Summary
В этом протоколе описывается изготовление и характеристика фоточувствительной наносборки пролекарство-краситель. В явной форме описана методология высвобождения лекарственного средства из наночастиц путем разборки, вызванной светом, включая установку светового облучения. Препараты, высвобождаемые из наночастиц после светового облучения, проявляли отличные эффекты против пролиферации колоректальных опухолевых клеток человека.
Abstract
Самосборка — это простой, но надежный метод построения наноразмерных систем доставки лекарств. Фотоактивируемые пролекарства обеспечивают контролируемое высвобождение лекарств из наноносителей в целевых участках, модулированных световым облучением. В этом протоколе представлен простой метод получения фотоактивируемых наночастиц пролекарства и красителя путем молекулярной самосборки. Подробно описаны процедуры синтеза пролекарств, изготовления наночастиц, физической характеристики наносборки, демонстрации фоторасщепления и проверки цитотоксичности in vitro . Впервые был синтезирован фоторасщепляемый бор-дипиррометен-хлорамбуцил (BC) пролекарство. BC и краситель ближнего инфракрасного диапазона IR-783 в оптимизированном соотношении могут самособираться в наночастицы (IR783 / BC NP). Синтезированные наночастицы имели средний размер 87,22 нм и поверхностный заряд -29,8 мВ. Наночастицы разбирались при облучении светом, что можно было наблюдать с помощью просвечивающей электронной микроскопии. Фоторасщепление BC было завершено в течение 10 мин с эффективностью восстановления хлорамбуцила 22%. Наночастицы проявляли повышенную цитотоксичность при световом облучении на длине волны 530 нм по сравнению с необлученными наночастицами и облученным свободным пролекарством BC. Этот протокол является справочным материалом для создания и оценки фоточувствительных систем доставки лекарств.
Introduction
Химиотерапия является распространенным методом лечения рака, в котором используются цитостатические агенты для уничтожения раковых клеток и, таким образом, ингибирование роста опухоли1. Однако пациенты могут страдать от побочных эффектов, таких как кардиотоксичность и гепатотоксичность, из-за нецелевого всасывания химиотерапевтических препаратов 2,3,4. Таким образом, локализованная доставка лекарственного средства посредством пространственно-временного контроля высвобождения/активации лекарственного средства в опухолях имеет важное значение для минимизации воздействия лекарственного средства на нормальные ткани.
Пролекарства представляют собой химически модифицированные препараты, которые проявляют пониженную токсичность в нормальных тканях, сохраняя при этом свое действие при пораженных поражениях при активации 5,6. Пролекарства могут реагировать на различные раздражители, такие как рН7,8, ферменты9,10, ультразвук 11,12, тепло 13 и свет 14,15,1 6, и высвобождать свои исходные лекарства именно в поражениях. Тем не менее, многие пролекарства имеют присущие им недостатки, такие как плохая растворимость, неправильная скорость всасывания и раннее метаболическое разрушение, что может ограничить их развитие17. В этом контексте образование пролекарственных наносборок предлагает такие преимущества, как снижение побочных эффектов, высвобождение лекарств in situ, лучшее удержание и сочетание лечения и визуализации, что указывает на большой потенциал применения этих наносборок. Для лечения заболеваний было разработано множество промедикаментозных наносборок, в том числе наносферы пролекарства доксорубицина, мицеллы пролекарства куркумина и нановолокна пролекарства камптотецина18.
В этом протоколе мы представляем простой метод получения наносборок пролекарства и красителя, которые демонстрируют высокое содержание пролекарства, хорошую диспергируемость в воде, долговременную стабильность и чувствительную способность реагировать. IR783 представляет собой водорастворимый краситель ближнего инфракрасного диапазона, который может служить стабилизатором наносборок19. Другим компонентом наносборки является бор-дипиррометен-хлорамбуцил (BODIPY-Cb, BC), пролекарство, которое было разработано по двум основным причинам. Поскольку хлорамбуцил (Cb) проявляет системную токсичность in vivo, пролекарственная форма может снижать его токсичность20. Пролекарство BC может быть фоторасщеплено с использованием светового излучения 530 нм, направленного на поражения заболевания, что обеспечивает локальное высвобождение Cb. С другой стороны, Cb склонен к гидролизу в водных средах и может быть защищен путем преобразования его в пролекарственную форму21. Таким образом, ожидалось, что совместная сборка пролекарства BC и красителя IR-783 образует стабильную и эффективную наносистему доставки лекарств (рис. 1A). Эта наносборка пролекарства-красителя улучшает диспергируемость и стабильность молекул пролекарства, что указывает на ее потенциал для применения в светоконтролируемой доставке лекарств. Фоторасщепление пролекарства BC обеспечивает разборку наночастиц и контролируемое светом высвобождение Cb в поражениях (дополнительный рисунок 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Синтез бор-дипиррометена-хлорамбуцила (БК) пролекарства (рис. 2)22
- Синтез BODIPY-OAc
- Взвесьте 1,903 г 2,4-диметилпиррола и растворите его в 20 мл безводного дихлорметана (DCM) в колбе с круглым дном в атмосфере азота. Взвесьте 1,638 г ацетоксиацетилхлорида и добавьте его по каплям в раствор. Продолжайте помешивать в течение 10 минут при комнатной температуре, а затем кипите раствор с обратным холодильником в течение 1 ч при 40 °C.
- Остудите смесь до комнатной температуры. Взвесьте 5,170 г N,N-диизопропилэтиламина (DIPEA) и добавьте его по каплям в смесь при перемешивании. Через 30 мин взвесьте 5,677 г диэтилэфирата трифторида бора (BF3· 2), добавьте его по каплям в раствор и продолжайте помешивать еще 30 минут.
- Добавьте в смесь 10 г силикагеля (200-400 меш) и удалите растворитель вращательным выпариванием при 45 °C. Остановите испарение, когда силикагель вернется в сухой порошок.
- Добавьте фритту в нижнюю часть картриджа (см. Таблицу материалов). Залейте силикагель (из шага 1.1.3) в картридж, а затем добавьте еще одну фритту в картридж в верхней части заполненного геля.
- Закрепите картридж в воротнике, соединенном с системой флэш-хроматографии (см. Таблицу материалов) и поверните его, чтобы зафиксировать. Установите картридж поверх шестиходового клапана в системе флэш-хроматографии и установите колонку вспышки (см. Таблицу материалов) под клапаном.
- Запустите хроматографический прибор и установите 515 нм и 365 нм в качестве длин волн детектирования. Выполните элюирование 4/3 (об./об.) гексана/ДКМП. Соберите фракции элюента при появлении сигнала 515 нм.
- Растворитель удаляется из собранных фракций вращательным выпариванием при 40°С до тех пор, пока растворитель не перестанет собираться в колбе для сбора растворителя. Поместите твердый продукт в вакуумную сушильную камеру на ночь, чтобы удалить остатки растворителя.
- Синтез БОДИПИ-ОН
- Взвесьте 1,120 г BODIPY-OAc (синтезированного на стадии 1.1) и растворите его в 70 мл тетрагидрофурана (ТГФ) при комнатной температуре, полностью накрыв фольгой. Добавьте 70 мл 0,1 М водного раствора LiOH по каплям в раствор BODIPY-OAc.
- Перемешивайте смесь в течение 30 мин и удаляйте растворитель при 40 °C вращательным испарением до тех пор, пока растворитель не перестанет собираться в колбе для сбора растворителя. Поместите остатки в вакуумную сушильную камеру на ночь, чтобы удалить воду.
- Сухой остаток растворить в 30 мл DCM и добавить в раствор 10 г силикагеля. Удалите растворитель вращательным выпариванием при 40 °C. Остановите испарение, когда силикагель вернется в сухой порошок.
- Очистите продукт BODIPY-OH с помощью колоночной хроматографии, следуя шагам с 1.1.4 по 1.1.6, используя только DCM в качестве элюента.
- Сравните фракции, собранные в разные моменты времени элюирования, с раствором ТГФ BODIPY-OAc на тонкослойной хроматографии (ТСХ) и идентифицируют продукт23.
- Нанесите 3-4 мкл элюированной фракции и раствора BODIPY-OAc отдельно на один край пластины TLC на той же высоте. Поместите пластину TLC в стеклянную камеру, содержащую 1 мл DCM, погрузив пятнистый край в растворитель DCM, но с двумя пятнами из растворителя.
- Выньте пластину TLC, когда растворитель DCM достигнет более половины высоты пластины. Выберите элюированную фракцию с пятном TLC на высоте, отличной от пятна BODIPY-OAc.
- Растворитель удаляют вращательным выпариванием при 40 °C (этап 1.1.7) для получения продукта BODIPY-OH.
- Синтез BODIPY-(Me)2-OH
- Взвесьте 313 мг BODIPY-OH и растворите его в 35 мл безводного диэтилового эфира в темноте в атмосфере азота. Добавьте 3,75 мл йодида метилмагния (3 М в диэтиловом эфире) по каплям в раствор и продолжайте помешивать в течение 3 ч при комнатной температуре.
- Погасите реакцию, добавив 3,5 мл воды по каплям.
- Извлеките смесь с помощью DCM и воды.
- Перелейте смесь в разделительную воронку объемом 125 мл. Добавьте в смесь 20 мл DCM.
- Закройте крышку разделительной воронки. Наклоните воронку примерно на 45° и слегка встряхните воронку. Откройте крышку, чтобы сдуться. Повторите этот шаг 3 раза и дайте постоять 3 минуты.
- Откройте нижний клапан и соберите нижнюю органическую фазу в стакан.
- Добавьте 30 мл DCM в водную фазу. Повторите экстракцию (этапы 1.3.3.2 и 1.3.3.3) 3 раза с 30 мл DCM каждый раз.
- Добавьте 10 г твердого Na2SO4 в собранную органическую фазу, чтобы высушить органическую фазу в течение ночи.
- Подсоедините фильтрующую колбу к вакуумному насосу с помощью резиновой трубки. Положите лист фильтровальной бумаги на воронку Бюхнера и вставьте воронку в верхнюю часть колбы. Смочите фильтровальную бумагу 1 мл DCM, перелейте смесь в воронку и включите вакуумный насос. Соберите органический раствор в колбу.
- Добавьте в органический раствор 10 г силикагеля. Удалите органический растворитель вращательным испарением при 40 ° C до тех пор, пока силикагель не превратится в сухой порошок. Очистите продукт BODIPY-(Me)2-OH с помощью колоночной хроматографии (этапы с 1.1.4 по 1.1.6) с гексаном/DCM = 1/1 (об./об.) в качестве элюента.
- Выберите элюированные фракции, содержащие продукт, с помощью TLC-анализа, как описано на шаге 1.2.5 (точка TLC на высоте, отличной от BODIPY-OH). Растворитель удаляют вращательным выпариванием при 40 °C для получения продукта, как описано на этапе 1.1.7.
- Синтез БОДИПИ-(Me)2-I2-OH
- Взвесьте 41 мг BODIPY-(Me)2-OH и растворите его в 2,5 мл безводного ТГФ в темноте в атмосфере азота. Взвесьте 74 мг N-йодсукцинимида и растворите его в 1 мл безводного ТГФ.
- Добавьте раствор N-йодсукцинимида по каплям в раствор BODIPY-(Me)2-OH. После перемешивания в течение 3,5 ч при комнатной температуре удаляют растворитель вращательным выпариванием при 40 °C до тех пор, пока растворитель не перестанет собираться в колбе для сбора растворителя на ротационном испарителе.
- Растворите остаток в 10 мл DCM и промойте его 3 раза 3 мл воды каждый раз, как описано в шаге 1.3.3. Высушите органическую фазу с помощью Na2SO 4 (этапы 1.3.4 и 1.3.5). Удаляют растворитель вращательным выпариванием при 40 °C (этап 1.1.7) для получения продукта BODIPY-(Me)2-I 2-OH.
- Синтез BODIPY-Cb
- Взвесьте 85 мг хлорамбуцила и растворите его в 2 мл безводного DCM в темноте в атмосфере азота. Взвесьте 69 мг N,N'-дициклогексилкарбодиимида и растворите его в 1 мл безводного ДКМП. Добавьте его по каплям в раствор хлорамбуцила при помешивании в течение 10 мин.
- Растворите 1,7 мг 4-диметиламинопиридина в 0,5 мл безводного DCM. Добавьте этот раствор в смесь и продолжайте помешивать в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем добавьте 73 мг BODIPY-(Me)2-I 2-OH, растворенного в 2 мл безводного DCM, и продолжайте помешивать в течение2 часов.
- Добавьте в смесь 10 г силикагеля и удалите растворитель вращательным выпариванием при 40 °C. Остановите испарение, когда силикагель вернется в сухой порошок. Очистите продукт BODIPY-Cb с помощью колоночной хроматографии (этапы с 1.1.4 по 1.1.6, длина волны сигнала 540 нм и 365 нм) с гексаном/DCM = 7/3 (об./об.) в качестве элюента.
- Выберите элюированные фракции, содержащие продукт, отличный от BODIPY-(Me)2-I 2-OH, с помощью TLC-анализа (этап 1.2.5). Растворитель удаляют вращательным выпариванием при 40 °C (этап 1.1.7) для получения продукта BODIPY-Cb.
2. Получение НП IR783/BC методом мгновенного осаждения
- Взвесьте 10 мг пролекарства BC (BODIPY-Cb) и растворите его в 1 мл ДМСО в микропробирке объемом 1,5 мл, чтобы получить исходный раствор 10 мг / мл. Накройте раствор БК фольгой.
- Приготовьте 300 мкл 0,4 мг/мл IR-783 в отфильтрованной деионизированной воде в микропробирке объемом 1,5 мл. Поместите эту микротрубку на вихревой смеситель со скоростью 1,500 об/мин.
- Добавьте 20 мкл раствора БК в ДМСО в раствор IR-783 в течение 10 с с постоянной скоростью с помощью пипетки 20 мкл. Конец наконечника пипетки должен касаться внутренней стенки микротрубки (рис. 1Б).
- Держите микротрубку на вихревом смесителе еще 30 с, чтобы получить раствор IR783/BC NP. Затем поместите раствор наночастиц на решетку, полностью покрытую фольгой.
- Центрифугируйте полученный раствор IR783/BC NP в течение 10 мин при 2 000 x g и 4 °C для удаления агрегатов. Соберите надосадочную жидкость, оставив ~ 20 мкл в пробирке, чтобы не нарушить гранулу. Выбросьте гранулы.
- Дважды центрифугируют надосадочную жидкость в течение 30 мин при 30 000 x g и 4 °C и собирают наночастицы в осадок из обоих центрифугирований. Ресуспендировать наночастицы в 300 мкл 1x PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Когда гидрофобное пролекарство BC в ДМСО диспергируется в воде с помощью вихря, ДМСО растворяется водой, и молекулы пролекарства имеют тенденцию образовывать наноразмерные сборки, чтобы оставаться стабильными в ситуации локального пересыщения24. - Количественно определите содержание IR-783 и BC с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием метода элюирования, показанного в таблице 1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образец ВЭЖХ готовят путем смешивания равных объемов раствора наночастиц и ацетонитрила. Объем впрыска составляет 20 мкл. Длина волны обнаружения для хлорамбуцила и пролекарства BC составляет 260 нм, а длина волны обнаружения для IR783 составляет 783 нм. Колонка для ВЭЖХ представляет собой аналитическую колонку C18 размером 4,6 мм (внутренний диаметр) x 100 мм (длина) с размером частиц 2,7 мкм и размером пор 120 Å. - Рассчитайте эффективность инкапсуляции пролекарства (EE%) и грузоподъемность (LC%) в соответствии со следующими уравнениями:
| Время (мин) | Ацетонитрил (%) | Вода (%) |
| 0 | 20 | 80 |
| 5 | 20 | 80 |
| 30 | 95 | 5 |
| 35 | 95 | 5 |
Таблица 1: Метод ВЭЖХ для качественного и количественного анализа пролекарства БК и его фоторасщепления. Воспроизведено с разрешения25. Авторское право 2022, Wiley.
3. Характеристика НП IR783/BC
- Измерьте средний размер NP IR783/BC с помощью прибора динамического рассеяния света (DLS) (см. Таблицу материалов). Добавьте 200 мкл раствора IR783/BC NP в кювету и вставьте кювету в держатель для измерения. Установите тип измерения как «размер» и температуру измерения как 25 °C. Выполните три измерения продолжительностью 20 с для каждого измерения.
- Измерьте поверхностный заряд NP IR783/BC с помощью прибора DLS с помощью кюветы для тестирования дзета-потенциала.
- Разбавьте 25 мкл раствора IR783/BC NP 725 мкл деионизированной воды в микропробирке объемом 1,5 мл и добавьте раствор в кювету для дзета-потенциала. Поместите кювету в канавку для образца. Закройте канавку для образца.
- Установите тип измерения как «дзета-потенциал» и температуру измерения как 25 °C. Выполните 10 измерений.
- Подготовьте образцы для визуализации с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). Добавьте 10 мкл раствора IR783/BC NP на кусок дырявой углеродной пленки на медной сетке (300 меш) и удалите 7 мкл. Оставьте 3 мкл раствора на пленке на ночь для самоиспарения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление 10 мкл раствора NP с последующим удалением 7 мкл позволяет капле покрыть более широкую область пленки.
4. Фотоактивация НП IR783/BC
- Установите светодиодную лампу (530 нм; см. Таблицу материалов) с железной подставкой так, чтобы светильник был направлен прямо на операционный пол. Поместите фотодиодный фотодиод интегрирующей сферы (см. Таблицу материалов) непосредственно под светодиодной лампой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы предотвратить влияние света окружающей среды, все эксперименты по световому облучению проводятся в темной комнате. - Включите светодиодную лампу и откройте крышку фотометра. Запишите освещенность и установите параметры лампы с помощью соответствующего программного обеспечения (см. Таблицу материалов). Отрегулируйте входной ток (мА), чтобы установить освещенность как 50 мВт/см2.
ПРИМЕЧАНИЕ: На освещенность также влияет расстояние между светодиодной лампой и фотометром. В используемой здесь установке (рис. 3A, B) расстояние зафиксировано на уровне 5 см. - Разбавьте раствор IR783/BC NP деионизированной водой до 50 мкМ в зависимости от концентрации BC. Добавьте 200 мкл раствора IR783/BC NP в микропробирку объемом 1,5 мл. Поместите трубку на пеноблок с пазом, соответствующим размеру микротрубки и той же высоте, что и фотометр на шаге 4.1 (рис. 3C, D).
- Откройте крышку тюбика. Включите светодиодную лампу и облучайте раствор наночастиц в течение 1, 2, 3, 5, 7 и 10 минут.
- Количественно определите потребление БК и высвобождение ХБ ВЭЖХ после облучения светом. Рассчитайте процент оставшегося выброса BC и Cb, используя следующие уравнения:
5. Тестирование цитотоксичности НП IR783/BC со световым облучением и без него
- Культивирование клеток HCT116 (клеточная линия колоректальной опухоли человека) в среде RPMI 1640, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки и 1% пенициллина-стрептомицина (полная среда) в атмосфере 5% CO 2 при 37 ° C (~2 x 106 клеток на чашку в чашке для культивирования клеток 90 мм). Регулярно субкультивируйте клетки каждые 2-3 дня.
ПРИМЕЧАНИЕ: HCT116 представляет собой клеточную линию толстой кишки человека. По сравнению с другими раковыми клетками, такими как клетки HeLa, MCF7 и A549, клетки HCT-116 экспрессируют более высокий уровень кавеолина-125, который может быть нацелен на IR783 и усиливает клеточное поглощение IR783 / BC NP. - Поместите ячейки HCT116 в 96-луночные планшеты с полной средой RPMI 1640 с плотностью 10,4 ячейки на лунку.
- Аспирируйте среду из чашки для культивирования, когда слияние клеток превышает 50%. Промойте ячейки 1x PBS и удалите PBS. Добавьте 1 мл 0,25% раствора трипсина и инкубируйте при 37 ° C в 5% инкубаторе CO2 .
- Через 3 минуты добавьте 2 мл полной среды, чтобы утолить переваривание трипсина. Ресуспендируют клетки, переносят клеточную суспензию в центрифугирующую пробирку объемом 15 мл и центрифугируют при 300 x g в течение 3 мин. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в 1 мл полной среды.
- Разбавьте 10 мкл клеточной суспензии до 200 мкл с полной средой. Поместите 10 мкл на гемоцитометр и закройте его покровным стеклом.
- Наблюдайте за гемоцитометром под микроскопом (окуляр: 10x; объектив: 4x). Подсчитайте и запишите номера ячеек в четырех угловых квадратах и в центре. Рассчитайте концентрацию клеток по формуле:
Где n = среднее значение чисел ячеек пяти квадратов. - Разбавьте клеточную суспензию до 1 х10 5 клеток /мл. Добавьте 100 мкл клеточной суспензии на лунку в 96-луночную пластину, чтобы засеять клетки. Добавьте 100 мкл PBS на лунку в незасеянные лунки.
- Обработайте клетки (1) 0,1-150 мкМ свободной БК, (2) 0,1-150 мкМ IR783/BC NP (в зависимости от концентрации BC), (3) 0,1-150 мкМ свободной BC световым облучением или (4) 0,1-150 мкМ IR783/BC NP (в зависимости от концентрации BC) световым облучением. Инкубируют клетки при 37 °C в инкубаторе 5% CO2 в течение 6 часов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Свободные растворы BC и IR783 / BC NP разбавляются из соответствующих исходных растворов с помощью полной среды. - После 6 ч инкубации замените среду, содержащую пролекарство/наночастицы, свежей полной средой. Инкубируют группы необлучения 1 и 2 в темноте в течение 24 ч. Для групп 3 и 4 облучают клетки светодиодной лампой с длиной волны 530 нм (50 мВт/см2) в течение 5 мин и инкубируют в течение 24 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пластины ячеек помещают на пенопластовый блок, чтобы обеспечить ту же высоту, что и фотометр на шаге 4.1. - Определите жизнеспособность клеток с помощью анализа 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ).
- После обработки BC или наночастицами добавьте 10 мкл МТТ (10 мг/мл в PBS) в каждую лунку и инкубируйте планшеты при 37 ° C в течение 3 часов. Затем удалите среду и добавьте по 100 мкл ДМСО в каждую лунку. Считывание поглощения с помощью считывателя микропланшетов на длителе 490 нм, 570 нм и 630 нм.
- Рассчитайте жизнеспособность клетки, используя следующее уравнение:
ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа проводятся четыре независимых эксперимента (n = 4) каждой группы. OD490 может быть заменен на OD570-OD 630 при расчете жизнеспособности клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
IR783 / BC NP были успешно изготовлены в этом исследовании с использованием метода мгновенного осаждения. Синтезированные NP IR783 / BC были представлены в виде фиолетового раствора, в то время как водный раствор IR783 был синим (рис. 4A). Как показано на рисунке 4B, NP IR783/BC показали средний размер примерно 87,22 нм с индексом полидисперсности (PDI) 0,089, что свидетельствует об узком распределении по размерам. Поверхностный заряд IR783/NP составлял приблизительно -29,8 мВ (рис. 4C), что можно объяснить отрицательно заряженными сульфонатными группами IR783. На рисунке 4D показана стабильность НП IR783/BC. Размер наночастиц поддерживался на уровне около 85 нм в течение, по крайней мере, 48 ч (в PBS при 37 ° C) после изготовления, в то время как его PDI также оставался менее 0,2. Существенных изменений в распределении по размерам НП IR783/BC через 0 ч, 24 ч и 48 ч после изготовления не наблюдалось (рис. 4E).
На рисунке 5A,B показана морфология NP IR783/BC до и после светового облучения соответственно. После облучения светом можно наблюдать как агрегаты, так и фрагменты, что указывает на диссоциацию и агрегацию наночастиц соответственно. На рисунке 5C показано изменение размера наночастиц и их распределение после 3 мин и 5 мин светового облучения. Увеличенный размер и более широкое распределение наблюдались для облученных наночастиц. Профили фоторелиза НП IR783/BC также измеряли методом ВЭЖХ. Как показано на рисунке 5D,E, пролекарство BC было фоторасщеплено через 10 минут. Между тем, Cb был выпущен с эффективностью извлечения около 22% за тот же период.
НП IR783 / BC показали значительную цитотоксичность на клетках колоректальной опухоли человека (HCT116) при световом облучении на длине волны 530 нм по сравнению с группой без облучения (рис. 6). IC50 НП IR783/BC со световым облучением (6,62 мкМ) был ниже, чем у свободных БК со световым облучением (9,24 мкМ), что демонстрирует более высокую противоопухолевую эффективность in vitro НП IR783/BC со световым облучением, чем у свободной БК со световым облучением25. Представленная цитотоксичность была обусловлена как высвобожденным Cb, так и генерируемыми активными формами кислорода (АФК) (дополнительный рисунок 1 и дополнительный рисунок 2). Более высокая цитотоксичность НП IR783/BC при световом облучении была в основном вызвана эффективным клеточным поглощением NPs25 IR783/BC.
Рисунок 1: Образование НП IR783/BC. (A) Самосборка и световая диссоциация НП IR783/BC. (B) Схема изготовления НП IR783/BC методом мгновенного осаждения. Воспроизведено с разрешения25. Авторское право 2022, Wiley. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Путь синтеза пролекарства BODIPY-Cb (BC). Производные BODIPY были сначала синтезированы из ацетоксиацетилхлорида и 2,4-диметилпиррола, а затем конъюгированы с Cb. 1Спектр H-ЯМР пролекарства BC показан на дополнительном рисунке 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Установка светодиодного облучения . (A, B) Настройка светодиодной лампы для измерения освещенности. (С,Д) Настройка светодиодной лампы для облучения НП IR783/BC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Характеристика NP IR783/BC. (A) Внешний вид свободных растворов IR783, свободных BC и IR783/BC NP. (B) Распределение NP IR783/BC. (C) Поверхностный заряд NP IR783/BC. (D) Изменение размера NP IR783/BC в PBS при 37°C в течение 48 часов после изготовления. (E) Распределение по размерам IR783/BC NP через 0 ч, 24 ч и 48 ч после изготовления. Воспроизведено с разрешения25. Авторское право 2022, Wiley. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Фоторелиз IR783/BC NP. ПЭМ-изображения НП IR783/BC (A) до и (B) после светового облучения. Масштабная линейка = 100 мкм. (C) Распределение IR783/NP по размерам после 0 мин, 3 мин и 5 мин светового облучения. (D) ВЭЖХ-анализ НЧ IR783/BC, подвергшихся увеличению продолжительности светового облучения до 10 мин. (E) Количественная оценка деградации BC и IR783 и высвобождения Cb (n = 3). Полосы погрешности представляют собой стандартное отклонение. Световое облучение: светодиодная лампа 530 нм, 50 мВт/см2. Воспроизведено с разрешения25. Авторское право 2022, Wiley. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Цитотоксичность IR783/BC NP против клеток HCT116. Значительная цитотоксичность появлялась при концентрациях БК >1 мкМ (n = 4). Полосы погрешности представляют собой стандартное отклонение. Для определения статистической значимости различий был принят независимый выборочный t-критерий. *p < 0,05, **p < 0,01. Световое облучение: светодиодная лампа 530 нм, 50 мВт/см2. Воспроизведено с разрешения25. Авторское право 2022, Wiley. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1: Механизм фотохимии. (А) Фоторасщепление пролекарства БК. (B) Разложение IR783. Адаптировано с разрешения25. Авторское право 2022, Wiley. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 2: Профиль генерации ROS. Генерация АФК различных образцов при световом облучении количественно определена с помощью синглетного датчика кислорода зеленого (SOSG). Световое облучение: светодиодная лампа 530 нм, 50 мВт/см2. Адаптировано с разрешения25. Авторское право 2022, Wiley. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 3: 1Н-ЯМР-спектр BODIPY-Cb. Перепечатывается сразрешения 22. Авторское право 2022, Американское химическое общество. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом протоколе описывается метод легкого мгновенного осаждения для изготовления наночастиц пролекарства и красителя, который предлагает простой и удобный подход к образованию наночастиц. В этом методе есть несколько важных шагов. Во-первых, для всех этапов синтеза, изготовления и определения характеристик контейнеры, такие как микротрубки, должны быть покрыты фольгой, чтобы избежать ненужного фоторасщепления пролекарства BC под воздействием света окружающей среды. Кроме того, на этапе мгновенного осаждения микропробирку, содержащую раствор IR-783, следует стабильно помещать на вихревой смеситель, медленно добавляя раствор пролекарства BC. Таким образом, раствор пролекарства BC (в ДМСО) может быть равномерно диспергирован в растворе IR-783. На этапе очистки используется метод дифференциального центрифугирования. Первое центрифугирование при 2000 x g используется для удаления выгруженных твердых веществ пролекарства BC, в то время как второе центрифугирование при 30 000 x g удаляет DMSO и IR783 в надосадочной жидкости, которые не включены в наночастицы. Затем NP IR783 / BC могут быть собраны в виде осадка и ресуспендированы в отфильтрованной деионизированной воде.
Самосборка — это простой и эффективный метод изготовления наночастиц. Однако метод самостоятельной сборки должен быть оптимизирован в соответствии с такими факторами, как гидрофобность строительных блоков. В этом протоколе один из компонентов, IR783, представляет собой водорастворимый краситель, растворенный в воде. Однако в некоторых случаях все компоненты могут быть гидрофобными. При таких обстоятельствах они должны быть растворены в ДМСО, как пролекарство BC в этом протоколе. Стабилизатор, такой как 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-поли(этиленгликоль) (DSPE-PEG), может быть использован для формирования и стабилизации самоорганизующихся наночастиц 14,26,27.
Свет имеет ограниченное проникновение в ткани, что ограничивает применение фотоактивируемых наночастиц в клиническом использовании. Одним из решений является разработка длинноволновых светоактивируемых систем, таких как красный или ближний инфракрасный свет28. Использование оптических волокон для доставки света является еще одним способом решения проблемы ограниченного проникновения света в ткани при некоторых пораженияхзаболеваний 29. Кроме того, совместная сборка компонентов в основном зависит от межмолекулярных сил, таких как гидрофобное взаимодействие, укладка π-π и водородная связь, что говорит о том, что этот метод не может быть применим ко всем молекулампролекарства и красителя 30. Возможность совместной сборки функциональных молекул, таких как лекарства, пролекарства, красители, фотосенсибилизаторы и фототермические агенты, должна быть оценена с помощью теоретических расчетов и экспериментальных характеристик.
Фотоактивируемая наноразмерная система доставки лекарств на основе пролекарства и красителя имеет ряд преимуществ. Во-первых, красители, такие как IR783, могут разлагаться под световым облучением, что впоследствии делает возможным локальную и специфическую разборку наночастиц25. Кроме того, инкорпорированный краситель может функционировать как визуализирующий агент для мониторинга системы доставки лекарственного средства, а его флуоресценция используется для отслеживания накопления и разборки наночастиц. Кроме того, сообщалось, что индоцианиновые красители с сульфонатными группами способны воздействовать на кавеолы при некоторых видахрака 19, что обеспечивает эффективное клеточное поглощение систем доставки лекарств25. Таким образом, индоцианиновые красители с аналогичной структурой имеют большой потенциал для включения в такие системы доставки лекарств.
До настоящего времени было опубликовано лишь несколько публикаций по стандартизации операций по фотоактивации наносистем доставки лекарств31. Таким образом, описанный здесь протокол может служить полезным справочным материалом для разработки фоточувствительных систем доставки лекарств.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Заявка по процедуре РСТ подана под номером .PCT/CN2021/081262.
Acknowledgments
Мы благодарим за помощь со стороны основного центра медицинского факультета Ли Ка Шин Университета Гонконга. Мы благодарим профессора Чи-Мин Че из Университета Гонконга за предоставление клеточной линии HCT116 человека. Эта работа была поддержана ассоциированным членом Центра репаративной медицины Мин Вай Лау и Советом по исследовательским грантам Гонконга (Схема ранней карьеры, No 27115220).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1260 Infinity II HPLC | Agilent Technologies | ||
| 2,4-Dimethyl pyrrole | J&K Scientific | 315305 | |
| 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT) | Gibco | M6494 | |
| 4-Dimethylaminopyridine (4-DMAP) | J&K Scientific | 212279 | |
| 90 mm Petri Dish Clear Treated Sterile | SPL | 11090 | |
| 96-well Tissue Culture Plate Clear Treated Sterile | SPL | 30096 | |
| Acetoxyacetyl chloride | J&K Scientific | 192001 | |
| Boron trifluoride diethyl etherate | J&K Scientific | 921076 | |
| Büchner funnel | AS ONE | 3-6466-01 | |
| Chlorambucil | J&K Scientific | 321407-1G | |
| CM100 Transmission Electron Microscope | Philips | ||
| CombiFlash RF chromatography system | Teledyne ISCO | ||
| Dichloromethane | DUKSAN Pure Chemicals | JT9315-88 | |
| Dimethyl sulfoxide | DUKSAN Pure Chemicals | 2762 | |
| Disposable cuvette | Malvern Panalytical | DTS1070 | Zeta potential measurement |
| Disposable cuvette | Malvern Panalytical | ZEN0040 | |
| Empty Disposable Sample Load Cartridges | Teledyne ISCO | 693873225 | can hold up to 65 g |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270106 | |
| Filtering flask | AS ONE | 3-7089-03 | |
| Hexane | DUKSAN Pure Chemicals | 4198 | |
| Holey carbon film on copper grid | Beijing Zhongjingkeyi Technology Co.,Ltd | BZ10023a | |
| HPLC column (InfinityLab Poroshell 120) | Agilent Technologies | 695975-902T | |
| Integrating sphere photodiode power sensor | Thorlabs | S142C | |
| IR783 | Tokyo Chemical Industry (TCI) Co., Ltd | I1031 | |
| LED | Mightex | LCS-0530-15-11 | |
| LED Driver Control Panel V3.2.0 (Software) | Mightex | ||
| Lithium Hydroxide Anhydrous | TCI | L0225 | |
| Methylmagnesium iodide, 3M solution in diethyl ether | Aladdin | M140783 | |
| N,N-Diisopropyl ethyl amine (DIPEA) | J&K Scientific | 203402 | |
| N,N'-Dicyclohexylcarbodiimide (DCC) | J&K Scientific | 275928 | |
| penicillin–streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate-buffered saline (10×) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| Power and energy meter | Thorlabs | PM100 USB | |
| Rotavapor | BUCHI Rotavapor R300 | ||
| RMPI 1640 | Gibco | 21870076 | |
| Separatory funnel (125 mL) | Synthware | F474125L | |
| Silver Silica Gel Disposable Flash Columns, 40 g | Teledyne ISCO | 692203340 | |
| Sodium sulfate, anhydrous | Alfa Aesar | A19890 | |
| SpectraMax M4 | Molecular Devices LLC | ||
| Tetrahydrofuran (THF), anhydrous | J&K Scientific | 943616 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | |
| Vortex | DLAB Scientific Co., Ltd | MX-S | |
| Zetasizer Nano ZS90 | Malvern Instrument |
References
- Chabner, B. A., Roberts, T. G. Chemotherapy and the war on cancer. Nature Reviews Cancer. 5 (1), 65-72 (2005).
- Monsuez, J. -J., Charniot, J. -C., Vignat, N., Artigou, J. -Y.
- Floyd, J., Mirza, I., Sachs, B., Perry, M. C.
- Bar-Joseph, H., Stemmer, S. M., Tsarfaty, I., Shalgi, R., Ben-Aharon, I. Chemotherapy-induced vascular toxicity-real-time in vivo imaging of vessel impairment. Journal of Visualized Experiments. (95), e51650 (2015).
- Denny, W. A.
- Kastrati, I., Delgado-Rivera, L., Georgieva, G., Thatcher, G. R. J., Frasor, J. Synthesis and characterization of an aspirin-fumarate prodrug that inhibits NFκB activity and breast cancer stem cells. Journal of Visualized Experiments. (119), e54798 (2017).
- Mao, J., et al. A simple dual-pH responsive prodrug-based polymeric micelles for drug delivery. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (27), 17109-17117 (2016).
- Li, S. -Y., et al. A pH-responsive prodrug for real-time drug release monitoring and targeted cancer therapy. Chemical Communications. 50 (80), 11852-11855 (2014).
- Andresen, T. L., Thompson, D. H., Kaasgaard, T. Enzyme-triggered nanomedicine: Drug release strategies in cancer therapy (Invited Review). Molecular Membrane Biology. 27 (7), 353-363 (2010).
- Xu, G., McLeod, H. L. Strategies for enzyme/prodrug cancer therapy. Clinical Cancer Research. 7 (11), 3314-3324 (2001).
- Luo, W., et al. Dual-targeted and pH-sensitive doxorubicin prodrug-microbubble complex with ultrasound for tumor treatment. Theranostics. 7 (2), 452 (2017).
- Gao, J., et al. Ultrasound triggered phase-change nanodroplets for doxorubicin prodrug delivery and ultrasound diagnosis: An in vitro study. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 174, 416-425 (2019).
- Brade, A. M., Szmitko, P., Ngo, D., Liu, F. -F., Klamut, H. J. Heat-directed suicide gene therapy for breast cancer. Cancer Gene Therapy. 10 (4), 294-301 (2003).
- Long, K., et al. One-photon red light-triggered disassembly of small-molecule nanoparticles for drug delivery. Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 357 (2021).
- Liu, Y., Long, K., Kang, W., Wang, T., Wang, W. Optochemical control of immune checkpoint blockade via light-triggered PD-L1 dimerization. Advanced NanoBiomed Research. 2 (6), 2200017 (2022).
- Wang, T., et al. Optochemical control of mTOR signaling and mTOR-dependent autophagy. ACS Pharmacology & Translational Science. 5 (3), 149-155 (2022).
- Abet, V., Filace, F., Recio, J., Alvarez-Builla, J., Burgos, C. Prodrug approach: An overview of recent cases. European Journal of Medicinal Chemistry. 127, 810-827 (2017).
- Li, G., et al. Small-molecule prodrug nanoassemblies: an emerging nanoplatform for anticancer drug delivery. Small. 17 (52), 2101460 (2021).
- Shamay, Y., et al. Quantitative self-assembly prediction yields targeted nanomedicines. Nature Materials. 17 (4), 361-368 (2018).
- Sinoway, P. A., Callen, J. P.
- Owen, W. R., Stewart, P. J. Kinetics and mechanism of chlorambucil hydrolysis. Journal of Pharmaceutical Sciences. 68 (8), 992-996 (1979).
- Lv, W., et al. Upconversion-like photolysis of BODIPY-based prodrugs via a one-photon process. Journal of the American Chemical Society. 141 (44), 17482-17486 (2019).
- Silver, J. Let us teach proper thin layer chromatography technique. Journal of Chemical Education. 97 (12), 4217-4219 (2020).
- Saad, W. S., Prud'homme, R. K. Principles of nanoparticle formation by flash nanoprecipitation. Nano Today. 11 (2), 212-227 (2016).
- Long, K., et al. Photoresponsive prodrug-dye nanoassembly for in-situ monitorable cancer therapy. Bioengineering & Translational Medicine. 7 (3), 10311 (2022).
- Zhong, T., et al. A self-assembling nanomedicine of conjugated linoleic acid-paclitaxel conjugate (CLA-PTX) with higher drug loading and carrier-free characteristic. Scientific Reports. 6 (1), 36614 (2016).
- Long, K., et al. Green light-triggered intraocular drug release for intravenous chemotherapy of retinoblastoma. Advanced Science. 8 (20), 2101754 (2021).
- Lv, W., Wang, W. One-photon upconversion-like photolysis: a new strategy to achieve long-wavelength light-excitable photolysis. Synlett. 31 (12), 1129-1134 (2020).
- Rwei, A. Y., Wang, W., Kohane, D. S. Photoresponsive nanoparticles for drug delivery. Nano Today. 10 (4), 451-467 (2015).
- Grzelczak, M., Vermant, J., Furst, E. M., Liz-Marzán, L. M.
- Gnanasammandhan, M. K., Idris, N. M., Bansal, A., Huang, K., Zhang, Y. Near-IR photoactivation using mesoporous silica-coated NaYF4:Yb,Er/Tm upconversion nanoparticles. Nature Protocols. 11 (4), 688-713 (2016).
