Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

प्रोड्रग-डाई नैनोअसेंबलीज की आसान तैयारी और फोटोएक्टिवेशन

Published: February 17, 2023 doi: 10.3791/64677
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology, The University of Hong Kong, 2Department of Pharmacology and Pharmacy, Li Ka Shing Faculty of Medicine, The University of Hong Kong, 3Laboratory of Molecular Engineering and Nanomedicine, Dr. Li Dak-Sum Research Centre, The University of Hong Kong

Summary

यह प्रोटोकॉल एक फोटोरेस्पॉन्सिव प्रोड्रग-डाई नैनोअसेंबली के निर्माण और लक्षण वर्णन का वर्णन करता है। प्रकाश विकिरण सेटअप सहित प्रकाश-ट्रिगर विघटन द्वारा नैनोकणों से दवा रिलीज के लिए पद्धति स्पष्ट रूप से वर्णित है। प्रकाश विकिरण के बाद नैनोकणों से जारी दवाओं ने मानव कोलोरेक्टल ट्यूमर कोशिकाओं पर उत्कृष्ट एंटी-प्रसार प्रभाव प्रदर्शित किए।

Abstract

नैनोस्केल दवा वितरण प्रणाली के निर्माण के लिए स्व-असेंबली एक सरल लेकिन विश्वसनीय तरीका है। फोटोएक्टिवेटेबल प्रोड्रग प्रकाश विकिरण द्वारा नियंत्रित लक्ष्य स्थलों पर नैनोकैरियर से नियंत्रणीय दवा रिलीज को सक्षम करते हैं। इस प्रोटोकॉल में, आणविक स्व-विधानसभा के माध्यम से फोटोएक्टिवेटेबल प्रोड्रग-डाई नैनोकणों को बनाने के लिए एक आसान विधि प्रस्तुत की गई है। प्रोड्रग संश्लेषण, नैनोपार्टिकल निर्माण, नैनोअसेंबली के भौतिक लक्षण वर्णन, फोटोक्लिवेज प्रदर्शन और इन विट्रो साइटोटॉक्सिसिटी सत्यापन के लिए प्रक्रियाओं को विस्तार से वर्णित किया गया है। एक फोटोक्लिवेबल बोरॉन-डिपिरोमेथेन-क्लोरम्बुसिल (बीसी) प्रोड्रग को पहली बार संश्लेषित किया गया था। बीसी और निकट-अवरक्त डाई, आईआर -783, एक अनुकूलित अनुपात में, नैनोकणों (आईआर 783 / बीसी एनपी) में स्वयं इकट्ठा हो सकता है। संश्लेषित नैनोकणों का औसत आकार 87.22 एनएम और सतह चार्ज -29.8 एमवी था। नैनोकणों को प्रकाश विकिरण पर अलग किया जाता है, जिसे ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉनिक माइक्रोस्कोपी द्वारा देखा जा सकता है। बीसी का फोटोक्लिवेज 10 मिनट के भीतर पूरा हो गया था, जिसमें क्लोरम्बुसिल के लिए 22% वसूली दक्षता थी। नैनोकणों ने गैर-विकिरणित नैनोकणों और विकिरणित मुक्त बीसी प्रोड्रग की तुलना में 530 एनएम पर प्रकाश विकिरण के तहत बढ़ी हुई साइटोटॉक्सिसिटी प्रदर्शित की। यह प्रोटोकॉल फोटोरेस्पॉन्सिव दवा वितरण प्रणालियों के निर्माण और मूल्यांकन के लिए एक संदर्भ प्रदान करता है।

Introduction

कीमोथेरेपी एक सामान्य कैंसर उपचार है जो कैंसर कोशिकाओं को मारने के लिए साइटोटोक्सिक एजेंटों को नियोजित करता है और इस प्रकारट्यूमर के विकास को रोकता है। हालांकि, कीमोथेरेपी दवाओं 2,3,4 के ऑफ-टारगेट अवशोषण के कारण रोगी कार्डियोटॉक्सिसिटी और हेपेटोटॉक्सिसिटी जैसे दुष्प्रभावों से पीड़ित हो सकते हैं। इसलिए, ट्यूमर में दवा रिलीज / सक्रियण के स्थानिक नियंत्रण के माध्यम से स्थानीयकृत दवा वितरण सामान्य ऊतकों में दवा जोखिम को कम करने के लिए आवश्यक है।

प्रोड्रग रासायनिक रूप से संशोधित दवाएं हैं जो सक्रियण 5,6 पर रोगग्रस्त घावों में अपनी कार्रवाई को बनाए रखते हुए सामान्य ऊतकों में कम विषाक्तता प्रदर्शित करती हैं। प्रोड्रग्स विभिन्न प्रकार की उत्तेजनाओं के प्रति उत्तरदायी हो सकते हैं, जैसे कि पीएच 7,8, एंजाइम 9,10, अल्ट्रासाउंड11,12, गर्मी13, और प्रकाश14,15,1 6, और विशेष रूप से घावों में अपनी मूल दवाएं जारी करते हैं। फिर भी, कई प्रोड्रग अंतर्निहित कमियों का प्रदर्शन करते हैं, जैसे कि खराब घुलनशीलता, गलत अवशोषण दर, और प्रारंभिक चयापचय विनाश, जो उनके विकास को सीमित कर सकताहै। इस संदर्भ में, प्रोड्रग नैनोअसेंबली का गठन साइड इफेक्ट्स में कमी, सीटू दवा रिलीज, बेहतर प्रतिधारण और उपचार और इमेजिंग के संयोजन जैसे फायदे प्रदान करता है, जो इन नैनोअसेंबली के लिए महान अनुप्रयोग क्षमता का संकेत देता है। रोग के उपचार के लिए कई प्रोड्रग नैनोअसेंबली विकसित की गई हैं, जिनमें डॉक्सोर्यूबिसिन प्रोड्रग नैनोस्फीयर, कर्क्यूमिन प्रोड्रग मिसेल और कैम्प्टोथेसिन प्रोड्रग नैनोफाइबर18 शामिल हैं।

इस प्रोटोकॉल में, हम प्रोड्रग-डाई नैनोअसेंबली की तैयारी के लिए एक सरल विधि प्रस्तुत करते हैं जो उच्च प्रोड्रग सामग्री, अच्छी पानी की फैलाव, दीर्घकालिक स्थिरता और संवेदनशील प्रतिक्रिया क्षमता प्रदर्शित करते हैं। आईआर 783 एक पानी में घुलनशील निकट-अवरक्त डाई है जो नैनोअसेंबली19 के स्टेबलाइजर के रूप में काम कर सकता है। नैनोअसेंबली का अन्य घटक बोरॉन-डिपिरोमेथेन-क्लोरम्बुसिल (बीओडीआईपीवाई-सीबी, बीसी) है, एक प्रोड्रग जिसे दो मुख्य कारणों से डिज़ाइन किया गया था। चूंकि क्लोरम्बुसिल (सीबी) विवो में प्रणालीगत विषाक्तता प्रदर्शित करता है, प्रोड्रग फॉर्म इसकी विषाक्तता को कम कर सकताहै20. बीसी प्रोड्रग को रोग के घावों पर निर्देशित 530 एनएम प्रकाश विकिरण का उपयोग करके फोटोक्लीवर किया जा सकता है, जिससे सीबी की स्थानीय रिहाई सक्षम होती है। दूसरी ओर, सीबी जलीय वातावरण में हाइड्रोलिसिस से ग्रस्त है, और इसे प्रोड्रग फॉर्म21 में बदलकर संरक्षित किया जा सकता है। इस प्रकार, बीसी प्रोड्रग और आईआर -783 डाई की सह-असेंबली से एक स्थिर और प्रभावी दवा वितरण नैनोसिस्टम (चित्रा 1 ए) बनाने की उम्मीद थी। यह प्रोड्रग-डाई नैनोअसेंबली प्रोड्रग अणुओं की फैलाव और स्थिरता में सुधार करता है, जो प्रकाश-नियंत्रणीय दवा वितरण में आवेदन के लिए इसकी क्षमता का सुझाव देता है। बीसी प्रोड्रग का फोटोक्लीवेज नैनोकणों के विघटन और घावों में सीबी की प्रकाश-नियंत्रित रिहाई को सक्षम बनाता है (पूरक चित्रा 1)।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. बोरान-डिपिरोमेथेन-क्लोरम्बुसिल (बीसी) प्रोड्रग का संश्लेषण (चित्रा 2)22

  1. BODIPY-OAC का संश्लेषण
    1. 2,4-डाइमिथाइल पाइरोल के 1.903 ग्राम वजन करें और इसे नाइट्रोजन वातावरण के तहत एक गोल-तल फ्लास्क में 20 एमएल निर्जल डाइक्लोरोमेथेन (डीसीएम) में घोलें। 1.638 ग्राम एसिटॉक्सी एसिटाइल क्लोराइड का वजन करें और इसे घोल में ड्रॉपवाइज जोड़ें। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए हिलाते रहें और फिर 40 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए घोल को रिफ्लक्स करें।
    2. मिश्रण को कमरे के तापमान पर ठंडा करें। एन , एन-डाइसोप्रोपाइलेथिलमाइन (डीआईपीईए) के 5.170 ग्राम वजन करें और इसे हिलाने के तहत मिश्रण में बूंद-वार जोड़ें। 30 मिनट के बाद, 5.677 ग्राम बोरान ट्राइफ्लोराइड डायथाइल एथेरेट (बीएफ3) का वजन करें। OEt2), इसे घोल में ड्रॉपवाइज जोड़ें, और अतिरिक्त 30 मिनट के लिए हिलाते रहें।
    3. मिश्रण में 10 ग्राम सिलिका जेल (200-400 जाल) जोड़ें और 45 डिग्री सेल्सियस पर रोटरी वाष्पीकरण द्वारा विलायक को हटा दें। जब सिलिका जेल सूखे पाउडर में लौटता है तो वाष्पीकरण बंद कर दें।
    4. एक कारतूस के निचले भाग में एक फ्रिट जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें)। कारतूस में सिलिका जेल (चरण 1.1.3 से) भरें और फिर भरे हुए जेल के शीर्ष पर कारतूस में एक और फ्रिट जोड़ें।
    5. कारतूस को फ्लैश क्रोमैटोग्राफी सिस्टम से जुड़े कॉलर में ठीक करें ( सामग्री की तालिका देखें) और इसे लॉक करने के लिए चालू करें। फ्लैश क्रोमैटोग्राफी सिस्टम में छह-तरफा वाल्व के शीर्ष पर कारतूस स्थापित करें और वाल्व के तहत एक फ्लैश कॉलम ( सामग्री की तालिका देखें) स्थापित करें।
    6. क्रोमैटोग्राफी उपकरण शुरू करें और डिटेक्शन तरंग दैर्ध्य के रूप में 515 एनएम और 365 एनएम सेट करें। 4/3 (v/v) हेक्सेन/DCM के साथ क्षालन निष्पादित करें। 515 एनएम सिग्नल दिखाई देने के रूप में एलुएंट अंशों को इकट्ठा करें।
    7. 40 डिग्री सेल्सियस पर रोटरी वाष्पीकरण द्वारा एकत्र किए गए अंशों से विलायक को हटा दें जब तक कि विलायक संग्रह फ्लास्क में कोई और विलायक एकत्र न हो। शेष विलायक को हटाने के लिए ठोस उत्पाद को रात भर वैक्यूम सुखाने वाले कक्ष में रखें।
  2. BODIPY-OH का संश्लेषण
    1. 1.120 ग्राम बीओडीआईपीवाई-ओएसी का वजन करें (चरण 1.1 में संश्लेषित) और इसे कमरे के तापमान पर टेट्राहाइड्रोफ्यूरान (टीएचएफ) के 70 एमएल में घोलें, पूरी तरह से पन्नी से ढका हुआ। BODIPY-OAC समाधान में 0.1 M LiOH जलीय घोल ड्रॉपवाइज का 70 एमएल जोड़ें।
    2. मिश्रण को 30 मिनट के लिए हिलाएं और रोटरी वाष्पीकरण द्वारा 40 डिग्री सेल्सियस पर विलायक को हटा दें जब तक कि विलायक संग्रह फ्लास्क में कोई और विलायक एकत्र न हो। पानी को हटाने के लिए अवशेषों को रात भर वैक्यूम सुखाने वाले कक्ष में रखें।
    3. सूखे अवशेषों को 30 एमएल डीसीएम में घोलें और घोल में 10 ग्राम सिलिका जेल जोड़ें। 40 डिग्री सेल्सियस पर रोटरी वाष्पीकरण द्वारा विलायक को हटा दें। जब सिलिका जेल सूखे पाउडर में लौटता है तो वाष्पीकरण बंद कर दें।
    4. चरण 1.1.4 से 1.1.6 का पालन करते हुए कॉलम क्रोमैटोग्राफी द्वारा उत्पाद बीओडीआईपीवाई-ओएच को शुद्ध करें, जिसमें अकेले डीसीएम एलुएंट के रूप में है।
    5. पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी) पर बीओडीआईपीवाई-ओएसी के टीएचएफ समाधान के साथ विभिन्न क्षालन समय बिंदुओं पर एकत्र किए गए अंशों की तुलना करें और उत्पाद23 की पहचान करें।
      1. समान ऊंचाई पर टीएलसी प्लेट के एक किनारे पर अलग-अलग इल्यूटेड अंश और बीओडीआईपीवाई-ओएसी समाधान के 3-4 μL को स्पॉट करें। टीएलसी प्लेट को एक ग्लास चैंबर में रखें जिसमें 1 एमएल डीसीएम होता है, धब्बेदार किनारे को डीसीएम विलायक में डुबोते हुए लेकिन विलायक से बाहर दो धब्बे के साथ।
      2. टीएलसी प्लेट को बाहर निकालें जब डीसीएम विलायक प्लेट की आधी ऊंचाई तक पहुंच जाता है। BODIPY-OAC स्पॉट से एक अलग ऊंचाई पर TLC स्पॉट के साथ इल्यूटेड अंश का चयन करें।
    6. उत्पाद BODIPY-OH प्राप्त करने के लिए 40 °C (चरण 1.1.7) पर रोटरी वाष्पीकरण द्वारा विलायक को हटा दें।
  3. BODIPY का संश्लेषण- (Me)2-OH
    1. 313 मिलीग्राम बीओडीआईपीवाई-ओएच का वजन करें और इसे नाइट्रोजन वातावरण के तहत अंधेरे में निर्जल डायथाइल ईथर के 35 एमएल में घोलें। घोल में 3.75 एमएल मिथाइल मैग्नीशियम आयोडाइड (डायथाइल ईथर में 3 एम) ड्रॉपवाइज जोड़ें और कमरे के तापमान पर 3 घंटे तक हिलाते रहें।
    2. 3.5 एमएल पानी की बूंद जोड़कर प्रतिक्रिया को बुझाएं।
    3. मिश्रण को डीसीएम और पानी के साथ निकालें।
      1. मिश्रण को 125 एमएल सेपरेटरी फ़नल में स्थानांतरित करें। मिश्रण में 20 एमएल डीसीएम जोड़ें।
      2. विभाजक फ़नल की टोपी बंद करें। फ़नल को लगभग 45° पर झुकाएं और फ़नल को थोड़ा हिलाएं। टोपी को डिफ़्लेट करने के लिए खोलें। इस चरण को 3 बार दोहराएं, और 3 मिनट के लिए खड़े रहने दें।
      3. निचले वाल्व को खोलें और एक बीकर में निचले कार्बनिक चरण को इकट्ठा करें।
      4. जलीय चरण में 30 एमएल डीसीएम जोड़ें। निष्कर्षण (चरण 1.3.3.2 और 1.3.3.3) को हर बार 30 एमएल डीसीएम के साथ 3 बार दोहराएं।
    4. रात भर कार्बनिक चरण को सुखाने के लिए एकत्रित कार्बनिक चरण में 10 ग्राम ठोस Na2SO4 जोड़ें।
    5. एक फ़िल्टरिंग फ्लास्क को रबर ट्यूब के साथ वैक्यूम पंप से लिंक करें। बुचनर फ़नल पर फ़िल्टर पेपर का एक टुकड़ा बिछाएं और फ़नल को फ्लास्क के शीर्ष में डालें। 1 एमएल डीसीएम के साथ फ़िल्टर पेपर गीला करें, मिश्रण को फ़नल में स्थानांतरित करें, और वैक्यूम पंप चालू करें। फ्लास्क में कार्बनिक घोल इकट्ठा करें।
    6. कार्बनिक घोल में 10 ग्राम सिलिका जेल जोड़ें। 40 डिग्री सेल्सियस पर रोटरी वाष्पीकरण द्वारा कार्बनिक विलायक को हटा दें जब तक कि सिलिका जेल सूखे पाउडर में वापस न आ जाए। कॉलम क्रोमैटोग्राफी (चरण 1.1.4 से 1.1.6) द्वारा उत्पाद BODIPY-(Me)2-OH को शुद्ध करें, जिसमें हेक्सेन/डीसीएम = 1/1 (v/v) को एलुएंट के रूप में शामिल किया गया है।
    7. चरण 1.2.5 (बीओडीआईपीवाई-ओएच से अलग ऊंचाई पर टीएलसी स्पॉट) में वर्णित टीएलसी विश्लेषण का उपयोग करके उत्पाद वाले इल्यूटेड अंशों का चयन करें। चरण 1.1.7 में वर्णित उत्पाद प्राप्त करने के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर रोटरी वाष्पीकरण द्वारा विलायक को हटा दें।
  4. BODIPY का संश्लेषण- (Me)2-I 2-OH
    1. 41 मिलीग्राम बीओडीआईपीवाई-(मी) 2-ओएच का वजन करें और इसे नाइट्रोजन वातावरण के तहत अंधेरे में निर्जल टीएचएफ के 2.5 एमएल में घोलें। एन-आयोडोसुकिनाइड के 74 मिलीग्राम वजन करें और इसे निर्जल टीएचएफ के 1 एमएल में घोलें।
    2. BODIPY-(Me)2-OH समाधान में N-iodosuccinimide समाधान ड्रॉपवाइज जोड़ें। कमरे के तापमान पर 3.5 घंटे तक हिलाने के बाद, 40 डिग्री सेल्सियस पर रोटरी वाष्पीकरण द्वारा विलायक को हटा दें जब तक कि रोटरी बाष्पीकरणकर्ता पर विलायक संग्रह फ्लास्क में कोई और विलायक एकत्र न हो।
    3. अवशेषों को 10 एमएल डीसीएम में घोलें और इसे हर बार 30 एमएल पानी से 3 बार धोएं, जैसा कि चरण 1.3.3 में वर्णित है। Na2SO 4 (चरण 1.3.4 और 1.3.5) के साथ कार्बनिक चरण को सुखाएं। उत्पाद BODIPY-(Me)2-I 2-OH प्राप्त करने के लिए 40 °C (चरण 1.1.7) पर रोटरी वाष्पीकरण द्वारा विलायक को हटा दें।
  5. BODIPY-CB का संश्लेषण
    1. क्लोरैम्बुसिल के 85 मिलीग्राम वजन करें और इसे नाइट्रोजन वातावरण के तहत अंधेरे में निर्जल डीसीएम के 2 एमएल में घोलें। एन , एन-डाइसाइक्लोहेक्सिलकार्बोडिमाइड के 69 मिलीग्राम वजन करें और इसे निर्जल डीसीएम के 1 एमएल में घोलें। इसे क्लोरम्बुसिल घोल में 10 मिनट तक हिलाने के साथ डालें।
    2. निर्जल डीसीएम के 0.5 एमएल में 1.7 मिलीग्राम 4-डाइमिथाइलमिनोपाइरिडाइन घोलें। इस घोल को मिश्रण में डालें और कमरे के तापमान पर 10 मिनट तक हिलाते रहें। फिर 73 मिलीग्राम बोडिपाई-(मी) 2-आई 2-ओएच को 2 एमएल निर्जल डीसीएम में घोलकर 2 घंटे तक हिलाते रहें।
    3. मिश्रण में 10 ग्राम सिलिका जेल जोड़ें और 40 डिग्री सेल्सियस पर रोटरी वाष्पीकरण द्वारा विलायक को हटा दें। जब सिलिका जेल सूखे पाउडर में लौटता है तो वाष्पीकरण बंद कर दें। कॉलम क्रोमैटोग्राफी (चरण 1.1.4 से 1.1.6, 540 एनएम और 365 एनएम सिग्नल तरंग दैर्ध्य) द्वारा उत्पाद बीओडीआईपीवाई-सीबी को शुद्ध करें, जिसमें हेक्सेन / डीसीएम = 7/3 (वी / वी) एलुएंट के रूप में है।
    4. टीएलसी विश्लेषण (चरण 1.2.5) का उपयोग करके बीओडीआईपीवाई-(मी)2-आई2-ओएच से अलग उत्पाद वाले इल्यूटेड अंशों का चयन करें। उत्पाद BODIPY-CB प्राप्त करने के लिए 40 °C (चरण 1.1.7) पर रोटरी वाष्पीकरण द्वारा विलायक को हटा दें।

2. फ्लैश वर्षा विधि द्वारा आईआर 783/बीसी एनपी की तैयारी

  1. बीसी प्रोड्रग (बीओडीआईपीवाई-सीबी) के 10 मिलीग्राम वजन करें और 10 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक समाधान प्राप्त करने के लिए इसे 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब में डीएमएसओ के 1 एमएल में घोलें। बीसी समाधान को पन्नी के साथ कवर करें।
  2. 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब में फ़िल्टर किए गए विआयनीकृत पानी में 0.4 मिलीग्राम / एमएल आईआर -783 का 300 μL तैयार करें। इस माइक्रोट्यूब को 1,500 आरपीएम पर एक भंवर मिक्सर पर रखें।
  3. 20 μL पिपेट का उपयोग करके स्थिर दर पर 10 s से अधिक आईआर -783 समाधान में DMSO में BC समाधान का 20 μL जोड़ें। पिपेट टिप का अंत माइक्रोट्यूब की आंतरिक दीवार को छूना चाहिए (चित्रा 1 बी)।
  4. आईआर 783 / बीसी एनपी समाधान प्राप्त करने के लिए अतिरिक्त 30 सेकंड के लिए भंवर मिक्सर पर माइक्रोट्यूब रखें। फिर, नैनोपार्टिकल समाधान को पन्नी के साथ पूरी तरह से कवर किए गए रैक पर रखें।
  5. परिणामी आईआर 783/बीसी एनपी समाधान को 10 मिनट के लिए 2,000 x g और 4 °C पर समुच्चय को हटाने के लिए सेंट्रीफ्यूज करें। गोली को परेशान करने से बचने के लिए ट्यूब में ~ 20 μL छोड़कर सुपरनैटेंट एकत्र करें। गोली को त्याग दें।
  6. 30,000 x g और 4 °C पर 30 मिनट के लिए दो बार सतह पर तैरने वाले को सेंट्रीफ्यूज करें और दोनों सेंट्रीफ्यूजेशन से नैनोपार्टिकल अवक्षेप एकत्र करें। नैनोकणों को 1x PBS के 300 μL में पुन: निलंबित किया।
    नोट: जब डीएमएसओ में हाइड्रोफोबिक बीसी प्रोड्रग को भंवर के साथ पानी में फैलाया जाता है, तो डीएमएसओ पानी से घुल जाता है, और प्रोड्रग अणु स्थानीय सुपरसेप्शन स्थिति24 के तहत खुद को स्थिर रखने के लिए नैनोस्केल असेंबली बनाते हैं।
  7. तालिका 1 में दिखाए गए क्षालन विधि का उपयोग करके उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) द्वारा आईआर -783 और बीसी की सामग्री की मात्रा निर्धारित करें।
    नोट: एचपीएलसी नमूना नैनोपार्टिकल समाधान और एसिटोनिट्राइल की समान मात्रा को मिलाकर तैयार किया जाता है। इंजेक्शन की मात्रा 20 μL है। क्लोरम्बुसिल और बीसी प्रोड्रग के लिए डिटेक्शन तरंग दैर्ध्य 260 एनएम है, और आईआर 783 के लिए डिटेक्शन तरंग दैर्ध्य 783 एनएम है। एचपीएलसी कॉलम एक विश्लेषणात्मक 4.6 मिमी (आंतरिक व्यास) x 100 मिमी (लंबाई) सी 18 कॉलम है, जिसमें 2.7 μm कण आकार और 120 A छिद्र आकार है।
  8. निम्नलिखित समीकरणों के अनुसार प्रोड्रग एनकैप्सुलेशन दक्षता (ईई%) और लोडिंग क्षमता (एलसी%) की गणना करें:
    Equation 1

समय (min) एसिटोनिट्राइल (%) पानी (%)
0 20 80
5 20 80
30 95 5
35 95 5

तालिका 1: बीसी प्रोड्रग और इसके फोटोक्लिवेज के गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एचपीएलसी विधि। अनुमति 25 के साथ पुन: प्रस्तुत किया गया। कॉपीराइट 2022, विली।

3. आईआर 783/बीसी एनपी का लक्षण वर्णन

  1. एक गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन (डीएलएस) उपकरण के साथ आईआर 783 / बीसी एनपी के औसत आकार को मापें ( सामग्री की तालिका देखें)। एक क्यूवेट में आईआर 783/बीसी एनपी समाधान का 200 μL जोड़ें और माप के लिए धारक में क्यूवेट डालें। माप प्रकार को 'आकार' और माप तापमान को 25 डिग्री सेल्सियस के रूप में सेट करें। प्रत्येक माप के लिए 20 सेकंड की अवधि के साथ तीन माप करें।
  2. एक जेटा-संभावित परीक्षण क्यूवेट का उपयोग करके डीएलएस उपकरण के साथ आईआर 783 / बीसी एनपी के सतह चार्ज को मापें।
    1. 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब में 725 μL विआयनीकृत पानी के साथ IR783/BC NP समाधान के 25 μL को पतला करें और घोल को एक ज़ेटा-संभावित परीक्षण क्यूवेट में जोड़ें। क्यूवेट को नमूना नाली में रखें। नमूना नाली को कैप करें।
    2. माप प्रकार को 'जेटा-क्षमता' और माप तापमान को 25 डिग्री सेल्सियस के रूप में सेट करें। 10 माप करें।
  3. ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) इमेजिंग के लिए नमूने तैयार करें। कॉपर ग्रिड (300 जाल) पर छेदी कार्बन फिल्म के एक टुकड़े पर आईआर 783/बीसी एनपी समाधान का 10 μL जोड़ें और 7 μL निकालें। ऑटो-वाष्पीकरण के लिए रात भर फिल्म पर 3 μL घोल छोड़ दें।
    नोट: एनपी समाधान के 10 μL को जोड़ने के बाद 7 μL को हटाने से बूंद को फिल्म पर एक व्यापक क्षेत्र को कवर करने की अनुमति मिलती है।

4. आईआर 783/बीसी एनपी का फोटोएक्टिवेशन

  1. लोहे के स्टैंड के साथ एक एलईडी लैंप (530 एनएम; सामग्री की तालिका देखें) सेट करें ताकि प्रकाश सीधे ऑपरेटिंग फ्लोर का सामना करे। सीधे एलईडी लैंप के नीचे एक एकीकृत क्षेत्र फोटोडायोड फोटोमीटर ( सामग्री की तालिका देखें) रखें।
    नोट: पर्यावरणीय प्रकाश के प्रभाव को रोकने के लिए, सभी प्रकाश विकिरण प्रयोग एक अंधेरे कमरे में आयोजित किए जाते हैं।
  2. एलईडी लैंप चालू करें और फोटोमीटर की टोपी खोलें। विकिरण रिकॉर्ड करें और संबंधित सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके लैंप पैरामीटर सेट करें ( सामग्री की तालिका देखें)। विकिरण को 50 mW/cm2 के रूप में सेट करने के लिए इनपुट धारा (mA) समायोजित करें।
    नोट: विकिरण एलईडी लैंप और फोटोमीटर के बीच की दूरी से भी प्रभावित होता है। यहां उपयोग किए गए सेटअप (चित्रा 3 ए, बी) में, दूरी 5 सेमी तय की गई है।
  3. आईआर 783/बीसी एनपी समाधान को विआयनीकृत पानी के साथ बीसी एकाग्रता के आधार पर 50 μM तक पतला करें। 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब में आईआर 783 / बीसी एनपी समाधान के 200 μL जोड़ें। ट्यूब को माइक्रोट्यूब के नाली फिटिंग आकार और चरण 4.1 (चित्रा 3 सी, डी) में फोटोमीटर के समान ऊंचाई के साथ फोम ब्लॉक पर रखें।
  4. ट्यूब की टोपी खोलें। एलईडी लैंप चालू करें और 1, 2, 3, 5, 7 और 10 मिनट के लिए नैनोपार्टिकल समाधान को विकिरणित करें।
  5. प्रकाश विकिरण के बाद एचपीएलसी द्वारा बीसी खपत और सीबी रिलीज की मात्रा निर्धारित करें। निम्नलिखित समीकरणों का उपयोग करके शेष बीसी और सीबी रिलीज के प्रतिशत की गणना करें:
    Equation 3

5. प्रकाश विकिरण के साथ और बिना आईआर 783 / बीसी एनपी के साइटोटॉक्सिसिटी का परीक्षण

  1. आरपीएमआई 1640 माध्यम में एचसीटी 116 कोशिकाएं (मानव कोलोरेक्टल ट्यूमर सेल लाइन) जिसमें 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 वातावरण में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (पूर्ण माध्यम) होता है (~ 2 x 106 कोशिकाएं प्रति डिश 90 मिमी सेल कल्चर डिश में)। नियमित रूप से हर 2-3 दिनों में कोशिकाओं को उपसंस्कृति करें।
    नोट: एचसीटी 116 एक मानव बृहदान्त्र सेल लाइन है। अन्य कैंसर कोशिकाओं जैसे हेला, एमसीएफ 7, और ए 549 कोशिकाओं की तुलना में, एचसीटी -116 कोशिकाएं कैवोलिन -125 के उच्च स्तर को व्यक्त करती हैं, जिसे आईआर 783 द्वारा लक्षित किया जा सकता है और आईआर 783 / बीसी एनपी के सेलुलर उत्थान को बढ़ाया जा सकता है।
  2. एचसीटी 116 कोशिकाओं को आरपीएमआई 1640 पूर्ण माध्यम के साथ 96-वेल प्लेटों में 10 4 कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह सेघनत्व पर प्लेट करें।
    1. जब सेल कंफ्लुएंसी 50% से अधिक हो जाती है तो संस्कृति डिश से माध्यम को एस्पिरेट करें। कोशिकाओं को 1x PBS से धोएं और PBS को हटा दें। 0.25% ट्रिप्सिन समाधान का 1 एमएल जोड़ें और 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    2. 3 मिनट के बाद, ट्रिप्सिन पाचन को बुझाने के लिए पूर्ण माध्यम के 2 एमएल जोड़ें। कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें, सेल निलंबन को 15 एमएल सेंट्रीफ्यूजेशन ट्यूब में स्थानांतरित करें, और 3 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। सुपरनैटेंट को छोड़ दें और सेल पेलेट को पूर्ण माध्यम के 1 एमएल में पुन: निलंबित करें।
    3. सेल सस्पेंशन के 10 μL को पूर्ण माध्यम के साथ 200 μL तक पतला करें। एक हेमोसाइटोमीटर पर 10 μL रखें और इसे कवरस्लिप के साथ कैप करें।
    4. माइक्रोस्कोप के तहत हेमोसाइटोमीटर का निरीक्षण करें (आईपीस: 10x; उद्देश्य लेंस: 4x)। चार कोने के वर्गों और केंद्र पर सेल संख्याओं की गणना और रिकॉर्ड करें। सूत्र का उपयोग करके सेल एकाग्रता की गणना करें:
      Equation 5
      जहां n = पाँच वर्गों की कोशिका संख्याओं का औसत।
    5. सेल निलंबन को 1 x 105 कोशिकाओं / एमएल तक पतला करें। कोशिकाओं को बीज देने के लिए 96-वेल प्लेट में प्रति अच्छी तरह से सेल सस्पेंशन का 100 μL जोड़ें। गैर-बीज वाले कुओं में प्रति कुएं 100 μL PBS जोड़ें।
  3. कोशिकाओं को (1) 0.1-150 μM मुक्त BC, (2) 0.1-150 μM IR783/BC NPs (BC एकाग्रता के आधार पर), (3) 0.1-150 μM मुक्त BC के साथ प्रकाश विकिरण के साथ, या (4) 0.1-150 μM IR783/BC NPs (BC एकाग्रता के आधार पर) के साथ प्रकाश विकिरण के साथ उपचारित करें। कोशिकाओं को 6 घंटे के लिए 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: मुफ्त बीसी और आईआर 783 / बीसी एनपी समाधान पूर्ण माध्यम के साथ अपने संबंधित स्टॉक समाधानों से पतला होते हैं।
  4. इनक्यूबेशन के 6 घंटे के बाद, प्रोड्रग / नैनोकणों युक्त माध्यम को ताजा पूर्ण माध्यम से बदलें। गैर-विकिरण समूह 1 और 2 को अंधेरे में 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। समूह 3 और 4 के लिए, 5 मिनट के लिए 530 एनएम एलईडी लैंप (50 mW / cm2) के साथ कोशिकाओं को विकिरणित करें, और 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: चरण 4.1 में फोटोमीटर के समान ऊंचाई सुनिश्चित करने के लिए सेल प्लेटों को फोम ब्लॉक पर रखा जाता है।
  5. 3-(4,5-डाइमिथाइलथियाज़ोल-2-yl)-2,5-डिफेनिल टेट्राज़ोलियम ब्रोमाइड (एमटीटी) परख के साथ सेल व्यवहार्यता निर्धारित करें।
    1. बीसी या नैनोपार्टिकल उपचार के बाद, प्रत्येक कुएं में 10 μL MTT (PBS में 10 mg / mL) जोड़ें और प्लेटों को 3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। फिर, माध्यम को हटा दें और प्रत्येक कुएं में डीएमएसओ के 100 μL जोड़ें। 490 एनएम, 570 एनएम और 630 एनएम पर माइक्रोप्लेट रीडर के साथ अवशोषण पढ़ें।
    2. निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करके सेल व्यवहार्यता की गणना करें:
      Equation 6
      नोट: विश्लेषण के लिए प्रत्येक समूह के चार स्वतंत्र प्रयोग (एन = 4) आयोजित किए जाते हैं। सेल व्यवहार्यता की गणना मेंOD 490 कोOD 570-OD 630 द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

आईआर 783 / बीसी एनपी को फ्लैश वर्षा विधि का उपयोग करके इस अध्ययन में सफलतापूर्वक गढ़ा गया था। संश्लेषित IR783/BC NPs को बैंगनी घोल के रूप में प्रस्तुत किया गया था, जबकि IR783 का जलीय घोल नीला था (चित्र 4A)। जैसा कि चित्रा 4 बी में दिखाया गया है, आईआर 783 / बीसी एनपी ने 0.089 के पॉलीडिस्पर्सिटी इंडेक्स (पीडीआई) के साथ लगभग 87.22 एनएम के औसत आकार का प्रदर्शन किया, जो एक संकीर्ण आकार वितरण का प्रदर्शन करता है। आईआर 783 / एनपी का सतह चार्ज लगभग -29.8 एमवी (चित्रा 4 सी) था, जिसे आईआर 783 के नकारात्मक रूप से चार्ज किए गए सल्फोनेट समूहों के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। चित्रा 4 डी आईआर 783 / बीसी एनपी की स्थिरता को दर्शाता है। निर्माण के बाद नैनोकणों का आकार कम से कम 48 घंटे (पीबीएस में 37 डिग्री सेल्सियस पर) के लिए लगभग 85 एनएम पर बनाए रखा गया था, जबकि इसका पीडीआई भी 0.2 से कम रहा। निर्माण के बाद 0 घंटे, 24 घंटे और 48 घंटे पर आईआर 783/ बीसी एनपी के आकार वितरण में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं देखा गया (चित्रा 4 ई)।

चित्र 5ए, बी क्रमशः प्रकाश विकिरण से पहले और बाद में आईआर 783 / बीसी एनपी की आकृति विज्ञान को प्रदर्शित करता है। प्रकाश विकिरण के बाद समुच्चय और टुकड़े दोनों देखे जा सकते हैं, जो क्रमशः नैनोकणों के पृथक्करण और एकत्रीकरण को इंगित करता है। चित्रा 5 सी 3 मिनट और 5 मिनट के प्रकाश विकिरण के बाद नैनोपार्टिकल आकार और इसके वितरण में परिवर्तन को प्रस्तुत करता है। विकिरणित नैनोकणों के लिए एक बढ़ा हुआ आकार और व्यापक वितरण देखा गया था। आईआर 783/बीसी एनपी के फोटोरिलीज प्रोफाइल को एचपीएलसी द्वारा भी मापा गया था। जैसा कि चित्रा 5 डी, ई में दिखाया गया है, प्रोड्रग बीसी को 10 मिनट में फोटोक्लीव किया गया था। इस बीच, सीबी को उसी अवधि के भीतर लगभग 22% की वसूली दक्षता के साथ जारी किया गया था।

आईआर 783 / बीसी एनपी ने गैर-विकिरण समूह (चित्रा 6) की तुलना में 530 एनएम पर प्रकाश विकिरण के तहत मानव कोलोरेक्टल ट्यूमर कोशिकाओं (एचसीटी 116) पर महत्वपूर्ण साइटोटॉक्सिसिटी प्रदर्शित की। प्रकाश विकिरण (6.62 μM) के साथ IR783/BC NPs का IC50 प्रकाश विकिरण (9.24 μM) के साथ मुक्त BC की तुलना में कम था, जो प्रकाश विकिरण25 के साथ मुक्त BC की तुलना में प्रकाश विकिरण के साथ IR783/BC NPs की उच्च इन विट्रो एंटीट्यूमर प्रभावकारिता को दर्शाता है। प्रस्तुत साइटोटॉक्सिसिटी जारी सीबी और उत्पन्न प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) (पूरक चित्रा 1 और पूरक चित्रा 2) दोनों के परिणामस्वरूप हुई। प्रकाश विकिरण के तहत आईआर 783 / बीसी एनपी की उच्च साइटोटॉक्सिसिटी मुख्य रूप से आईआर 783 / बीसी एनपी25 के कुशल सेलुलर उत्थान के कारण हुई थी।

Figure 1
रेखाचित्र 1: IR783/BC NPs का गठन। (A) IR783/BC NPs का स्व-संयोजन और प्रकाश-ट्रिगर पृथक्करण। (B) आकस्मिक वर्षा द्वारा IR783/BC NPs की निर्माण योजना। अनुमति 25 के साथ पुन: प्रस्तुत किया गया। कॉपीराइट 2022, विली। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: प्रोड्रग बीओडीआईपीवाई-सीबी (बीसी) का संश्लेषण मार्ग। बीओडीआईपीवाई डेरिवेट्स को पहले एसिटॉक्सीएसिटाइल क्लोराइड और 2,4-डाइमिथाइल पाइरोल से संश्लेषित किया गया था, और फिर बीसी प्रोड्रग के सीबी 1एच-एनएमआर स्पेक्ट्रम के साथ संयुग्मित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: एलईडी विकिरण सेटअप। (ए, बी) विकिरण माप के लिए एलईडी लैंप सेटिंग। (C, D) IR783/BC NPs के विकिरण के लिए LED लैंप सेटिंग. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: आईआर 783 / बीसी एनपी का लक्षण वर्णन (ए) मुफ्त आईआर 783, मुफ्त बीसी, और आईआर 783 / बीसी एनपी समाधानों की उपस्थिति। (ख) आईआर783/बीसी एनपी का आकार वितरण(ग) आईआर783/बीसी एनपी का सतही प्रभार(घ) निर्माण के बाद 48 घंटे के दौरान पीबीएस में आईआर783/बीसी एनपी के आकार में 37 डिग्री सेल्सियस पर परिवर्तन। (E) निर्माण के बाद 0 घंटे, 24 घंटे और 48 घंटे पर आईआर 783/बीसी एनपी का आकार वितरण। अनुमति 25 के साथ पुन: प्रस्तुत किया गया। कॉपीराइट 2022, विली। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्र 5: आईआर 783 / बीसी एनपी का फोटोरिलीज। प्रकाश विकिरण से पहले आईआर 783/ बीसी एनपी (ए) और (बी) के बाद टीईएम छवियां। स्केल बार = 100 μm. (C) प्रकाश विकिरण के 0 मिनट, 3 मिनट और 5 मिनट के बाद IR783/NPs का आकार वितरण। (घ) आईआर783/बीसी एनपी का एचपीएलसी विश्लेषण प्रकाश विकिरण की बढ़ती अवधि के अधीन 10 मिनट तक (ई) बीसी और आईआर 783 अवक्रमण और सीबी रिलीज का परिमाणीकरण (एन = 3)। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं. प्रकाश विकिरण: 530 एनएम एलईडी लैंप, 50 एमडब्ल्यू / अनुमति 25 के साथ पुन: प्रस्तुत किया गया। कॉपीराइट 2022, विली। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: एचसीटी 116 कोशिकाओं के खिलाफ आईआर 783 / बीसी एनपी की साइटोटॉक्सिसिटी। महत्वपूर्ण साइटोटॉक्सिसिटी बीसी सांद्रता >1 μM (n = 4) पर दिखाई दी। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं. मतभेदों के सांख्यिकीय महत्व को निर्धारित करने के लिए एक स्वतंत्र नमूना टी-टेस्ट अपनाया गया था। * पी < 0.05, ** पी < 0.01। प्रकाश विकिरण: 530 एनएम एलईडी लैंप, 50 एमडब्ल्यू / अनुमति 25 के साथ पुन: प्रस्तुत किया गया। कॉपीराइट 2022, विली। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा 1: फोटोकैमिस्ट्री तंत्र। (ए) बीसी प्रोड्रग का फोटोक्लिवेज। (ख) आईआर783 का अपघटन। अनुमति 25 के साथ अनुकूलित। कॉपीराइट 2022, विली। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 2: आरओएस पीढ़ी प्रोफ़ाइल। प्रकाश विकिरण के तहत विभिन्न नमूनों की आरओएस पीढ़ी एक एकल ऑक्सीजन सेंसर ग्रीन (एसओएसजी) जांच के साथ निर्धारित की गई। प्रकाश विकिरण: 530 एनएम एलईडी लैंप, 50 एमडब्ल्यू / अनुमति 25 के साथ अनुकूलित। कॉपीराइट 2022, विली। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 3: बीओडीआईपीवाई-सीबी का 1एच-एनएमआर स्पेक्ट्रम। अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित22. कॉपीराइट 2022, अमेरिकन केमिकल सोसाइटी। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यह प्रोटोकॉल प्रोड्रग-डाई नैनोकणों के निर्माण के लिए एक आसान फ्लैश वर्षा विधि को रेखांकित करता है, जो नैनोपार्टिकल गठन के लिए एक सरल और सुविधाजनक दृष्टिकोण प्रदान करता है। इस विधि में कई महत्वपूर्ण चरण हैं। सबसे पहले, संश्लेषण, निर्माण और लक्षण वर्णन के सभी चरणों के लिए, माइक्रोट्यूब जैसे कंटेनरों को पर्यावरणीय प्रकाश द्वारा बीसी प्रोड्रग के अनावश्यक फोटोक्लिवेज से बचने के लिए पन्नी के साथ कवर किया जाना चाहिए। इसके अलावा, फ्लैश वर्षा चरण में, आईआर -783 समाधान युक्त माइक्रोट्यूब को धीरे-धीरे बीसी प्रोड्रग समाधान जोड़ते हुए भंवर मिक्सर पर स्थिर रूप से रखा जाना चाहिए। इस तरह, बीसी प्रोड्रग समाधान (डीएमएसओ में) आईआर -783 समाधान में समान रूप से फैलाया जा सकता है। शुद्धिकरण चरण में, एक अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन विधि का उपयोग किया जाता है। 2,000 x g पर पहला सेंट्रीफ्यूजेशन अनलोडेड बीसी प्रोड्रग ठोस पदार्थों को हटाने के लिए उपयोग किया जाता है, जबकि 30,000 x g पर दूसरा सेंट्रीफ्यूजेशन सुपरनैटेंट में डीएमएसओ और आईआर 783 को हटा देता है जो नैनोकणों में शामिल नहीं होते हैं। आईआर 783/बीसी एनपी को तब अवक्षेप के रूप में एकत्र किया जा सकता है और फ़िल्टर किए गए विआयनीकृत पानी में पुन: निलंबित किया जा सकता है।

स्व-असेंबली नैनोकणों के निर्माण के लिए एक सरल और कुशल विधि है। हालांकि, स्व-असेंबली विधि को बिल्डिंग ब्लॉकों की हाइड्रोफोबिसिटी जैसे कारकों के अनुसार अनुकूलित करने की आवश्यकता है। इस प्रोटोकॉल में, घटकों में से एक, आईआर 783, एक पानी में घुलनशील डाई है जो पानी में घुल जाता है। हालांकि, कुछ मामलों में, सभी घटक हाइड्रोफोबिक हो सकते हैं। ऐसी परिस्थिति में, उन्हें इस प्रोटोकॉल में बीसी प्रोड्रग की तरह डीएमएसओ में भंग कर दिया जाना चाहिए। 1, 2-डिस्टेरोयल-एसएन-ग्लाइसेरो-3-फॉस्फोएथेनॉलमाइन-पॉली (एथिलीन ग्लाइकोल) (डीएसपीई-पीईजी) जैसे स्टेबलाइजर का उपयोग स्व-इकट्ठे नैनोकणों 14,26,27 को बनाने और स्थिर करनेमें मदद करने के लिए किया जा सकता है।

प्रकाश में सीमित ऊतक प्रवेश होता है, जो नैदानिक उपयोग में फोटोएक्टिवेबिलिटी नैनोकणों के आवेदन को सीमित करता है। एक समाधान लंबी तरंग दैर्ध्य प्रकाश-सक्रिय प्रणालियों को विकसित करना है, जैसे कि लाल या निकट-अवरक्त प्रकाश28। प्रकाश देने के लिए ऑप्टिक फाइबर का उपयोग करना कुछ रोग घावों के लिए प्रकाश के सीमित ऊतक प्रवेश मुद्दे को हल करने का एक औरतरीका है। इसके अलावा, घटकों की सह-असेंबली मुख्य रूप से हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन, π-π स्टैकिंग और हाइड्रोजन बॉन्डिंग जैसे इंटरमॉलिक्युलर बलों पर निर्भर करती है, जो बताती है कि यह विधि सभी प्रोड्रग और डाई अणुओं30 पर लागू नहीं हो सकती है। दवाओं, प्रोड्रग्स, रंजक, फोटोसेंसिटाइज़र और फोटोथर्मल एजेंटों जैसे कार्यात्मक अणुओं को सह-संयोजन की व्यवहार्यता का सैद्धांतिक गणना और प्रयोगात्मक लक्षण वर्णन के माध्यम से मूल्यांकन करने की आवश्यकता है।

फोटोएक्टिवेटेबल प्रोड्रग-डाई नैनोस्केल दवा वितरण प्रणाली के कई फायदे हैं। सबसे पहले, आईआर 783 जैसे रंगों को प्रकाश विकिरण के तहत विघटित किया जा सकता है, बाद में नैनोकणों के स्थानीय और विशिष्ट विघटन को सक्षम किया जा सकताहै। इसके अलावा, शामिल डाई दवा वितरण प्रणाली की निगरानी के लिए एक इमेजिंग एजेंट के रूप में कार्य कर सकती है, इसकी प्रतिदीप्ति का उपयोग नैनोकणों के संचय और विघटन को ट्रैक करने के लिए किया जाता है। इसके अलावा, सल्फोनेट समूहों के साथ इंडोसाइनिन रंगों को कुछ कैंसर19 में कैवोले को लक्षित करने में सक्षम होने की सूचना मिली है, जो दवा वितरण प्रणालियों के कुशल सेलुलर उत्थान को सक्षम बनाताहै। इस प्रकार, समान संरचनाओं वाले इंडोसाइनिन रंगों में ऐसी दवा वितरण प्रणालियों में शामिल होने की बहुत संभावना है।

नैनो दवावितरण प्रणालियों के फोटोएक्टिवेशन पर संचालन को मानकीकृत करने पर अब तक केवल कुछ प्रकाशन हुए हैं। इस प्रकार, यहां वर्णित प्रोटोकॉल फोटोरेस्पोंसिव दवा वितरण प्रणालियों को विकसित करने के लिए एक उपयोगी संदर्भ के रूप में काम कर सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

पीसीटी आवेदन नंबर .PCT/सीएन2021/081262 के साथ दायर किया गया है।

Acknowledgments

हम हांगकांग विश्वविद्यालय से सहायता स्वीकार करते हैं ली का शिंग फैकल्टी ऑफ मेडिसिन फैकल्टी कोर फैसिलिटी। हम मानव एचसीटी 116 सेल लाइन प्रदान करने के लिए हांगकांग विश्वविद्यालय में प्रोफेसर ची-मिंग चे को धन्यवाद देते हैं। इस काम को मिंग वाई लाउ सेंटर फॉर रिपैरेटिव मेडिसिन एसोसिएट मेंबर प्रोग्राम और रिसर्च ग्रांट्स काउंसिल ऑफ हांगकांग (अर्ली करियर स्कीम, नंबर 27115220) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1260 Infinity II HPLC Agilent Technologies
2,4-Dimethyl pyrrole J&K Scientific 315305
3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT) Gibco M6494
4-Dimethylaminopyridine (4-DMAP) J&K Scientific 212279
90 mm Petri Dish Clear Treated Sterile SPL 11090
96-well Tissue Culture Plate Clear Treated Sterile SPL 30096
Acetoxyacetyl chloride J&K Scientific 192001
Boron trifluoride diethyl etherate J&K Scientific 921076
Büchner funnel AS ONE 3-6466-01
Chlorambucil J&K Scientific 321407-1G
CM100 Transmission Electron Microscope Philips
CombiFlash RF chromatography system  Teledyne ISCO
Dichloromethane DUKSAN Pure Chemicals JT9315-88
Dimethyl sulfoxide DUKSAN Pure Chemicals 2762
Disposable cuvette Malvern Panalytical DTS1070 Zeta potential measurement
Disposable cuvette Malvern Panalytical ZEN0040
Empty Disposable Sample Load Cartridges Teledyne ISCO 693873225 can hold up to 65 g
Fetal bovine serum Gibco 10270106
Filtering flask AS ONE 3-7089-03
Hexane DUKSAN Pure Chemicals 4198
Holey carbon film on copper grid Beijing Zhongjingkeyi Technology Co.,Ltd BZ10023a
HPLC column (InfinityLab Poroshell 120) Agilent Technologies 695975-902T
Integrating sphere photodiode power sensor Thorlabs S142C
IR783 Tokyo Chemical Industry (TCI) Co., Ltd I1031
LED  Mightex LCS-0530-15-11
LED Driver Control Panel V3.2.0 (Software) Mightex
Lithium Hydroxide Anhydrous TCI L0225
Methylmagnesium iodide, 3M solution in diethyl ether Aladdin M140783
N,N-Diisopropyl ethyl amine (DIPEA) J&K Scientific 203402
N,N'-Dicyclohexylcarbodiimide (DCC) J&K Scientific 275928
penicillin–streptomycin Gibco 15140122
Phosphate-buffered saline (10×)  Sigma-Aldrich P5493
 Power and energy meter  Thorlabs PM100 USB
Rotavapor BUCHI Rotavapor R300
RMPI 1640 Gibco 21870076
Separatory funnel (125 mL) Synthware F474125L
Silver Silica Gel Disposable Flash Columns, 40 g Teledyne ISCO 692203340
Sodium sulfate, anhydrous Alfa Aesar A19890
SpectraMax M4 Molecular Devices LLC
Tetrahydrofuran (THF), anhydrous J&K Scientific 943616
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Gibco 25200056
Vortex DLAB Scientific Co., Ltd MX-S
Zetasizer Nano ZS90  Malvern Instrument

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chabner, B. A., Roberts, T. G. Chemotherapy and the war on cancer. Nature Reviews Cancer. 5 (1), 65-72 (2005).
  2. Monsuez, J. -J., Charniot, J. -C., Vignat, N., Artigou, J. -Y. Cardiac side-effects of cancer chemotherapy. International Journal of Cardiology. 144 (1), 3-15 (2010).
  3. Floyd, J., Mirza, I., Sachs, B., Perry, M. C. Hepatotoxicity of chemotherapy. Seminars in Oncology. 33 (1), 50-67 (2006).
  4. Bar-Joseph, H., Stemmer, S. M., Tsarfaty, I., Shalgi, R., Ben-Aharon, I. Chemotherapy-induced vascular toxicity-real-time in vivo imaging of vessel impairment. Journal of Visualized Experiments. (95), e51650 (2015).
  5. Denny, W. A. Prodrug strategies in cancer therapy. European Journal of Medicinal Chemistry. 36 (7-8), 577-595 (2001).
  6. Kastrati, I., Delgado-Rivera, L., Georgieva, G., Thatcher, G. R. J., Frasor, J. Synthesis and characterization of an aspirin-fumarate prodrug that inhibits NFκB activity and breast cancer stem cells. Journal of Visualized Experiments. (119), e54798 (2017).
  7. Mao, J., et al. A simple dual-pH responsive prodrug-based polymeric micelles for drug delivery. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (27), 17109-17117 (2016).
  8. Li, S. -Y., et al. A pH-responsive prodrug for real-time drug release monitoring and targeted cancer therapy. Chemical Communications. 50 (80), 11852-11855 (2014).
  9. Andresen, T. L., Thompson, D. H., Kaasgaard, T. Enzyme-triggered nanomedicine: Drug release strategies in cancer therapy (Invited Review). Molecular Membrane Biology. 27 (7), 353-363 (2010).
  10. Xu, G., McLeod, H. L. Strategies for enzyme/prodrug cancer therapy. Clinical Cancer Research. 7 (11), 3314-3324 (2001).
  11. Luo, W., et al. Dual-targeted and pH-sensitive doxorubicin prodrug-microbubble complex with ultrasound for tumor treatment. Theranostics. 7 (2), 452 (2017).
  12. Gao, J., et al. Ultrasound triggered phase-change nanodroplets for doxorubicin prodrug delivery and ultrasound diagnosis: An in vitro study. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 174, 416-425 (2019).
  13. Brade, A. M., Szmitko, P., Ngo, D., Liu, F. -F., Klamut, H. J. Heat-directed suicide gene therapy for breast cancer. Cancer Gene Therapy. 10 (4), 294-301 (2003).
  14. Long, K., et al. One-photon red light-triggered disassembly of small-molecule nanoparticles for drug delivery. Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 357 (2021).
  15. Liu, Y., Long, K., Kang, W., Wang, T., Wang, W. Optochemical control of immune checkpoint blockade via light-triggered PD-L1 dimerization. Advanced NanoBiomed Research. 2 (6), 2200017 (2022).
  16. Wang, T., et al. Optochemical control of mTOR signaling and mTOR-dependent autophagy. ACS Pharmacology & Translational Science. 5 (3), 149-155 (2022).
  17. Abet, V., Filace, F., Recio, J., Alvarez-Builla, J., Burgos, C. Prodrug approach: An overview of recent cases. European Journal of Medicinal Chemistry. 127, 810-827 (2017).
  18. Li, G., et al. Small-molecule prodrug nanoassemblies: an emerging nanoplatform for anticancer drug delivery. Small. 17 (52), 2101460 (2021).
  19. Shamay, Y., et al. Quantitative self-assembly prediction yields targeted nanomedicines. Nature Materials. 17 (4), 361-368 (2018).
  20. Sinoway, P. A., Callen, J. P. Chlorambucil. Arthritis & Rheumatism. 36 (3), 319-324 (1993).
  21. Owen, W. R., Stewart, P. J. Kinetics and mechanism of chlorambucil hydrolysis. Journal of Pharmaceutical Sciences. 68 (8), 992-996 (1979).
  22. Lv, W., et al. Upconversion-like photolysis of BODIPY-based prodrugs via a one-photon process. Journal of the American Chemical Society. 141 (44), 17482-17486 (2019).
  23. Silver, J. Let us teach proper thin layer chromatography technique. Journal of Chemical Education. 97 (12), 4217-4219 (2020).
  24. Saad, W. S., Prud'homme, R. K. Principles of nanoparticle formation by flash nanoprecipitation. Nano Today. 11 (2), 212-227 (2016).
  25. Long, K., et al. Photoresponsive prodrug-dye nanoassembly for in-situ monitorable cancer therapy. Bioengineering & Translational Medicine. 7 (3), 10311 (2022).
  26. Zhong, T., et al. A self-assembling nanomedicine of conjugated linoleic acid-paclitaxel conjugate (CLA-PTX) with higher drug loading and carrier-free characteristic. Scientific Reports. 6 (1), 36614 (2016).
  27. Long, K., et al. Green light-triggered intraocular drug release for intravenous chemotherapy of retinoblastoma. Advanced Science. 8 (20), 2101754 (2021).
  28. Lv, W., Wang, W. One-photon upconversion-like photolysis: a new strategy to achieve long-wavelength light-excitable photolysis. Synlett. 31 (12), 1129-1134 (2020).
  29. Rwei, A. Y., Wang, W., Kohane, D. S. Photoresponsive nanoparticles for drug delivery. Nano Today. 10 (4), 451-467 (2015).
  30. Grzelczak, M., Vermant, J., Furst, E. M., Liz-Marzán, L. M. Directed self-assembly of nanoparticles. ACS Nano. 4 (7), 3591-3605 (2010).
  31. Gnanasammandhan, M. K., Idris, N. M., Bansal, A., Huang, K., Zhang, Y. Near-IR photoactivation using mesoporous silica-coated NaYF4:Yb,Er/Tm upconversion nanoparticles. Nature Protocols. 11 (4), 688-713 (2016).

Tags

चिकित्सा अंक 192
प्रोड्रग-डाई नैनोअसेंबलीज की आसान तैयारी और फोटोएक्टिवेशन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, Y., Long, K., Wang, W. Facile … More

Zhang, Y., Long, K., Wang, W. Facile Preparation and Photoactivation of Prodrug-Dye Nanoassemblies. J. Vis. Exp. (192), e64677, doi:10.3791/64677 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter