Summary
Este protocolo describe la fabricación y caracterización de un nanoensamblaje fotosensible profármaco-colorante. Se describe explícitamente la metodología para la liberación del fármaco de las nanopartículas mediante el desmontaje activado por la luz, incluida la configuración de irradiación de la luz. Los fármacos liberados de las nanopartículas después de la irradiación de luz exhibieron excelentes efectos antiproliferación en las células tumorales colorrectales humanas.
Abstract
El autoensamblaje es un método simple pero confiable para construir sistemas de administración de fármacos a nanoescala. Los profármacos fotoactivables permiten la liberación controlable de fármacos de nanoportadores en sitios objetivo modulados por irradiación de luz. En este protocolo, se presenta un método fácil para fabricar nanopartículas fotoactivables de profármaco-colorante a través del autoensamblaje molecular. Los procedimientos para la síntesis de profármacos, la fabricación de nanopartículas, la caracterización física del nanoensamblaje, la demostración de fotoescisión y la verificación de citotoxicidad in vitro se describen en detalle. Primero se sintetizó un profármaco fotodicente boro-dipironoteno-clorambucilo (BC). BC y un tinte infrarrojo cercano, IR-783, en una proporción optimizada, podrían autoensamblarse en nanopartículas (IR783 / BC NPs). Las nanopartículas sintetizadas tenían un tamaño promedio de 87.22 nm y una carga superficial de -29.8 mV. Las nanopartículas se desmontaron con irradiación de luz, que pudo observarse mediante microscopía electrónica de transmisión. La fotoescisión de BC se completó en 10 min, con una eficiencia de recuperación del 22% para clorambucilo. Las nanopartículas mostraron una mayor citotoxicidad bajo irradiación de luz a 530 nm en comparación con las nanopartículas no irradiadas y el profármaco BC libre irradiado. Este protocolo proporciona una referencia para la construcción y evaluación de sistemas de administración de fármacos fotosensibles.
Introduction
La quimioterapia es un tratamiento común contra el cáncer que emplea agentes citotóxicos para destruir las células cancerosas y, por lo tanto, inhibe el crecimiento tumoral1. Sin embargo, los pacientes pueden sufrir efectos secundarios como cardiotoxicidad y hepatotoxicidad debido a la absorción fuera del objetivo de los medicamentos de quimioterapia 2,3,4. Por lo tanto, la administración localizada de fármacos a través del control espaciotemporal de la liberación/activación del fármaco en los tumores es esencial para minimizar la exposición al fármaco en los tejidos normales.
Los profármacos son fármacos modificados químicamente que presentan una toxicidad reducida en los tejidos normales, conservando su acción en las lesiones enfermas tras la activación 5,6. Los profármacos pueden responder a una variedad de estímulos, como pH7,8, enzimas 9,10, ultrasonido 11,12, calor 13 y luz14,15,1 6, y liberar sus fármacos parentales específicamente en las lesiones. Sin embargo, muchos profármacos presentan inconvenientes inherentes, como baja solubilidad, tasa de absorción incorrecta y destrucción metabólica temprana, lo que puede limitar su desarrollo17. En este contexto, la formación de nanoensamblajes de profármacos ofrece ventajas como la disminución de los efectos secundarios, la liberación in situ del fármaco, una mejor retención y la combinación de tratamiento e imágenes, lo que indica un gran potencial de aplicación para estos nanoensamblajes. Se han desarrollado muchos nanoensamblajes de profármacos para el tratamiento de enfermedades, incluidas las nanoesferas de profármacos de doxorrubicina, las micelas de profármacos de curcumina y las nanofibras de profármacos de camptotecina18.
En este protocolo, presentamos un método simple para la preparación de nanoensamblajes profármaco-colorante que exhiben un alto contenido de profármacos, buena dispersabilidad del agua, estabilidad a largo plazo y capacidad de respuesta sensible. IR783 es un colorante infrarrojo cercano soluble en agua que puede servir como estabilizador de los nanoconjuntos19. El otro componente del nanoensamblaje es boro-dipironeteno-clorambucilo (BODIPY-Cb, BC), un profármaco que fue diseñado por dos razones principales. Como el clorambucilo (Cb) muestra toxicidad sistémica in vivo, la forma profármaco puede disminuir su toxicidad20. El profármaco BC se puede fotoescindar utilizando irradiación de luz de 530 nm dirigida a las lesiones de la enfermedad, lo que permite la liberación local de Cb. Por otro lado, el Cb es propenso a la hidrólisis en ambientes acuosos, y puede protegerse transformándolo en una forma profármaco21. Por lo tanto, se esperaba que el ensamblaje conjunto del profármaco BC y el colorante IR-783 formara un nanosistema de administración de fármacos estable y efectivo (Figura 1A). Este nanoensamblaje profármaco-colorante mejora la dispersabilidad y estabilidad de las moléculas de profármaco, lo que sugiere su potencial para su aplicación en la administración de fármacos controlables por la luz. La fotoescisión del profármaco BC permite el desmontaje de nanopartículas y la liberación controlada por luz de Cb en las lesiones (Figura suplementaria 1).
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Protocol
1. Síntesis del profármaco boro-dipironeteno-clorambucilo (BC) (Figura 2)22
- Síntesis de BODIPY-OAc
- Pesar 1,903 g de 2,4-dimetilpirrol y disolverlo en 20 ml de diclorometano anhidro (MCD) en un matraz de fondo redondo en atmósfera de nitrógeno. Pesar 1.638 g de acetoxy acetil cloruro y añadirlo gota a gota a la solución. Mantener agitando durante 10 min a temperatura ambiente y luego reflujo la solución durante 1 h a 40 °C.
- Enfríe la mezcla a temperatura ambiente. Pesar 5.170 g de N,N-diisopropiletilamina (DIPEA) y añadirlo gota a gota a la mezcla bajo agitación. Después de 30 min, pesar 5,677 g de trifluoruro de boro dietil etherato (BF3· OEt2), agréguelo gota a gota en la solución y siga revolviendo durante 30 minutos adicionales.
- Añadir 10 g de gel de sílice (malla 200-400) a la mezcla y eliminar el disolvente por evaporación rotativa a 45 °C. Detenga la evaporación cuando el gel de sílice vuelva a ser polvo seco.
- Agregue una frita en la parte inferior de un cartucho (consulte la Tabla de materiales). Llene el gel de sílice (del paso 1.1.3) en el cartucho y, a continuación, añada otra frita al cartucho en la parte superior del gel lleno.
- Fije el cartucho en el collar conectado con el sistema de cromatografía flash (consulte Tabla de materiales) y gírelo para bloquearlo. Instale el cartucho en la parte superior de la válvula de seis vías en el sistema de cromatografía flash e instale una columna de flash (consulte la Tabla de materiales) debajo de la válvula.
- Inicie el instrumento de cromatografía y establezca 515 nm y 365 nm como longitudes de onda de detección. Realizar la elución con 4/3 (v/v) hexano/DCM. Recoja las fracciones eluyentes a medida que aparezca la señal de 515 nm.
- Retirar el disolvente de las fracciones recogidas por evaporación rotativa a 40 °C hasta que no se recoja más disolvente en el matraz de recogida de disolventes. Coloque el producto sólido en una cámara de secado al vacío durante la noche para eliminar el resto del disolvente.
- Síntesis de BODIPY-OH
- Pesar 1,120 g de BODIPY-OAc (sintetizado en el paso 1.1) y disolverlo en 70 ml de tetrahidrofurano (THF) a temperatura ambiente, completamente cubierto con papel de aluminio. Añadir 70 ml de solución acuosa de LiOH 0,1 M gota a gota en la solución BODIPY-OAc.
- Agitar la mezcla durante 30 min y retirar el disolvente a 40 °C por evaporación rotativa hasta que no se recoja más disolvente en el matraz de recogida de disolventes. Coloque el residuo en una cámara de secado al vacío durante la noche para eliminar el agua.
- Disuelva el residuo seco en 30 ml de DCM y agregue 10 g de gel de sílice a la solución. Eliminar el disolvente por evaporación rotativa a 40 °C. Detenga la evaporación cuando el gel de sílice vuelva a ser polvo seco.
- Purificar el producto BODIPY-OH por cromatografía en columna, siguiendo los pasos 1.1.4 a 1.1.6, con DCM solo como eluyente.
- Comparar fracciones recogidas en diferentes puntos de tiempo de elución con una solución THF de BODIPY-OAc en cromatografía en capa fina (TLC) e identificar el producto23.
- Detectar 3-4 μL de la fracción eluyida y la solución de BODIPY-OAc por separado en un borde de una placa TLC a la misma altura. Coloque la placa TLC en una cámara de vidrio que contenga 1 ml de DCM, sumergiendo el borde manchado en el disolvente DCM pero con los dos puntos fuera del disolvente.
- Saque la placa TLC cuando el disolvente DCM alcance más de la mitad de la altura de la placa. Seleccione la fracción eluyente con un punto TLC a una altura diferente del punto BODIPY-OAc.
- Eliminar el disolvente por evaporación rotativa a 40 °C (paso 1.1.7) para obtener el producto BODIPY-OH.
- Síntesis de BODIPY-(Me)2-OH
- Pesar 313 mg de BODIPY-OH y disolverlo en 35 ml de éter dietílico anhidro en la oscuridad bajo una atmósfera de nitrógeno. Añadir 3,75 ml de yoduro de metil magnesio (3 M en éter dietílico) gota a gota en la solución y mantener agitando durante 3 h a temperatura ambiente.
- Apague la reacción agregando 3.5 ml de agua gota a gota.
- Extraer la mezcla con DCM y agua.
- Transfiera la mezcla a un embudo de separación de 125 ml. Agregue 20 ml de DCM a la mezcla.
- Cierre la tapa del embudo separador. Incline el embudo a unos 45° y agite ligeramente el embudo. Abra la tapa para desinflar. Repita este paso 3 veces y deje reposar durante 3 minutos.
- Abra la válvula inferior y recoja la fase orgánica inferior en un vaso de precipitados.
- Añadir 30 mL de DCM a la fase acuosa. Repita la extracción (pasos 1.3.3.2 y 1.3.3.3) 3 veces con 30 ml de MCD cada vez.
- Añadir 10 g deNa2SO4 sólido en la fase orgánica recogida para secar la fase orgánica durante la noche.
- Conecte un matraz filtrante a una bomba de vacío con un tubo de goma. Coloque un trozo de papel de filtro en el embudo Büchner e inserte el embudo en la parte superior del matraz. Moje el papel de filtro con 1 ml de DCM, transfiera la mezcla al embudo y encienda la bomba de vacío. Recoger la solución orgánica en el matraz.
- Añadir 10 g de gel de sílice en la solución orgánica. Eliminar el disolvente orgánico por evaporación rotativa a 40 °C hasta que el gel de sílice vuelva a convertirse en polvo seco. Purificar el producto BODIPY-(Me)2-OH por cromatografía en columna (pasos 1.1.4 a 1.1.6) con hexano/DCM = 1/1 (v/v) como eluyente.
- Seleccione las fracciones eluidas que contienen el producto mediante el análisis TLC como se describe en el paso 1.2.5 (punto TLC a una altura diferente de BODIPY-OH). Eliminar el disolvente por evaporación rotativa a 40 °C para obtener el producto como se describe en el paso 1.1.7.
- Síntesis de BODIPY-(Me)2-I 2-OH
- Pesar 41 mg de BODIPY-(Me)2-OH y disolverlo en 2,5 ml de THF anhidro en la oscuridad bajo una atmósfera de nitrógeno. Pesar 74 mg de N-yodosuccinimida y disolverlo en 1 ml de THF anhidro.
- Agregue la solución de N-yodosuccinimida gota a gota en la solución BODIPY-(Me)2-OH. Después de agitar durante 3,5 h a temperatura ambiente, extraer el disolvente por evaporación rotativa a 40 °C hasta que no se recoja más disolvente en el matraz de recogida de disolventes del evaporador rotativo.
- Disolver el residuo en 10 ml de MCD y lavarlo 3 veces con 30 ml de agua cada vez, como se describe en el paso 1.3.3. Secar la fase orgánica conNa2SO4 (pasos 1.3.4 y 1.3.5). Eliminar el disolvente por evaporación rotativa a 40 °C (paso 1.1.7) para obtener el producto BODIPY-(Me)2-I 2-OH.
- Síntesis de BODIPY-Cb
- Pesar 85 mg de clorambucilo y disolverlo en 2 ml de MCD anhidro en la oscuridad bajo una atmósfera de nitrógeno. Pesar 69 mg de N,N'-diciclohexilcarbodiimida y disolverlo en 1 mL de DCM anhidro. Añádalo gota a gota en la solución de clorambucilo agitando durante 10 minutos.
- Disolver 1,7 mg de 4-dimetilaminopiridina en 0,5 ml de MCD anhidro. Agregue esta solución a la mezcla y siga revolviendo durante 10 minutos a temperatura ambiente. Luego agregue 73 mg de BODIPY-(Me)2-I 2-OH disuelto en 2 ml de DCM anhidro y mantenga la agitación durante 2 h.
- Añadir 10 g de gel de sílice a la mezcla y eliminar el disolvente por evaporación rotativa a 40 °C. Detenga la evaporación cuando el gel de sílice vuelva a ser polvo seco. Purificar el producto BODIPY-Cb por cromatografía en columna (pasos 1.1.4 a 1.1.6, longitud de onda de señal de 540 nm y 365 nm) con hexano/DCM = 7/3 (v/v) como eluyente.
- Seleccione las fracciones eluidas que contienen el producto diferente de BODIPY-(Me)2-I 2-OH mediante el análisis TLC (paso 1.2.5). Eliminar el disolvente por evaporación rotativa a 40 °C (paso 1.1.7) para obtener el producto BODIPY-Cb.
2. Preparación de NPs IR783/BC por el método de precipitación flash
- Pesar 10 mg del profármaco B (BODIPY-Cb) y disolverlo en 1 ml de DMSO en un microtubo de 1,5 ml para obtener una solución madre de 10 mg/ml. Cubra la solución BC con papel de aluminio.
- Preparar 300 μL de 0,4 mg/ml IR-783 en agua desionizada filtrada en un microtubo de 1,5 ml. Coloque este microtubo en un mezclador de vórtice a 1.500 rpm.
- Añadir 20 μL de la solución BC en DMSO a la solución IR-783 durante 10 s a una velocidad constante utilizando una pipeta de 20 μL. El extremo de la punta de la pipeta debe tocar la pared interna del microtubo (Figura 1B).
- Mantenga el microtubo en el mezclador de vórtice durante 30 s adicionales para obtener la solución IR783/BC NP. Luego, coloque la solución de nanopartículas en un estante completamente cubierto con papel de aluminio.
- Centrifugar la solución IR783/BC NP resultante durante 10 min a 2.000 x g y 4 °C para eliminar los agregados. Recoja el sobrenadante, dejando ~20 μL en el tubo para evitar perturbar el pellet. Deseche el pellet.
- Centrifugar el sobrenadante dos veces durante 30 min a 30.000 x g y 4 °C y recoger el precipitado de nanopartículas de ambas centrifugaciones. Resuspender las nanopartículas en 300 μL de 1x PBS.
NOTA: Cuando el profármaco BC hidrófobo en DMSO se dispersa en agua con vórtice, el DMSO es disuelto por el agua, y las moléculas del profármaco tienden a formar ensamblajes a nanoescala para mantenerse estables bajo la situación de sobresaturación local24. - Cuantificar el contenido de IR-783 y BC por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), utilizando el método de elución que se muestra en la Tabla 1.
NOTA: La muestra de HPLC se prepara mezclando volúmenes iguales de solución de nanopartículas y acetonitrilo. El volumen de inyección es de 20 μL. La longitud de onda de detección para clorambucilo y profármaco BC es de 260 nm, y la longitud de onda de detección para IR783 es de 783 nm. La columna de HPLC es una columna C18 analítica de 4,6 mm (diámetro interior) x 100 mm (longitud), con un tamaño de partícula de 2,7 μm y un tamaño de poro de 120 Å. - Calcule la eficiencia de encapsulación del profármaco (EE%) y la capacidad de carga (LC%) de acuerdo con las siguientes ecuaciones:
| Tiempo (min) | Acetonitrilo (%) | Agua (%) |
| 0 | 20 | 80 |
| 5 | 20 | 80 |
| 30 | 95 | 5 |
| 35 | 95 | 5 |
Tabla 1: Método de HPLC para el análisis cualitativo y cuantitativo del profármaco BC y su fotoescisión. Reproducido con permiso25. Derechos de autor 2022, Wiley.
3. Caracterización de NPs IR783/BC
- Mida el tamaño promedio de los NP IR783 / BC con un instrumento de dispersión dinámica de luz (DLS) (consulte la Tabla de materiales). Añadir 200 μL de solución IR783/BC NP en una cubeta e insertar la cubeta en el soporte para su medición. Establezca el tipo de medición como "tamaño" y la temperatura de medición como 25 °C. Realice tres mediciones con una duración de 20 s para cada medición.
- Mida la carga superficial de las NP IR783/BC con el instrumento DLS utilizando una cubeta de prueba de potencial zeta.
- Diluir 25 μL de solución IR783/BC NP con 725 μL de agua desionizada en un microtubo de 1,5 ml y añadir la solución a una cubeta de prueba de potencial zeta. Coloque la cubeta en la ranura de muestra. Tapa la ranura de la muestra.
- Establezca el tipo de medición como "potencial zeta" y la temperatura de medición como 25 °C. Realizar 10 mediciones.
- Prepare las muestras para la obtención de imágenes por microscopía electrónica de transmisión (TEM). Añadir 10 μL de solución de NP IR783/BC sobre un trozo de película de carbono agujereada en una rejilla de cobre (malla 300) y retirar 7 μL. Dejar 3 μL de solución en la película durante la noche para la autoevaporación.
NOTA: La adición de 10 μL de la solución NP seguida de la eliminación de 7 μL permite que la gota cubra un área más amplia en la película.
4. Fotoactivación de NPs IR783/BC
- Instale una lámpara LED (530 nm; consulte la Tabla de materiales) con un soporte de hierro para que la luz mire directamente hacia el piso de operación. Coloque un fotómetro de fotodiodo de esfera integradora (consulte la Tabla de materiales) directamente debajo de la lámpara LED.
NOTA: Para evitar la influencia de la luz ambiental, todos los experimentos de irradiación de luz se llevan a cabo en un cuarto oscuro. - Encienda la lámpara LED y abra la tapa del fotómetro. Registre la irradiancia y ajuste los parámetros de la lámpara utilizando el software asociado (consulte la Tabla de materiales). Ajuste la corriente de entrada (mA) para ajustar la irradiancia como 50 mW/cm2.
NOTA: La irradiancia también se ve afectada por la distancia entre la lámpara LED y el fotómetro. En la configuración utilizada aquí (Figura 3A, B), la distancia se fija en 5 cm. - Diluir la solución IR783/BC NP con agua desionizada a 50 μM en función de la concentración de BC. Añadir 200 μL de la solución IR783/BC NP en un microtubo de 1,5 ml. Coloque el tubo en un bloque de espuma con un tamaño de ranura del microtubo y la misma altura que el fotómetro en el paso 4.1 (Figura 3C, D).
- Abra la tapa del tubo. Encienda la lámpara LED e irradie la solución de nanopartículas durante 1, 2, 3, 5, 7 y 10 min.
- Cuantificar el consumo de BC y la liberación de Cb por HPLC después de la irradiación de luz. Calcule el porcentaje de liberación de BC y Cb restante utilizando las siguientes ecuaciones:
5. Ensayo de citotoxicidad de NPs IR783/BC con y sin irradiación lumínica
- Cultivo de células HCT116 (línea celular de tumor colorrectal humano) en medio RPMI 1640 que contiene 10% de suero bovino fetal y 1% de penicilina-estreptomicina (medio completo) en una atmósfera de CO2 al 5% a 37 °C (~2 x 106 células por plato en una placa de cultivo celular de 90 mm). Subcultivo rutinario de las células cada 2-3 días.
NOTA: HCT116 es una línea celular de colon humano. En comparación con otras células cancerosas como las células HeLa, MCF7 y A549, las células HCT-116 expresan un nivel más alto de caveolina-125, que puede ser atacado por IR783 y mejorar la absorción celular de IR783 / BC NP. - Coloque las células HCT116 en placas de 96 pocillos con medio completo RPMI 1640 a una densidad de 10a 4 células por pocillo.
- Aspirar el medio de la placa de cultivo cuando la confluencia celular supere el 50%. Lave las celdas con 1x PBS y retire el PBS. Añadir 1 ml de solución de tripsina al 0,25% e incubar a 37 °C en una incubadora deCO2 al 5%.
- Después de 3 minutos, agregue 2 ml de medio completo para calmar la digestión de tripsina. Vuelva a suspender las células, transfiera la suspensión celular a un tubo de centrifugación de 15 ml y centrifugar a 300 x g durante 3 min. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en 1 mL de medio completo.
- Diluir 10 μL de la suspensión celular a 200 μL con medio completo. Coloque 10 μL en un hemocitómetro y cúbralo con un cubreobjetos.
- Observe el hemocitómetro bajo un microscopio (ocular: 10x; lente del objetivo: 4x). Cuente y registre los números de celda en los cuatro cuadrados de las esquinas y el centro. Calcule la concentración celular usando la fórmula:
Donde n = el promedio de los números de celda de los cinco cuadrados. - Diluir la suspensión celular a 1 x 105 células/ml. Agregue 100 μL de la suspensión celular por pocillo en una placa de 96 pocillos para sembrar las células. Agregue 100 μL de PBS por pocillo en los pozos sin sembrar.
- Tratar las células con (1) 0.1-150 μM libres BCs, (2) 0.1-150 μM IR783/BC NPs (basado en la concentración BC), (3) 0.1-150 μM BC libre con irradiación de luz, o (4) 0.1-150 μM IR783/BC NPs (basado en la concentración de BC) con irradiación de luz. Incubar las células a 37 °C en una incubadora deCO2 al 5% durante 6 h.
NOTA: Las soluciones libres BC e IR783/BC NP se diluyen de sus respectivas soluciones madre con medio completo. - Después de 6 h de incubación, sustituir el medio que contiene profármacos/nanopartículas por un medio fresco completo. Incubar los grupos de no irradiación 1 y 2 en la oscuridad durante 24 h. Para los grupos 3 y 4, irradiar las células con una lámpara LED de 530 nm (50 mW/cm2) durante 5 min, e incubar durante 24 h.
NOTA: Las placas celulares se colocan en un bloque de espuma para garantizar la misma altura que el fotómetro en el paso 4.1. - Determinar la viabilidad celular con el ensayo de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolio (MTT).
- Después del tratamiento BC o nanopartículas, añadir 10 μL de MTT (10 mg/ml en PBS) a cada pocillo e incubar las placas a 37 °C durante 3 h. Luego, retire el medio y agregue 100 μL de DMSO a cada pocillo. Lea la absorbancia con un lector de microplacas a 490 nm, 570 nm y 630 nm.
- Calcula la viabilidad celular usando la siguiente ecuación:
NOTA: Se realizan cuatro experimentos independientes (n = 4) de cada grupo para el análisis. OD490 puede ser reemplazado por OD570-OD 630 en el cálculo de la viabilidad celular.
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Representative Results
Las NP IR783 / BC se fabricaron con éxito en este estudio utilizando un método de precipitación repentina. Los NPs IR783/BC sintetizados se presentaron como una solución púrpura, mientras que la solución acuosa de IR783 fue azul (Figura 4A). Como se muestra en la Figura 4B, los NP IR783/BC exhibieron un tamaño promedio de aproximadamente 87.22 nm con un índice de polidispersidad (PDI) de 0.089, lo que demuestra una distribución de tamaño estrecha. La carga superficial de los IR783/NPs fue de aproximadamente -29,8 mV (Figura 4C), lo que podría atribuirse a los grupos sulfonato cargados negativamente de IR783. La Figura 4D muestra la estabilidad de los NPs IR783/BC. El tamaño de las nanopartículas se mantuvo en alrededor de 85 nm durante al menos 48 h (en PBS a 37 ° C) después de la fabricación, mientras que su PDI también se mantuvo por debajo de 0,2. No se observaron cambios significativos en la distribución de tamaño de las NP IR783/BC a las 0 h, 24 h y 48 h después de la fabricación (Figura 4E).
La Figura 5A,B muestra la morfología de las NPs IR783/BC antes y después de la irradiación lumínica, respectivamente. Tanto los agregados como los fragmentos pudieron observarse después de la irradiación de la luz, lo que indica la disociación y agregación de las nanopartículas, respectivamente. La figura 5C presenta el cambio en el tamaño de las nanopartículas y su distribución después de 3 min y 5 min de irradiación lumínica. Se observó un aumento de tamaño y una distribución más amplia para las nanopartículas irradiadas. Los perfiles de liberación fotográfica de los NP IR783/BC también se midieron mediante HPLC. Como se muestra en la Figura 5D,E, el profármaco BC fue fotoescindido en 10 min. Mientras tanto, Cb fue liberado con una eficiencia de recuperación de alrededor del 22% en el mismo período.
Los NP IR783/BC mostraron citotoxicidad significativa en células tumorales colorrectales humanas (HCT116) bajo irradiación lumínica a 530 nm en comparación con el grupo sin irradiación (Figura 6). El IC50 de los NP IR783/BC con irradiación ligera (6,62 μM) fue menor que el de los BC libres con irradiación lumínica (9,24 μM), lo que demuestra una mayor eficacia antitumoral in vitro de los NP IR783/BC con irradiación lumínica que la de los BC libres con irradiación lumínica25. La citotoxicidad presentada resultó tanto del Cb liberado como de la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) (Figura suplementaria 1 y Figura suplementaria 2). La mayor citotoxicidad de las NPs IR783/BC bajo irradiación lumínica fue causada principalmente por la absorción celular eficiente de las NPs IR783/BC25.
Figura 1: Formación de NPs IR783/BC. (A) Autoensamblaje y disociación activada por luz de NPs IR783/BC. (B) Esquema de fabricación de NPs IR783/BC por precipitación repentina. Reproducido con permiso25. Derechos de autor 2022, Wiley. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Ruta de síntesis del profármaco BODIPY-Cb (BC). Los derivados de BODIPY se sintetizaron primero a partir de cloruro de acetoxyacetil y 2,4-dimetilpirrol, y luego se conjugaron con Cb. El espectro H-RMN 1del profármaco BC se muestra en la Figura 3 suplementaria. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Configuración de irradiación LED. (A, B) Configuración de la lámpara LED para la medición de irradiancia. (C,D) Configuración de la lámpara LED para la irradiación de IR783/BC NPs. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Caracterización de NPs IR783/BC. (A) Aparición de soluciones libres IR783, BC libre e IR783/BC NP. (B) Distribución del tamaño de los NP IR783/BC. (C) Carga superficial de los NP IR783/BC. (D) Cambio de tamaño de los NP IR783/BC en PBS a 37 °C durante 48 h después de la fabricación. (E) Distribución del tamaño de las NP IR783/BC a las 0 h, 24 h y 48 h después de la fabricación. Reproducido con permiso25. Derechos de autor 2022, Wiley. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Liberación fotográfica de NPs IR783/BC. Imágenes TEM de IR783/BC NPs (A) antes y (B) después de la irradiación de luz. Barra de escala = 100 μm. (C) Distribución del tamaño de IR783/NPs después de 0 min, 3 min y 5 min de irradiación lumínica. (D) Análisis por HPLC de NPs IR783/BC sometidos a una duración creciente de la irradiación lumínica hasta 10 min. (E) Cuantificación de la degradación de BC e IR783 y liberación de Cb (n = 3). Las barras de error representan una desviación estándar. Irradiación de luz: lámpara LED de 530 nm, 50 mW/cm2. Reproducido con permiso25. Derechos de autor 2022, Wiley. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Citotoxicidad de las NPs IR783/BC frente a las células HCT116. Apareció citotoxicidad significativa a concentraciones de BC >1 μM (n = 4). Las barras de error representan una desviación estándar. Se adoptó una prueba t de muestra independiente para determinar la significación estadística de las diferencias. *p < 0,05, **p < 0,01. Irradiación de luz: lámpara LED de 530 nm, 50 mW/cm2. Reproducido con permiso25. Derechos de autor 2022, Wiley. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura suplementaria 1: Mecanismo fotoquímico. (A) Fotoescisión del profármaco BC. (B) Descomposición de IR783. Adaptado con permiso25. Derechos de autor 2022, Wiley. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 2: Perfil de generación de ROS. Generación de ROS de diferentes muestras bajo irradiación lumínica cuantificadas con una sonda verde con sensor de oxígeno singlete (SOSG). Irradiación de luz: lámpara LED de 530 nm, 50 mW/cm2. Adaptado con permiso25. Derechos de autor 2022, Wiley. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria 3: 1espectro H-RMN de BODIPY-Cb. Reproducido con permiso22. Derechos de autor 2022, American Chemical Society. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Este protocolo describe un método de precipitación flash fácil para la fabricación de nanopartículas de colorante profármaco, que ofrece un enfoque simple y conveniente para la formación de nanopartículas. Hay varios pasos críticos en este método. En primer lugar, para todos los pasos de síntesis, fabricación y caracterización, los recipientes como los microtubos deben cubrirse con papel de aluminio para evitar la fotoescisión innecesaria del profármaco BC por la luz ambiental. Además, en la etapa de precipitación repentina, el microtubo que contiene la solución IR-783 debe colocarse de manera estable en el mezclador de vórtice mientras se agrega lentamente la solución de profármaco BC. De esta manera, la solución de profármaco BC (en DMSO) se puede dispersar uniformemente en la solución IR-783. En la etapa de purificación, se utiliza un método de centrifugación diferencial. La primera centrifugación a 2.000 x g se utiliza para eliminar los sólidos de profármaco BC descargados, mientras que la segunda centrifugación a 30.000 x g elimina DMSO e IR783 en el sobrenadante que no están incorporados en las nanopartículas. Las NP IR783/BC pueden recogerse como precipitado y resuspenderse en agua desionizada filtrada.
El autoensamblaje es un método simple y eficiente para la fabricación de nanopartículas. Sin embargo, el método de autoensamblaje debe optimizarse de acuerdo con factores como la hidrofobicidad de los bloques de construcción. En este protocolo, uno de los componentes, IR783, es un colorante soluble en agua que se disuelve en agua. Sin embargo, en algunos casos, todos los componentes pueden ser hidrófobos. Bajo tal circunstancia, deben disolverse en DMSO como el profármaco BC en este protocolo. Se puede usar un estabilizador como 1, 2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-Poly(ethylene glycol) (DSPE-PEG) para ayudar a formar y estabilizar nanopartículas autoensambladas 14,26,27.
La luz tiene una penetración tisular limitada, lo que limita la aplicación de nanopartículas fotoactivables en el uso clínico. Una solución es desarrollar sistemas activables por luz de longitud de onda larga, como la luz roja o infrarroja cercana28. El uso de fibras ópticas para suministrar luz es otra forma de resolver el problema de penetración tisular limitada de la luz para algunas lesiones de enfermedades29. Además, el coensamblaje de componentes se basa principalmente en fuerzas intermoleculares como la interacción hidrofóbica, el apilamiento de π-π y el enlace de hidrógeno, lo que sugiere que este método puede no ser aplicable a todas las moléculas de profármacos y colorantes30. La viabilidad de coensamblar moléculas funcionales como fármacos, profármacos, colorantes, fotosensibilizadores y agentes fototérmicos debe evaluarse mediante el cálculo teórico y la caracterización experimental.
El sistema fotoactivable de administración de fármacos a nanoescala de colorante profármaco tiene varias ventajas. En primer lugar, los colorantes como IR783 pueden descomponerse bajo irradiación de luz, lo que permite posteriormente el desmontaje local y específico de las nanopartículas25. Además, el colorante incorporado puede funcionar como un agente de imagen para monitorear el sistema de administración de fármacos, con su fluorescencia utilizada para rastrear la acumulación y el desmontaje de las nanopartículas. Además, se ha descrito que los colorantes de indocianina con grupos sulfonato son capaces de atacar caveolas en algunos cánceres19, lo que permite la captación celular eficiente de los sistemas de administración de fármacos25. Por lo tanto, los colorantes de indocianina con estructuras similares tienen un gran potencial para su incorporación en tales sistemas de administración de fármacos.
Hasta la fecha, sólo ha habido unas pocas publicaciones sobre la estandarización de las operaciones de fotoactivación de los sistemas de administración de nanofármacos31. Por lo tanto, el protocolo descrito aquí puede servir como una referencia útil para el desarrollo de sistemas de administración de fármacos fotosensibles.
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Disclosures
Se ha presentado una solicitud PCT con el Nº.PCT/CN2021/081262.
Acknowledgments
Reconocemos la asistencia de la Facultad de Medicina Li Ka Shing de la Universidad de Hong Kong. Agradecemos al profesor Chi-Ming Che de la Universidad de Hong Kong por proporcionar la línea celular humana HCT116. Este trabajo fue apoyado por el Programa de Miembros Asociados del Centro Ming Wai Lau para la Medicina Reparadora y el Consejo de Becas de Investigación de Hong Kong (Plan de Carrera Temprana, No. 27115220).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1260 Infinity II HPLC | Agilent Technologies | ||
| 2,4-Dimethyl pyrrole | J&K Scientific | 315305 | |
| 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT) | Gibco | M6494 | |
| 4-Dimethylaminopyridine (4-DMAP) | J&K Scientific | 212279 | |
| 90 mm Petri Dish Clear Treated Sterile | SPL | 11090 | |
| 96-well Tissue Culture Plate Clear Treated Sterile | SPL | 30096 | |
| Acetoxyacetyl chloride | J&K Scientific | 192001 | |
| Boron trifluoride diethyl etherate | J&K Scientific | 921076 | |
| Büchner funnel | AS ONE | 3-6466-01 | |
| Chlorambucil | J&K Scientific | 321407-1G | |
| CM100 Transmission Electron Microscope | Philips | ||
| CombiFlash RF chromatography system | Teledyne ISCO | ||
| Dichloromethane | DUKSAN Pure Chemicals | JT9315-88 | |
| Dimethyl sulfoxide | DUKSAN Pure Chemicals | 2762 | |
| Disposable cuvette | Malvern Panalytical | DTS1070 | Zeta potential measurement |
| Disposable cuvette | Malvern Panalytical | ZEN0040 | |
| Empty Disposable Sample Load Cartridges | Teledyne ISCO | 693873225 | can hold up to 65 g |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270106 | |
| Filtering flask | AS ONE | 3-7089-03 | |
| Hexane | DUKSAN Pure Chemicals | 4198 | |
| Holey carbon film on copper grid | Beijing Zhongjingkeyi Technology Co.,Ltd | BZ10023a | |
| HPLC column (InfinityLab Poroshell 120) | Agilent Technologies | 695975-902T | |
| Integrating sphere photodiode power sensor | Thorlabs | S142C | |
| IR783 | Tokyo Chemical Industry (TCI) Co., Ltd | I1031 | |
| LED | Mightex | LCS-0530-15-11 | |
| LED Driver Control Panel V3.2.0 (Software) | Mightex | ||
| Lithium Hydroxide Anhydrous | TCI | L0225 | |
| Methylmagnesium iodide, 3M solution in diethyl ether | Aladdin | M140783 | |
| N,N-Diisopropyl ethyl amine (DIPEA) | J&K Scientific | 203402 | |
| N,N'-Dicyclohexylcarbodiimide (DCC) | J&K Scientific | 275928 | |
| penicillin–streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate-buffered saline (10×) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| Power and energy meter | Thorlabs | PM100 USB | |
| Rotavapor | BUCHI Rotavapor R300 | ||
| RMPI 1640 | Gibco | 21870076 | |
| Separatory funnel (125 mL) | Synthware | F474125L | |
| Silver Silica Gel Disposable Flash Columns, 40 g | Teledyne ISCO | 692203340 | |
| Sodium sulfate, anhydrous | Alfa Aesar | A19890 | |
| SpectraMax M4 | Molecular Devices LLC | ||
| Tetrahydrofuran (THF), anhydrous | J&K Scientific | 943616 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | |
| Vortex | DLAB Scientific Co., Ltd | MX-S | |
| Zetasizer Nano ZS90 | Malvern Instrument |
References
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