- Kweek HCT116-cellen (humane colorectale tumorcellijn) in RPMI 1640-medium met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine (compleet medium) in een 5% CO 2-atmosfeer bij 37 °C (~2 x 106 cellen per schaal in een celkweekschaal van 90 mm). Routinematig subcultuur de cellen om de 2-3 dagen.
OPMERKING: HCT116 is een menselijke coloncellijn. In vergelijking met andere kankercellen zoals HeLa-, MCF7- en A549-cellen, drukken HCT-116-cellen een hoger niveau van caveolin-125 uit, dat kan worden gericht door IR783 en de cellulaire opname van IR783 / BC NP's verbetert. - Plaats de HCT116-cellen in 96-putplaten met RPMI 1640 compleet medium met een dichtheid van 104 cellen per put.
- Zuig het medium uit de kweekschaal wanneer de celconfluentie meer dan 50% bedraagt. Was de cellen met 1x PBS en verwijder de PBS. Voeg 1 ml 0,25% trypsine-oplossing toe en incubeer bij 37 °C in een 5% CO 2-incubator.
- Voeg na 3 minuten 2 ml volledig medium toe om de trypsinevertering te blussen. Resuspensie van de cellen, breng de celsuspensie over in een centrifugeerbuis van 15 ml en centrifugeer gedurende 3 minuten op 300 x g . Gooi het supernatant weg en resuspensie de celkorrel in 1 ml volledig medium.
- Verdun 10 μL van de celsuspensie tot 200 μL met volledig medium. Plaats 10 μL op een hemocytometer en sluit deze af met een coverslip.
- Observeer de hemocytometer onder een microscoop (oculair: 10x; objectieflens: 4x). Tel en noteer de celnummers op de vier hoekvierkanten en het midden. Bereken de celconcentratie met behulp van de formule:
Waarbij n = het gemiddelde van de celnummers van de vijf kwadraten. - Verdun de celsuspensie tot 1 x 105 cellen/ml. Voeg 100 μL van de celsuspensie per put toe in een plaat met 96 putten om de cellen te zaaien. Voeg 100 μL PBS per put toe in de niet-ingezaaide putten.
- Behandel de cellen met (1) 0,1-150 μM vrije BC, (2) 0,1-150 μM IR783/BC NP's (gebaseerd op BC-concentratie), (3) 0,1-150 μM vrij BC met lichtbestraling, of (4) 0,1-150 μM IR783/BC NP's (gebaseerd op BC-concentratie) met lichtbestraling. Incubeer de cellen bij 37 °C in een 5% CO 2-incubator gedurende 6 uur.
OPMERKING: De vrije BC- en IR783/BC NP-oplossingen worden uit hun respectieve stamoplossingen verdund met volledig medium. - Vervang na 6 uur incubatie het prodrug/nanodeeltjes-bevattende medium door vers compleet medium. Incubeer de niet-bestralingsgroepen 1 en 2 gedurende 24 uur in het donker. Bestraal voor de groepen 3 en 4 de cellen met een 530 nm LED-lamp (50 mW/cm2) gedurende 5 minuten en incubeer gedurende 24 uur.
OPMERKING: Celplaten worden op een schuimblok geplaatst om dezelfde hoogte te garanderen als de fotometer in stap 4.1. - Bepaal de levensvatbaarheid van de cel met een 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT)-test.
- Voeg na de BC- of nanodeeltjesbehandeling 10 μL MTT (10 mg/ml in PBS) toe aan elke put en incubeer de platen bij 37 °C gedurende 3 uur. Verwijder vervolgens het medium en voeg 100 μL DMSO toe aan elk putje. Lees de absorptie af met een microplaatlezer bij 490 nm, 570 nm en 630 nm.
- Bereken de levensvatbaarheid van de cel met behulp van de volgende vergelijking:
OPMERKING: Vier onafhankelijke experimenten (n = 4) van elke groep worden uitgevoerd voor analyse. OD490 kan worden vervangen door OD570-OD 630 bij de berekening van de levensvatbaarheid van cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
IR783/BC NP's werden met succes gefabriceerd in deze studie met behulp van een flash precipitatie methode. De gesynthetiseerde IR783/BC NP's presenteerden zich als een paarse oplossing, terwijl de waterige oplossing van IR783 blauw was (figuur 4A). Zoals te zien is in figuur 4B, vertoonden de IR783/BC NP's een gemiddelde grootte van ongeveer 87,22 nm met een polydispersiteitsindex (PDI) van 0,089, wat een smalle grootteverdeling aantoont. De oppervlaktelading van de IR783/NP's was ongeveer -29,8 mV (figuur 4C), wat kon worden toegeschreven aan de negatief geladen sulfonaatgroepen van IR783. Figuur 4D toont de stabiliteit van de IR783/BC NP's. De grootte van de nanodeeltjes werd gedurende ten minste 48 uur (in PBS bij 37 °C) na fabricage op ongeveer 85 nm gehouden, terwijl de PDI ook minder dan 0,2 bleef. Er werd geen significante verandering waargenomen in de grootteverdeling van IR783/BC NP's na 0 h, 24 h en 48 h na fabricage (figuur 4E).
Figuur 5A,B toont de morfologie van IR783/BC NP's voor respectievelijk en na lichtbestraling. Zowel aggregaten als fragmenten konden worden waargenomen na lichtbestraling, wat respectievelijk de dissociatie en aggregatie van de nanodeeltjes aangeeft. Figuur 5C toont de verandering in de grootte van nanodeeltjes en de verdeling ervan na 3 minuten en 5 minuten lichtbestraling. Een grotere omvang en bredere verspreiding werden waargenomen voor de bestraalde nanodeeltjes. De fotorelease profielen van de IR783/BC NP's werden ook gemeten door HPLC. Zoals te zien is in figuur 5D,E, werd prodrug BC in 10 minuten gefotokliefd. Ondertussen werd Cb vrijgegeven met een herstelefficiëntie van ongeveer 22% in dezelfde periode.
De IR783/BC NP's vertoonden een significante cytotoxiciteit op menselijke colorectale tumorcellen (HCT116) onder lichte bestraling bij 530 nm in vergelijking met de niet-bestralingsgroep (figuur 6). De IC50 van IR783/BC NP's met lichtbestraling (6,62 μM) was lager dan die van vrije BC met lichtbestraling (9,24 μM), wat een hogere in vitro antitumoreffectiviteit van IR783/BC NP's met lichtbestraling aantoont dan die van vrije BC met lichtbestraling25. De gepresenteerde cytotoxiciteit was het gevolg van zowel vrijgegeven Cb als gegenereerde reactieve zuurstofsoorten (ROS) (aanvullende figuur 1 en aanvullende figuur 2). De hogere cytotoxiciteit van de IR783/BC NP's onder lichte bestraling werd voornamelijk veroorzaakt door de efficiënte cellulaire opname van de IR783/BC NP's25.
Figuur 1: Vorming van IR783/BC NP's. (A) Zelfassemblage en licht-getriggerde dissociatie van IR783/BC NP's. (B) Fabricageschema van IR783/BC NP's door flitsprecipitatie. Gereproduceerd met toestemming25. Auteursrecht 2022, Wiley. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Syntheseroute van prodrug BODIPY-Cb (BC). BODIPY-derivaten werden eerst gesynthetiseerd uit acetoxyacetylchloride en 2,4-dimethylpyrrool en vervolgens geconjugeerd met Cb. 1H-NMR-spectrum van de BC-prodrug wordt weergegeven in aanvullende figuur 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: LED-bestralingsopstelling . (A,B) LED-lampinstelling voor stralingsmeting. (C,D) LED-lampinstelling voor de bestraling van IR783/BC NP's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Karakterisering van IR783/BC NP's. (A) Verschijning van vrije IR783, vrije BC en IR783/BC NP oplossingen. (B) Grootteverdeling van IR783/BC NP's. (C) Oppervlaktelading van IR783/BC NP's. (D) Verandering van grootte van IR783/BC NP's in PBS bij 37 °C gedurende 48 uur na fabricage. (E) Grootteverdeling van IR783/BC NP's op 0 h, 24 h en 48 h na fabricage. Gereproduceerd met toestemming25. Auteursrecht 2022, Wiley. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Fotorelease van IR783/BC NP's. TEM-beelden van IR783/BC NP's (A) voor en (B) na lichtbestraling. Schaalbalk = 100 μm. (C) Grootteverdeling van IR783/NP's na 0 min, 3 min en 5 min lichtbestraling. (D) HPLC-analyse van IR783/BC NP's die worden onderworpen aan een toenemende duur van lichtbestraling tot 10 min. (E) Kwantificering van BC- en IR783-afbraak en Cb-afgifte (n = 3). Foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie. Lichtinstraling: 530 nm LED-lamp, 50 mW/cm2. Gereproduceerd met toestemming25. Auteursrecht 2022, Wiley. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Cytotoxiciteit van IR783/BC NP's tegen HCT116 cellen. Significante cytotoxiciteit verscheen bij BC-concentraties >1 μM (n = 4). Foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie. Een onafhankelijke steekproef t-test werd aangenomen om de statistische significantie van verschillen te bepalen. *p < 0,05, **p < 0,01. Lichtinstraling: 530 nm LED-lamp, 50 mW/cm2. Gereproduceerd met toestemming25. Auteursrecht 2022, Wiley. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Fotochemiemechanisme. (A) Fotosplitsing van BC prodrug. (B) Ontbinding van IR783. Aangepast met toestemming25. Auteursrecht 2022, Wiley. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2: ROS-generatieprofiel. ROS-generatie van verschillende monsters onder lichtbestraling gekwantificeerd met een singlet zuurstofsensor groene (SOSG) sonde. Lichtinstraling: 530 nm LED-lamp, 50 mW/cm2. Aangepast met toestemming25. Auteursrecht 2022, Wiley. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 3: 1H-NMR spectrum van BODIPY-Cb. Overgenomen met toestemming22. Copyright 2022, American Chemical Society. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol schetst een gemakkelijke flash-precipitatiemethode voor de fabricage van prodrug-dye nanodeeltjes, die een eenvoudige en handige aanpak biedt voor de vorming van nanodeeltjes. Er zijn verschillende kritieke stappen in deze methode. Ten eerste moeten containers zoals microbuizen voor alle stappen van synthese, fabricage en karakterisering worden bedekt met folie om onnodige fotosplitsing van de BC-prodrug door omgevingslicht te voorkomen. Bovendien moet in de flitsprecipitatiestap de microbuis met de IR-783-oplossing stabiel op de vortexmenger worden geplaatst terwijl langzaam de BC-prodrugoplossing wordt toegevoegd. Op deze manier kan de BC prodrug-oplossing (in DMSO) gelijkmatig worden gedispergeerd in de IR-783-oplossing. In de zuiveringsstap wordt een differentiële centrifugatiemethode gebruikt. De eerste centrifugatie bij 2.000 x g wordt gebruikt om de onbelaste BC-prodrug-vaste stoffen te verwijderen, terwijl de tweede centrifugatie bij 30.000 x g DMSO en IR783 in het supernatant verwijdert die niet in de nanodeeltjes zijn opgenomen. IR783/BC NP's kunnen vervolgens als neerslag worden opgevangen en in gefilterd gedeïoniseerd water worden geresuspendeerd.
Zelfassemblage is een eenvoudige en efficiënte methode voor de fabricage van nanodeeltjes. De zelfassemblagemethode moet echter worden geoptimaliseerd op basis van factoren zoals de hydrofobiciteit van bouwstenen. In dit protocol is een van de componenten, IR783, een in water oplosbare kleurstof die is opgelost in water. In sommige gevallen kunnen alle componenten echter hydrofoob zijn. Onder een dergelijke omstandigheid moeten ze worden opgelost in DMSO zoals de BC-prodrug in dit protocol. Een stabilisator zoals 1, 2-Distearoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-Poly(ethyleenglycol) (DSPE-PEG) kan worden gebruikt om zelfgeassembleerde nanodeeltjeste helpen vormen en stabiliseren 14,26,27.
Licht heeft een beperkte weefselpenetratie, wat de toepassing van foto-activeerbare nanodeeltjes bij klinisch gebruik beperkt. Een oplossing is het ontwikkelen van lange-golflengte licht-activeerbare systemen, zoals rood of nabij-infrarood licht28. Het gebruik van optische vezels om licht te leveren is een andere manier om het beperkte weefselpenetratieprobleem van licht voor sommige ziektelaesies op te lossen29. Bovendien is de co-assemblage van componenten voornamelijk afhankelijk van intermoleculaire krachten zoals hydrofobe interactie, π-π stapeling en waterstofbinding, wat suggereert dat deze methode mogelijk niet van toepassing is op alle prodrug- en kleurstofmoleculen30. De haalbaarheid van het co-assembleren van functionele moleculen zoals geneesmiddelen, prodrugs, kleurstoffen, fotosensitizers en fotothermische middelen moet worden geëvalueerd door middel van theoretische berekening en experimentele karakterisering.
Het fotoactiveerbare prodrug-dye nanoschaal medicijnafgiftesysteem heeft verschillende voordelen. Ten eerste kunnen kleurstoffen zoals IR783 worden afgebroken onder lichtbestraling, waardoor vervolgens lokale en specifieke demontage van de nanodeeltjes mogelijk wordt25. Bovendien kan de opgenomen kleurstof functioneren als een beeldvormingsmiddel voor het bewaken van het medicijnafgiftesysteem, met zijn fluorescentie die wordt gebruikt om de accumulatie en demontage van de nanodeeltjes te volgen. Bovendien is gemeld dat indocyaninekleurstoffen met sulfonaatgroepen zich kunnen richten op caveolae in sommige kankers19, wat een efficiënte cellulaire opname van de medicijnafgiftesystemen mogelijk maakt25. Indocyaninekleurstoffen met vergelijkbare structuren hebben dus een groot potentieel voor opname in dergelijke medicijnafgiftesystemen.
Er zijn tot nu toe slechts enkele publicaties verschenen over het standaardiseren van operaties op de fotoactivering van nano-toedieningssystemenvoor geneesmiddelen 31. Het hier beschreven protocol kan dus dienen als een nuttige referentie voor het ontwikkelen van fotoresponsieve medicijnafgiftesystemen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Er is een PCT-aanvraag ingediend bij nr.PCT/CN2021/081262.
Acknowledgments
We erkennen de hulp van de University of Hong Kong Li Ka Shing Faculty of Medicine Faculty Core Facility. We danken professor Chi-Ming Che van de Universiteit van Hong Kong voor het leveren van de menselijke HCT116-cellijn. Dit werk werd ondersteund door het Ming Wai Lau Centre for Reparative Medicine Associate Member Program en de Research Grants Council of Hong Kong (Early Career Scheme, No. 27115220).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1260 Infinity II HPLC | Agilent Technologies | ||
| 2,4-Dimethyl pyrrole | J&K Scientific | 315305 | |
| 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT) | Gibco | M6494 | |
| 4-Dimethylaminopyridine (4-DMAP) | J&K Scientific | 212279 | |
| 90 mm Petri Dish Clear Treated Sterile | SPL | 11090 | |
| 96-well Tissue Culture Plate Clear Treated Sterile | SPL | 30096 | |
| Acetoxyacetyl chloride | J&K Scientific | 192001 | |
| Boron trifluoride diethyl etherate | J&K Scientific | 921076 | |
| Büchner funnel | AS ONE | 3-6466-01 | |
| Chlorambucil | J&K Scientific | 321407-1G | |
| CM100 Transmission Electron Microscope | Philips | ||
| CombiFlash RF chromatography system | Teledyne ISCO | ||
| Dichloromethane | DUKSAN Pure Chemicals | JT9315-88 | |
| Dimethyl sulfoxide | DUKSAN Pure Chemicals | 2762 | |
| Disposable cuvette | Malvern Panalytical | DTS1070 | Zeta potential measurement |
| Disposable cuvette | Malvern Panalytical | ZEN0040 | |
| Empty Disposable Sample Load Cartridges | Teledyne ISCO | 693873225 | can hold up to 65 g |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270106 | |
| Filtering flask | AS ONE | 3-7089-03 | |
| Hexane | DUKSAN Pure Chemicals | 4198 | |
| Holey carbon film on copper grid | Beijing Zhongjingkeyi Technology Co.,Ltd | BZ10023a | |
| HPLC column (InfinityLab Poroshell 120) | Agilent Technologies | 695975-902T | |
| Integrating sphere photodiode power sensor | Thorlabs | S142C | |
| IR783 | Tokyo Chemical Industry (TCI) Co., Ltd | I1031 | |
| LED | Mightex | LCS-0530-15-11 | |
| LED Driver Control Panel V3.2.0 (Software) | Mightex | ||
| Lithium Hydroxide Anhydrous | TCI | L0225 | |
| Methylmagnesium iodide, 3M solution in diethyl ether | Aladdin | M140783 | |
| N,N-Diisopropyl ethyl amine (DIPEA) | J&K Scientific | 203402 | |
| N,N'-Dicyclohexylcarbodiimide (DCC) | J&K Scientific | 275928 | |
| penicillin–streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate-buffered saline (10×) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| Power and energy meter | Thorlabs | PM100 USB | |
| Rotavapor | BUCHI Rotavapor R300 | ||
| RMPI 1640 | Gibco | 21870076 | |
| Separatory funnel (125 mL) | Synthware | F474125L | |
| Silver Silica Gel Disposable Flash Columns, 40 g | Teledyne ISCO | 692203340 | |
| Sodium sulfate, anhydrous | Alfa Aesar | A19890 | |
| SpectraMax M4 | Molecular Devices LLC | ||
| Tetrahydrofuran (THF), anhydrous | J&K Scientific | 943616 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | |
| Vortex | DLAB Scientific Co., Ltd | MX-S | |
| Zetasizer Nano ZS90 | Malvern Instrument |
References
- Chabner, B. A., Roberts, T. G. Chemotherapy and the war on cancer. Nature Reviews Cancer. 5 (1), 65-72 (2005).
- Monsuez, J. -J., Charniot, J. -C., Vignat, N., Artigou, J. -Y.
- Floyd, J., Mirza, I., Sachs, B., Perry, M. C.
- Bar-Joseph, H., Stemmer, S. M., Tsarfaty, I., Shalgi, R., Ben-Aharon, I. Chemotherapy-induced vascular toxicity-real-time in vivo imaging of vessel impairment. Journal of Visualized Experiments. (95), e51650 (2015).
- Denny, W. A.
- Kastrati, I., Delgado-Rivera, L., Georgieva, G., Thatcher, G. R. J., Frasor, J. Synthesis and characterization of an aspirin-fumarate prodrug that inhibits NFκB activity and breast cancer stem cells. Journal of Visualized Experiments. (119), e54798 (2017).
- Mao, J., et al. A simple dual-pH responsive prodrug-based polymeric micelles for drug delivery. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (27), 17109-17117 (2016).
- Li, S. -Y., et al. A pH-responsive prodrug for real-time drug release monitoring and targeted cancer therapy. Chemical Communications. 50 (80), 11852-11855 (2014).
- Andresen, T. L., Thompson, D. H., Kaasgaard, T. Enzyme-triggered nanomedicine: Drug release strategies in cancer therapy (Invited Review). Molecular Membrane Biology. 27 (7), 353-363 (2010).
- Xu, G., McLeod, H. L. Strategies for enzyme/prodrug cancer therapy. Clinical Cancer Research. 7 (11), 3314-3324 (2001).
- Luo, W., et al. Dual-targeted and pH-sensitive doxorubicin prodrug-microbubble complex with ultrasound for tumor treatment. Theranostics. 7 (2), 452 (2017).
- Gao, J., et al. Ultrasound triggered phase-change nanodroplets for doxorubicin prodrug delivery and ultrasound diagnosis: An in vitro study. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 174, 416-425 (2019).
- Brade, A. M., Szmitko, P., Ngo, D., Liu, F. -F., Klamut, H. J. Heat-directed suicide gene therapy for breast cancer. Cancer Gene Therapy. 10 (4), 294-301 (2003).
- Long, K., et al. One-photon red light-triggered disassembly of small-molecule nanoparticles for drug delivery. Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 357 (2021).
- Liu, Y., Long, K., Kang, W., Wang, T., Wang, W. Optochemical control of immune checkpoint blockade via light-triggered PD-L1 dimerization. Advanced NanoBiomed Research. 2 (6), 2200017 (2022).
- Wang, T., et al. Optochemical control of mTOR signaling and mTOR-dependent autophagy. ACS Pharmacology & Translational Science. 5 (3), 149-155 (2022).
- Abet, V., Filace, F., Recio, J., Alvarez-Builla, J., Burgos, C. Prodrug approach: An overview of recent cases. European Journal of Medicinal Chemistry. 127, 810-827 (2017).
- Li, G., et al. Small-molecule prodrug nanoassemblies: an emerging nanoplatform for anticancer drug delivery. Small. 17 (52), 2101460 (2021).
- Shamay, Y., et al. Quantitative self-assembly prediction yields targeted nanomedicines. Nature Materials. 17 (4), 361-368 (2018).
- Sinoway, P. A., Callen, J. P.
- Owen, W. R., Stewart, P. J. Kinetics and mechanism of chlorambucil hydrolysis. Journal of Pharmaceutical Sciences. 68 (8), 992-996 (1979).
- Lv, W., et al. Upconversion-like photolysis of BODIPY-based prodrugs via a one-photon process. Journal of the American Chemical Society. 141 (44), 17482-17486 (2019).
- Silver, J. Let us teach proper thin layer chromatography technique. Journal of Chemical Education. 97 (12), 4217-4219 (2020).
- Saad, W. S., Prud'homme, R. K. Principles of nanoparticle formation by flash nanoprecipitation. Nano Today. 11 (2), 212-227 (2016).
- Long, K., et al. Photoresponsive prodrug-dye nanoassembly for in-situ monitorable cancer therapy. Bioengineering & Translational Medicine. 7 (3), 10311 (2022).
- Zhong, T., et al. A self-assembling nanomedicine of conjugated linoleic acid-paclitaxel conjugate (CLA-PTX) with higher drug loading and carrier-free characteristic. Scientific Reports. 6 (1), 36614 (2016).
- Long, K., et al. Green light-triggered intraocular drug release for intravenous chemotherapy of retinoblastoma. Advanced Science. 8 (20), 2101754 (2021).
- Lv, W., Wang, W. One-photon upconversion-like photolysis: a new strategy to achieve long-wavelength light-excitable photolysis. Synlett. 31 (12), 1129-1134 (2020).
- Rwei, A. Y., Wang, W., Kohane, D. S. Photoresponsive nanoparticles for drug delivery. Nano Today. 10 (4), 451-467 (2015).
- Grzelczak, M., Vermant, J., Furst, E. M., Liz-Marzán, L. M.
- Gnanasammandhan, M. K., Idris, N. M., Bansal, A., Huang, K., Zhang, Y. Near-IR photoactivation using mesoporous silica-coated NaYF4:Yb,Er/Tm upconversion nanoparticles. Nature Protocols. 11 (4), 688-713 (2016).
