Summary
이 프로토콜은 광반응성 전구약물-염료 나노어셈블리의 제조 및 특성화를 설명합니다. 광 조사 설정을 포함하여 광 트리거 분해에 의한 나노 입자로부터의 약물 방출 방법론이 명시 적으로 설명된다. 광 조사 후 나노 입자로부터 방출 된 약물은 인간 대장 종양 세포에 우수한 항 증식 효과를 나타냈다.
Abstract
자가 조립은 나노 규모의 약물 전달 시스템을 구축하기 위한 간단하면서도 신뢰할 수 있는 방법입니다. 광활성성 전구약물은 광 조사에 의해 조절된 표적 부위에서 나노운반체로부터 제어 가능한 약물 방출을 가능하게 합니다. 이 프로토콜에서, 분자 자기 조립을 통해 광 활성화 가능한 전구 약물-염료 나노 입자를 제조하는 용이한 방법이 제시된다. 전구약물 합성, 나노 입자 제조, 나노 어셈블리의 물리적 특성화, 광 절단 시연 및 시험관 내 세포 독성 검증에 대한 절차가 자세히 설명되어 있습니다. 광절단 가능한 붕소-디피로메텐-클로람부실(BC) 전구약물을 먼저 합성했습니다. BC와 근적외선 염료 인 IR-783은 최적화 된 비율로 나노 입자 (IR783 / BC NP)로 자체 조립 될 수 있습니다. 합성된 나노입자는 평균 크기가 87.22nm이고 표면 전하가 -29.8mV였습니다. 나노 입자는 광 조사시 분해되어 투과 전자 현미경으로 관찰 할 수 있습니다. BC의 광절단은 10분 이내에 완료되었으며 클로람부실의 경우 22%의 회수 효율이 있었습니다. 나노입자는 조사되지 않은 나노입자 및 조사된 유리 BC 전구약물과 비교하여 530 nm에서 광 조사 하에서 향상된 세포독성을 나타내었다. 이 프로토콜은 광반응성 약물 전달 시스템의 구축 및 평가를 위한 참조를 제공합니다.
Introduction
화학요법은 세포독성제를 사용하여 암세포를 죽이고 종양 성장을 억제하는 일반적인 암 치료법이다1. 그러나, 환자는 화학요법 약물 2,3,4의 표적 이탈 흡수로 인한 심장 독성 및 간독성과 같은 부작용을 겪을 수 있다. 따라서 종양에서 약물 방출/활성화의 시공간적 제어를 통한 국소 약물 전달은 정상 조직에서 약물 노출을 최소화하는 데 필수적입니다.
전구약물은 정상 조직에서는 독성이 감소하는 동시에 활성화 시 병든 병변에서는 작용을 유지하는 화학적으로 변형된 약물이다 5,6. 전구약물은 pH7,8, 효소 9,10, 초음파 11,12, 열 13 및 빛14,15,1 6과 같은 다양한 자극에 반응할 수 있으며 병변에서 특이적으로 모 약물을 방출합니다. 그럼에도 불구하고, 많은 전구약물은 용해도 저하, 흡수율 부정확, 조기 대사 파괴와 같은 고유한 단점을 나타내어 발달을 제한할 수 있다17. 이러한 맥락에서, 전구 약물 나노 어셈블리의 형성은 부작용 감소, 현장 약물 방출, 더 나은 보유 및 치료 및 이미징의 조합과 같은 이점을 제공하여 이러한 나노 어셈블리에 대한 큰 응용 가능성을 나타냅니다. 독소루비신 전구약물 나노스피어, 커큐민 전구약물 미셀, 캄프토테신 전구약물 나노섬유 등 많은 전구약물 나노어셈블리가 질병 치료를 위해 개발되었다18.
이 프로토콜에서 우리는 높은 프로드러그 함량, 우수한 수분산성, 장기 안정성 및 민감한 반응 능력을 나타내는 프로드러그-염료 나노어셈블리를 제조하기 위한 간단한 방법을 제시합니다. IR783은 나노어셈블리(19)의 안정제 역할을 할 수 있는 수용성 근적외선 염료이다. 나노 어셈블리의 다른 구성 요소는 붕소-디피로메텐-클로람부실(BODIPY-Cb, BC)로, 두 가지 주요 이유로 설계된 전구약물입니다. 클로람부실(chlorambucil, Cb)은 생체 내에서 전신 독성을 나타내므로, 전구약물 형태는 독성을 감소시킬 수 있다20. BC 전구약물은 질병 병변을 겨냥한 530nm 광 조사를 사용하여 광분해되어 Cb의 국소 방출을 가능하게 합니다. 한편, Cb는 수성 환경에서 가수분해되기 쉽고, 이를 전구약물 형태21로 변형시킴으로써 보호될 수 있다. 따라서, BC 전구약물과 IR-783 염료의 공동조립은 안정적이고 효과적인 약물 전달 나노시스템을 형성할 것으로 예상되었다(도 1A). 이 전구약물-염료 나노어셈블리는 전구약물 분자의 분산성과 안정성을 향상시켜 광 제어 가능한 약물 전달에 적용할 수 있는 가능성을 시사합니다. BC 전구약물의 광절단은 나노입자의 분해 및 병변에서 Cb의 광 제어 방출을 가능하게 합니다(보충 그림 1).
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Protocol
1. 붕소-디피로메텐-클로람부실(BC) 전구약물의 합성(그림 2)22
- BODIPY-OAc의 합성
- 2,4-디메틸 피롤 1.903g을 칭량하여 질소 분위기 하의 둥근 바닥 플라스크에 무수 디클로로메탄(DCM) 20mL에 용해시킨다. 아세톡시 아세틸 클로라이드 1.638g의 무게를 달아 용액에 적가한다. 실온에서 10분 동안 계속 교반한 다음 용액을 40°C에서 1시간 동안 환류합니다.
- 혼합물을 실온으로 식힌다. N,N-디이소프로필에틸아민(DIPEA) 5.170g의 무게를 달아 교반하면서 혼합물에 적가합니다. 30분 후, 삼불화붕소 디에틸 에테레이트(BF3· O2), 용액에 한 방울 떨어뜨리고 추가로 30분 동안 계속 저어줍니다.
- 상기 혼합물에 10 g의 실리카겔 (200-400 메쉬)을 첨가하고, 45°C에서 회전 증발에 의해 용매를 제거한다. 실리카겔이 건조 분말로 돌아오면 증발을 중지합니다.
- 카트리지 바닥에 프릿을 추가합니다( 재료 표 참조). 실리카겔(1.1.3단계부터)을 카트리지에 채운 다음 채워진 젤 상단의 카트리지에 다른 프릿을 추가합니다.
- 플래시 크로마토그래피 시스템( 재료 표 참조)과 연결된 칼라에 카트리지를 고정하고 돌려서 잠급니다. 플래시 크로마토그래피 시스템의 6방향 밸브 위에 카트리지를 설치하고 밸브 아래에 플래시 컬럼( 재료 표 참조)을 설치합니다.
- 크로마토그래피 기기를 시작하고 검출 파장으로 515nm 및 365nm를 설정합니다. 4/3 (v/v) 헥산/DCM으로 용리를 수행합니다. 515nm 신호가 나타나면 용리액 분획을 수집합니다.
- 용매 수집 플라스크에서 더 이상 용매가 수집되지 않을 때까지 40°C에서 회전 증발에 의해 수집된 분획으로부터 용매를 제거한다. 고체 생성물을 진공 건조 챔버에 밤새 넣어 나머지 용매를 제거합니다.
- BODIPY-OH의 합성
- BODIPY-OAc (1.1 단계에서 합성) 1.120g의 무게를 측정하고 실온에서 70mL의 테트라 히드로 푸란 (THF)에 용해시키고 호일로 완전히 덮습니다. 0.1M LiOH 수용액 70mL를 BODIPY-OAc 용액에 적가합니다.
- 혼합물을 30분 동안 교반하고, 용매 수집 플라스크에 더 이상 용매가 수집되지 않을 때까지 회전 증발에 의해 40°C에서 용매를 제거한다. 잔류물을 진공 건조실에 밤새 넣어 물을 제거합니다.
- 건조 잔류물을 DCM 30mL에 용해시키고 실리카겔 10g을 용액에 첨가한다. 40°C에서 회전 증발에 의해 용매를 제거한다. 실리카겔이 건조 분말로 돌아오면 증발을 중지합니다.
- 1.1.4 내지 1.1.6 단계에 따라 컬럼 크로마토그래피로 생성물 BODIPY-OH를 정제하고, DCM 단독을 용리액으로 사용합니다.
- 상이한 용출 시점에서 수집된 분획을 박층 크로마토그래피(TLC) 상에서 BODIPY-OAc의 THF 용액과 비교하고 생성물23을 확인한다.
- 용출된 분획 3-4μL와 BODIPY-OAc 용액을 동일한 높이의 TLC 플레이트의 한쪽 가장자리에 별도로 스팟합니다. TLC 플레이트를 1mL의 DCM이 들어 있는 유리 챔버에 넣고 점박이 가장자리를 DCM 용매에 담그되 두 개의 반점은 용매에서 빼냅니다.
- DCM 용매가 플레이트 높이의 절반 이상에 도달하면 TLC 플레이트를 꺼냅니다. BODIPY-OAc 스폿과 다른 높이에 TLC 스폿이 있는 용리된 분획을 선택합니다.
- 40°C에서 회전 증발에 의해 용매를 제거하여(단계 1.1.7) 생성물 BODIPY-OH를 얻었다.
- BODIPY-(Me)2-OH의 합성
- BODIPY-OH 313mg을 달아 질소 분위기 하의 암실에서 무수 디에틸 에테르 35mL에 녹인다. 3.75mL의 요오드화 메틸 마그네슘(디에틸 에테르 중 3M)을 용액에 적가하고 실온에서 3시간 동안 계속 교반합니다.
- 물 3.5mL를 한 방울 떨어뜨려 반응을 종료합니다.
- DCM과 물로 혼합물을 추출합니다.
- 혼합물을 125mL 분액 깔때기로 옮깁니다. 혼합물에 20mL의 DCM을 첨가한다.
- 분리 깔때기의 캡을 닫습니다. 깔때기를 약 45° 기울이고 깔때기를 약간 흔듭니다. 캡을 열어 공기를 빼십시오. 이 단계를 3회 반복하고 3분 동안 그대로 두십시오.
- 하단 밸브를 열고 비커에 하부 유기상을 수집합니다.
- 30 mL의 DCM을 수성상에 첨가한다. 추출(단계 1.3.3.2 및 1.3.3.3)을 매번 30mL의 DCM으로 3회 반복합니다.
- 수집 된 유기상에 10g의 고체 Na2SO4 를 첨가하여 유기 상을 밤새 건조시켰다.
- 여과 플라스크를 고무 튜브가 있는 진공 펌프에 연결합니다. Büchner 깔때기에 여과지를 놓고 깔때기를 플라스크 상단에 삽입합니다. DCM 1mL로 여과지를 적시고 혼합물을 깔때기로 옮기고 진공 펌프를 켭니다. 플라스크에 유기 용액을 수집합니다.
- 유기 용액에 실리카겔 10g을 첨가한다. 실리카겔이 건조 분말로 돌아올 때까지 40°C에서 회전 증발에 의해 유기 용매를 제거한다. 헥산/DCM = 1/1 (v/v)를 용리액으로 사용하여 컬럼 크로마토그래피(단계 1.1.4 - 1.1.6)로 생성물 BODIPY-(Me)2-OH를 정제합니다.
- 단계 1.2.5 (BODIPY-OH와 상이한 높이의 TLC 스팟)에 기재된 바와 같이 TLC 분석을 사용하여 생성물을 함유하는 용출된 분획을 선택한다. 40°C에서 회전 증발에 의해 용매를 제거하여 단계 1.1.7에 기재된 바와 같은 생성물을 수득한다.
- BODIPY-(Me)2-I 2-OH의 합성
- BODIPY-(Me)2-OH 41mg을 칭량하여 질소 분위기 하의 암실에서 무수 THF 2.5mL에 녹인다. N-iodosuccinimide 74mg의 무게를 달아 무수 THF 1mL에 녹입니다.
- N-요오도숙신이미드 용액을 BODIPY-(Me)2-OH 용액에 적가합니다. 실온에서 3.5 h 동안 교반한 후, 회전 증발기 상의 용매 수집 플라스크에 더 이상 용매가 수집되지 않을 때까지 40°C에서 회전 증발에 의해 용매를 제거한다.
- 잔류물을 DCM 10mL에 용해시키고 단계 1.3.3에 설명된 대로 매번 30mL의 물로 3회 세척합니다. 유기상을Na2SO4로 건조시킨다(단계 1.3.4 및 1.3.5). 40°C에서 회전 증발에 의해 용매를 제거하여(단계 1.1.7) 생성물 BODIPY-(Me)2-I 2-OH를 얻었다.
- BODIPY-Cb의 합성
- 85mg의 클로람부실을 칭량하여 질소 분위기 하의 어두운 곳에서 무수 DCM 2mL에 용해시킵니다. 69mg의 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드를 칭량하여 무수 DCM 1mL에 녹입니다. 10분 동안 교반하면서 chlorambucil 용액에 적가합니다.
- 4-디메틸아미노피리딘 1.7mg을 무수 DCM 0.5mL에 녹인다. 이 용액을 혼합물에 넣고 실온에서 10 분 동안 계속 저어줍니다. 그런 다음 무수 DCM 2mL에 용해된 BODIPY-(Me)2-I 2-OH 73mg을 넣고 2시간 동안 계속 교반합니다.
- 상기 혼합물에 실리카겔 10 g을 첨가하고, 40°C에서 회전 증발에 의해 용매를 제거한다. 실리카겔이 건조 분말로 돌아오면 증발을 중지합니다. 헥산/DCM = 7/3(v/v)를 용리액으로 사용하여 컬럼 크로마토그래피(단계 1.1.4 - 1.1.6, 540nm 및 365nm 신호 파장)로 제품 BODIPY-Cb를 정제합니다.
- TLC 분석을 사용하여 BODIPY-(Me)2-I 2-OH와 다른 생성물을 포함하는 용출된 분획을 선택합니다(단계 1.2.5). 40°C에서 회전 증발에 의해 용매를 제거하고(단계 1.1.7) 생성물 BODIPY-Cb를 얻었다.
2. 플래시 침전법에 의한 IR783/BC NP의 제조
- BC 프로드러그(BODIPY-Cb) 10mg을 칭량하고 1.5mL 마이크로튜브에 있는 DMSO 1mL에 용해시켜 10mg/mL 원액을 얻습니다. BC 용액을 호일로 덮으십시오.
- 300 μL의 0.4 mg/mL IR-783을 1.5 mL 마이크로튜브에 여과된 탈이온수로 준비합니다. 이 마이크로튜브를 1,500rpm의 소용돌이 믹서에 놓습니다.
- 20 μL 피펫을 사용하여 일정한 속도로 10초에 걸쳐 IR-783 용액에 DMSO의 BC 용액 20 μL를 추가합니다. 피펫 팁의 끝은 마이크로튜브의 내벽에 닿아야 합니다(그림 1B).
- IR30/BC NP 용액을 얻기 위해 추가로 783초 동안 소용돌이 믹서에 마이크로튜브를 유지합니다. 그런 다음 호일로 완전히 덮인 랙에 나노 입자 용액을 놓습니다.
- 생성된 IR783/BC NP 용액을 2,000 x g 및 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 응집체를 제거하였다. 펠릿을 방해하지 않도록 튜브에 ~20μL를 남기고 상층액을 수집합니다. 펠릿을 버리십시오.
- 상층액을 30,000 x g 및 4°C에서 30분 동안 2회 원심분리하고, 양쪽 원심분리로부터 나노입자 침전물을 수집하였다. 나노입자를 300μL의 1x PBS에 재현탁합니다.
참고: DMSO 내의 소수성 BC 전구약물이 와동과 함께 물에 분산될 때, DMSO는 물에 의해 용해되고, 전구약물 분자는 국소 과포화 상황 하에서 안정하게 유지하기 위해 나노스케일 어셈블리를 형성하는 경향이 있다24. - 표 1에 나타낸 용출법을 이용하여 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 IR-783 및 BC의 함량을 정량화한다.
참고: HPLC 샘플은 동일한 부피의 나노입자 용액과 아세토니트릴을 혼합하여 준비합니다. 주입 부피는 20μL입니다. chlorambucil 및 BC 전구약물의 검출 파장은 260nm이고 IR783의 검출 파장은 783nm입니다. HPLC 컬럼은 입자 크기가 2.7μm이고 공극 크기가 120Å인 분석용 4.6mm(내경) x 100mm(길이) C18 컬럼입니다. - 다음 방정식에 따라 전구약물 캡슐화 효율(EE%)과 로딩 용량(LC%)을 계산합니다.
| 시간(분) | 아세토니트릴(%) | 수분 (%) |
| 0 | 20 | 80 |
| 5 | 20 | 80 |
| 30 | 95 | 5 |
| 35 | 95 | 5 |
표 1: BC 전구약물 및 이의 광절단의 정성 및 정량 분석을 위한 HPLC 방법. 허락을 받아 복제25. 저작권 2022, 와일리.
3. IR783/BC NP의 특성화
- 동적 광 산란(DLS) 기기로 IR783/BC NP의 평균 크기를 측정합니다( 재료 표 참조). 큐벳에 IR783/BC NP 용액 200μL를 추가하고 측정을 위해 큐벳을 홀더에 삽입합니다. 측정 유형을 '크기'로, 측정 온도를 25°C로 설정합니다. 각 측정에 대해 20초의 지속 시간으로 세 번의 측정을 수행합니다.
- 제타 전위 테스트 큐벳을 사용하여 DLS 기기로 IR783/BC NP의 표면 전하를 측정합니다.
- IR783/BC NP 용액 25μL를 1.5mL 마이크로튜브에 725μL의 탈이온수로 희석하고 용액을 제타 전위 테스트 큐벳에 추가합니다. 큐벳을 샘플 홈에 놓습니다. 샘플 홈을 덮습니다.
- 측정 유형을 '제타 전위'로 설정하고 측정 온도를 25°C로 설정합니다. 10회 측정합니다.
- 투과 전자 현미경(TEM) 이미징을 위해 샘플을 준비합니다. 구리 그리드(300메쉬)의 구멍이 뚫린 탄소 필름 조각에 IR783/BC NP 용액 10μL를 추가하고 7μL를 제거합니다.
참고: NP 용액 10μL를 추가한 후 7μL를 제거하면 액적이 필름의 더 넓은 영역을 덮을 수 있습니다.
4. IR783/BC NP의 광활성화
- 조명이 작업 현장을 직접 향하도록 철제 스탠드가 있는 LED 램프(530nm, 재료 표 참조)를 설정합니다. 적분구 포토다이오드 광도계( 재료 표 참조)를 LED 램프 바로 아래에 놓습니다.
알림: 환경 조명의 영향을 방지하기 위해 모든 광 조사 실험은 암실에서 수행됩니다. - LED 램프를 켜고 광도계의 캡을 엽니다. 방사 조도를 기록하고 램프 관련 소프트웨어를 사용하여 매개변수를 설정합니다( 재료 표 참조). 입력 전류(mA)를 조정하여 방사 조도를 50mW/cm2로 설정합니다.
알림: 조도는 LED 램프 사이의 거리에도 영향을 받습니다. 여기에 사용된 설정(그림 3A,B)에서 거리는 5cm로 고정되어 있습니다. - IR783/BC NP 용액을 탈이온수로 BC 농도를 기준으로 50μM로 희석합니다. IR783/BC NP 용액 200μL를 1.5mL 마이크로튜브에 추가합니다. 4.1단계에서 마이크로튜브의 홈 피팅 크기와 광도계와 동일한 높이의 폼 블록에 튜브를 놓습니다(그림 3C,D).
- 튜브의 캡을 엽니다. LED 램프를 켜고 나노 입자 용액을 1, 2, 3, 5, 7, 10분 동안 조사합니다.
- 광 조사 후 HPLC로 BC 소비량 및 Cb 방출을 정량화합니다. 다음 방정식을 사용하여 나머지 BC 및 Cb 방출의 백분율을 계산합니다.
5. 빛 조사 유무에 관계없이 IR783/BC NP의 세포 독성 테스트
- HCT116 세포 (인간 결장직장 종양 세포주)를 37°C에서 5% CO2 분위기 하에 10% 소 태아 혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 (완전 배지)을 함유하는 RPMI 1640 배지 (90 mm 세포 배양 디쉬 내의 디쉬당~2 x 10 6 세포)에서 배양하였다. 2-3일마다 정기적으로 세포를 계대 배양합니다.
참고: HCT116은 인간 결장 세포주입니다. HeLa, MCF7 및 A549 세포와 같은 다른 암세포와 비교하여 HCT-116 세포는 IR783에 의해 표적화되고 IR783/BC NP의 세포 흡수를 향상시킬 수 있는 더 높은 수준의 카베올린-1 25를 발현합니다. - HCT116 세포를 96-웰 플레이트에 RPMI 1640 완전 배지로 웰 당 104 세포의 밀도로 플레이트합니다.
- 세포 밀도가 50%를 초과할 때 배양 접시에서 배지를 흡인합니다. 세포를 1x PBS로 세척하고 PBS를 제거한다. 0.25% 트립신 용액 1mL를 첨가하고 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 인큐베이션한다.
- 3분 후, 트립신 소화를 촉진하기 위해 2 mL의 완전 배지를 추가합니다. 세포를 재현탁하고, 세포 현탁액을 15mL 원심분리 튜브로 옮기고, 300 x g 에서 3분 동안 원심분리한다. 상층액을 버리고 세포 펠릿을 1mL의 완전 배지에 재현탁합니다.
- 세포 현탁액 10μL를 완전 배지로 200μL로 희석합니다. 혈구계에 10μL를 놓고 커버슬립으로 덮습니다.
- 현미경으로 혈구계를 관찰합니다(접안렌즈: 10x, 대물렌즈: 4x). 네 모서리 사각형과 중앙에 셀 번호를 세고 기록합니다. 다음 공식을 사용하여 세포 농도를 계산합니다.
여기서 n = 5 개의 제곱에 대한 셀 번호의 평균입니다. - 세포 현탁액을 1 x 105 cells/mL로 희석합니다. 96-웰 플레이트에 웰당 100μL의 세포 현탁액을 추가하여 세포를 시딩합니다. 시드되지 않은 웰에 웰당 100μL의 PBS를 추가합니다.
- 세포를 (1) 0.1-150 μM free BC, (2) 0.1-150 μM IR783/BC NP(BC 농도 기준), (3) 0.1-150 μM free BCs(광 조사), 또는 (4) 0.1-150 μM IR783/BC NP(BC 농도 기준)로 광 조사. 세포를 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 6시간 동안 인큐베이션한다.
참고: 무료 BC 및 IR783/BC NP 용액은 각각의 원액에서 완전한 배지로 희석됩니다. - 6시간 배양 후 전구약물/나노입자 함유 배지를 새로운 완전 배지로 교체합니다. 방사선 조사되지 않은 그룹 1과 2를 어둠 속에서 24시간 동안 배양합니다. 그룹 3 및 4의 경우 530nm LED 램프(50mW/cm2)로 5분 동안 세포를 조사하고 24시간 동안 배양합니다.
알림: 셀 플레이트는 4.1단계의 광도계와 동일한 높이를 보장하기 위해 폼 블록에 배치됩니다. - 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT) 분석법으로 세포 생존율을 측정합니다.
- BC 또는 나노 입자 처리 후 각 웰에 10 μL의 MTT (PBS에서 10 mg / mL)를 추가하고 플레이트를 37 ° C에서 3 시간 동안 배양합니다. 그런 다음 배지를 제거하고 각 웰에 100μL의 DMSO를 추가합니다. 마이크로플레이트 리더로 490nm, 570nm, 630nm에서 흡광도를 판독합니다.
- 다음 방정식을 사용하여 세포 생존율을 계산합니다.
참고: 분석을 위해 각 그룹의 4개의 독립적인 실험(n = 4)이 수행됩니다. OD490은 세포 생존율의 계산에서OD570-OD630으로 대체될 수 있다.
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Representative Results
IR783/BC NP는 플래시 침전 방법을 사용하여 이 연구에서 성공적으로 제조되었습니다. 합성된 IR783/BC NP는 보라색 용액으로 표시되는 반면 IR783의 수용액은 파란색이었습니다(그림 4A). 그림 4B에서 볼 수 있듯이 IR783/BC NP는 다분산 지수(PDI)가 0.089인 약 87.22nm의 평균 크기를 나타내어 좁은 크기 분포를 보여줍니다. IR783/NP의 표면 전하는 약 -29.8mV(그림 4C)였으며, 이는 IR783의 음전하를 띤 설포네이트 그룹에 기인할 수 있습니다. 그림 4D 는 IR783/BC NP의 안정성을 보여줍니다. 나노 입자의 크기는 제조 후 최소 48 시간 동안 약 85 nm (37 °C의 PBS)로 유지되었지만 PDI도 0.2 미만으로 유지되었습니다. 제조 후 0시간, 24시간 및 48시간에서 IR783/BC NP의 크기 분포에서 유의미한 변화가 관찰되지 않았습니다(그림 4E).
그림 5A, B 는 각각 광 조사 전후의 IR783/BC NP의 형태를 표시합니다. 응집체와 단편 모두 광 조사 후에 관찰 될 수 있으며, 이는 각각 나노 입자의 해리 및 응집을 나타냅니다. 도 5C 는 광 조사 3분 및 5분 후의 나노입자 크기 및 이의 분포의 변화를 나타낸다. 조사된 나노입자에 대해 증가된 크기 및 더 넓은 분포가 관찰되었다. IR783/BC NP의 광방출 프로파일도 HPLC로 측정했습니다. 그림 5D, E에서 볼 수 있듯이, 전구약물 BC는 10 분 안에 광분해되었습니다. 한편, Cb는 같은 기간 동안 약 22%의 회수 효율로 출시되었습니다.
IR783/BC NP는 비방사선 조사 그룹과 비교하여 530nm에서 광 조사 하에서 인간 결장직장 종양 세포(HCT116)에서 상당한 세포독성을 나타냈습니다(그림 6). 광 조사(6.62 μM)를 사용한 IR783/BC NP의IC50 은 광 조사를 받은 유리 BC(9.24 μM)보다 낮았으며, 이는 광 조사를 받은 IR783/BC NP의 시험관 내 항종양 효능이 광 조사를 받은 유리 BC보다 더 높았다25. 제시된 세포독성은 방출된 Cb 및 생성된 활성 산소종(ROS) 모두에서 발생했습니다(보충 그림 1 및 보충 그림 2). 빛 조사 하에서 IR783/BC NP의 더 높은 세포독성은 주로 IR783/BC NPs25의 효율적인 세포 흡수에 기인한다.
그림 1: IR783/BC NP의 형성. (A) IR783/BC NP의 자가 조립 및 광 유발 해리. (B) 플래시 침전에 의한 IR783/BC NP의 제조 계획. 허락을 받아 복제25. 저작권 2022, 와일리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 전구약물 BODIPY-Cb(BC)의 합성 경로. BODIPY 유도체는 먼저 아세톡시아세틸 클로라이드 및 2,4-디메틸피롤로부터 합성한 다음, Cb. BC 전구약물의 1H-NMR 스펙트럼은 보충 그림 3에 나와 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: LED 조사 설정. (A,B) LED lamp 조도 측정을 위한 설정. (씨, 디) IR783/BC NP의 조사를 위한 LED 램프 설정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: IR783/BC NP의 특성화. (A) 유리 IR783, 유리 BC 및 IR783/BC NP 용액의 모습. (B) IR783/BC NP의 크기 분포. (C) IR783/BC NP의 표면 전하. (D) 제조 후 48시간 동안 37°C에서 PBS에서 IR783/BC NP의 크기 변화. (E) 제조 후 0시간, 24시간 및 48시간에 IR783/BC NP의 크기 분포. 허락을 받아 복제25. 저작권 2022, 와일리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: IR783/BC NP의 광방출. IR783/BC NP의 TEM 이미지(A) 광 조사 전 및 후(B). 스케일 바 = 100 μm. (C) 783분, 0분, 3분 및 5분의 광 조사 후 IR5/NP의 크기 분포. (D) 10분까지 광 조사 지속 시간을 증가시키는 IR783/BC NP의 HPLC 분석. (E) BC 및 IR783 분해 및 Cb 방출의 정량화(n = 3). 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 광 조사: 530nm LED 램프, 50mW/cm2. 허락을 받아 복제25. 저작권 2022, 와일리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: HCT116 세포에 대한 IR783/BC NP의 세포독성. BC 농도 >1 μM (n = 4)에서 유의한 세포 독성이 나타났다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 차이의 통계적 유의성을 결정하기 위해 독립 표본 t-검정을 채택했습니다. *p < 0.05, **p < 0.01. 광 조사: 530nm LED 램프, 50mW/cm2. 허락을 받아 복제25. 저작권 2022, 와일리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: 광화학 메커니즘. (A) BC 전구약물의 광절단. (B) IR783의 분해. 허가를 받아 개조25. 저작권 2022, 와일리. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2: ROS 생성 프로필. SOSG(singlet oxygen sensor green) 프로브로 정량화된 광 조사 하에서 다양한 샘플의 ROS 생성. 광 조사: 530nm LED 램프, 50mW/cm2. 허가를 받아 개조25. 저작권 2022, 와일리. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 3: BODIPY-Cb의 1H-NMR 스펙트럼. 허가를 받아 증쇄22. Copyright 2022, 미국 화학 학회. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 나노 입자 형성을 위한 간단하고 편리한 접근 방식을 제공하는 전구약물-염료 나노입자의 제조를 위한 손쉬운 플래시 침전 방법을 설명합니다. 이 방법에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 합성, 제조 및 특성화의 모든 단계에서 마이크로튜브와 같은 용기는 환경광에 의한 BC 프로드러그의 불필요한 광절단을 방지하기 위해 호일로 덮어야 합니다. 또한, 플래시 침전 단계에서, IR-783 용액을 함유하는 마이크로튜브는 BC 프로드러그 용액을 서서히 첨가하면서 볼텍스 믹서 상에 안정하게 놓아야 한다. 이러한 방식으로, BC 전구약물 용액(DMSO 내)은 IR-783 용액에 균일하게 분산될 수 있다. 정제 단계에서, 차등 원심분리 방법이 사용된다. 2,000 x g에서의 첫 번째 원심분리는 로딩 되지 않은 BC 전구약물 고체를 제거하는 데 사용되는 반면, 30,000 x g에서의 두 번째 원심분리는 나노입자에 혼입되지 않은 상청액에서 DMSO 및 IR783을 제거합니다. 그런 다음 IR783/BC NP를 침전물로 수집하고 여과된 탈이온수에 재현탁할 수 있습니다.
자기 조립은 나노 입자의 제조를위한 간단하고 효율적인 방법입니다. 그러나 자체 조립 방법은 빌딩 블록의 소수성과 같은 요인에 따라 최적화되어야 합니다. 이 프로토콜에서 구성 요소 중 하나인 IR783은 물에 용해된 수용성 염료입니다. 그러나, 어떤 경우에는 모든 성분이 소수성일 수 있다. 이러한 상황에서, 이들은 이 프로토콜의 BC 프로드러그와 같이 DMSO에 용해되어야 한다. 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-폴리(에틸렌 글리콜)(DSPE-PEG)와 같은 안정제를 사용하여 자가 조립 나노입자 14,26,27을 형성하고 안정화할 수 있습니다.
빛은 조직 침투가 제한되어 있어 임상적 사용에서 광활성화 가능한 나노입자의 적용을 제한합니다. 한 가지 해결책은 적색 또는 근적외선(28)과 같은 장파장 광 활성화 시스템을 개발하는 것이다. 광섬유를 사용하여 빛을 전달하는 것은 일부 질병 병변에 대한 빛의 제한된 조직 침투 문제를 해결하는 또 다른 방법이다29. 더욱이, 성분의 공동조립은 주로 소수성 상호작용, π-π 적층 및 수소 결합과 같은 분자간 힘에 의존하며, 이는 이 방법이 모든 프로드러그 및 염료 분자(30)에 적용되지 않을 수 있음을 시사한다. 약물, 전구약물, 염료, 감광제 및 광열제와 같은 기능성 분자를 공동 조립할 가능성은 이론적 계산과 실험적 특성화를 통해 평가해야 합니다.
광활성성 프로드럭-염료 나노스케일 약물 전달 시스템은 몇 가지 장점을 갖는다. 첫째, IR783과 같은 염료는 광 조사 하에서 분해될 수 있고, 이어서 나노입자(25)의 국부적 및 특이적 분해를 가능하게 한다. 또한, 혼입된 염료는 나노입자의 축적 및 분해를 추적하는 데 사용되는 형광과 함께 약물 전달 시스템을 모니터링하기 위한 이미징 에이전트로 기능할 수 있습니다. 또한, 설포네이트 그룹을 갖는 인도시아닌 염료는 일부 암에서 카베올라를 표적으로 삼을 수 있는 것으로 보고되었으며19, 이는 약물 전달 시스템의 효율적인 세포 흡수를 가능하게 한다25. 따라서, 유사한 구조를 갖는 인도시아닌 염료는 이러한 약물 전달 시스템에 혼입될 가능성이 크다.
지금까지 나노 약물 전달 시스템의 광활성화에 대한 작업을 표준화하는 것에 대한 출판물은 소수에 불과하다(31). 따라서, 여기에 기술된 프로토콜은 광반응성 약물 전달 시스템을 개발하기 위한 유용한 참고 자료로서 기능할 수 있다.
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Disclosures
PCT 출원은 No.PCT/CN2021/081262에 제출되었습니다.
Acknowledgments
우리는 홍콩 대학교 Li Ka Shing 의과 대학 교수 핵심 시설의 도움을 인정합니다. 인간 HCT116 세포주를 제공한 홍콩 대학교의 Chi-Ming Che 교수에게 감사드립니다. 이 작업은 Ming Wai Lau Center for Reparative Medicine Associate Member Program과 홍콩 연구 보조금 위원회(Early Career Scheme, No. 27115220)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1260 Infinity II HPLC | Agilent Technologies | ||
| 2,4-Dimethyl pyrrole | J&K Scientific | 315305 | |
| 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT) | Gibco | M6494 | |
| 4-Dimethylaminopyridine (4-DMAP) | J&K Scientific | 212279 | |
| 90 mm Petri Dish Clear Treated Sterile | SPL | 11090 | |
| 96-well Tissue Culture Plate Clear Treated Sterile | SPL | 30096 | |
| Acetoxyacetyl chloride | J&K Scientific | 192001 | |
| Boron trifluoride diethyl etherate | J&K Scientific | 921076 | |
| Büchner funnel | AS ONE | 3-6466-01 | |
| Chlorambucil | J&K Scientific | 321407-1G | |
| CM100 Transmission Electron Microscope | Philips | ||
| CombiFlash RF chromatography system | Teledyne ISCO | ||
| Dichloromethane | DUKSAN Pure Chemicals | JT9315-88 | |
| Dimethyl sulfoxide | DUKSAN Pure Chemicals | 2762 | |
| Disposable cuvette | Malvern Panalytical | DTS1070 | Zeta potential measurement |
| Disposable cuvette | Malvern Panalytical | ZEN0040 | |
| Empty Disposable Sample Load Cartridges | Teledyne ISCO | 693873225 | can hold up to 65 g |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270106 | |
| Filtering flask | AS ONE | 3-7089-03 | |
| Hexane | DUKSAN Pure Chemicals | 4198 | |
| Holey carbon film on copper grid | Beijing Zhongjingkeyi Technology Co.,Ltd | BZ10023a | |
| HPLC column (InfinityLab Poroshell 120) | Agilent Technologies | 695975-902T | |
| Integrating sphere photodiode power sensor | Thorlabs | S142C | |
| IR783 | Tokyo Chemical Industry (TCI) Co., Ltd | I1031 | |
| LED | Mightex | LCS-0530-15-11 | |
| LED Driver Control Panel V3.2.0 (Software) | Mightex | ||
| Lithium Hydroxide Anhydrous | TCI | L0225 | |
| Methylmagnesium iodide, 3M solution in diethyl ether | Aladdin | M140783 | |
| N,N-Diisopropyl ethyl amine (DIPEA) | J&K Scientific | 203402 | |
| N,N'-Dicyclohexylcarbodiimide (DCC) | J&K Scientific | 275928 | |
| penicillin–streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate-buffered saline (10×) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| Power and energy meter | Thorlabs | PM100 USB | |
| Rotavapor | BUCHI Rotavapor R300 | ||
| RMPI 1640 | Gibco | 21870076 | |
| Separatory funnel (125 mL) | Synthware | F474125L | |
| Silver Silica Gel Disposable Flash Columns, 40 g | Teledyne ISCO | 692203340 | |
| Sodium sulfate, anhydrous | Alfa Aesar | A19890 | |
| SpectraMax M4 | Molecular Devices LLC | ||
| Tetrahydrofuran (THF), anhydrous | J&K Scientific | 943616 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | |
| Vortex | DLAB Scientific Co., Ltd | MX-S | |
| Zetasizer Nano ZS90 | Malvern Instrument |
References
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