Summary
Detta protokoll beskriver tillverkning och karakterisering av en fotoresponsiv prodrug-dye nanoassembly. Metoden för läkemedelsfrisättning från nanopartiklarna genom ljusutlöst demontering, inklusive ljusbestrålningsinställningen, beskrivs uttryckligen. Läkemedlen som frigjordes från nanopartiklarna efter ljusbestrålning uppvisade utmärkta anti-spridningseffekter på humana kolorektala tumörceller.
Abstract
Självmontering är en enkel men pålitlig metod för att konstruera läkemedelsleveranssystem i nanoskala. Fotoaktiverbara prodroger möjliggör kontrollerbar läkemedelsfrisättning från nanobärare på målplatser som moduleras av ljusbestrålning. I detta protokoll presenteras en enkel metod för tillverkning av fotoaktiverbara prodrug-dye nanopartiklar via molekylär självmontering. Procedurerna för prodrogsyntes, nanopartikeltillverkning, fysisk karakterisering av nanoenheten, fotoklyvningsdemonstration och cytotoxicitetsverifiering in vitro beskrivs i detalj. En fotoklyvbar bor-dipyrromethen-klorambucil (BC) prodrug syntetiserades först. BC och ett nära infrarött färgämne, IR-783, vid ett optimerat förhållande, kunde självmontera till nanopartiklar (IR783 / BC NPs). De syntetiserade nanopartiklarna hade en genomsnittlig storlek på 87, 22 nm och en ytladdning på -29, 8 mV. Nanopartiklarna demonterades vid ljusbestrålning, vilket kunde observeras genom elektronisk mikroskopi. Fotoklyvningen av BC slutfördes inom 10 minuter, med en återvinningseffektivitet på 22% för klorambucil. Nanopartiklarna uppvisade förbättrad cytotoxicitet vid ljusbestrålning vid 530 nm jämfört med icke-bestrålade nanopartiklar och bestrålad fri BC-prodrug. Detta protokoll ger en referens för konstruktion och utvärdering av fotoresponsiva läkemedelsleveranssystem.
Introduction
Kemoterapi är en vanlig cancerbehandling som använder cytotoxiska medel för att döda cancerceller och därmed hämmar tumörtillväxt1. Patienter kan dock drabbas av biverkningar såsom kardiotoxicitet och levertoxicitet på grund av off-target absorption av kemoterapiläkemedlen 2,3,4. Därför är lokal läkemedelsleverans genom spatiotemporal kontroll av läkemedelsfrisättning / aktivering i tumörer avgörande för att minimera läkemedelsexponering i normala vävnader.
Prodroger är kemiskt modifierade läkemedel som uppvisar minskad toxicitet i normala vävnader samtidigt som de behåller sin verkan i sjuka lesioner vid aktivering 5,6. Prodroger kan reagera på en mängd olika stimuli, såsom pH7,8, enzymer9,10, ultraljud 11,12, värme 13 och ljus14,15,1 6, och släppa sina moderläkemedel specifikt i lesionerna. Ändå uppvisar många prodroger inneboende nackdelar, såsom dålig löslighet, felaktig absorptionshastighet och tidig metabolisk förstörelse, vilket kan begränsa deras utveckling17. I detta sammanhang erbjuder bildandet av prodrug nanoassemblies fördelar som minskade biverkningar, in situ läkemedelsfrisättning, bättre retention och kombinationen av behandling och avbildning, vilket indikerar stor applikationspotential för dessa nanosammansättningar. Många prodrug nanoassemblies har utvecklats för sjukdomsbehandling, inklusive doxorubicin prodrug nanospheres, curcumin prodrug miceller och camptothecin prodrug nanofibrer18.
I detta protokoll presenterar vi en enkel metod för framställning av prodrug-dye nanoassemblies som uppvisar högt prodroginnehåll, god vattendispergerbarhet, långsiktig stabilitet och känslig svarsförmåga. IR783 är ett vattenlösligt nära infrarött färgämne som kan fungera som stabilisator för nanosammansättningarna19. Den andra komponenten i nanosammansättningen är bor-dipyrromethen-klorambucil (BODIPY-Cb, BC), en prodrog som utformades av två huvudskäl. Eftersom klorambucil (Cb) uppvisar systemisk toxicitet in vivo kan prodrogformen minska dess toxicitet20. BC-prodrogen kan fotoklyvas med 530 nm ljusbestrålning riktad mot sjukdomsskador, vilket möjliggör lokal frisättning av Cb. Å andra sidan är Cb benägen för hydrolys i vattenhaltiga miljöer och kan skyddas genom att omvandla den till en prodrogform21. Således förväntades sammonteringen av BC-prodrogen och IR-783-färgämnet bilda ett stabilt och effektivt nanosystem för läkemedelsleverans (figur 1A). Denna prodrug-dye nanoassembly förbättrar dispergerbarheten och stabiliteten hos prodrugmolekylerna, vilket tyder på dess potential för tillämpning i ljuskontrollerbar läkemedelsleverans. Fotoklyvningen av BC-prodrogen möjliggör demontering av nanopartiklar och ljuskontrollerad frisättning av Cb i lesionerna (kompletterande figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Syntes av bor-dipyrromethen-klorambucil (BC) prodrug (figur 2)22
- Syntes av BODIPY-OAc
- Väg upp 1,903 g 2,4-dimetylpyrrol och lös den i 20 ml vattenfri diklormetan (DCM) i en rundkolv i kväveatmosfär. Väg 1,638 g acetoxy acetylklorid och tillsätt det droppvis i lösningen. Rör om i 10 minuter vid rumstemperatur och återspäd sedan lösningen i 1 timme vid 40 °C.
- Kyl blandningen till rumstemperatur. Väg upp 5,170 g N,N-diisopropyletylamin (DIPEA) och tillsätt det droppvis i blandningen under omrörning. Efter 30 minuter ska du väga upp 5,677 g bortrifluoriddietyleter (BF3· OEt2), tillsätt den droppvis i lösningen och rör om i ytterligare 30 minuter.
- Tillsätt 10 g kiselgel (200–400 mesh) i blandningen och avlägsna lösningsmedlet genom rotationsindunstning vid 45 °C. Stoppa avdunstningen när kiselgelen återgår till torrt pulver.
- Lägg till en fritta i botten av en patron (se Materialförteckning). Fyll kiselgelen (från steg 1.1.3) i cylinderampullen och tillsätt sedan ytterligare en fritta i cylinderampullen på toppen av den fyllda gelén.
- Fäst patronen i kragen som är ansluten till flashkromatografisystemet (se materialförteckning) och vrid den för att låsa den. Installera patronen ovanpå sexvägsventilen i flashkromatografisystemet och installera en blixtkolonn (se materialtabell) under ventilen.
- Starta kromatografiinstrumentet och ställ in 515 nm och 365 nm som detektionsvåglängder. Utför eluering med 4/3 (v/v) hexan/DCM. Samla upp elueringsfraktionerna när 515 nm-signalen visas.
- Avlägsna lösningsmedlet från de uppsamlade fraktionerna genom rotationsindunstning vid 40 °C tills inget mer lösningsmedel samlas upp i uppsamlingskolven med lösningsmedel. Placera den fasta produkten i en vakuumtorkkammare över natten för att avlägsna resten av lösningsmedlet.
- Syntes av BODIPY-OH
- Väg upp 1,120 g BODIPY-OAc (syntetiserad i steg 1.1) och lös upp den i 70 ml tetrahydrofuran (THF) vid rumstemperatur, helt täckt med folie. Tillsätt 70 ml 0,1 M LiOH vattenlösning droppvis i BODIPY-OAc-lösningen.
- Rör om blandningen i 30 minuter och avlägsna lösningsmedlet vid 40 °C genom rotationsindunstning tills inget mer lösningsmedel samlas upp i uppsamlingskolven med lösningsmedel. Placera återstoden i en vakuumtorkkammare över natten för att avlägsna vatten.
- Lös upp den torra återstoden i 30 ml DCM och tillsätt 10 g kiselgel i lösningen. Avlägsna lösningsmedlet genom rotationsindunstning vid 40 °C. Stoppa avdunstningen när kiselgelen återgår till torrt pulver.
- Rena produkten BODIPY-OH genom kolonnkromatografi enligt steg 1.1.4 till 1.1.6 med enbart DCM som elueringsmedel.
- Jämför fraktioner som samlats in vid olika elueringstidpunkter med en THF-lösning av BODIPY-OAc på tunnskiktskromatografi (TLC) och identifiera produkten23.
- Spot 3–4 μL av den eluerade fraktionen och BODIPY-OAc-lösningen separat på ena kanten av en TLC-platta på samma höjd. Placera TLC-plattan i en glaskammare som innehåller 1 ml DCM, sänk ner den prickiga kanten i DCM-lösningsmedlet men med de två fläckarna ur lösningsmedlet.
- Ta ut TLC-plattan när DCM-lösningsmedlet når över halva plattans höjd. Välj den eluerade fraktionen med en TLC-punkt på en annan höjd än BODIPY-OAc-punkten.
- Avlägsna lösningsmedlet genom rotationsindunstning vid 40 °C (steg 1.1.7) så att produkten erhålls BODIPY-OH.
- Syntes av BODIPY-(Me)2-OH
- Väg upp 313 mg BODIPY-OH och lös upp det i 35 ml vattenfri dietyleter i mörker och i kväveatmosfär. Tillsätt 3,75 ml metylmagnesiumjodid (3 M i dietyleter) droppvis i lösningen och rör om i 3 timmar vid rumstemperatur.
- Släck reaktionen genom att tillsätta 3,5 ml vatten droppvis.
- Extrahera blandningen med DCM och vatten.
- Överför blandningen till en 125 ml separatorstratt. Tillsätt 20 ml DCM i blandningen.
- Stäng locket på separatorstratten. Luta tratten vid cirka 45° och skaka tratten något. Öppna locket för att tömma. Upprepa detta steg 3 gånger och låt stå i 3 minuter.
- Öppna bottenventilen och samla den nedre organiska fasen i en bägare.
- Tillsätt 30 ml DCM till vattenfasen. Upprepa extraktionen (steg 1.3.3.2 och 1.3.3.3) 3 gånger med 30 ml DCM varje gång.
- Tillsätt 10 g fast Na2SO4 i den uppsamlade organiska fasen för att torka den organiska fasen över natten.
- Länka en filterkolv till en vakuumpump med ett gummirör. Lägg en bit filterpapper på Büchner-tratten och sätt in tratten i toppen av kolven. Blöt filterpapperet med 1 ml DCM, överför blandningen till tratten och slå på vakuumpumpen. Samla upp den organiska lösningen i kolven.
- Tillsätt 10 g kiselgel i den organiska lösningen. Avlägsna det organiska lösningsmedlet genom rotationsindunstning vid 40 °C tills kiselgelen återgår till torrt pulver. Rena produkten BODIPY-(Me)2-OH genom kolonnkromatografi (steg 1.1.4-1.1.6) med hexan/DCM = 1/1 (v/v) som elueringsmedel.
- Välj de eluerade fraktioner som innehåller produkten med TLC-analys enligt beskrivningen i steg 1.2.5 (TLC-punkt på en annan höjd än BODIPY-OH). Avlägsna lösningsmedlet genom rotationsindunstning vid 40 °C så att produkten erhålls enligt beskrivningen i steg 1.1.7.
- Syntes av BODIPY-(Me)2-I 2-OH
- Väg upp 41 mg BODIPY-(Me)2-OH och lös upp det i 2,5 ml vattenfri THF i mörker under kväveatmosfär. Väg upp 74 mg N-jodsuccinimid och lös upp den i 1 ml vattenfri THF.
- Tillsätt N-jodosuccinimidlösningen droppvis i BODIPY-(Me)2-OH-lösningen. Efter omrörning i 3,5 h vid rumstemperatur, avlägsna lösningsmedlet genom rotationsindunstning vid 40 °C tills inget mer lösningsmedel samlas upp i uppsamlingskolven för lösningsmedel på rotationsindunstaren.
- Lös upp återstoden i 10 ml DCM och tvätta den 3 gånger med 30 ml vatten varje gång, enligt beskrivningen i steg 1.3.3. Torka den organiska fasen medNa2SO4 (steg 1.3.4 och 1.3.5). Avlägsna lösningsmedlet genom rotationsindunstning vid 40 °C (steg 1.1.7) så att produkten erhålls BODIPY-(Me)2-I2-OH.
- Syntes av BODIPY-Cb
- Väg upp 85 mg klorambucil och lös upp det i 2 ml vattenfri DCM i mörker under kväveatmosfär. Väg upp 69 mg N,N'-dicyklohexylkarbodiimid och lös upp det i 1 ml vattenfri DCM. Tillsätt den droppvis i klorambucillösningen under omrörning i 10 minuter.
- Lös 1,7 mg 4-dimetylaminopyridin i 0,5 ml vattenfri DCM. Tillsätt denna lösning i blandningen och rör om i 10 minuter vid rumstemperatur. Tillsätt sedan 73 mg BODIPY-(Me)2-I 2-OH upplöst i 2 ml vattenfri DCM och rör om i 2 timmar.
- Tillsätt 10 g kiselgel i blandningen och avlägsna lösningsmedlet genom roterande indunstning vid 40 °C. Stoppa avdunstningen när kiselgelen återgår till torrt pulver. Rena produkten BODIPY-Cb med kolonnkromatografi (steg 1.1.4 till 1.1.6, 540 nm och 365 nm signalvåglängd) med hexan/DCM = 7/3 (v/v) som elueringsmedel.
- Välj de eluerade fraktioner som innehåller produkten som skiljer sig från BODIPY-(Me)2-I 2-OH med TLC-analys (steg 1.2.5). Avlägsna lösningsmedlet genom rotationsindunstning vid 40 °C (steg 1.1.7) så att produkten BODIPY-Cb erhålls.
2. Beredning av IR783/BC NPs med flashfällningsmetoden
- Väg upp 10 mg BC-prodrug (BODIPY-Cb) och lös upp den i 1 ml DMSO i ett 1,5 ml mikrorör för att erhålla en 10 mg/ml stamlösning. Täck BC-lösningen med folie.
- Bered 300 μL 0,4 mg/ml IR-783 i filtrerat avjoniserat vatten i ett 1,5 ml mikrorör. Placera detta mikrorör på en virvelblandare vid 1 500 rpm.
- Tillsätt 20 μL BC-lösning i DMSO till IR-783-lösningen under 10 s med konstant hastighet med en 20 μL pipett. Pipettspetsens ände ska vidröra mikrorörets innervägg (figur 1B).
- Håll mikroröret på virvelblandaren i ytterligare 30 s för att få IR783 / BC NP-lösningen. Placera sedan nanopartikellösningen på ett ställ helt täckt med folie.
- Centrifugera den resulterande IR783/BC NP-lösningen i 10 minuter vid 2 000 x g och 4 °C för att avlägsna ballast. Samla supernatanten och lämna ~ 20 μL i röret för att undvika att störa pelleten. Kassera pelleten.
- Centrifugera supernatanten två gånger i 30 minuter vid 30 000 x g och 4 °C och samla upp nanopartikelfällningen från båda centrifugeringarna. Resuspendera nanopartiklarna i 300 μL 1x PBS.
OBS: När den hydrofoba BC-prodrogen i DMSO dispergeras i vatten med virvelning, löses DMSO av vatten, och prodrogmolekylerna tenderar att bilda nanoskala sammansättningar för att hålla sig stabila under den lokala övermättnadssituationen24. - Kvantifiera innehållet av IR-783 och BC med vätskekromatografi med hög prestanda (HPLC) med hjälp av elueringsmetoden som visas i tabell 1.
HPLC-provet framställs genom att blanda lika stora volymer nanopartikellösning och acetonitril. Insprutningsvolymen är 20 μl. Detektionsvåglängden för klorambucil och BC-prodrug är 260 nm och detektionsvåglängden för IR783 är 783 nm. HPLC-kolonnen är en analytisk C18-kolonn på 4,6 mm (innerdiameter) x 100 mm (längd), med en partikelstorlek på 2,7 μm och en porstorlek på 120 å. - Beräkna prodroginkapslingseffektiviteten (EE%) och lastkapaciteten (LC%) enligt följande ekvationer:
| Tid (min) | Acetonitril (%) | Vatten (%) |
| 0 | 20 | 80 |
| 5 | 20 | 80 |
| 30 | 95 | 5 |
| 35 | 95 | 5 |
Tabell 1: HPLC-metod för kvalitativ och kvantitativ analys av blockkedjeprodrog och dess fotoklyvning. Reproducerad med tillstånd25. Upphovsrätt 2022, Wiley.
3. Karakterisering av IR783/BC NP
- Mät den genomsnittliga storleken på IR783/BC NPs med ett DLS-instrument (dynamic light scattering) (se Materialförteckning). Tillsätt 200 μL IR783/BC NP-lösning i en kyvett och sätt in kyvetten i hållaren för mätning. Ställ in mättypen som "storlek" och mättemperaturen som 25 °C. Utför tre mätningar med en varaktighet på 20 s för varje mätning.
- Mät ytladdningen hos IR783/BC NP med DLS-instrumentet med en zetapotentialtestkyvett.
- Späd 25 μL IR783/BC NP-lösning med 725 μL avjoniserat vatten i ett 1,5 ml mikrorör och tillsätt lösningen i en zetapotentialtestkyvett. Placera kyvetten i provspåret. Täck provspåret.
- Ställ in mättypen som "zeta-potential" och mättemperaturen som 25 °C. Utför 10 mätningar.
- Förbered proverna för transmissionselektronmikroskopi (TEM). Tillsätt 10 μL IR783/BC NP-lösning på en bit hålig kolfilm på ett koppargaller (300 mesh) och avlägsna 7 μl. Låt 3 μl lösning ligga kvar på filmen över natten för automatisk avdunstning.
OBS: Genom att tillsätta 10 μL av NP-lösningen följt av avlägsnandet av 7 μL kan droppen täcka ett bredare område på filmen.
4. Fotoaktivering av IR783/BC NPs
- Sätt upp en LED-lampa (530 nm; se Materialförteckning) med ett järnstativ så att ljuset vetter direkt mot manövergolvet. Placera en integrerande sfärfotodiodfotometer (se materialförteckning) direkt under LED-lampan.
OBS: För att förhindra påverkan av miljöljus utförs alla ljusbestrålningsexperiment i ett mörkrum. - Slå på LED-lampan och öppna fotometerns lock. Registrera bestrålningen och ställ in lampparametrarna med tillhörande programvara (se Materialförteckning). Justera ingångsströmmen (mA) för att ställa in bestrålningen som 50 mW/cm2.
OBS: Bestrålningen påverkas också av avståndet mellan LED-lampan och fotometern. I den inställning som används här (figur 3A,B) är avståndet fastställt till 5 cm. - Späd IR783/BC NP-lösningen med avjoniserat vatten till 50 μM baserat på BC-koncentration. Tillsätt 200 μL av IR783/BC NP-lösningen i ett 1,5 ml mikrorör. Placera röret på ett skumblock med en spårpassande storlek på mikroröret och samma höjd som fotometern i steg 4.1 (figur 3C, D).
- Öppna locket på röret. Slå på LED-lampan och bestråla nanopartikellösningen i 1, 2, 3, 5, 7 och 10 minuter.
- Kvantifiera BC-förbrukning och Cb-utsläpp med HPLC efter ljusbestrålning. Beräkna procentandelen återstående BC- och Cb-frisättning med hjälp av följande ekvationer:
5. Testning av cytotoxicitet hos IR783/BC NPs med och utan ljusbestrålning
- Odling HCT116-celler (human kolorektal tumörcellinje) i RPMI 1640-medium innehållande 10% fetalt bovint serum och 1% penicillin-streptomycin (komplett medium) i en 5% CO 2-atmosfär vid 37 ° C (~2 x 106 celler per maträtt i en 90 mm cellodlingsskål). Subkultur rutinmässigt cellerna var 2-3: e dag.
HCT116 är en human koloncellinje. Jämfört med andra cancerceller såsom HeLa-, MCF7- och A549-celler uttrycker HCT-116-celler en högre nivå av caveolin-125, som kan riktas mot IR783 och förbättra cellulärt upptag av IR783 / BC NP. - Platta HCT116-cellerna i 96-brunnsplattor med RPMI 1640 komplett medium med en densitet av 104 celler per brunn.
- Aspirera mediet från odlingsskålen när cellflödet överstiger 50%. Tvätta cellerna med 1x PBS och ta bort PBS. Tillsätt 1 ml 0,25% trypsinlösning och inkubera vid 37 °C i en 5% CO2-inkubator .
- Efter 3 minuter, tillsätt 2 ml komplett medium för att släcka trypsinsmältningen. Återsuspendera cellerna, överför cellsuspensionen till ett 15 ml centrifugeringsrör och centrifugera vid 300 x g i 3 minuter. Kassera supernatanten och suspendera cellpelleten igen i 1 ml komplett medium.
- Späd 10 μl av cellsuspensionen till 200 μl med ett komplett medium. Placera 10 μL på en hemocytometer och täck den med ett täckglas.
- Observera hemocytometern under ett mikroskop (okular: 10x; objektivlins: 4x). Räkna och registrera cellnumren vid de fyra hörnrutorna och mitten. Beräkna cellkoncentrationen med formeln:
Där n = medelvärdet av cellnumren för de fem rutorna. - Späd cellsuspensionen till 1 x 105 celler/ml. Tillsätt 100 μL av cellsuspensionen per brunn i en 96-brunnsplatta för att fröa cellerna. Tillsätt 100 μL PBS per brunn i de osådda brunnarna.
- Behandla cellerna med (1) 0,1-150 μM fri BC, (2) 0,1-150 μM IR783/BC NP (baserat på BC-koncentration), (3) 0,1-150 μM fri BC med ljusbestrålning, eller (4) 0,1-150 μM IR783/BC NPs (baserat på BC-koncentration) med ljusbestrålning. Inkubera cellerna vid 37 °C i en 5 %CO2-inkubator i 6 timmar.
OBS: De fria BC- och IR783/BC NP-lösningarna späds ut från sina respektive stamlösningar med komplett medium. - Efter 6 timmars inkubation, ersätt prodrogen/nanopartikelinnehållande medium med färskt komplett medium. Inkubera icke-bestrålningsgrupperna 1 och 2 i mörker i 24 timmar. För grupperna 3 och 4, bestråla cellerna med en 530 nm LED-lampa (50 mW/cm2) i 5 minuter och inkubera i 24 timmar.
OBS: Cellplattor placeras på ett skumblock för att säkerställa samma höjd som fotometern i steg 4.1. - Bestäm cellviabiliteten med 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT)-test.
- Efter BC- eller nanopartikelbehandlingen tillsätts 10 μL MTT (10 mg/ml i PBS) till varje brunn och inkubera plattorna vid 37 °C i 3 timmar. Ta sedan bort mediet och tillsätt 100 μL DMSO till varje brunn. Avläs absorbansen med en mikroplattläsare vid 490 nm, 570 nm och 630 nm.
- Beräkna cellviabiliteten med följande ekvation:
OBS: Fyra oberoende experiment (n = 4) av varje grupp utförs för analys. OD490 kan ersättas med OD570-OD 630 vid beräkning av cellviabilitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
IR783/BC NPs tillverkades framgångsrikt i denna studie med hjälp av en flashfällningsmetod. De syntetiserade IR783/BC NP presenterades som en lila lösning, medan den vattenhaltiga lösningen av IR783 var blå (figur 4A). Som visas i figur 4B uppvisade IR783/BC NP en genomsnittlig storlek på cirka 87,22 nm med ett polydispersitetsindex (PDI) på 0,089, vilket visar en smal storleksfördelning. Ytladdningen för IR783/NP var cirka -29,8 mV (figur 4C), vilket kan hänföras till de negativt laddade sulfonatgrupperna i IR783. Figur 4D visar stabiliteten hos IR783/BC NP. Nanopartiklarnas storlek bibehölls vid cirka 85 nm i minst 48 timmar (i PBS vid 37 °C) efter tillverkning, medan dess PDI också förblev mindre än 0,2. Ingen signifikant förändring observerades i storleksfördelningen av IR783/BC NP vid 0 timmar, 24 timmar och 48 timmar efter tillverkning (figur 4E).
Figur 5A,B visar morfologin hos IR783/BC NP före respektive efter ljusbestrålning. Både aggregat och fragment kunde observeras efter ljusbestrålning, vilket indikerar dissociation respektive aggregering av nanopartiklarna. Figur 5C visar förändringen i nanopartikelstorlek och dess fördelning efter 3 min och 5 min ljusbestrålning. En ökad storlek och bredare fördelning observerades för de bestrålade nanopartiklarna. Fotoreleaseprofilerna för IR783/BC NPs mättes också med HPLC. Som visas i figur 5D,E fotoklyvades prodrog BC på 10 minuter. Samtidigt släpptes Cb med en återvinningseffektivitet på cirka 22% inom samma period.
IR783/BC NPs uppvisade signifikant cytotoxicitet på humana kolorektala tumörceller (HCT116) under ljusbestrålning vid 530 nm jämfört med icke-bestrålningsgruppen (figur 6). IC50 för IR783/BC NP med ljusbestrålning (6,62 μM) var lägre än för fri BC med ljusbestrålning (9,24 μM), vilket visar en högre antitumöreffekt in vitro av IR783/BC NP med ljusbestrålning än för fri BC med ljusbestrålning25. Den presenterade cytotoxiciteten berodde på både frisatt Cb och genererade reaktiva syreradikaler (ROS) (kompletterande figur 1 och kompletterande figur 2). Den högre cytotoxiciteten hos IR783/BC NPs under ljusbestrålning orsakades huvudsakligen av det effektiva cellulära upptaget av IR783/BC NPs25.
Figur 1: Bildning av IR783/BC NPs. (A) Självmontering och ljusutlöst dissociation av IR783/BC NPs. (B) Tillverkningsschema för IR783/BC NPs genom blixtfällning. Reproducerad med tillstånd25. Upphovsrätt 2022, Wiley. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Syntesväg för prodrogen BODIPY-Cb (BC). BODIPY-derivat syntetiserades först från acetoxiacetylklorid och 2,4-dimetylpyrrol och konjugerades sedan med Cb. 1H-NMR-spektrum av BC-prodrogen visas i kompletterande figur 3. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Inställning av LED-bestrålning . (A,B) LED-lampinställning för strålningsmätning. (C,D) LED-lampinställning för bestrålning av IR783 / BC NP. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Karakterisering av IR783/BC NPs. (A) Utseende av fria IR783, fri BC och IR783/BC NP-lösningar. (B) Storleksfördelning av IR783/BC NP. (C) Ytladdning av IR783/BC NP. (D) Förändring av storleken på IR783/BC NP i PBS vid 37 °C under 48 timmar efter tillverkningen. (E) Storleksfördelning av IR783/BC NP vid 0 timmar, 24 timmar och 48 timmar efter tillverkning. Reproducerad med tillstånd25. Upphovsrätt 2022, Wiley. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Fotorelease av IR783/BC NPs. TEM-bilder av IR783/BC NP (A) före och (B) efter ljusbestrålning. Skalstapel = 100 μm. (C) Storleksfördelning av IR783/NP efter 0 min, 3 min och 5 min ljusbestrålning. (D) HPLC-analys av IR783/BC NP som utsätts för ökande varaktighet av ljusbestrålning fram till 10 min. (E) Kvantifiering av BC- och IR783-nedbrytning och Cb-frisättning (n = 3). Felstaplar representerar standardavvikelse. Ljusbestrålning: 530 nm LED-lampa, 50 mW/cm2. Reproducerad med tillstånd25. Upphovsrätt 2022, Wiley. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Cytotoxicitet hos IR783/BC NP mot HCT116-celler. Signifikant cytotoxicitet uppträdde vid BC-koncentrationer >1 μM (n = 4). Felstaplar representerar standardavvikelse. Ett oberoende urval t-test antogs för att bestämma den statistiska signifikansen av skillnader. *p < 0,05, **p < 0,01. Ljusbestrålning: 530 nm LED-lampa, 50 mW/cm2. Reproducerad med tillstånd25. Upphovsrätt 2022, Wiley. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande figur 1: Fotokemisk mekanism. (A) Fotoklyvning av BC-prodrug. (B) Nedbrytning av IR783. Anpassad med tillstånd25. Upphovsrätt 2022, Wiley. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande bild 2: ROS-genereringsprofil. ROS-generering av olika prover under ljusbestrålning kvantifierad med en singlet syresensor grön (SOSG) sond. Ljusbestrålning: 530 nm LED-lampa, 50 mW/cm2. Anpassad med tillstånd25. Upphovsrätt 2022, Wiley. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 3: 1H-NMR-spektrum för BODIPY-Cb. Omtryckt med tillstånd22. Upphovsrätt 2022, American Chemical Society. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver en enkel flashutfällningsmetod för tillverkning av prodrug-dye nanopartiklar, vilket erbjuder ett enkelt och bekvämt tillvägagångssätt för nanopartikelbildning. Det finns flera kritiska steg i denna metod. För det första, för alla steg av syntes, tillverkning och karakterisering, bör behållare som mikrorör täckas med folie för att undvika onödig fotoklyvning av BC-prodrogen genom miljöljus. I flashfällningssteget bör dessutom mikroröret innehållande IR-783-lösningen placeras stabilt på virvelblandaren medan BC-prodroglösningen långsamt tillsätts. På så sätt kan BC-prodroglösningen (i DMSO) dispergeras jämnt i IR-783-lösningen. I reningssteget används en differentiell centrifugeringsmetod. Den första centrifugeringen vid 2 000 x g används för att avlägsna de obelastade BC-prodrogfasta ämnena, medan den andra centrifugeringen vid 30 000 x g avlägsnar DMSO och IR783 i supernatanten som inte ingår i nanopartiklarna. IR783/BC NP kan sedan samlas upp som fällning och återsuspenderas i filtrerat avjoniserat vatten.
Självmontering är en enkel och effektiv metod för tillverkning av nanopartiklar. Självmonteringsmetoden måste dock optimeras enligt faktorer som byggstenarnas hydrofobicitet. I detta protokoll är en av komponenterna, IR783, ett vattenlösligt färgämne som löses i vatten. I vissa fall kan dock alla komponenter vara hydrofoba. Under sådana omständigheter bör de lösas i DMSO som BC-prodrogen i detta protokoll. En stabilisator såsom 1, 2-Distearoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamin-Poly(etylenglykol) (DSPE-PEG) kan användas för att hjälpa till att bilda och stabilisera självmonterade nanopartiklar 14,26,27.
Ljus har begränsad vävnadspenetration, vilket begränsar tillämpningen av fotoaktiverbara nanopartiklar i klinisk användning. En lösning är att utveckla ljusaktiveringsbara system med lång våglängd, såsom rött eller nära infrarött ljus28. Att använda optiska fibrer för att leverera ljus är ett annat sätt att lösa det begränsade vävnadspenetrationsproblemet med ljus för vissa sjukdomsskador29. Dessutom bygger sammonteringen av komponenter huvudsakligen på intermolekylära krafter såsom hydrofob interaktion, π-π-stapling och vätebindning, vilket tyder på att denna metod kanske inte är tillämplig på alla prodrog- och färgämnesmolekyler30. Möjligheten att sammontera funktionella molekyler som läkemedel, prodrugs, färgämnen, fotosensibilisatorer och fototermiska medel måste utvärderas genom teoretisk beräkning och experimentell karakterisering.
Det fotoaktiverbara prodrug-dye nanoskala drug delivery-systemet har flera fördelar. För det första kan färgämnen som IR783 sönderdelas under ljusbestrålning, vilket möjliggör lokal och specifik demontering av nanopartiklarna25. Dessutom kan det införlivade färgämnet fungera som ett bildmedel för övervakning av läkemedelsleveranssystemet, med dess fluorescens som används för att spåra ackumulering och demontering av nanopartiklarna. Dessutom har indocyaninfärgämnen med sulfonatgrupper rapporterats kunna rikta sig mot caveolae i vissa cancerformer19, vilket möjliggör effektivt cellulärt upptag av läkemedelsleveranssystemen25. Således har indocyaninfärgämnen med liknande strukturer stor potential för införlivande i sådana läkemedelsleveranssystem.
Det har hittills bara gjorts ett fåtal publikationer om standardisering av operationer för fotoaktivering av nano-läkemedelsleveranssystem31. Således kan protokollet som beskrivs här fungera som en användbar referens för att utveckla fotoresponsiva läkemedelsleveranssystem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
En PCT-ansökan har lämnats in till No.PCT/CN2021/081262.
Acknowledgments
Vi erkänner hjälp från University of Hong Kong Li Ka Shing Faculty of Medicine Faculty Core Facility. Vi tackar professor Chi-Ming Che vid University of Hong Kong för att ha tillhandahållit den humana HCT116-cellinjen. Detta arbete stöddes av Ming Wai Lau Center for Reparative Medicine Associate Member Program och Research Grants Council of Hong Kong (Early Career Scheme, No. 27115220).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1260 Infinity II HPLC | Agilent Technologies | ||
| 2,4-Dimethyl pyrrole | J&K Scientific | 315305 | |
| 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT) | Gibco | M6494 | |
| 4-Dimethylaminopyridine (4-DMAP) | J&K Scientific | 212279 | |
| 90 mm Petri Dish Clear Treated Sterile | SPL | 11090 | |
| 96-well Tissue Culture Plate Clear Treated Sterile | SPL | 30096 | |
| Acetoxyacetyl chloride | J&K Scientific | 192001 | |
| Boron trifluoride diethyl etherate | J&K Scientific | 921076 | |
| Büchner funnel | AS ONE | 3-6466-01 | |
| Chlorambucil | J&K Scientific | 321407-1G | |
| CM100 Transmission Electron Microscope | Philips | ||
| CombiFlash RF chromatography system | Teledyne ISCO | ||
| Dichloromethane | DUKSAN Pure Chemicals | JT9315-88 | |
| Dimethyl sulfoxide | DUKSAN Pure Chemicals | 2762 | |
| Disposable cuvette | Malvern Panalytical | DTS1070 | Zeta potential measurement |
| Disposable cuvette | Malvern Panalytical | ZEN0040 | |
| Empty Disposable Sample Load Cartridges | Teledyne ISCO | 693873225 | can hold up to 65 g |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270106 | |
| Filtering flask | AS ONE | 3-7089-03 | |
| Hexane | DUKSAN Pure Chemicals | 4198 | |
| Holey carbon film on copper grid | Beijing Zhongjingkeyi Technology Co.,Ltd | BZ10023a | |
| HPLC column (InfinityLab Poroshell 120) | Agilent Technologies | 695975-902T | |
| Integrating sphere photodiode power sensor | Thorlabs | S142C | |
| IR783 | Tokyo Chemical Industry (TCI) Co., Ltd | I1031 | |
| LED | Mightex | LCS-0530-15-11 | |
| LED Driver Control Panel V3.2.0 (Software) | Mightex | ||
| Lithium Hydroxide Anhydrous | TCI | L0225 | |
| Methylmagnesium iodide, 3M solution in diethyl ether | Aladdin | M140783 | |
| N,N-Diisopropyl ethyl amine (DIPEA) | J&K Scientific | 203402 | |
| N,N'-Dicyclohexylcarbodiimide (DCC) | J&K Scientific | 275928 | |
| penicillin–streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate-buffered saline (10×) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| Power and energy meter | Thorlabs | PM100 USB | |
| Rotavapor | BUCHI Rotavapor R300 | ||
| RMPI 1640 | Gibco | 21870076 | |
| Separatory funnel (125 mL) | Synthware | F474125L | |
| Silver Silica Gel Disposable Flash Columns, 40 g | Teledyne ISCO | 692203340 | |
| Sodium sulfate, anhydrous | Alfa Aesar | A19890 | |
| SpectraMax M4 | Molecular Devices LLC | ||
| Tetrahydrofuran (THF), anhydrous | J&K Scientific | 943616 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | |
| Vortex | DLAB Scientific Co., Ltd | MX-S | |
| Zetasizer Nano ZS90 | Malvern Instrument |
References
- Chabner, B. A., Roberts, T. G. Chemotherapy and the war on cancer. Nature Reviews Cancer. 5 (1), 65-72 (2005).
- Monsuez, J. -J., Charniot, J. -C., Vignat, N., Artigou, J. -Y.
- Floyd, J., Mirza, I., Sachs, B., Perry, M. C.
- Bar-Joseph, H., Stemmer, S. M., Tsarfaty, I., Shalgi, R., Ben-Aharon, I. Chemotherapy-induced vascular toxicity-real-time in vivo imaging of vessel impairment. Journal of Visualized Experiments. (95), e51650 (2015).
- Denny, W. A.
- Kastrati, I., Delgado-Rivera, L., Georgieva, G., Thatcher, G. R. J., Frasor, J. Synthesis and characterization of an aspirin-fumarate prodrug that inhibits NFκB activity and breast cancer stem cells. Journal of Visualized Experiments. (119), e54798 (2017).
- Mao, J., et al. A simple dual-pH responsive prodrug-based polymeric micelles for drug delivery. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (27), 17109-17117 (2016).
- Li, S. -Y., et al. A pH-responsive prodrug for real-time drug release monitoring and targeted cancer therapy. Chemical Communications. 50 (80), 11852-11855 (2014).
- Andresen, T. L., Thompson, D. H., Kaasgaard, T. Enzyme-triggered nanomedicine: Drug release strategies in cancer therapy (Invited Review). Molecular Membrane Biology. 27 (7), 353-363 (2010).
- Xu, G., McLeod, H. L. Strategies for enzyme/prodrug cancer therapy. Clinical Cancer Research. 7 (11), 3314-3324 (2001).
- Luo, W., et al. Dual-targeted and pH-sensitive doxorubicin prodrug-microbubble complex with ultrasound for tumor treatment. Theranostics. 7 (2), 452 (2017).
- Gao, J., et al. Ultrasound triggered phase-change nanodroplets for doxorubicin prodrug delivery and ultrasound diagnosis: An in vitro study. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 174, 416-425 (2019).
- Brade, A. M., Szmitko, P., Ngo, D., Liu, F. -F., Klamut, H. J. Heat-directed suicide gene therapy for breast cancer. Cancer Gene Therapy. 10 (4), 294-301 (2003).
- Long, K., et al. One-photon red light-triggered disassembly of small-molecule nanoparticles for drug delivery. Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 357 (2021).
- Liu, Y., Long, K., Kang, W., Wang, T., Wang, W. Optochemical control of immune checkpoint blockade via light-triggered PD-L1 dimerization. Advanced NanoBiomed Research. 2 (6), 2200017 (2022).
- Wang, T., et al. Optochemical control of mTOR signaling and mTOR-dependent autophagy. ACS Pharmacology & Translational Science. 5 (3), 149-155 (2022).
- Abet, V., Filace, F., Recio, J., Alvarez-Builla, J., Burgos, C. Prodrug approach: An overview of recent cases. European Journal of Medicinal Chemistry. 127, 810-827 (2017).
- Li, G., et al. Small-molecule prodrug nanoassemblies: an emerging nanoplatform for anticancer drug delivery. Small. 17 (52), 2101460 (2021).
- Shamay, Y., et al. Quantitative self-assembly prediction yields targeted nanomedicines. Nature Materials. 17 (4), 361-368 (2018).
- Sinoway, P. A., Callen, J. P.
- Owen, W. R., Stewart, P. J. Kinetics and mechanism of chlorambucil hydrolysis. Journal of Pharmaceutical Sciences. 68 (8), 992-996 (1979).
- Lv, W., et al. Upconversion-like photolysis of BODIPY-based prodrugs via a one-photon process. Journal of the American Chemical Society. 141 (44), 17482-17486 (2019).
- Silver, J. Let us teach proper thin layer chromatography technique. Journal of Chemical Education. 97 (12), 4217-4219 (2020).
- Saad, W. S., Prud'homme, R. K. Principles of nanoparticle formation by flash nanoprecipitation. Nano Today. 11 (2), 212-227 (2016).
- Long, K., et al. Photoresponsive prodrug-dye nanoassembly for in-situ monitorable cancer therapy. Bioengineering & Translational Medicine. 7 (3), 10311 (2022).
- Zhong, T., et al. A self-assembling nanomedicine of conjugated linoleic acid-paclitaxel conjugate (CLA-PTX) with higher drug loading and carrier-free characteristic. Scientific Reports. 6 (1), 36614 (2016).
- Long, K., et al. Green light-triggered intraocular drug release for intravenous chemotherapy of retinoblastoma. Advanced Science. 8 (20), 2101754 (2021).
- Lv, W., Wang, W. One-photon upconversion-like photolysis: a new strategy to achieve long-wavelength light-excitable photolysis. Synlett. 31 (12), 1129-1134 (2020).
- Rwei, A. Y., Wang, W., Kohane, D. S. Photoresponsive nanoparticles for drug delivery. Nano Today. 10 (4), 451-467 (2015).
- Grzelczak, M., Vermant, J., Furst, E. M., Liz-Marzán, L. M.
- Gnanasammandhan, M. K., Idris, N. M., Bansal, A., Huang, K., Zhang, Y. Near-IR photoactivation using mesoporous silica-coated NaYF4:Yb,Er/Tm upconversion nanoparticles. Nature Protocols. 11 (4), 688-713 (2016).
