Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung und Charakterisierung einer photoresponsiven Prodrug-Farbstoff-Nanoanordnung. Die Methodik zur Wirkstofffreisetzung aus den Nanopartikeln durch lichtgesteuerte Demontage, einschließlich des Lichtbestrahlungsaufbaus, wird explizit beschrieben. Die Wirkstoffe, die nach Lichtbestrahlung aus den Nanopartikeln freigesetzt wurden, zeigten eine hervorragende Antiproliferationswirkung auf menschliche kolorektale Tumorzellen.
Abstract
Die Selbstassemblierung ist eine einfache, aber zuverlässige Methode zum Aufbau von nanoskaligen Medikamentenverabreichungssystemen. Photoaktivierbare Prodrugs ermöglichen eine kontrollierbare Wirkstofffreisetzung von Nanocarriern an Zielstellen, die durch Lichtbestrahlung moduliert werden. In diesem Protokoll wird eine einfache Methode zur Herstellung von photoaktivierbaren Prodrug-Farbstoff-Nanopartikeln durch molekulare Selbstorganisation vorgestellt. Die Verfahren zur Prodrug-Synthese, zur Herstellung von Nanopartikeln, zur physikalischen Charakterisierung der Nanoanordnung, zur Demonstration der Photospaltung und zur Verifizierung der In-vitro-Zytotoxizität werden ausführlich beschrieben. Zunächst wurde ein photospaltbares Bor-Dipyrromethen-Chlorambucil (BC)-Prodrug synthetisiert. BC und ein Nahinfrarot-Farbstoff, IR-783, konnten sich in einem optimierten Verhältnis selbst zu Nanopartikeln (IR783/BC NPs) zusammensetzen. Die synthetisierten Nanopartikel hatten eine durchschnittliche Größe von 87,22 nm und eine Oberflächenladung von -29,8 mV. Die Nanopartikel zerfielen unter Lichteinstrahlung, was mittels Transmissionsmikroskopie beobachtet werden konnte. Die Photospaltung von BC wurde innerhalb von 10 Minuten abgeschlossen, mit einer Rückgewinnungseffizienz von 22 % für Chlorambucil. Die Nanopartikel zeigten eine erhöhte Zytotoxizität unter Lichtbestrahlung bei 530 nm im Vergleich zu den unbestrahlten Nanopartikeln und dem bestrahlten freien BC-Prodrug. Dieses Protokoll bietet eine Referenz für den Aufbau und die Evaluierung von photoresponsiven Drug-Delivery-Systemen.
Introduction
Die Chemotherapie ist eine gängige Krebsbehandlung, bei der Zytostatika eingesetzt werden, um Krebszellen abzutöten und so das Tumorwachstum zu hemmen1. Die Patienten können jedoch unter Nebenwirkungen wie Kardiotoxizität und Hepatotoxizität leiden, die auf die Off-Target-Resorption der Chemotherapeutika zurückzuführensind 2,3,4. Daher ist eine lokalisierte Wirkstoffabgabe durch die raumzeitliche Kontrolle der Wirkstofffreisetzung/-aktivierung in Tumoren unerlässlich, um die Wirkstoffexposition in normalem Gewebe zu minimieren.
Prodrugs sind chemisch modifizierte Medikamente, die in normalem Gewebe eine reduzierte Toxizität aufweisen, während sie bei erkrankten Läsionen nach Aktivierung ihre Wirkung beibehalten 5,6. Prodrugs können auf eine Vielzahl von Reizen wie pH7,8, Enzyme9,10, Ultraschall 11,12, Wärme 13 und Licht14,15,1 6 ansprechen und ihre Elternmedikamente spezifisch in den Läsionen freisetzen. Dennoch weisen viele Prodrugs inhärente Nachteile auf, wie z. B. eine schlechte Löslichkeit, eine falsche Absorptionsrate und eine frühe Stoffwechselzerstörung, die ihre Entwicklung einschränken können17. In diesem Zusammenhang bietet die Bildung von Prodrug-Nanoassemblys Vorteile wie geringere Nebenwirkungen, In-situ-Wirkstofffreisetzung, bessere Retention und die Kombination von Behandlung und Bildgebung, was auf ein großes Anwendungspotenzial für diese Nanoassemblys hinweist. Viele Prodrug-Nanoanordnungen wurden für die Behandlung von Krankheiten entwickelt, darunter Doxorubicin-Prodrug-Nanosphären, Curcumin-Prodrug-Mizellen und Camptothecin-Prodrug-Nanofasern18.
In diesem Protokoll stellen wir eine einfache Methode zur Herstellung von Prodrug-Farbstoff-Nanoanordnungen vor, die einen hohen Prodrug-Gehalt, eine gute Wasserdispergierbarkeit, Langzeitstabilität und eine empfindliche Reaktionsfähigkeit aufweisen. IR783 ist ein wasserlöslicher Nahinfrarotfarbstoff, der als Stabilisator der Nanoanordnungen19 dienen kann. Die andere Komponente der Nanoanordnung ist Bor-Dipyrromethen-Chlorambucil (BODIPY-Cb, BC), ein Prodrug, das aus zwei Hauptgründen entwickelt wurde. Da Chlorambucil (Cb) in vivo eine systemische Toxizität aufweist, kann die Prodrug-Form seine Toxizität verringern20. Das BC-Prodrug kann mit einer 530-nm-Lichtbestrahlung, die auf Krankheitsläsionen gerichtet ist, photogespalten werden, was die lokale Freisetzung von Cbe ermöglicht. Auf der anderen Seite ist Cb anfällig für Hydrolyse in wässriger Umgebung und kann geschützt werden, indem es in eine Prodrug-Form21 umgewandelt wird. Daher wurde erwartet, dass die Co-Assemblierung des BC-Prodrugs und des IR-783-Farbstoffs ein stabiles und effektives Wirkstoff-Delivery-Nanosystem bildet (Abbildung 1A). Diese Prodrug-Farbstoff-Nanoanordnung verbessert die Dispergierbarkeit und Stabilität der Prodrug-Moleküle, was auf ihr Potenzial für die Anwendung in der lichtkontrollierbaren Wirkstoffabgabe hindeutet. Die Photospaltung des BC-Prodrugs ermöglicht den Abbau von Nanopartikeln und die lichtgesteuerte Freisetzung von Cb in den Läsionen (ergänzende Abbildung 1).
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Protocol
1. Synthese von Bor-Dipyrromethen-Chlorambucil (BC)-Prodrug (Abbildung 2)22
- Synthese von BODIPY-OAc
- 1,903 g 2,4-Dimethylpyrrol wiegen und in 20 ml wasserfreiem Dichlormethan (DCM) in einem Rundkolben unter Stickstoffatmosphäre auflösen. 1,638 g Acetoxyacetylchlorid wiegen und tropfenweise in die Lösung geben. 10 min bei Raumtemperatur weiterrühren und dann die Lösung für 1 h bei 40 °C zurückfließen lassen.
- Kühlen Sie die Mischung auf Raumtemperatur ab. 5,170 g N,N-Diisopropylethylamin (DIPEA) abwiegen und unter Rühren tropfenweise in die Mischung geben. Nach 30 min 5,677 g Bortrifluoriddiethyletherat (BF3· OEt2), tröpfeln Sie es in die Lösung und rühren Sie weitere 30 Minuten weiter.
- Geben Sie 10 g Kieselgel (200-400 mesh) in die Mischung und entfernen Sie das Lösungsmittel durch Rotationsverdampfung bei 45 °C. Stoppen Sie die Verdunstung, wenn das Kieselgel wieder zu trockenem Pulver wird.
- Fügen Sie eine Fritte in den Boden einer Kartusche hinzu (siehe Materialtabelle). Füllen Sie das Kieselgel (aus Schritt 1.1.3) in die Kartusche und geben Sie dann eine weitere Fritte in die Kartusche auf der Oberseite des gefüllten Gels.
- Befestigen Sie die Kartusche in der Manschette, die mit dem Flash-Chromatographie-System verbunden ist (siehe Materialtabelle), und drehen Sie sie, um sie zu verriegeln. Setzen Sie die Kartusche oben auf das Sechswegeventil im Flash-Chromatographie-System und installieren Sie eine Flash-Säule (siehe Materialtabelle) unter dem Ventil.
- Starten Sie das Chromatographiegerät und stellen Sie 515 nm und 365 nm als Detektionswellenlängen ein. Führen Sie eine Elution mit 4/3 (v/v) Hexan/DCM durch. Sammeln Sie die Eluentenfraktionen, wenn das 515-nm-Signal erscheint.
- Entfernen Sie das Lösungsmittel aus den gesammelten Fraktionen durch Rotationsverdampfung bei 40 °C, bis sich kein Lösungsmittel mehr im Lösungsmittelsammelkolben sammelt. Legen Sie das feste Produkt über Nacht in eine Vakuumtrockenkammer, um den Rest des Lösungsmittels zu entfernen.
- Synthese von BODIPY-OH
- 1,120 g BODIPY-OAc (in Schritt 1.1 synthetisiert) wiegen und in 70 ml Tetrahydrofuran (THF) bei Raumtemperatur auflösen, vollständig mit Folie abgedeckt. 70 mL 0,1 M LiOH wässrige Lösung tropfenweise in die BODIPY-OAc-Lösung geben.
- Rühren Sie das Gemisch 30 min lang und entfernen Sie das Lösungsmittel bei 40 °C durch Rotationsverdampfung, bis sich kein Lösungsmittel mehr im Lösemittelauffangkolben sammelt. Legen Sie die Rückstände über Nacht in eine Vakuumtrockenkammer, um das Wasser zu entfernen.
- Lösen Sie den trockenen Rückstand in 30 ml DCM auf und geben Sie 10 g Kieselgel in die Lösung. Entfernen Sie das Lösungsmittel durch Rotationsverdampfung bei 40 °C. Stoppen Sie die Verdunstung, wenn das Kieselgel wieder zu trockenem Pulver wird.
- Das Produkt BODIPY-OH wird nach den Schritten 1.1.4 bis 1.1.6 säulenchromatographisch gereinigt, wobei DCM allein als Laufmittel dient.
- Vergleichen Sie Fraktionen, die zu verschiedenen Elutionszeitpunkten gesammelt wurden, mit einer THF-Lösung von BODIPY-OAc in der Dünnschichtchromatographie (TLC) und identifizieren Sie das Produkt23.
- Lokalisieren Sie 3-4 μL der eluierten Fraktion und der BODIPY-OAc-Lösung separat auf einer Kante einer TLC-Platte auf gleicher Höhe. Legen Sie die TLC-Platte in eine Glaskammer mit 1 ml DCM und tauchen Sie die gefleckte Kante in das DCM-Lösungsmittel ein, wobei die beiden Flecken jedoch aus dem Lösungsmittel entfernt sind.
- Nehmen Sie die DCC-Platte heraus, wenn das DCM-Lösungsmittel mehr als die Hälfte der Höhe der Platte erreicht. Wählen Sie die eluierte Fraktion mit einem TLC-Spot in einer anderen Höhe als dem BODIPY-OAc-Spot.
- Das Lösungsmittel wird durch Rotationsverdampfung bei 40 °C (Schritt 1.1.7) entfernt, um das Produkt BODIPY-OH zu erhalten.
- Synthese von BODIPY-(Me)2-OH
- Wiegen Sie 313 mg BODIPY-OH ab und lösen Sie es in 35 ml wasserfreiem Diethylether im Dunkeln unter Stickstoffatmosphäre auf. 3,75 ml Methylmagnesiumiodid (3 M in Diethylether) tropfweise in die Lösung geben und 3 h bei Raumtemperatur weiterrühren.
- Beenden Sie die Reaktion, indem Sie 3,5 ml Wasser tropfenweise hinzufügen.
- Extrahieren Sie die Mischung mit DCM und Wasser.
- Übertragen Sie das Gemisch in einen 125-ml-Trenntrichter. Fügen Sie der Mischung 20 ml DCM hinzu.
- Schließen Sie die Kappe des Scheidetrichters. Kippen Sie den Trichter um ca. 45° und schütteln Sie den Trichter leicht. Öffnen Sie die Kappe, um die Luft abzulassen. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 Mal und lassen Sie ihn 3 Minuten stehen.
- Öffnen Sie das Bodenventil und sammeln Sie die untere organische Phase in einem Becherglas.
- Fügen Sie der wässrigen Phase 30 ml DCM hinzu. Die Extraktion (Schritte 1.3.3.2 und 1.3.3.3) wird 3 Mal mit jeweils 30 ml DCM wiederholt.
- Fügen Sie 10 g festesNa2SO4 in die gesammelte organische Phase hinzu, um die organische Phase über Nacht zu trocknen.
- Verbinden Sie einen Filterkolben mit einem Gummischlauch mit einer Vakuumpumpe. Legen Sie ein Stück Filterpapier auf den Büchner-Trichter und führen Sie den Trichter oben in den Kolben ein. Benetzen Sie das Filterpapier mit 1 ml DCM, geben Sie das Gemisch in den Trichter und schalten Sie die Vakuumpumpe ein. Sammeln Sie die organische Lösung im Kolben.
- 10 g Kieselgel in die organische Lösung geben. Entfernen Sie das organische Lösungsmittel durch Rotationsverdampfung bei 40 °C, bis das Kieselgel wieder zu trockenem Pulver wird. Das Produkt BODIPY-(Me)2-OH wird durch Säulenchromatographie (Schritte 1.1.4 bis 1.1.6) mit Hexan/DCM = 1/1 (v/v) als Eluenten gereinigt.
- Wählen Sie die eluierten Fraktionen, die das Produkt enthalten, mit Hilfe der TLC-Analyse aus, wie in Schritt 1.2.5 beschrieben (TLC-Spot in einer anderen Höhe als BODIPY-OH). Das Lösungsmittel wird durch Rotationsverdampfung bei 40 °C entfernt, um das Produkt wie in Schritt 1.1.7 beschrieben zu erhalten.
- Synthese von BODIPY-(Me)2-I 2-OH
- Wiegen Sie 41 mg BODIPY-(Me)2-OH ab und lösen Sie es in 2,5 ml wasserfreiem THF im Dunkeln unter Stickstoffatmosphäre auf. Wiegen Sie 74 mg N-Iodosuccinimid ab und lösen Sie es in 1 ml wasserfreiem THF auf.
- Die N-Iodosuccinimid-Lösung wird tropfenweise in die BODIPY-(Me)2-OH-Lösung gegeben. Nach 3,5 h Rühren bei Raumtemperatur das Lösemittel durch Rotationsverdampfung bei 40 °C entfernen, bis sich kein Lösemittel mehr im Lösemittelauffangkolben am Rotationsverdampfer sammelt.
- Lösen Sie den Rückstand in 10 ml DCM auf und waschen Sie ihn 3 Mal mit jeweils 30 ml Wasser, wie in Schritt 1.3.3 beschrieben. Die organische Phase wird mitNa2SO4 getrocknet (Schritte 1.3.4 und 1.3.5). Das Lösungsmittel wird durch Rotationsverdampfung bei 40 °C (Schritt 1.1.7) entfernt, um das Produkt BODIPY-(Me)2-I2-OH zu erhalten.
- Synthese von BODIPY-Cb
- Wiegen Sie 85 mg Chlorambucil ab und lösen Sie es in 2 ml wasserfreiem DCM im Dunkeln unter Stickstoffatmosphäre auf. Wiegen Sie 69 mg N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid ab und lösen Sie es in 1 ml wasserfreiem DCM auf. Geben Sie es unter Rühren 10 Minuten lang in die Chlorambucil-Lösung.
- Lösen Sie 1,7 mg 4-Dimethylaminopyridin in 0,5 ml wasserfreiem DCM auf. Diese Lösung in die Mischung geben und 10 Minuten bei Raumtemperatur weiterrühren. Dann 73 mg BODIPY-(Me)2-I 2-OH gelöst in 2 ml wasserfreiem DCM zugeben und 2 h weiterrühren.
- Geben Sie 10 g Kieselgel in die Mischung und entfernen Sie das Lösungsmittel durch Rotationsverdampfung bei 40 °C. Stoppen Sie die Verdunstung, wenn das Kieselgel wieder zu trockenem Pulver wird. Das Produkt BODIPY-Cb wird säulenchromatographisch (Schritte 1.1.4 bis 1.1.6, 540 nm und 365 nm Signalwellenlänge) mit Hexan/DCM = 7/3 (v/v) als Eluenten gereinigt.
- Wählen Sie die eluierten Fraktionen aus, die das von BODIPY-(Me)2-I 2-OH abweichende Produkt enthalten, indem Sie die TLC-Analyse (Schritt 1.2.5) verwenden. Das Lösungsmittel wird durch Rotationsverdampfung bei 40 °C (Schritt 1.1.7) entfernt, um das Produkt BODIPY-Cbe zu erhalten.
2. Präparation von IR783/BC NPs nach der Flash-Fällungsmethode
- Wiegen Sie 10 mg des BC-Prodrugs (BODIPY-Cb) ab und lösen Sie es in 1 ml DMSO in einem 1,5-ml-Mikroröhrchen auf, um eine 10 mg/ml-Stammlösung zu erhalten. Decken Sie die BC-Lösung mit Folie ab.
- Bereiten Sie 300 μl 0,4 mg/ml IR-783 in gefiltertem deionisiertem Wasser in einem 1,5-ml-Mikroröhrchen vor. Legen Sie dieses Mikroröhrchen mit 1.500 U/min auf einen Wirbelmischer.
- Geben Sie 20 μl der BC-Lösung in DMSO über 10 s mit einer konstanten Rate unter Verwendung einer 20-μl-Pipette über 10 s in die IR-783-Lösung. Das Ende der Pipettenspitze sollte die Innenwand des Mikroröhrchens berühren (Abbildung 1B).
- Lassen Sie das Mikroröhrchen für weitere 30 s auf dem Wirbelmischer, um die IR783/BC NP-Lösung zu erhalten. Legen Sie dann die Nanopartikellösung auf ein vollständig mit Folie bedecktes Gestell.
- Zentrifugieren Sie die resultierende IR783/BC NP-Lösung 10 Minuten lang bei 2.000 x g und 4 °C, um Zuschlagstoffe zu entfernen. Sammeln Sie den Überstand und lassen Sie ~20 μL im Röhrchen, um eine Störung des Pellets zu vermeiden. Entsorgen Sie das Pellet.
- Zentrifugieren Sie den Überstand zweimal für 30 min bei 30.000 x g und 4 °C und sammeln Sie den Nanopartikel-Niederschlag aus beiden Zentrifugationen. Resuspendieren Sie die Nanopartikel in 300 μL 1x PBS.
ANMERKUNG: Wenn das hydrophobe BC-Prodrug in DMSO in Wasser mit Vortexing dispergiert wird, wird das DMSO durch Wasser gelöst, und die Prodrug-Moleküle neigen dazu, nanoskalige Anordnungen zu bilden, um sich unter der lokalen Übersättigungssituation stabil zu halten24. - Quantifizieren Sie den Gehalt an IR-783 und BC mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) unter Verwendung der in Tabelle 1 gezeigten Elutionsmethode.
HINWEIS: Die HPLC-Probe wird durch Mischen gleicher Volumina von Nanopartikellösung und Acetonitril hergestellt. Das Injektionsvolumen beträgt 20 μL. Die Detektionswellenlänge für Chlorambucil und BC-Prodrug beträgt 260 nm und die Detektionswellenlänge für IR783 783 nm. Die HPLC-Säule ist eine analytische C18-Säule mit einer Größe von 4,6 mm (Innendurchmesser) x 100 mm (Länge) mit einer Partikelgröße von 2,7 μm und einer Porengröße von 120 Å. - Berechnen Sie die Prodrug-Verkapselungseffizienz (EE%) und die Beladungskapazität (LC%) gemäß den folgenden Gleichungen:
| Zeit (min) | Acetonitril (%) | Wasser (%) |
| 0 | 20 | 80 |
| 5 | 20 | 80 |
| 30 | 95 | 5 |
| 35 | 95 | 5 |
Tabelle 1: HPLC-Methode zur qualitativen und quantitativen Analyse von BC-Prodrug und seiner Photospaltung. Vervielfältigung mit freundlicher Genehmigung25. Copyright 2022, Wiley.
3. Charakterisierung von IR783/BC NPs
- Messen Sie die durchschnittliche Größe der IR783/BC NPs mit einem Instrument zur dynamischen Lichtstreuung (DLS) (siehe Materialtabelle). Geben Sie 200 μl IR783/BC NP-Lösung in eine Küvette und setzen Sie die Küvette zur Messung in den Halter ein. Stellen Sie den Messtyp auf "Größe" und die Messtemperatur auf 25 °C ein. Führen Sie für jede Messung drei Messungen mit einer Dauer von 20 s durch.
- Messen Sie die Oberflächenladung der IR783/BC NPs mit dem DLS-Gerät unter Verwendung einer Zeta-Potential-Testküvette.
- Verdünnen Sie 25 μl IR783/BC NP-Lösung mit 725 μl deionisiertem Wasser in einem 1,5-ml-Mikroröhrchen und geben Sie die Lösung in eine Zeta-Potential-Testküvette. Setzen Sie die Küvette in die Probennut ein. Verschließen Sie die Probenrille.
- Stellen Sie den Messtyp auf "Zeta-Potential" und die Messtemperatur auf 25 °C ein. Führen Sie 10 Messungen durch.
- Bereiten Sie die Proben für die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) vor. Geben Sie 10 μl IR783/BC NP-Lösung auf ein Stück löchrigen Kohlenstofffilm auf einem Kupfergitter (300 Mesh) und entfernen Sie 7 μl. Lassen Sie 3 μl Lösung über Nacht auf der Folie für die automatische Verdampfung.
Anmerkungen: Durch die Zugabe von 10 μl der NP-Lösung und anschließender Entfernung von 7 μl kann das Tröpfchen einen breiteren Bereich auf der Folie abdecken.
4. Photoaktivierung von IR783/BC NPs
- Stellen Sie eine LED-Lampe (530 nm; siehe Materialtabelle) mit einem Eisenstativ so auf, dass die Leuchte direkt auf den Bedienboden ausgerichtet ist. Platzieren Sie ein Ulbrichtkugel-Photodiodenphotometer (siehe Materialtabelle) direkt unter der LED-Lampe.
HINWEIS: Um den Einfluss von Umgebungslicht zu verhindern, werden alle Lichtbestrahlungsexperimente in einer Dunkelkammer durchgeführt. - Schalten Sie die LED-Lampe ein und öffnen Sie die Kappe des Photometers. Zeichnen Sie die Bestrahlungsstärke auf und stellen Sie die Lampenparameter mit der zugehörigen Software ein (siehe Materialtabelle). Stellen Sie den Eingangsstrom (mA) so ein, dass die Bestrahlungsstärke auf 50 mW/cm2 eingestellt ist.
Anmerkungen: Die Bestrahlungsstärke wird auch durch den Abstand zwischen der LED-Lampe und dem Photometer beeinflusst. In dem hier verwendeten Aufbau (Bild 3A,B) ist der Abstand auf 5 cm festgelegt. - Die IR783/BC NP-Lösung wird mit deionisiertem Wasser auf 50 μM verdünnt, basierend auf der BC-Konzentration. Geben Sie 200 μl der IR783/BC NP-Lösung in ein 1,5-ml-Mikroröhrchen. Legen Sie das Röhrchen auf einen Schaumstoffblock mit einer Nut, die die Größe des Mikroröhrchens hat und die gleiche Höhe wie das Photometer in Schritt 4.1 hat (Abbildung 3C,D).
- Öffnen Sie die Kappe der Tube. Schalten Sie die LED-Lampe ein und bestrahlen Sie die Nanopartikellösung 1, 2, 3, 5, 7 und 10 Minuten lang.
- Quantifizierung des BC-Verbrauchs und der Cb-Freisetzung durch HPLC nach Lichtbestrahlung. Berechnen Sie den Prozentsatz der verbleibenden BC- und Cb-Freisetzung mit den folgenden Gleichungen:
5. Prüfung der Zytotoxizität von IR783/BC NPs mit und ohne Lichtbestrahlung
- Kultur von HCT116-Zellen (humane kolorektale Tumorzelllinie) in RPMI 1640-Medium mit 10 % fötalem Kälberserum und 1 % Penicillin-Streptomycin (komplettes Medium) in einer 5 % CO2 -Atmosphäre bei 37 °C (~2 x 10,6 Zellen pro Schale in einer 90 mm Zellkulturschale). Subkulturieren Sie die Zellen routinemäßig alle 2-3 Tage.
HINWEIS: HCT116 ist eine humane Dickdarmzelllinie. Im Vergleich zu anderen Krebszellen wie HeLa-, MCF7- und A549-Zellen exprimieren HCT-116-Zellen einen höheren Gehalt an Caveolin-125, das von IR783 angegriffen werden kann und die zelluläre Aufnahme von IR783/BC-NPs erhöht. - Die HCT116-Zellen werden in 96-Well-Platten mit RPMI 1640 Komplettmedium mit einer Dichte von 104 Zellen pro Well beschichtet.
- Saugen Sie das Medium aus der Kulturschale ab, wenn die Zellkonfluenz 50 % überschreitet. Waschen Sie die Zellen mit 1x PBS und entfernen Sie das PBS. 1 ml 0,25%ige Trypsinlösung zugeben und bei 37 °C in einem 5%igen CO2 -Inkubator inkubieren.
- Nach 3 Minuten fügen Sie 2 ml des vollständigen Mediums hinzu, um den Trypsinaufschluss zu löschen. Resuspendieren Sie die Zellen, übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15-ml-Zentrifugationsröhrchen und zentrifugieren Sie 3 Minuten lang bei 300 x g . Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml des vollständigen Mediums.
- 10 μL der Zellsuspension auf 200 μL mit Komplettmedium verdünnen. Geben Sie 10 μl auf ein Hämozytometer und verschließen Sie es mit einem Deckglas.
- Beobachten Sie das Hämozytometer unter dem Mikroskop (Okular: 10x; Objektivlinse: 4x). Zählen und notieren Sie die Zellnummern an den vier Eckfeldern und in der Mitte. Berechnen Sie die Zellkonzentration mit der folgenden Formel:
Wobei n = der Durchschnitt der Zellzahlen der fünf Quadrate ist. - Verdünnen Sie die Zellsuspension auf 1 x 105 Zellen/ml. Fügen Sie 100 μl der Zellsuspension pro Well in eine 96-Well-Platte hinzu, um die Zellen zu besiedeln. Geben Sie 100 μl PBS pro Vertiefung in die nicht ausgesäten Vertiefungen.
- Behandeln Sie die Zellen mit (1) 0,1-150 μM freiem BC, (2) 0,1-150 μM IR783/BC NPs (bezogen auf die BC-Konzentration), (3) 0,1-150 μM freiem BC mit Lichtbestrahlung oder (4) 0,1-150 μM IR783/BC NPs (bezogen auf die BC-Konzentration) mit Lichtbestrahlung. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem 5%igen CO2 -Inkubator für 6 h.
HINWEIS: Die freien BC- und IR783/BC NP-Lösungen werden aus ihren jeweiligen Stammlösungen mit vollständigem Medium verdünnt. - Ersetzen Sie nach 6 h Inkubationszeit das Prodrug-/Nanopartikel-haltige Medium durch frisches Komplettmedium. Die nicht bestrahlenden Gruppen 1 und 2 werden 24 h im Dunkeln inkubiert. Für die Gruppen 3 und 4 werden die Zellen 5 min lang mit einer 530 nm LED-Lampe (50 mW/cm2) bestrahlt und 24 h inkubiert.
Anmerkungen: Die Zellplatten werden auf einen Schaumstoffblock gelegt, um die gleiche Höhe wie das Photometer in Schritt 4.1 zu gewährleisten. - Bestimmung der Zellviabilität mit einem 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Assay.
- Nach der BC- oder Nanopartikelbehandlung werden 10 μl MTT (10 mg/ml in PBS) in jede Vertiefung gegeben und die Platten 3 h lang bei 37 °C inkubiert. Entfernen Sie dann das Medium und geben Sie 100 μl DMSO in jede Vertiefung. Lesen Sie die Absorption mit einem Mikroplatten-Reader bei 490 nm, 570 nm und 630 nm ab.
- Berechnen Sie die Zellviabilität mit der folgenden Gleichung:
ANMERKUNG: Vier unabhängige Experimente (n = 4) jeder Gruppe werden zur Analyse durchgeführt. OD490 kann bei der Berechnung der Zellviabilität durch OD570-OD 630 ersetzt werden.
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Representative Results
IR783/BC NPs wurden in dieser Studie erfolgreich unter Verwendung einer Flash-Fällungsmethode hergestellt. Die synthetisierten IR783/BC-NPs präsentierten sich als violette Lösung, während die wässrige Lösung von IR783 blau war (Abbildung 4A). Wie in Abbildung 4B dargestellt, wiesen die IR783/BC NPs eine durchschnittliche Größe von ca. 87,22 nm mit einem Polydispersitätsindex (PDI) von 0,089 auf, was eine enge Größenverteilung zeigt. Die Oberflächenladung der IR783/NPs betrug etwa -29,8 mV (Abbildung 4C), was auf die negativ geladenen Sulfonatgruppen von IR783 zurückzuführen ist. Abbildung 4D zeigt die Stabilität der IR783/BC NPs. Die Größe der Nanopartikel wurde nach der Herstellung für mindestens 48 h (in PBS bei 37 °C) bei etwa 85 nm gehalten, während ihr PDI ebenfalls kleiner als 0,2 blieb. Es wurde keine signifikante Veränderung in der Größenverteilung von IR783/BC NPs 0 h, 24 h und 48 h nach der Herstellung beobachtet (Abbildung 4E).
Abbildung 5A,B zeigt die Morphologie von IR783/BC NPs vor bzw. nach Lichtbestrahlung. Sowohl Aggregate als auch Fragmente konnten nach Lichteinstrahlung beobachtet werden, was auf die Dissoziation bzw. Aggregation der Nanopartikel hinweist. Abbildung 5C zeigt die Änderung der Nanopartikelgröße und ihrer Verteilung nach 3 min und 5 min Lichtbestrahlung. Für die bestrahlten Nanopartikel wurde eine größere Größe und eine breitere Verteilung beobachtet. Die Photorelease-Profile der IR783/BC NPs wurden ebenfalls mittels HPLC gemessen. Wie in Abbildung 5D,E gezeigt, wurde Prodrug BC in 10 min photogespalten. Gleichzeitig wurde Cb mit einer Rückgewinnungseffizienz von rund 22 % im gleichen Zeitraum freigesetzt.
Die IR783/BC NPs zeigten eine signifikante Zytotoxizität auf humanen kolorektalen Tumorzellen (HCT116) unter Lichtbestrahlung bei 530 nm im Vergleich zur Nicht-Bestrahlungsgruppe (Abbildung 6). Der IC50 von IR783/BC NPs mit Lichtbestrahlung (6,62 μM) war niedriger als der von freiem BC mit Lichtbestrahlung (9,24 μM), was eine höhere in vitro Antitumorwirksamkeit von IR783/BC NPs mit Lichtbestrahlung zeigt als die von freiem BC mit Lichtbestrahlung25. Die dargestellte Zytotoxizität resultierte sowohl aus freigesetztem Cb als auch aus erzeugten reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) (ergänzende Abbildung 1 und ergänzende Abbildung 2). Die höhere Zytotoxizität der IR783/BC NPs unter Lichtbestrahlung wurde hauptsächlich durch die effiziente zelluläre Aufnahme der IR783/BC NPs verursacht25.
Abbildung 1: Bildung von IR783/BC NPs. (A) Selbstorganisation und lichtgetriggerte Dissoziation von IR783/BC NPs. (B) Herstellungsschema von IR783/BC NPs durch Blitzausfällung. Vervielfältigung mit freundlicher Genehmigung25. Copyright 2022, Wiley. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Syntheseroute des Prodrugs BODIPY-Cb (BC). BODIPY-Derivate wurden zunächst aus Acetoxyacetylchlorid und 2,4-Dimethylpyrrol synthetisiert und dann mit Cb konjugiert. 1H-NMR-Spektrum des BC-Prodrugs ist in ergänzender Abbildung 3 dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Aufbau der LED-Bestrahlung . (A,B) Einstellung der LED-Lampe zur Messung der Bestrahlungsstärke. (C,D) LED-Lampeneinstellung für die Bestrahlung von IR783/BC NPs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Charakterisierung von IR783/BC NPs. (A) Erscheinungsbild von freien IR783-, freien BC- und IR783/BC NP-Lösungen. (B) Größenverteilung von IR783/BC NPs. (C) Oberflächenladung von IR783/BC NPs. (D) Größenänderung von IR783/BC NPs in PBS bei 37 °C während 48 h nach der Herstellung. (E) Größenverteilung von IR783/BC NPs bei 0 h, 24 h und 48 h nach der Herstellung. Vervielfältigung mit freundlicher Genehmigung25. Copyright 2022, Wiley. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Photorelease von IR783/BC NPs. TEM-Aufnahmen von IR783/BC NPs (A) vor und (B) nach Lichteinstrahlung. Maßstabsbalken = 100 μm. (C) Größenverteilung von IR783/NPs nach 0 min, 3 min und 5 min Lichteinstrahlung. (D) HPLC-Analyse von IR783/BC NPs, die einer zunehmenden Bestrahlungsdauer von bis zu 10 min ausgesetzt waren. (E) Quantifizierung des Abbaus von BC und IR783 und der Cb-Freisetzung (n = 3). Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar. Lichteinstrahlung: 530 nm LED-Lampe, 50 mW/cm2. Vervielfältigung mit freundlicher Genehmigung25. Copyright 2022, Wiley. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Zytotoxizität von IR783/BC NPs gegen HCT116-Zellen. Eine signifikante Zytotoxizität zeigte sich bei BC-Konzentrationen >1 μM (n = 4). Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar. Es wurde ein unabhängiger Stichproben-t-Test durchgeführt, um die statistische Signifikanz der Unterschiede zu bestimmen. *p < 0,05, **p < 0,01. Lichteinstrahlung: 530 nm LED-Lampe, 50 mW/cm2. Vervielfältigung mit freundlicher Genehmigung25. Copyright 2022, Wiley. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzende Abbildung 1: Photochemischer Mechanismus. (A) Photospaltung von BC-Prodrug. (B) Zerlegung von IR783. Angepasst mit Genehmigung25. Copyright 2022, Wiley. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 2: ROS-Generierungsprofil. ROS-Erzeugung verschiedener Proben unter Lichtbestrahlung, quantifiziert mit einer Singulett-Sauerstoffsensor-Grünsonde (SOSG). Lichteinstrahlung: 530 nm LED-Lampe, 50 mW/cm2. Angepasst mit Genehmigung25. Copyright 2022, Wiley. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 3: 1H-NMR-Spektrum von BODIPY-Cb. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung22. Copyright 2022, American Chemical Society. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Flash-Fällungsmethode für die Herstellung von Prodrug-Dye-Nanopartikeln, die einen einfachen und bequemen Ansatz für die Bildung von Nanopartikeln bietet. Diese Methode besteht aus mehreren kritischen Schritten. Erstens sollten für alle Schritte der Synthese, Herstellung und Charakterisierung Behälter wie Mikroröhrchen mit Folie abgedeckt werden, um eine unnötige Photospaltung des BC-Prodrugs durch Umgebungslicht zu vermeiden. Darüber hinaus sollte im Flash-Fällungsschritt das Mikroröhrchen, das die IR-783-Lösung enthält, stabil auf dem Wirbelmischer platziert werden, während langsam die BC-Prodrug-Lösung hinzugefügt wird. Auf diese Weise kann die BC-Prodrug-Lösung (in DMSO) gleichmäßig in der IR-783-Lösung dispergiert werden. Im Reinigungsschritt wird ein Differentialzentrifugationsverfahren verwendet. Die erste Zentrifugation bei 2.000 x g wird verwendet, um die ungeladenen BC-Prodrug-Feststoffe zu entfernen, während die zweite Zentrifugation bei 30.000 x g DMSO und IR783 im Überstand entfernt, die nicht in den Nanopartikeln eingebaut sind. IR783/BC NPs können dann als Niederschlag aufgefangen und in gefiltertem deionisiertem Wasser resuspendiert werden.
Die Selbstorganisation ist eine einfache und effiziente Methode zur Herstellung von Nanopartikeln. Die Methode der Selbstorganisation muss jedoch unter Berücksichtigung von Faktoren wie der Hydrophobie der Bausteine optimiert werden. In diesem Protokoll ist eine der Komponenten, IR783, ein wasserlöslicher Farbstoff, der in Wasser gelöst ist. In einigen Fällen können jedoch alle Komponenten hydrophob sein. Unter solchen Umständen sollten sie wie das BC-Prodrug in diesem Protokoll in DMSO aufgelöst werden. Ein Stabilisator wie 1 ,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-Poly(ethylenglykol) (DSPE-PEG) kann verwendet werden, um selbstorganisierte Nanopartikel 14,26,27 zu bilden und zu stabilisieren.
Licht hat eine begrenzte Gewebedurchdringung, was die Anwendung von photoaktivierbaren Nanopartikeln in der klinischen Anwendung einschränkt. Eine Lösung besteht darin, langwellige, lichtaktivierbare Systeme, wie z.B. rotes oder nahinfrarotes Licht28, zu entwickeln. Die Verwendung von Lichtwellenleitern zur Lichtabgabe ist eine weitere Möglichkeit, das Problem der begrenzten Gewebedurchdringung von Licht bei einigen Krankheitsläsionen zu lösen29. Darüber hinaus beruht die Ko-Assemblierung von Komponenten hauptsächlich auf intermolekularen Kräften wie hydrophober Wechselwirkung, π-π-Stapelung und Wasserstoffbrückenbindungen, was darauf hindeutet, dass diese Methode möglicherweise nicht auf alle Prodrug- und Farbstoffmoleküle anwendbar ist30. Die Machbarkeit des Zusammenbaus funktioneller Moleküle wie Medikamente, Prodrugs, Farbstoffe, Photosensibilisatoren und photothermischer Wirkstoffe muss durch theoretische Berechnungen und experimentelle Charakterisierung bewertet werden.
Das photoaktivierbare Prodrug-Dye-Nano-Drug-Delivery-System hat mehrere Vorteile. Zum einen können Farbstoffe wie IR783 unter Lichtbestrahlung zersetzt werden, was anschließend eine lokale und spezifische Demontage der Nanopartikel25 ermöglicht. Darüber hinaus kann der eingebaute Farbstoff als bildgebendes Mittel zur Überwachung des Drug-Delivery-Systems fungieren, wobei seine Fluoreszenz verwendet wird, um die Akkumulation und den Abbau der Nanopartikel zu verfolgen. Darüber hinaus wurde berichtet, dass Indocyaninfarbstoffe mit Sulfonatgruppen in der Lage sind, bei einigen Krebsarten auf Caveolae abzuzielen19, was eine effiziente zelluläre Aufnahme der Wirkstoffabgabesysteme ermöglicht25. Daher haben Indocyaninfarbstoffe mit ähnlichen Strukturen ein großes Potenzial für den Einbau in solche Drug-Delivery-Systeme.
Bisher gibt es nur wenige Veröffentlichungen zur Standardisierung von Operationen zur Photoaktivierung von Nano-Drug-Delivery-Systemen31. Daher kann das hier beschriebene Protokoll als nützliche Referenz für die Entwicklung photoresponsiver Wirkstoffverabreichungssysteme dienen.
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Disclosures
Eine PCT-Anmeldung wurde unter der Nr.PCT/CN2021/081262 eingereicht.
Acknowledgments
Wir bedanken uns für die Unterstützung durch die Core Facility der medizinischen Fakultät Li Ka Shing der Universität von Hongkong. Wir danken Professor Chi-Ming Che von der Universität Hongkong für die Bereitstellung der humanen HCT116-Zelllinie. Diese Arbeit wurde vom Ming Wai Lau Centre for Reparative Medicine Associate Member Program und dem Research Grants Council of Hong Kong (Early Career Scheme, Nr. 27115220) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1260 Infinity II HPLC | Agilent Technologies | ||
| 2,4-Dimethyl pyrrole | J&K Scientific | 315305 | |
| 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT) | Gibco | M6494 | |
| 4-Dimethylaminopyridine (4-DMAP) | J&K Scientific | 212279 | |
| 90 mm Petri Dish Clear Treated Sterile | SPL | 11090 | |
| 96-well Tissue Culture Plate Clear Treated Sterile | SPL | 30096 | |
| Acetoxyacetyl chloride | J&K Scientific | 192001 | |
| Boron trifluoride diethyl etherate | J&K Scientific | 921076 | |
| Büchner funnel | AS ONE | 3-6466-01 | |
| Chlorambucil | J&K Scientific | 321407-1G | |
| CM100 Transmission Electron Microscope | Philips | ||
| CombiFlash RF chromatography system | Teledyne ISCO | ||
| Dichloromethane | DUKSAN Pure Chemicals | JT9315-88 | |
| Dimethyl sulfoxide | DUKSAN Pure Chemicals | 2762 | |
| Disposable cuvette | Malvern Panalytical | DTS1070 | Zeta potential measurement |
| Disposable cuvette | Malvern Panalytical | ZEN0040 | |
| Empty Disposable Sample Load Cartridges | Teledyne ISCO | 693873225 | can hold up to 65 g |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270106 | |
| Filtering flask | AS ONE | 3-7089-03 | |
| Hexane | DUKSAN Pure Chemicals | 4198 | |
| Holey carbon film on copper grid | Beijing Zhongjingkeyi Technology Co.,Ltd | BZ10023a | |
| HPLC column (InfinityLab Poroshell 120) | Agilent Technologies | 695975-902T | |
| Integrating sphere photodiode power sensor | Thorlabs | S142C | |
| IR783 | Tokyo Chemical Industry (TCI) Co., Ltd | I1031 | |
| LED | Mightex | LCS-0530-15-11 | |
| LED Driver Control Panel V3.2.0 (Software) | Mightex | ||
| Lithium Hydroxide Anhydrous | TCI | L0225 | |
| Methylmagnesium iodide, 3M solution in diethyl ether | Aladdin | M140783 | |
| N,N-Diisopropyl ethyl amine (DIPEA) | J&K Scientific | 203402 | |
| N,N'-Dicyclohexylcarbodiimide (DCC) | J&K Scientific | 275928 | |
| penicillin–streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate-buffered saline (10×) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| Power and energy meter | Thorlabs | PM100 USB | |
| Rotavapor | BUCHI Rotavapor R300 | ||
| RMPI 1640 | Gibco | 21870076 | |
| Separatory funnel (125 mL) | Synthware | F474125L | |
| Silver Silica Gel Disposable Flash Columns, 40 g | Teledyne ISCO | 692203340 | |
| Sodium sulfate, anhydrous | Alfa Aesar | A19890 | |
| SpectraMax M4 | Molecular Devices LLC | ||
| Tetrahydrofuran (THF), anhydrous | J&K Scientific | 943616 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | |
| Vortex | DLAB Scientific Co., Ltd | MX-S | |
| Zetasizer Nano ZS90 | Malvern Instrument |
References
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