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Biology

Langzeitkultur und Monitoring von isolierten Caenorhabditis elegans auf festen Medien in Multi-Well-Geräten

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/64681
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Molecular & Cellular Biology, University of Arizona, 2Department of Bioengineering, School of Engineering and Applied Sciences, University of Pennsylvania

Summary

Hier wird ein optimiertes Protokoll für die Kultivierung isolierter einzelner Nematoden auf festen Medien in mikrofabrizierten Multi-Well-Bauelementen vorgestellt. Dieser Ansatz ermöglicht es, einzelne Tiere ihr ganzes Leben lang auf eine Vielzahl von Phänotypen im Zusammenhang mit dem Altern und der Gesundheit zu überwachen, einschließlich Aktivität, Körpergröße und -form, Bewegungsgeometrie und Überleben.

Abstract

Der Fadenwurm Caenorhabditis elegans gehört aufgrund seiner einfachen und kostengünstigen Kulturtechniken, seines schnellen Reproduktionszyklus (~3 Tage), seiner kurzen Lebensdauer (~3 Wochen) und zahlreicher verfügbarer Werkzeuge für die genetische Manipulation und molekulare Analyse zu den am häufigsten verwendeten Modellsystemen in der Alternsforschung. Der gebräuchlichste Ansatz zur Durchführung von Alterungsstudien bei C. elegans, einschließlich der Überlebensanalyse, besteht darin, Populationen von Dutzenden bis Hunderten von Tieren zusammen auf festen Nematoden-Wachstumsmedien (NGM) in Petriplatten zu kultivieren. Während bei diesem Ansatz Daten über eine Population von Tieren gesammelt werden, verfolgen die meisten Protokolle einzelne Tiere nicht über einen längeren Zeitraum. Hier wird ein optimiertes Protokoll für die Langzeitkultivierung von Einzeltieren auf mikrofabrizierten Polydimethylsiloxan (PDMS)-Geräten, den sogenannten WorMotels, vorgestellt. Jedes Gerät ermöglicht die Kultivierung von bis zu 240 Tieren in kleinen Vertiefungen, die NGM enthalten, wobei jede Vertiefung durch einen kupfersulfathaltigen Graben isoliert wird, der die Tiere an der Flucht hindert. Aufbauend auf der ursprünglichen WorMotel-Beschreibung enthält dieses Dokument ein detailliertes Protokoll für das Formen, Vorbereiten und Bestücken jedes Geräts mit Beschreibungen häufiger technischer Komplikationen und Ratschlägen zur Fehlerbehebung. Innerhalb dieses Protokolls enthalten Techniken für die konsistente Beladung von NGM in kleinen Mengen, die konsistente Trocknung sowohl des NGM als auch der bakteriellen Nahrung, Optionen für die Verabreichung pharmakologischer Interventionen, Anweisungen und praktische Einschränkungen bei der Wiederverwendung von PDMS-Geräten sowie Tipps zur Minimierung der Austrocknung, selbst in Umgebungen mit niedriger Luftfeuchtigkeit. Diese Technik ermöglicht die longitudinale Überwachung verschiedener physiologischer Parameter, einschließlich stimulierter Aktivität, unstimulierter Aktivität, Körpergröße, Bewegungsgeometrie, Gesundheitsspanne und Überleben, in einer Umgebung, die der Standardtechnik für Gruppenkulturen auf festen Medien in Petriplatten ähnelt. Diese Methode ist in Verbindung mit automatisierter Mikroskopie- und Analysesoftware mit der Datenerfassung mit hohem Durchsatz kompatibel. Abschließend werden die Grenzen dieser Technik diskutiert und ein Vergleich dieses Ansatzes mit einer kürzlich entwickelten Methode durchgeführt, bei der Mikroschalen verwendet werden, um isolierte Nematoden auf festen Medien zu kultivieren.

Introduction

Caenorhabditis elegans werden aufgrund ihrer kurzen Generationszeit (ca. 3 Tage), ihrer kurzen Lebensdauer (ca. 3 Wochen), ihrer einfachen Kultivierung im Labor, ihres hohen Maßes an evolutionärer Erhaltung molekularer Prozesse und Signalwege bei Säugetieren und ihrer breiten Verfügbarkeit genetischer Manipulationstechniken häufig in Alternsstudien eingesetzt. Im Rahmen von Alterungsstudien ermöglichen C. elegans die schnelle Generierung von Langlebigkeitsdaten und gealterten Populationen für die Analyse von Phänotypen im späten Leben lebender Tiere. Der typische Ansatz für die Durchführung von Studien zur Wurmalterung besteht darin, die Lebensdauer einer Population von Würmern, die in Gruppen von 20 bis 70 Tieren gehalten wird, manuell auf festen Agar-Nematoden-Wachstumsmedien (NGM) in 6-cm-Petriplatten zu messen1. Die Verwendung alterssynchronisierter Populationen ermöglicht die Messung der Lebensspanne oder der Querschnittsphänotypen bei einzelnen Tieren in der gesamten Population, aber diese Methode schließt die Überwachung der Merkmale einzelner Tiere im Laufe der Zeit aus. Dieser Ansatz ist auch arbeitsintensiv und schränkt daher die Größe der Population ein, die getestet werden kann.

Es gibt eine begrenzte Anzahl von Kulturmethoden, die die longitudinale Überwachung einzelner C. elegans während ihrer gesamten Lebensspanne ermöglichen, und jede hat eine Reihe von Vor- und Nachteilen. Mikrofluidik-Geräte, darunter WormFarm2, NemaLife3 und der "Verhaltens"-Chip4, unter anderem 5,6,7, ermöglichen die Überwachung einzelner Tiere über einen längeren Zeitraum. Die Kultivierung von Würmern in Flüssigkultur unter Verwendung von Multi-Well-Platten ermöglicht in ähnlicher Weise die Überwachung einzelner Tiere oder kleiner Populationen von C. elegans über einen längeren Zeitraum 8,9. Die flüssige Umgebung stellt einen anderen Umweltkontext dar als die übliche Kulturumgebung auf festen Medien in Petriplatten, die altersrelevante Aspekte der Tierphysiologie verändern können, einschließlich des Fettgehalts und der Expression von Stressreaktionsgenen10,11. Die Möglichkeit, diese Studien direkt mit der Mehrzahl der Daten zu vergleichen, die über alternde C. elegans erhoben wurden, ist durch Unterschiede in potenziell wichtigen Umweltvariablen eingeschränkt. Der Worm Corral12 ist ein Ansatz, der entwickelt wurde, um einzelne Tiere in einer Umgebung unterzubringen, die der typischen Solid-Media-Kultur näher kommt. Der Worm Corral enthält für jedes Tier eine versiegelte Kammer auf einem Objektträger mit Hydrogel, die die Längsbeobachtung isolierter Tiere ermöglicht. Diese Methode verwendet Standard-Hellfeld-Bildgebung, um morphologische Daten wie Körpergröße und -aktivität aufzuzeichnen. Die Tiere werden jedoch als Embryonen in die Hydrogel-Umgebung gebracht, wo sie während ihrer gesamten Lebensspanne ungestört bleiben. Dies erfordert die Verwendung von bedingt sterilen mutierten oder transgenen genetischen Hintergründen, was sowohl die Kapazität für ein genetisches Screening einschränkt, da jede neue Mutation oder jedes Transgen in einen Hintergrund mit bedingter Sterilität gekreuzt werden muss, als auch die Kapazität für ein Arzneimittelscreening, da Behandlungen nur einmal bei den Tieren als Embryonen angewendet werden können.

Eine alternative Methode, die vom Fang-Yen-Labor entwickelt wurde, ermöglicht die Kultivierung von Würmern auf festen Medien in einzelnen Vertiefungen eines mikrofabrizierten Polydimethylsiloxan-Geräts (PDMS) namens WorMotel13,14. Jedes Gerät befindet sich in einer Single-Well-Schale (d. h. mit den gleichen Abmessungen wie eine 96-Well-Platte) und verfügt über 240 Vertiefungen, die durch einen Graben getrennt sind, der mit einer aversiven Lösung gefüllt ist, um zu verhindern, dass die Würmer zwischen den Vertiefungen wandern. Jeder Brunnen kann für die Dauer seiner Lebensdauer einen einzelnen Wurm beherbergen. Das Gerät ist von wasserabsorbierenden Polyacrylamid-Gel-Pellets (als "Wasserkristalle" bezeichnet) umgeben, und die Schale ist mit Parafilm-Laborfolie versiegelt, um die Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten und das Austrocknen des Mediums zu minimieren. Dieses System ermöglicht es, Daten über die Gesundheitsspanne und die Lebensdauer einzelner Tiere zu sammeln, während die Verwendung fester Medien die von den Tieren in der überwiegenden Mehrheit der veröffentlichten Studien zur Lebensspanne von C. elegans erlebte Umgebung besser rekapituliert und somit direktere Vergleiche ermöglicht. Kürzlich wurde eine ähnliche Technik entwickelt, bei der Polystyrol-Mikroschalen verwendet wurden, die ursprünglich für Mikrozytotoxizitätsassays15 anstelle des PDMS-Geräts16 verwendet wurden. Die Microtray-Methode ermöglicht die Erfassung individualisierter Daten für Würmer, die auf festen Medien kultiviert wurden, und hat eine verbesserte Fähigkeit, Würmer unter Bedingungen einzudämmen, die typischerweise zur Flucht führen würden (z. B. Stressoren oder Ernährungseinschränkungen), wobei der Kompromiss darin besteht, dass jede Mikroschale nur 96 Tiere enthalten kann16, während das hier verwendete Multi-Well-Gerät bis zu 240 Tiere enthalten kann.

Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Herstellung von Multi-Well-Geräten vorgestellt, das für die Konsistenz von Platte zu Platte und die parallele Herstellung mehrerer Geräte optimiert ist. Dieses Protokoll wurde aus dem ursprünglichen Protokoll des Fang-Yen-Labors13 adaptiert. Insbesondere gibt es Beschreibungen für Techniken zur Minimierung der Kontamination, zur Optimierung der gleichmäßigen Trocknung sowohl des festen Mediums als auch der bakteriellen Nahrungsquelle sowie zur Abgabe von RNAi und Medikamenten. Dieses System kann verwendet werden, um die individuelle Gesundheitsspanne, die Lebensdauer und andere Phänotypen wie Körpergröße und -form zu verfolgen. Diese Multi-Well-Geräte sind mit bestehenden Hochdurchsatzsystemen zur Messung der Lebensdauer kompatibel, wodurch ein Großteil der manuellen Arbeit, die mit herkömmlichen Lebensdauerexperimenten verbunden ist, entfallen kann und die Möglichkeit einer automatisierten, direkten Langlebigkeitsmessung und Gesundheitsverfolgung bei einzelnen C. elegans in großem Maßstab bietet.

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Protocol

1. Aufbereitung von Stammlösungen und Medien

Anmerkungen: Bevor Sie mit der Vorbereitung der Multiwell-Geräte beginnen, bereiten Sie die folgenden Stammlösungen und -medien vor.

  1. Stammlösungen für Nematoden-Nährmedien (NGM) und Low-Melt-NGM (lmNGM):
    1. 1 M K 2 HPO4 vorbereiten: 174,18 g K2HPO4 in eine1-Liter-Flasche geben und bis zu 1 Liter mit sterilem deionisiertem Wasser füllen. 30 Minuten lang autoklavieren (121 °C, 15 psig) und bei Raumtemperatur (RT) lagern.
    2. 1 M KPi, pH 6,0 zubereiten: 136,09 g KH2HPO4 in eine 1-Liter-Flasche geben und bis zu 1 Liter mit sterilem deionisiertem Wasser auffüllen. Mit 1 M K2HPO4 auf pH 6,0 titrieren. 30 Minuten lang autoklavieren (121 °C, 15 psig) und bei RT lagern.
    3. Bereiten Sie 1 M CaCl 2 vor: Geben Sie 73,5 g CaCl2 in eine 500-ml-Flasche und füllen Sie sie bis zu 500 ml mit sterilem deionisiertem Wasser. 30 Minuten lang autoklavieren (121 °C, 15 psig) und bei RT lagern.
    4. Bereiten Sie 1 M MgSO 4 vor: Geben Sie 123,25 g MgSO4 in eine 500-ml-Flasche und füllen Sie sie bis zu 500 ml mit sterilem deionisiertem Wasser. 30 Minuten lang autoklavieren (121 °C, 15 psig) und bei RT lagern.
    5. Bereiten Sie 5 mg/ml Cholesterin vor: Kombinieren Sie 2,5 g Cholesterin, 275 ml 100%iges Ethanol und 25 ml steriles deionisiertes Wasser in einer 500-ml-Braunflasche. Bei RT einkaufen.
    6. Bereiten Sie 50 mM Floxuridin vor: Kombinieren Sie 0,1231 g Floxuridin und 10 ml steriles deionisiertes Wasser in einem konischen 15-ml-Röhrchen. Filtersterilisieren Sie es mit einem 0,22-μm-Filter unter Verwendung einer 10-ml-Spritze. Jeweils 1 ml in 10 Mikrozentrifugenröhrchen aliquotieren und bei −20 °C lagern.
    7. Bereiten Sie 50 mg/ml Carbenicillin vor: Kombinieren Sie in einem konischen 15-ml-Röhrchen 500 mg Carbenicillin mit 10 ml sterilem deionisiertem Wasser. Filtersterilisieren Sie es mit einem 0,22-μm-Filter unter Verwendung einer 10-ml-Spritze. Jeweils 1 ml in 10 Mikrozentrifugenröhrchen aliquotieren und bei −20 °C lagern.
    8. Herstellung von 1 mM Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG): Kombinieren Sie in einem konischen 15-ml-Röhrchen 2,38 g IPTG mit 10 ml sterilem deionisiertem Wasser. Filtersterilisieren Sie es mit einem 0,22-μm-Filter unter Verwendung einer 10-ml-Spritze. Jeweils 1 ml in 10 Mikrozentrifugenröhrchen aliquotieren und bei −20 °C lagern.
    9. 100 mg/ml Ampicillin zubereiten: Kombinieren Sie in einem konischen 15-ml-Röhrchen 1 g Ampicillin mit 10 ml sterilem deionisiertem Wasser. Filtersterilisieren Sie es mit einem 0,22-μm-Filter unter Verwendung einer 10-ml-Spritze. Jeweils 1 ml in 10 Mikrozentrifugenröhrchen aliquotieren und bei −20 °C lagern.
  2. Vorbereitung von Nematoden-Nährmedien (NGM) für die allgemeine Pflege von C. elegans
    1. Um 50 Teller herzustellen, vermischen Sie in einem 1-Liter-Kolben 10 g Bacto-Agar, 1,5 g NaCl, 1,25 g Bacto-Pepton und 486 ml Reinstwasser. Zum Sterilisieren mindestens 30 Minuten im Flüssigkeitskreislauf (121 °C, 15 psig) autoklavieren.
    2. Nach dem Autoklavieren werden nach dem Abkühlen des Mediums auf 55 °C 12,5 ml 1 M KPi, 500 μl 1 MMgSO4, 500 μl 1 M CaCl2 und 500 μl 5 mg/ml Cholesterin zugegeben.
    3. Gießen Sie mit einer sterilen Technik 10 ml Medium in jede 60-mm-Platte (insgesamt 50). Nachdem das Medium erstarrt ist (mindestens 30 Minuten nach dem Gießen), pipettieren Sie 300 μl Bakterienkultur (hergestellt gemäß Schritt 4 und Schritt 10), die über Nacht gewachsen ist, auf die Mitte der Platte. Lassen Sie die Platte auf der Bank stehen und lassen Sie die Bakterienkultur trocknen und dicker werden (1-2 Tage). Lagern Sie die Platten bei 4 °C.
  3. Bereiten Sie die Vormischung des niedrigschmelzenden Nematodenwachstumsmediums (lmNGM) vor:
    1. Kombinieren Sie in einem 500-ml-Kolben 4 g niedrigschmelzende Agarose, 0,5 g Bacto Peptone und 195 ml Reinstwasser. Zum Sterilisieren mindestens 30 Minuten im Flüssigkeitskreislauf (121 °C, 15 psig) autoklavieren.
    2. Während das Medium noch geschmolzen ist, verteilen Sie 10 ml Aliquots in sterile Glasreagenzgläser. Verschließen Sie jedes Reagenzglas mit Parafilm, gefolgt von einer Reagenzglaskappe, um die lmNGM-Vormischung zu konservieren und ein Austrocknen zu verhindern. Das Medium verfestigt sich und kann vor der Verwendung ~2 Wochen bei RT gelagert werden.
  4. 142,8 mM NaCl zubereiten: In einer 250-ml-Flasche 0,8345 g NaCl und 100 ml steriles deionisiertes Wasser vermischen. 30 Minuten lang autoklavieren (121 °C, 15 psig) und bei RT lagern.
  5. Bereiten Sie die Reinigungslösung vor: Kombinieren Sie in einem konischen 15-ml-Röhrchen 3 ml Tween 20 und 7 ml steriles deionisiertes Wasser. Gründlich mischen, mit einem 0,22-μm-Filter mit einer 10-ml-Spritze filtern und bei RT lagern.
  6. Kupfersulfatlösung zubereiten: In einer sterilen 50-ml-Flasche 20 ml steriles deionisiertes Wasser, 0,5 g CuSO4 und 100 μl Reinigungslösung (in Schritt 1.5 zubereitet) vermischen. Mischen, bis sich das CuSO4 aufgelöst hat. Bei RT einkaufen.
  7. Bereiten Sie wasserabsorbierende Polyacrylamidkristalle vor: Kombinieren Sie in einer autoklavsicheren Quetschflasche 150 ml deionisiertes Wasser und 1 g superabsorbierendes Polymer vom Typ S. Mischen Sie vorsichtig, indem Sie die Flasche mehrmals umdrehen. Autoklavieren Sie mindestens 20 Minuten lang in einem Flüssigkeitskreislauf (121 °C, 15 psig) und lagern Sie sie bei RT.
  8. Lysogene Brühe (LB) zubereiten: Kombinieren Sie in einem 1-Liter-Becherglas oder größer 20 g LB-Pulver mit 1 l deionisiertem Wasser. Aliquot in zwei 500-ml-Bechergläser. 30 Minuten lang autoklavieren (121 °C, 15 psig) und bei RT lagern
  9. Bereiten Sie Lysogenbrühe (LB) Agarplatten vor:
    1. Kombinieren Sie in einem 1-Liter-Kolben 10 g LB-Pulver, 7,5 g Bacto-Agar und 500 ml deionisiertes Wasser. Im Flüssigkeitskreislauf (121 °C, 15 psig) für 30 min autoklavieren.
    2. Falls gewünscht, fügen Sie optionale Antibiotika hinzu (nach dem Autoklavieren, nachdem das Medium auf 55 °C abgekühlt ist): 500 μl 100 mg/ml Ampicillin. Gießen Sie mit einer sterilen Technik 20 ml Medium in jede 100-mm-Platte (insgesamt 25) und lagern Sie sie bei 4 °C.

2. Drucken der 3D-Multiwell-Geräteform

HINWEIS: Jedes Gerät wird aus PDMS mit einer benutzerdefinierten 3D-gedruckten Form geformt. Mit einer einzigen Form können so viele Geräte wie nötig hergestellt werden. Wenn Sie jedoch versuchen, mehrere Geräte gleichzeitig vorzubereiten, ist eine 3D-gedruckte Form erforderlich, damit jedes Gerät parallel hergestellt werden kann.

  1. Laden Sie die STL-Datei herunter (siehe Ergänzungsdatei 1).
  2. Drucken Sie die Form mit einem hochauflösenden 3D-Drucker.
    HINWEIS: Die Auflösung des Druckers muss ausreichend hoch sein, um konsistente Well- und Grabenvolumina zu ermöglichen. Die empfohlene Druckerauflösung ist eine minimale XY-Auflösung von ~40 μm und eine Schichtauflösung von 28 μm. Das Material, das der 3D-Drucker verwendet, ist ebenso wichtig, da viele Materialtypen die Aushärtung des PDMS verhindern. Formen, die mit hochauflösenden PolyJet-Druckern (Auflösung: X-Achse = 600 dpi, Y-Achse = 600 dpi, Z-Achse = 1.600 dpi) mit dem Vero Black-Druckmaterial hergestellt wurden, funktionieren erfahrungsgemäß konstant. Der 3D-Druck der in dieser Studie verwendeten Formen wurde ausgelagert (Druckdetails finden Sie in der Materialtabelle).

3. Vorbereitung des Multi-Well-Gerätes

HINWEIS: In diesem Abschnitt wird beschrieben, wie die 3D-gedruckte Form zur Herstellung des PDMS-Multiwell-Geräts verwendet wird.

  1. Stellen Sie den Aushärteofen auf 55 °C ein, um ein Vorheizen zu ermöglichen.
  2. Bestimmen Sie die Anzahl der Geräte, die in einer Charge vorbereitet werden sollen. Mischen Sie für jedes Gerät 60 g PDMS-Base und 6 g Härter in einem großen Einweg-Wiegeschiff (oder einem ähnlichen Einwegbehälter) mit einem Einwegspatel.
  3. Geben Sie das PDMS-Gemisch für 30 Minuten bei −0,08 MPa in eine Vakuumkammer, um Blasen zu entfernen.
  4. Gießen Sie die PDMS-Mischung in jede 3D-gedruckte Form. Füllen Sie die Form vollständig, wobei die PDMS-Mischung leicht über die Oberseite der Form hinausragt. Bewahren Sie die überschüssige PDMS-Mischung auf, um die Form im Falle eines Verschüttens wieder aufzufüllen.
  5. Stellen Sie die gefüllte Form und die überschüssige PDMS-Mischung für 25 Minuten bei −0,08 MPa in die Vakuumkammer, um alle während des Gießvorgangs entstandenen Blasen zu entfernen.
  6. Nehmen Sie die gefüllte Form aus der Vakuumkammer und lassen Sie alle verbleibenden Blasen mit einem Einwegspatel platzen. Verwenden Sie den Spatel, um sichtbaren Schmutz oder verbleibende Blasen bis zum Rand der Form von den Vertiefungen wegzubürsten. Verbleibende Ablagerungen oder Blasen können die Bildgebung in den späteren Schritten beeinträchtigen.
  7. Stellen Sie sicher, dass die Form vollständig mit der PDMS-Mischung gefüllt ist. Es kommt häufig vor, dass ein kleiner Teil des Gemisches in der Vakuumkammer oder während des Transfers austritt. Nachfüllen mit dem zusätzlichen PDMS-Gemisch, das in Schritt 3.5 entgast wurde. Dies sollte keine Blasen erzeugen, aber wenn sich welche bilden, können sie mit dem Spatel vorsichtig an die Seite der Form gebürstet werden.
  8. Legen Sie eine flache Acrylplatte auf die mit PDMS gefüllte Form, indem Sie zuerst eine Kante platzieren und die andere langsam absenken, bis das Acryl flach auf der Form sitzt und die PDMS-Mischung, die über den Rand hinausragt, verdrängt. Wenn sich beim Platzieren der Acrylplatte Blasen bilden, entfernen Sie das Acryl langsam, füllen Sie die Form bei Bedarf mit PDMS-Mischung auf und starten Sie die Acrylplatzierung neu. Die Acrylplatte bildet einen flachen Boden für das geformte Gerät und stellt sicher, dass sich alle Vertiefungen relativ zur Basis auf gleicher Höhe befinden.
  9. Legen Sie ein 2,5 Pfund schweres Gewicht auf das Acryl. Es können mehrere Formen mit jeweils einer separaten Acrylplatte gestapelt werden. Die beschwerten Förmchen in den Ofen schieben und über Nacht bei 55 °C aushärten lassen.
  10. Am nächsten Tag die Gewichte und die Förmchen aus dem Ofen nehmen.
  11. Arbeiten Sie vorsichtig mit einer Rasierklinge zwischen dem Acryl und dem ausgehärteten PDMS, um das Siegel zu brechen. Entfernen Sie vorsichtig das Acryl von der Oberseite der Form. Das PDMS ist zu diesem Zeitpunkt ausgehärtet und das Entfernen des Acryls kann etwas Kraft erfordern.
  12. Lösen Sie mit einem Rasierer oder einem Metallspatel vorsichtig die Seiten des ausgehärteten PDMS aus der Form. Es ist leicht, das PDMS in diesem Stadium zu zerreißen; Arbeiten Sie langsam und vorsichtig um den Rand herum, um das PDMS-Gerät intakt zu entfernen.
    HINWEIS: Frisch gedruckte Formen sind bei den ersten drei Anwendungen besonders klebrig, und das PDMS reißt oft, wenn versucht wird, das Gerät zu entfernen. Mit zunehmender Verwendung wird es einfacher, das ausgehärtete PDMS aus der Form zu entfernen.
  13. Wickeln Sie das Gerät in Alufolie ein und versiegeln Sie es mit Autoklavenklebeband. Autoklavieren Sie mindestens 15 Minuten lang bei 121 °C, 15 psig zum Sterilisieren. Bewahren Sie die verpackten Geräte nach dem Autoklavieren auf der Werkbank auf und verwenden Sie sie nach Bedarf.

4. Streifen der Bakterien

Anmerkungen: Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Bakterien, die als Nahrungsquelle für die Würmer verwendet werden, während sie sich auf dem Multi-Well-Gerät befinden. Das häufigste Bakterium ist der Escherichia coli-Stamm OP50 (oder der Stamm HT115 für RNAi-Experimente). Führen Sie diesen Schritt mindestens 2 Tage vor dem Hinzufügen der Würmer zum Gerät aus.

  1. Streichen Sie die Bakterien auf eine frische LB-Platte. Stellen Sie sicher, dass alle stammspezifischen selektiven Zusatzstoffe (z. B. Ampicillin zur Auswahl eines Plasmids, das den Bakterien eine Ampicillinresistenz verleiht) in den LB-Platten enthalten sind.
  2. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C über Nacht (~18 h), damit die Kolonien wachsen können.

5. Vorbereitung der Multi-Well-Vorrichtung für die Medienbeladung

HINWEIS: Die Oberfläche des Silikon-PDMS-Materials, aus dem das Gerät besteht, ist hydrophob, wodurch verhindert wird, dass die kleinvolumigen Vertiefungen und aversiven Wassergräben mit NGM bzw. Kupfersulfat gefüllt werden. Um dieses Problem zu umgehen, wird ein Sauerstoffplasma verwendet, um die Oberflächeneigenschaften des Geräts vorübergehend hydrophil zu modifizieren, so dass die Brunnen und der Graben innerhalb eines begrenzten Zeitfensters (bis zu ~2 h) gefüllt werden können. In diesem Abschnitt werden die Schritte zum Abschließen des Plasmareinigungsprozesses beschrieben. Führen Sie diesen Schritt mindestens 1 Tag vor der Erkennung von Bakterien durch, da die anhaltende Wirkung der Plasmareinigung die Schmierblutung beeinträchtigen kann. Angesichts des zeitlichen Ablaufs der Abschnitte 5-7 liegt die praktische Grenze für diese Schritte pro Techniker bei drei Geräten parallel.

  1. Einen trockenen Perlbad-Inkubator zur Vorbereitung auf Abschnitt 6 auf 90 °C vorheizen.
  2. Da das Gesamtvolumen des Mediums, das zum Befüllen der Vertiefungen eines Multi-Well-Geräts benötigt wird, im Vergleich zu dem von Petriplatten gering ist, bereiten Sie eine große Menge NGM vor und aliquotieren Sie es in Reagenzgläser (siehe Schritt 1.3).
    Anmerkungen: Dies kann im Voraus erfolgen, da die Medienröhrchen ~2 Wochen auf dem Tisch gelagert werden können. Wenn das Medium vorbereitet und in Röhrchen aliquotiert wurde, fahren Sie mit Schritt 5.3 fort.
  3. Packen Sie mit Handschuhen ein autoklaviertes Multiwell-Gerät aus. Vermeiden Sie es, einen der Brunnen zu berühren. Schneiden Sie eine kleine Kerbe in die obere rechte Ecke des Geräts, um anzuzeigen, wie oft es verwendet/wiederverwendet wurde (siehe Abschnitt 15 unten für Anweisungen und Empfehlungen zur Reinigung und Wiederverwendung jedes Geräts).
  4. Legen Sie bis zu drei unverpackte Geräte mit den Vertiefungen nach oben in den Plasmareiniger. Lassen Sie den Plasmareiniger laufen.
    HINWEIS : Die folgenden detaillierten Anweisungen gelten für den Plasmareiniger Plasma Etch PE-50. Die spezifischen Schritte und Einstellungen müssen angepasst und ggf. für andere Plasmareiniger neu optimiert werden.
    1. Vergewissern Sie sich, dass die Leistungsstufe des Plasmareinigers auf 75 % eingestellt ist.
    2. Stellen Sie sicher, dass sich sowohl die Entlüftungs- als auch die Absperrventile in der Position OFF befinden.
    3. Öffnen Sie das Hauptventil am Sauerstofftank. Warten Sie, bis der Reglerdruck auf 15 psig bis 20 psig abfällt, und drehen Sie dann das Absperrventil in die Position ON .
    4. Schalten Sie die Vakuumpumpe und den Plasmareiniger ein.
    5. Nehmen Sie die folgenden Einstellungen am Plasmareiniger ein (erste Verwendung) oder überprüfen Sie, ob die zuvor programmierten Einstellungen korrekt sind:
      Plasmazeit: 3:00 min
      Vakuum-Sollwert: 149,5 mTorr
      Atmosphärischer Schlot: 45 s
      Entlüftung spülen: 5 s
      Gasstabilisierung: 15 s
      Vakuum-Alarm: 3:00 min
      Automatisches Ausschalten: EIN
    6. Drücken Sie die Eingabetaste , um zum Menü "Befehle" zu gelangen. Verwenden Sie die nach-rechts-Taste , um Setup-Menü auszuwählen, und drücken Sie dann die Eingabetaste. Scrollen Sie durch alle Einstellungen, indem Sie die Eingabetaste drücken, um jede aktuelle Einstellung zu bestätigen, und dann den Pfeil nach rechts, um zur nächsten Einstellung zu wechseln.
    7. Kehren Sie zum Befehlsmenü zurück, indem Sie den Aufwärtspfeil und dann den Linkspfeil drücken.
    8. Drücken Sie auf dem Bildschirm Befehlsmenü die Eingabetaste. Wählen Sie Befehle PLASMA aus, indem Sie die Eingabetaste drücken. Das System durchläuft die folgenden Phasen:
      Plasma-Pumpdown
      Gasstabilisierung: Stellen Sie in dieser Phase den Gas 1-Knopf am Plasmareiniger ein, bis der Durchflussmesser bei 10 cc/min steht.
      Plasmazeit
      Spülen Pumpdown
      Plasmazyklus abgeschlossen
      Kammer-Entlüftung
      Anmerkungen: Dieser Vorgang sollte ca. 5-10 Minuten dauern. Wenn alle Phasen abgeschlossen sind, wird das Befehlsmenü wieder auf dem Bildschirm angezeigt. Wenn der Druck während der Plasma-Pumpdown-Phase nicht niedrig genug wird, fährt der Plasmareiniger nicht mit der nächsten Phase fort und der Bildschirm zeigt eine Fehlermeldung an. Überprüfen Sie in diesem Fall das Öl der Vakuumpumpe. Wenn der Ölstand niedrig oder das Öl trüb/verschmutzt ist, kann ein Ölwechsel dazu führen, dass der Vakuumdruck das erforderliche Niveau erreicht.
    9. Schalten Sie das Hauptventil am Sauerstofftank aus.
    10. Drehen Sie das Entlüftungsventil sehr langsam in die Position ON und lassen Sie den Reglerdruck des Sauerstofftanks auf Null zurückkehren.
    11. Drehen Sie das Absperrventil in die Position OFF .
    12. Schalten Sie die Vakuumpumpe und den Plasmareiniger aus.
      HINWEIS: Die hydrophile Oberflächenmodifikation des Multiwell-Geräts durch den Plasmareiniger ist vorübergehend und wird mit der Zeit (bis zu ca. 2 h) zunehmend weniger wirksam. Fahren Sie so schnell wie möglich mit den Abschnitten 6 und 7 fort.

6. Befüllen der Vertiefungen mit lmNGM

Anmerkungen: Ein trockener Wulstbad-Inkubator sollte eingeschaltet und ab Schritt 5.1 vorgeheizt sein. Stellen Sie sicher, dass das Bad 90 °C erreicht hat.

  1. Sterilisieren Sie eine Single-Well-Styroporschale pro Gerät, indem Sie die Innenseite der Schale mit 70%igem Ethanol besprühen und mit einem Arbeitstuch trocken wischen.
  2. Nehmen Sie jedes Gerät mit einer behandschuhten Hand aus dem Plasmareiniger und legen Sie es in eine gereinigte Schale.
  3. Stellen Sie ein 25-ml-Einweg-Pipettenbecken in den Perlenbad-Inkubator, nachdem Sie es auf 90 °C erhitzt haben.
  4. Pro zu befüllendem Gerät ist ein Röhrchen mit verfestigter lmNGM-Vormischung zu entnehmen (siehe Schritt 1.3).
  5. Geben Sie die lmNGM-Reagenzgläser in ein 200-ml-Glasbecherglas und entfernen Sie die Kappen und den Parafilm. Mikrowelle für ~20 s, bis das Medium ausreichend geschmolzen ist, um es zu gießen (das Vorhandensein einiger fester Medien ist in diesem Stadium in Ordnung).
  6. Kombinieren Sie die geschmolzene lmNGM-Vormischung aus mehreren Reagenzgläsern in einem anderen sterilen 200-ml-Becherglas. Setzen Sie die Mikrowelle für weitere 20 s fort, um insgesamt 40 s zu erreichen. Wenn die lmNGM-Vormischung zu überkochen beginnt, stoppen Sie die Mikrowelle und lassen Sie die lmNGM-Vormischung absetzen, bevor Sie fortfahren.
  7. Nehmen Sie die geschmolzene lmNGM-Vormischung aus der Mikrowelle und lassen Sie sie auf ~60 °C abkühlen.
    Anmerkungen: In diesem Stadium kühlt das Medium ab und verfestigt sich nach ~5 Minuten wieder. Fahren Sie sofort mit Schritt 6.8 und Schritt 6.9 fort.
  8. Für jeweils 10 ml lmNGM-Vormischung fügen Sie Folgendes hinzu (in der Reihenfolge): 250 μl 1 M KPi, 10 μl 1 MMgSO4, 10 μl 1 M CaCl2 und 10 μl 5 mg/ml Cholesterin.
    1. Um das Schlüpfen von Eiern bei der Überwachung von Erwachsenen auf dem Gerät zu verhindern, fügen Sie 10 μl 50 mM Floxuridin hinzu.
    2. Um ein RNAi-Plasmid auszuwählen und die Expression der RNA zu induzieren, werden 5 μl 50 mg/ml Carbenicillin und 12 μl 1 mM IPTG hinzugefügt.
      HINWEIS: Die Antibiotika oder andere Zusatzstoffe können je nach Versuchsplanung verändert werden. In diesem Stadium können auch Testsubstanzen/Medikamente dem Medium zugesetzt werden.
  9. Gießen Sie das geschmolzene lmNGM in das 25-ml-Becken im Perlenbad.
  10. Füllen Sie die Gerätevertiefungen mit lmNGM mit einer 200-μl-Mehrkanal-Repeater-Pipette.
    1. Stellen Sie den Repeater so ein, dass Aliquots von 14 μl dosiert werden (14 μl können bis zu 14 Mal dosiert werden, wenn eine 200-μl-Pipettenspitze verwendet wird).
    2. Montieren Sie fünf Pipettenspitzen. Die Wells des Geräts haben den gleichen Abstand wie eine 384-Well-Platte. Standard-Mehrkanalpipetten sind so beabstandet, dass der Benutzer in jede zweite Vertiefung in einer Reihe/Spalte pipettieren kann.
    3. Füllen Sie die Spitzen mit geschmolzenem lmNGM. Geben Sie die ersten 14 μl zurück in das lmNGM-haltige Becken.
    4. Dosieren Sie schnell, aber vorsichtig 14 μl in die inneren Vertiefungen (weiß in Abbildung 1B), beginnend mit denen, die in Abbildung 1B mit einem "x" markiert sind, und bewegen Sie sich über die Platte nach rechts und dann nach unten, wobei Sie insgesamt 12 Mal (60 Vertiefungen) dosieren.
    5. Geben Sie das verbleibende lmNGM zurück in das Becken, da das endgültige Aliquot in der Regel weniger als 14 μl beträgt.
    6. Wiederholen Sie die Schritte 6.10.3-6.10.5, bis alle inneren Vertiefungen gefüllt sind.
    7. Stellen Sie als Nächstes den Repeater so ein, dass er Aliquots von 15 μl dosiert. Wiederholen Sie die Schritte 6.10.3-6.10.5, aber füllen Sie anstelle der inneren Vertiefungen den äußersten Ring der Vertiefungen (grau in Abbildung 1B), beginnend mit den Vertiefungen, die in Abbildung 1B mit "+" markiert sind, und bewegen Sie sich um den äußeren Rand der Platte.
      Anmerkungen: Arbeiten Sie schnell, damit sich das Medium in den Pipettenspitzen nicht verfestigt. Vermeiden Sie es, lmNGM in den Wassergraben zu verschütten. Die äußeren Vertiefungen trocknen tendenziell schneller aus. Die zusätzlichen 1 μl lmNGM ermöglichen es, dass die endgültige getrocknete Vertiefung in der gleichen Trocknungszeit wie die inneren Vertiefungen eine ebene Oberfläche hat.
  11. Untersuchen Sie im Rahmen der Qualitätskontrolle jedes Well, um diejenigen mit Fehlern zu identifizieren, die die Bildgebung beeinträchtigen könnten, einschließlich Wells, die unterfüllt sind (die lmNGM-Oberfläche ist unter den Rand des Wells abgesenkt), überfüllt (die lmNGM-Oberfläche hat eine gewölbte Oberseite) und Blasen oder Schmutz enthalten.
  12. Entfernen Sie das erstarrte lmNGM mit einem kurzen Platin-Drahtpickel oder einem Vakuumsauger aus den unbefriedigenden Vertiefungen. Füllen Sie die leeren Vertiefungen mit frischem, geschmolzenem lmNGM auf. Entfernen Sie außerdem alle Medien, die in den Graben gelaufen sind, mit einem kurzen Platin-Drahtpickel oder einem Vakuumsauger.

7. Zugabe von Kupfersulfat zum Graben

Anmerkungen: Die Brunnen dieses Geräts sind von einem durchgehenden Wassergraben umgeben. Hier ist der Graben mit Kupfersulfat gefüllt, das als Abwehrmittel wirkt und die Würmer von der Flucht aus ihren Brunnen abhält.

  1. Geben Sie mit einer 200-μl-Pipette 200 μl Kupfersulfatlösung (siehe Schritt 1.6) in den Gerätegraben in jeder Ecke, 2x pro Ecke. Dieses Volumen sollte groß genug sein, damit das Kupfersulfat durch den gesamten Graben fließen kann. Achten Sie darauf, den Wassergraben zu keinem Zeitpunkt zu überfüllen. Das Kupfersulfat sollte die Oberseite der Vertiefungen nicht berühren.
  2. Wenn das Kupfersulfat nicht leicht durch den gesamten Graben fließt, verwenden Sie einen kurzen Platindrahtpickel, um die Spannung zu brechen und das Kupfersulfat durch den Graben zu ziehen.
  3. Nachdem das Kupfersulfat durch den gesamten Graben geflossen ist, entfernen Sie so viel Kupfersulfat wie möglich mit einer 200-μl-Pipette oder einer Aspiration mit Vakuum aus dem Graben. Die zurückbleibenden Rückstände reichen aus, um die Würmer davon abzuhalten, ihre Brunnen zu verlassen. Wenn der Graben mit Kupfersulfatlösung gefüllt bleibt, besteht die Gefahr, dass Kupfersulfat in die Brunnen gelangt, was die Würmer zur Flucht veranlassen würde.

8. Zugabe von autoklavierten Wasserkristallen

Anmerkungen: Um die Feuchtigkeit in der Platte aufrechtzuerhalten und ein Austrocknen des lmNGM zu verhindern, ist jedes Gerät von gesättigten, wasserabsorbierenden Polyacrylamidkristallen umgeben.

  1. Bereiten Sie die Wasserkristalle vor (siehe Schritt 1.7).
  2. Geben Sie die Wasserkristalle mit einer Quetschflasche in die Zwischenräume zwischen dem Gerät und den Wänden des Tabletts. Schließen Sie den Deckel des Tabletts und wickeln Sie alle vier Seiten mit einem Stück Parafilm ein. Fügen Sie zwei zusätzliche Stücke Parafilm hinzu, um die Platte vollständig zu versiegeln.
    Anmerkungen: Wasserkristalle können in einem Becherglas zubereitet und mit einem sterilisierten Spatel in die Schale geschöpft werden. Dies verlängert jedoch die Zeit des Verfahrens und verlängert die Zeit, in der jede Schale geöffnet und potenziellen Verunreinigungen ausgesetzt ist.
  3. Lassen Sie das versiegelte Gerät bis zum nächsten Tag auf dem Tisch, wenn die Bakterien bereit sind, entdeckt zu werden. Stellen Sie sicher, dass die Geräte nach dem Hinzufügen des lmNGM mit den Vertiefungen nach oben gelagert werden.

9. Präparation einer alterssynchronisierten Wurmpopulation

HINWEIS: Die folgenden Schritte ergeben eine synchronisierte Population von Würmern, die bereit sind, dem Multi-Well-Gerät im vierten Larvenstadium (L4) hinzugefügt zu werden. Es können aber auch Würmer in unterschiedlichen Entwicklungsstadien hinzugefügt werden. Dieser Schritt sollte 2 Tage vor dem Hinzufügen der Würmer zum Gerät abgeschlossen sein, wenn L4s gewünscht werden. Passen Sie den Zeitpunkt der Synchronisierung für die gewünschte Lebensphase an.

  1. Für konsistente Alterungsstudien ist C. elegans auf Standard-NGM-Platten zu halten (siehe Schritt 1.2 bei 20 °C unter gut gedüngten Bedingungen).
  2. Erzielen Sie eine synchronisierte Population von Tieren aus einem Vorratsteller mit Standardmethoden, z. B. Bleichen17 oder zeitgesteuerte Eiablage1.
  3. Legen Sie isolierte Eier auf eine NGM-Platte, die mit Bakterien befleckt ist. Die Eier schlüpfen auf dieser Platte, und die Würmer erreichen das L4-Larvenstadium bei Wildtyp-Tieren in 2 Tagen.

10. Beimpfung der Bakterienkultur

HINWEIS: Bakterien werden als primäre Nahrungsquelle für C. elegans verwendet, am häufigsten für die E. coli-Stämme OP50 oder HT115. Die Bakterien sind 10-fach konzentriert, was im Volumen der vorbereiteten Kultur berücksichtigt werden sollte. Bereiten Sie am Tag vor der Entdeckung des Geräts eine Bakterienkultur vor.

  1. Wählen Sie aus der in Schritt 4 vorbereiteten LB-Platte eine einzelne Kolonie aus und beimpfen Sie 12 ml steriles LB pro Gerät, das entdeckt werden soll. Fügen Sie bei Bedarf selektive Mittel für den verwendeten Bakterienstamm hinzu.
  2. Kultivieren Sie die Bakterienkultur über Nacht (~18 h) in einem 37 °C heißen Inkubator mit Schütteln bei ~250 U/min.

11. Aufspüren der Brunnen mit konzentrierten Bakterien

Anmerkungen: In jede Vertiefung wird eine kleine Menge konzentrierter Bakterien gegeben, die ausreicht, um die Würmer während ihrer gesamten Lebensdauer auf dem Gerät zu ernähren. Die Bakterienkultur muss getrocknet werden, bevor die Würmer in die Vertiefungen gegeben werden können. Da das Medienvolumen in jeder Vertiefung klein ist (14-15 μl) im Verhältnis zum zugegebenen Bakterienvolumen (5 μl), kann der chemische Gehalt der bakteriellen Medien die chemische Umgebung der Vertiefung beeinflussen. Um dies zu berücksichtigen, werden die Bakterien in Salzwasser konzentriert und resuspendiert, um erschöpftes LB zu entfernen und gleichzeitig hypoosmotischen Stress zu vermeiden. Der lmNGM-Rezeptur wird kein Salz zugesetzt (siehe Schritte 1.3-1.4), da es in dieser Phase hinzugefügt wird.

  1. Nachdem die Bakterien über Nacht gezüchtet wurden, wie in Abschnitt 10 beschrieben, wird die Bakterienkultur 10x konzentriert. Pelletieren Sie die Bakterien, indem Sie sie 20 Minuten lang bei ~3.400 x g zentrifugieren, den Überstand entsorgen und das Pellet in 1/10 des ursprünglichen Kulturvolumens von 142,8 mM NaCl resuspendieren (siehe Schritt 1.4). Um beispielsweise ein 240-Well-Gerät zu erkennen, werden 12 ml Kultur heruntergedreht und in 1,2 ml 142,8 mM NaCl resuspendiert.
    HINWEIS: Testverbindungen/Medikamente können der resuspendierten Bakterienkultur vor der Schmierblutung zugesetzt werden.
  2. Mit einer Wiederholpipette jede Vertiefung mit 5 μl der konzentrierten Bakterien punktieren. Vermeiden Sie den direkten Kontakt mit der lmNGM-Oberfläche, da die Pipettenspitze das lmNGM durchbohren und es dem Wurm ermöglichen kann, sich unter die Oberfläche des Wells zu graben. Achten Sie darauf, dass die Bakterien nicht in den Graben gelangen, da die Würmer davon angezogen werden und in den Graben fliehen.
  3. Trocknen Sie die gefleckten Bakterien bei abgenommenen Schalendeckeln. Dieser Schritt ist wichtig für die langfristige Integrität der Brunnenumgebung, und es gibt eine Vielzahl von Möglichkeiten, die gefleckten Geräte zu trocknen. Unabhängig davon, welche Methode verwendet wird, stellen Sie sicher, dass das Gerät in einer sterilen Umgebung bleibt, da es unbedeckt sitzen muss, während die Bakterien trocknen. Der erhöhte Luftstrom verkürzt die Trocknungszeit erheblich. Die Trocknung kann wie in den folgenden Schritten beschrieben durchgeführt werden:
    1. Lassen Sie das Gerät unbedeckt in einem sauberen, verschlossenen Behälter, z. B. einem Plastikbehälter, der mit 10 % Bleichmittel und 70 % Ethanol gereinigt wurde. Diese Trocknungsmethode kann mehrere Stunden dauern.
    2. Legen Sie die Geräte unbedeckt in eine sterile Laminar-Flow-Haube (ähnlich der unten angegebenen bevorzugten Methode).
    3. Trocknen Sie die Geräte mit einer speziell angefertigten "Trockenbox" (die optimierte Methode, die in dieser Studie verwendet wurde), die mit minimalen Kosten mit Computergehäuselüftern und HEPA-Filtern gebaut werden kann (siehe Ergänzungsdatei 1).
      HINWEIS: Unabhängig von der verwendeten Methode muss der Trocknungsschritt für die lokale Umgebung optimiert werden. Überwachen Sie regelmäßig, wie schnell die Wells trocknen, bis die typische Trocknungszeit ermittelt wurde. In einer Umgebung mit niedriger Luftfeuchtigkeit führt die Verwendung einer Trockenbox zu einer Trocknungszeit von ~30-40 Minuten. Lassen Sie die Platten nicht zu trocken werden, da das Medium in den Vertiefungen schrumpft und absinkt. Es ist besser, das Gerät aus dem Trocknen zu nehmen, während einige Vertiefungen noch nass sind, als es länger trocknen zu lassen und möglicherweise eine große Anzahl von Vertiefungen zu übertrocknen.
  4. Überprüfe die Wasserkristalle. Wenn der Großteil der Wasserkristalle in der Schale ausgetrocknet ist und während des Trocknungsvorgangs an Volumen verloren hat, geben Sie mehr in die Schale.
  5. Nachdem die Bakterien getrocknet sind, fügen Sie die Würmer sofort hinzu (Abschnitt 12) oder verschließen Sie die Schale, um sie später zu verwenden. Zum Verschließen schließen Sie den Deckel des Tabletts und wickeln Sie alle vier Seiten mit einem einzigen Stück Parafilm ein. Wiederholen Sie dies zweimal für insgesamt drei Parafilm-Schichten. Nachdem das Tablett vollständig eingewickelt wurde, kann das Gerät bis zu 4 Tage bei Raumtemperatur auf dem Tisch belassen werden, bevor die Würmer hinzugefügt werden (Abschnitt 12).

12. Hinzufügen von Würmern zum Multi-Well-Gerät

  1. Geben Sie manuell einen Wurm pro Vertiefung mit einem Platinpickel in jede Vertiefung, um die Tiere von den in Abschnitt 9 vorbereiteten Wurmplatten zu übertragen. Pflücken Sie nur Würmer, die sich im gewünschten Lebensstadium und Alter befinden.
    HINWEIS: Wenn Sie mehr als 1 Stunde benötigen, um die Würmer in das Gerät einzubringen, kann dies zu einer lmNGM-Austrocknung führen, daher sollten die Würmer so schnell wie möglich hinzugefügt werden. Wenn Sie mehrere Würmer (20+) gleichzeitig auswählen, bevor Sie sie zu den Gerätevertiefungen hinzufügen, kann dies dazu beitragen, die Geschwindigkeit zu erhöhen.

13. Abschluss der Vorbereitung des Produkts für den Langzeitgebrauch

HINWEIS: Diese Schritte stellen sicher, dass die Gerätevertiefungen für die Dauer des Experiments hydratisiert bleiben.

  1. Untersuche die Wasserkristalle. Stellen Sie sicher, dass die Wasserkristalle auf gleicher Höhe mit der Oberseite des Geräts sind, aber nicht darauf überlaufen. Geben Sie bei Bedarf weitere Wasserkristalle in das Tablett.
  2. Geben Sie einen Tropfen der vorbereiteten Waschmittellösung (siehe Schritt 1.5) auf die Innenseite des Schalendeckels und reiben Sie sie mit einem Arbeitstuch ein, bis die Waschmittellösung getrocknet ist. Dies verhindert ein Beschlagen des Deckels, nachdem das Gerät in der Schale versiegelt wurde, so dass die Würmer gut sichtbar sind.
  3. Wickeln Sie die Schale mit drei Stücken Parafilm ein, indem Sie eine spezielle Technik anwenden, die die langfristige Integrität der Parafilm-Versiegelung fördert.
    1. Dehnen Sie ein Stück Parafilm leicht, so dass es nur zwei Seiten des Tabletts bedeckt. Wiederholen Sie dies mit einem zweiten Stück Parafilm, um die anderen beiden Seiten abzudecken.
    2. Nehmen Sie auf die erste Schicht Parafilm ein letztes Stück Parafilm, dehnen Sie es vollständig und wickeln Sie alle vier Seiten ein. Bei ordnungsgemäßer Versiegelung sollten die Gerätevertiefungen ~2 Monate lang hydratisiert bleiben.
      Anmerkungen: Die Unversehrtheit von Parafilm sollte alle 1-2 Wochen überwacht werden, und der Parafilm sollte ausgetauscht werden, wenn er beschädigt ist.
  4. Entfernen Sie alle Fingerabdrücke von der Oberseite des Fachs mit einem mit 70 % Ethanol benetzten Arbeitstuch.

14. Erhebung der Daten

HINWEIS: Der Zweck dieser Studie ist es, die Kulturmethodik zu beschreiben. Einmal bestückt, sind Multiwell-Geräte mit der Längsschnittüberwachung einer Vielzahl von Phänotypen kompatibel. Hier finden Sie eine grundlegende Anleitung zur Messung einiger der gebräuchlichsten Parameter.

  1. Lebensdauer: Überwachen Sie die Lebensdauer, indem Sie auf die Platte klopfen oder die Würmer alle 1-3 Tage einem hellen blauen Licht aussetzen. Bewerten Sie als tot, wenn keine Bewegung beobachtet wird. Diese Multi-Well-Geräte sind auch mit automatisierten Bildgebungs- und Analyse-Pipelines kompatibel, um die Lebensdauerabzuschätzen 13,18.
  2. Aktivität: Überwachen Sie die Aktivität einzelner Tiere während des gesamten Lebens, indem Sie statische Bilder oder Videos der Tiere in den Gerätevertiefungen aufnehmen und die zurückgelegte Strecke, die Geschwindigkeit oder andere Bewegungsmetriken bewerten. Die Geräte sind auch mit automatisierten Bildgebungs- und Analyse-Pipelines zur Schätzung der Aktivitätkompatibel 13,18.
  3. Körpergröße und -form: Überwachen Sie die Veränderungen der Körpergröße und -form, indem Sie statische Bilder der Tiere in den Gerätevertiefungen aufnehmen und die visuellen Parameter mit Standard-Bildgebungsverfahren quantifizieren. Prinzipiell sollte diese Kulturmethode mit bestehender Software kompatibel sein, um eine differenziertere Beurteilung der Wurmkörperformzu ermöglichen 19,20,21.

15. Wiederverwendung der Geräte

HINWEIS: Nach Abschluss eines Experiments können die Multiwell-Geräte bis zu dreimal gereinigt und wiederverwendet werden. Eine zusätzliche Wiederverwendung wirkt sich auf die Phänotypen der Würmer aus, die möglicherweise durch Chemikalien aus dem Medium oder Bakterien verursacht werden, die sich in den Wänden des PDMS-Materials ansammeln.

  1. Entsorgen Sie den Parafilm und nehmen Sie das Gerät aus dem Fach. Überprüfen Sie die Kerben in der oberen rechten Ecke des Geräts, die anzeigen, wie oft es verwendet wurde. Wenn es dreimal verwendet wurde, entsorgen Sie das Gerät. Wenn es weniger als dreimal verwendet wurde, reinigen Sie es und verwenden Sie es wieder.
    Anmerkungen: Die Schalen bestehen aus Polystyrol und kommen nicht direkt mit lmNGM, Bakterien oder Zusatzstoffen des Mediums in Kontakt. Sie können viele Male wiederverwendet werden, solange sie visuell klar bleiben.
  2. Spülen Sie alle verbleibenden Wasserkristalle aus der Schale. Besprühen Sie die Innenseite der Schale mit 10%iger Bleichlösung und lassen Sie sie 10 Minuten einwirken. Mit deionisiertem Wasser abspülen und sofort trocknen, um Wasserflecken zu vermeiden.
  3. Halten Sie das Gerät unter fließendes Wasser, um mit der Reinigung des Mediums aus den Vertiefungen zu beginnen. Biegen und drehen Sie das Gerät vorsichtig unter Wasser, um das Medium aus den Vertiefungen zu lösen, aber biegen Sie es nicht so weit, dass das Gerät reißt. Ziehen Sie mit einer 200-μl-Pipettenspitze alle verbleibenden Medien heraus, die in Vertiefungen stecken.
  4. Füllen Sie einen 2-Liter-Becher mit einem Rührstab ~3/4 voll mit deionisiertem Wasser und bringen Sie ihn auf einer heißen Platte zum Kochen.
  5. Geben Sie ein oder zwei Multiwell-Geräte und einen Rührstab in das kochende Wasser. Schalten Sie das magnetische Rühren auf eine niedrige Drehzahl (~200 U/min) ein, um die Geräte im Wasser sanft zu bewegen. Lassen Sie die Geräte 10 Minuten kochen.
  6. Nehmen Sie die Geräte mit einer Metallpinzette aus dem Wasser und legen Sie sie zum Abtropfen mit der Bauchseite nach unten auf Küchenpapier. Lassen Sie die Geräte mindestens über Nacht trocknen.
  7. Wenn die Geräte vollständig getrocknet sind, wickeln Sie sie in Folie ein und versiegeln Sie sie mit Autoklavenklebeband. Schreiben Sie auf das Autoklavenband, wie oft das Gerät verwendet wurde. Zum Sterilisieren 15 Minuten im Trockenzyklus bei 121 °C autoklavieren. Die Geräte sind nun bereit für die Wiederverwendung.

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Representative Results

Das WorMotel-Kultursystem kann verwendet werden, um eine Vielzahl von Daten zu sammeln, unter anderem über Lebensdauer, Gesundheitsspanne und Aktivität. In veröffentlichten Studien wurden Multi-Well-Geräte verwendet, um die Lebensdauer und die Gesundheitsspanne 13,14, die Ruhephase und den Schlaf 22,23,24 und das Verhalten 25 zu untersuchen. Die Lebensdauer kann manuell oder durch eine Sammlung von Bildern und nachgeschaltete Bildgebungsanalysen bewertet werden. Beim ersteren Ansatz können die Würmer nach einem Stimulus (z. B. Klopfen auf die Platte oder Exposition gegenüber blauem Licht) alle 1-3 Tage manuell beobachtet und als tot eingestuft werden, wenn keine Bewegung beobachtet wird, ähnlich wie bei Standardmethoden auf Petriplatten1. Der letztere Ansatz ist ähnlich, mit der Ausnahme, dass die Wurmbewegung durch den Vergleich von Bild-zu-Bild-Unterschieden zwischen den Bildern, die nach dem Anwenden des Stimulus aufgenommen wurden, bestimmt werden kann. Dies bietet den zusätzlichen Vorteil, dass die Bewegung Informationen sowohl über das Aktivitätsniveau einzelner Tiere zu diesem Zeitpunkt liefert als auch eine Metrik liefert, anhand derer die Lebensspanne (z. B. Einstellung der Bewegung) und die Gesundheitsspanne (es wurden mehrere Definitionen vorgeschlagen) bestimmt werden können. Die Bilder können außerdem verwendet werden, um zusätzliche physiologische Parameter wie Körpergröße, Körperform und Körperhaltung zu extrahieren.

Um die Leistungsfähigkeit des Systems zu demonstrieren, untersuchten wir die klassische epistatische Beziehung zwischen dem Insulinrezeptor, der durch das Gen daf-2 kodiert wird, und dem nachgeschalteten Transkriptionsfaktor der FOXO-Familie, der von daf-16 kodiert wird, im Zusammenhang mit der Lebensdauer, der Gesundheit und der täglichen Aktivität einzelner Tiere. Wildtyp (Stamm N2) und daf-16(mu68) Funktionsverlust (Stamm CF1038) C. elegans fütterten mit E. coli (Stamm HT115) und exprimierten entweder Kontrolle (leerer Vektor; EV) oder daf-2 RNAi-Fütterungskonstrukte wurden in Multi-Well-Geräten kultiviert, und jedes Tier wurde auf Lebensdauer (Abbildung 2A), Gesundheitsspanne (Abbildung 2B) und tägliche Aktivität (Abbildung 2C) überwacht. Die Aktivität wurde täglich überwacht, indem alle 5 Sekunden für 2 Minuten eine Reihe von Standbildern aufgenommen wurde, wobei die Würmer 5 Sekunden lang bei 1 Minute hellem blauem Licht ausgesetzt wurden, um die Aktivität zu stimulieren (gemäß Churgin et al.13). Die tägliche Aktivität für jedes Tier wurde geschätzt, indem der Hintergrund über Vertiefungen und Bilder normalisiert, das Wurmgebiet in jedem Bild identifiziert und die Flächenänderung zwischen benachbarten Bildern berechnet wurde. Die Lebensspanne wurde definiert als das Alter, in dem die letzte Aktivität für jeden Wurm beobachtet wurde, und die Gesundheitsspanne wurde definiert als das Alter, in dem sich ein Wurm nicht mehr über die gesamte Körperlänge bewegen konnte. Wie aus zahlreichen früheren Studien (z.B. Kenyon et al.26, Murphy et al.27) zu erwarten war, führte die daf-16(mu86)-Mutation zu kurzen Lebensspannen und verhinderte eine Verlängerung der Lebensdauer durch den RNAi-Knockdown von daf-2 (Abbildung 2A). Ein ähnliches Muster wurde für die Gesundheitsspanne beobachtet (Abbildung 2B). Ein Vorteil der Verwendung von Multi-Well-Device-Kultursystemen ist, dass die Fähigkeit, einzelne Tiere ein Leben lang zu verfolgen, eine detaillierte Analyse der individuellen Variation jedes gemessenen Phänotyps in der gesamten Population ermöglicht. So kann beispielsweise die Variation der Lebens- und Gesundheitsspanne einzelner Tiere entweder absolut (Abbildung 2D) oder als Bruchteil der Gesamtlebensspanne (Abbildung 2E) verglichen werden. Phänotypen im frühen Leben können außerdem mit Phänotypen im späten Leben, einschließlich der Lebensspanne, bei einzelnen Tieren in einer Population verglichen werden. So korrelierte beispielsweise die kumulative Aktivität für jedes einzelne Tier über die gesamte Lebensspanne (d. h. die Fläche unter der Kurve [AUC] für die individuelle Aktivität) besser mit der Lebensspanne (Abbildung 2F) als die kumulative Lebensspanne bis zum 5. Lebenstag (Abbildung 2G) über alle gemessenen Bedingungen. Wir betonen, dass der Zweck dieser Arbeit darin besteht, ein detailliertes Protokoll für die Konstruktion der Multi-Well-Umgebung zur Verfolgung einzelner Tiere über die Zeit bereitzustellen, nicht für die Messung eines bestimmten Phänotyps mit dem Gerät. Die in Abbildung 2 dargestellten repräsentativen Ergebnisse sind nur ein Beispiel für die Phänotypen, die in diesem System gemessen werden können. Einmal konstruiert, ist die Multi-Well-Umgebung mit einer Vielzahl von Techniken zur Messung der Phänotypen von frei kriechenden Würmern auf festen Medien kompatibel.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung der mikrofabrizierten Multi-Well-Bauelemente . (A) Einzelne C. elegans werden auf festen, niedrigschmelzenden Nematoden-Wachstumsmedien (lmNGM) kultiviert, die in einzelnen Vertiefungen mit bakterieller Nahrung besiedelt sind. Der Raum zwischen den Vertiefungen ist mit einer aversiven Chemikalie (Kupfersulfat) beschichtet, um jeden Wurm in seiner Vertiefung zu isolieren. Jedes Gerät ist in einem Single-Well-Tray gesichert. Der Umfang des Tabletts ist mit Wasserkristallen gefüllt, um die Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten. Die Schale ist mit Parafilm versiegelt, um einen Sauerstoffaustausch zu ermöglichen. Bild erstellt mit BioRender.com. (B) Übersicht über die Multiwell-Vorrichtung mit Angabe der vorgeschlagenen Reihenfolge für die Beladung der Wells. Die inneren Vertiefungen (weiß) erhalten 14 μL lmNGM. Die äußeren Vertiefungen (grau) erhalten 15 μL lmNGM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Korrelation der gemessenen Phänotypen über Populationen hinweg bei einzelnen Tieren unter Verwendung von Multi-Well-Geräten. Alle Panels liefern Daten aus demselben Experiment, in dem vier Tiergruppen verglichen werden: Wildtyp-Tiere (N2), die einem leeren Vektor-EV(RNAi) ausgesetzt sind (N = 138), Wildtyp-Tiere, die daf-2(RNAi) erhalten haben (N = 151), daf-16(mu86)-Tiere, die EV(RNAi) erhalten haben (N = 123), und daf-16(mu86)-Tiere, die daf-2(RNAi) erhalten haben (N = 135). (A) Die Verlängerung der Lebensdauer von daf-2(RNAi) wird durch die daf-16(mu86) Nullmutation blockiert. Paarweise Signifikanz zwischen Gruppen, bestimmt durch den Log-Rank-Test (survdiff-Funktion in R). (B) Die hier definierte Gesundheitsspanne als der Tag, an dem ein Tier eine Ganzkörperlängenverlängerung von daf-2(RNAi) nicht mehr bewegen kann, wird durch die daf-16(mu86)-Nullmutation blockiert. Paarweise Signifikanz zwischen Gruppen, bestimmt durch den Log-Rank-Test (survdiff-Funktion in R). (C) Der gleitende 3-Tage-Mittelwert der Aktivität über die Lebensspanne wird sowohl durch daf-16(mu86) als auch durch daf-2(RNAi) reduziert. Signifikanz, die mit dem Mann-Whitney-U-Test berechnet wurde, um die Fläche unter der Kurve für die Aktivität einzelner Tiere über die Lebensspanne einzelner Tiere zwischen Gruppen zu vergleichen. (D) Gesundheitsspanne und Lebensdauer für jede Grundgesamtheit als absolute Werte (Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts). (E) Gesundheitsspanne und Lebenserwartung für jede Population, normalisiert auf die Gesamtlebensspanne innerhalb jeder Gruppe (Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts). (F) Die kumulative Aktivität über die Lebensspanne (Fläche unter der Kurve [AUC] über die Lebensspanne) für einzelne Tiere korreliert besser mit der Lebensdauer als (G) die Aktivität für einzelne Tiere an einem bestimmten Tag über die gesamte Lebensspanne (die Aktivitätskorrelation an Tag 8, die den Punkt darstellt, an dem die mittlere Aktivität maximiert ist, wird gezeigt), wie durch lineare Regression berechnet (lm-Funktion in R). n.s. = nicht signifikant, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Alle p-Werte wurden für Mehrfachvergleiche mit der Bonferroni-Methode für Vergleiche innerhalb der einzelnen Panels angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ergänzende Datei 1: STL-Datei zum Drucken der 3D-Multiwell-Geräteform Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Das WorMotel-System ist ein leistungsstarkes Werkzeug, um individualisierte Daten für Hunderte von isolierten C. elegans im Laufe der Zeit zu sammeln. In Anlehnung an die vorangegangenen Studien mit Multi-Well-Geräten für Anwendungen in der Entwicklungsruhe, im Bewegungsverhalten und im Altern war es das Ziel dieser Arbeit, die Präparation von Multi-Well-Geräten für die Langzeitüberwachung von Aktivität, Gesundheit und Lebensdauer in einem höheren Durchsatz zu optimieren. Diese Arbeit liefert ein detailliertes Protokoll für die Herstellung von Multi-Well-Geräten, das viele der Schritte aus dem ursprünglichen Protokoll13 optimiert, Schlüsselpunkte hervorhebt, die technische Schwierigkeiten darstellen können, und eine Diskussion über die Wiederverwendung der Platten und anderer Materialien bietet.

Für die Zwecke der Skalierung - als Labor, das derzeit zwischen 10 und 20 Geräte in einer typischen Woche vorbereitet - war eine der wichtigsten Überlegungen, ob die Geräte wiederverwendet werden können und wenn ja, in welchem Umfang. Die Herstellung von PDMS-Geräten ist mit höheren Zeit- und Kostenkosten verbunden als die Durchführung herkömmlicher Kulturen auf Petriplatten, aber diese höheren Kosten können durch die Wiederverwendung des PDMS oder anderer Komponenten des Systems reduziert werden. Bei vielen Wiederverwendungen begann das PDMS eine gelbe Färbung zu entwickeln, die wahrscheinlich die Anhäufung von Verbindungen aus den lmNGM-Medien oder Bakterien widerspiegelt. Die Tiere, die auf diesen Platten kultiviert wurden, zeigten auch eine höhere Fluchtrate und eine kürzere Lebenserwartung. Basierend auf Dutzenden von Experimenten sind drei Verwendungszwecke optimal für die Wiederverwendung dieser PDMS-Geräte, die es ermöglichen, altersbedingte Phänotypen ohne messbare Auswirkungen der PDMS-Degradation zu bewerten und gleichzeitig die Anzahl der neuen Geräte zu reduzieren, die geformt werden müssen (und damit Kosten sparen). Wir bestätigten ferner, dass Versuchstiere, die bei ihrer ersten, zweiten und dritten Verwendung auf Geräten gezüchtet wurden, Überlebenskurven erzeugten, die nahezu nicht unterscheidbar und statistisch nicht unterschiedlich waren (Daten nicht gezeigt). Die Schalen, in denen sich die Geräte befinden, bestehen aus Styropor und können unbegrenzt gereinigt und wiederverwendet werden, wenn sie frei von Kratzern oder anderen Flecken bleiben, die die Visualisierung der Würmer beeinträchtigen könnten.

Eine zentrale Herausforderung bei der Vorbereitung von Multiwell-Geräten für Anwendungen, die länger als ~2 Wochen dauern, ist die Verhinderung einer Plattenkontamination durch Umweltbakterien und Pilze. Es gibt mehrere Schritte, bei denen die Sterilisation entscheidend ist, um eine Kontamination zu verhindern. Dazu gehören das Autoklavieren aller Geräte vor dem Gebrauch, das Abkochen der zur Wiederverwendung vorgesehenen Geräte, das Autoklavieren der absorbierenden Wasserkristalle, die zur Aufrechterhaltung der Luftfeuchtigkeit verwendet werden, das Reinigen der Schalen, in denen sich die Geräte befinden, mit Bleichmittel und Ethanol vor dem Gebrauch und das Filtersterilisieren der Reinigungslösung, die auf den Deckel der Schale aufgetragen wird, um ein Beschlagen zu verhindern, und der Kupfersulfatlösung zugesetzt wird. Durch die Implementierung jeder dieser Änderungen wurden Kontaminationsereignisse deutlich reduziert, so dass die versiegelten Geräte über die gesamte Lebensdauer hinweg konsequent für die Längsüberwachung verwendet werden können, selbst unter Bedingungen für die Langlebigkeit (z. B. Knockout von daf-2), die eine Überwachung von >45 Tagen erfordern. Das hier beschriebene Protokoll enthält zwei Modifikationen des ursprünglichen Protokolls für Langzeitanwendungen, die darauf ausgelegt sind, eine konsistente Well-Trocknung aufrechtzuerhalten und eine Austrocknung zu verhindern. Zunächst wurde die Gesamttiefe des Geräts um 2 mm erhöht, um die Kapazität für Wasserkristalle zu erhöhen. In langen Experimenten, insbesondere in einer Umgebung mit niedriger Luftfeuchtigkeit, führten zu wenige Wasserkristalle in der Schale zum Austrocknen des lmNGM. Zusammen mit mehr Wasserkristallen war es notwendig, das Volumen der Agarose zu erhöhen, die den Vertiefungen am Rand des Geräts zugesetzt wurde. Diese Brunnen trockneten nach der Beladung des Brunnens (Abschnitt 6) zunächst aus und schrumpften. Die Verwendung von 14 μl Agarose in den inneren Vertiefungen reichte aus, um die Vertiefungen vollständig zu füllen, ohne die gewölbte Oberseite zu erzeugen, die durch eine Überfüllung der Vertiefungen entsteht. Die Zugabe von 15 μl Agarose zu den äußeren Vertiefungen ergab so viel Volumen, dass die Vertiefungen beim Austrocknen auf ein Niveau schrumpften, das mit den 14 μl vergleichbar war, die in den inneren Vertiefungen zugegeben wurden.

Eine der größten Abweichungen vom ursprünglichen Protokoll bestand darin, die Reihenfolge, in der der Benutzer lmNGM (Abschnitt 6) und Kupfersulfat (Abschnitt 7) lädt, umzukehren. Ursprünglich wurde zuerst das Kupfersulfat in den Graben gegeben, gefolgt von der Befüllung der Brunnen mit lmNGM13. Es wurde beobachtet, dass das Befüllen der Vertiefungen mit lmNGM so bald wie möglich nach der Plasmareinigung die Haftung des lmNGM an den Wellwänden verbesserte. Zu langes Warten nach der Plasmareinigung führte zu Vertiefungen mit Blasen und gewölbten Spitzen, die die Visualisierung der Würmer beeinträchtigen können. Die Priorisierung der Befüllung der Vertiefungen gegenüber der Zugabe von Kupfersulfat ist besonders wichtig, wenn mehrere Geräte gleichzeitig vorbereitet werden, um konsistente, qualitativ hochwertige lmNGM-Oberflächen zu gewährleisten. Ein Nachteil des ersten Befüllens der Vertiefungen besteht darin, dass die hydrophile Oberflächenmodifikation, die durch den Plasmareiniger erzeugt wird, merklich nachgelassen hat, wenn der Benutzer mit der Zugabe des Kupfersulfats fortfährt. Kupfersulfat fließt nicht leicht durch den Graben, wenn die Oberfläche weniger hydrophil wird, was es schwierig macht, eine vollständige Abdeckung zu erreichen. Die Zugabe von Reinigungsmittel zur Kupfersulfatlösung, das als Tensid wirkt, verbessert den Fluss der Lösung durch den Graben. Ein Platin-Drahtpickel kann auch verwendet werden, um das Kupfersulfat sanft durch den Graben zu führen, indem die Spannung an allen Stellen gebrochen wird, an denen das Kupfersulfat Schwierigkeiten beim Fließen hat. Wenn die Kupfersulfatlösung im Graben verbleibt, würde sie außerdem leicht in die Vertiefungen gelangen und die lmNGM-Oberfläche beim Kippen der Wanne kontaminieren. Die Art des Ladevorgangs macht es fast unmöglich, das Gerät durchgehend ausreichend waagerecht zu halten, um zu verhindern, dass Kupfer einen Teil der Bohrlöcher verunreinigt. Um dies zu berücksichtigen, wird die Kupfersulfatlösung aus dem Graben entfernt (Schritt 7.3), und das zurückbleibende Kupfersulfat reicht aus, um die meisten Würmer von der Flucht abzuhalten. Als abschließende Anmerkung zur Verwendung von Kupfersulfat als aversive Barriere können einige Repellentien altersassoziierte Phänotypen, einschließlich der Lebensdauer, beeinflussen. Die Verwendung von Kupfersulfat in diesen Multi-Well-Geräten wurde von Churgin et al.13 untersucht und es wurde festgestellt, dass sie keinen nachweisbaren Einfluss auf die Lebensdauer oder die Entwicklung hat.

Weitere kleinere Aktualisierungen des Protokolls konzentrieren sich auf die Verbesserung der Schritte, die zur Vorbereitung des PDMS unternommen wurden. Nach dem Mischen von PDMS-Basis und Härter wurde ein zusätzlicher Entgasungsschritt hinzugefügt, da dies ein Prozess ist, bei dem viele Blasen entstehen. Durch das Entfernen des Großteils der Blasen vor der Zugabe der Mischung zu den Geräteformen werden die nach dem zweiten Entgasungsschritt verbleibenden Blasen minimiert. Um sicherzustellen, dass die Unterseite des Geräts völlig flach und eben ist, ein Merkmal, das für die Belichtung ganzer Platten wichtig ist, wurde ein Stück Glas oder Acryl über die Oberseite der gefüllten Form gelegt. Dieser Schritt ist für Anwendungen, die jeweils nur ein Well untersuchen, nicht unbedingt erforderlich, aber dennoch hilfreich, da der Benutzer den Fokus für jedes Well manuell anpassen kann. Schließlich war eine Aushärtung des PDMS bei einer höheren Temperatur (55 °C) an dem Ort notwendig, an dem diese Version des Protokolls optimiert wurde (Tucson, Arizona, USA), im Gegensatz zu den 40 °C, die das ursprüngliche Protokoll (optimiert in Philadelphia, Pennsylvania, USA) angab. Dies deutet darauf hin, dass Unterschiede zwischen den Standorten (z. B. das Klima oder die genauen verwendeten Reagenzien und Geräte) die spezifischen Schritte im Protokoll beeinflussen können, wie z. B. die Aushärtungstemperatur oder die Trocknungstechniken, und dass diese möglicherweise an jedem Standort optimiert werden müssen. Zum Beispiel spielt die Luftfeuchtigkeit eine große Rolle bei der Bestimmung der Trocknungszeit für die Platten nach dem Spotten, und diese kann je nach Standort oder Jahreszeit stark variieren.

Prinzipiell kann dieses Multi-Well-Gerätesystem verwendet werden, um Daten über jeden Phänotyp zu sammeln, der unter Standard-Hellfeldmikroskopie auf Petriplatten gemessen werden kann - Lebensdauer, Gesundheitsspanne, unstimulierte/stimulierte Bewegung, Körpergröße und -form, Bewegungsgeometrie - mit der zusätzlichen Möglichkeit, diese Metriken für einzelne Würmer im Laufe der Zeit zu verfolgen. Wie in der Einleitung erwähnt, gibt es andere Methoden, um individuelle Daten über die gesamte Lebensspanne zu erfassen. Mikrofluidik-Vorrichtungen28 oder Multi-Well-Platten29 bieten die Möglichkeit, die Lebensgeschichte einzelner Tiere zu verfolgen, jedoch nur durch Kultivierung der Würmer in flüssigen Medien. Eine flüssige Umgebung kann das Transkriptom der Würmer verändern 10,11,30 im Vergleich zu festen Medien und induziert deutliche physiologische und Verhaltensänderungen, einschließlich episodischem Schwimmen 31, erhöhtem Energieverbrauch 10,32 und erhöhtem oxidativem Stress 10. Es ist unklar, inwieweit die Lebensdauer und andere Metriken im Zusammenhang mit gesundem Altern direkt zwischen flüssigen und festen Medien verglichen werden können. Festkultur-Multiwell-Geräte ermöglichen die Verfolgung einzelner Würmer in einer Umgebung, die mit der Standard-Gruppenkultur auf Petriplatten vergleichbar ist. Die gekrümmte Struktur der Gerätewand ermöglicht die Abbildung von Würmern überall im Inneren des Bohrlochs, wodurch diese Geräte prinzipiell mit ausgefeilteren Werkzeugen für die Einzelwurmanalyse, wie z. B. Worm Tracker33, kompatibel sind.

Die Möglichkeit, einzelne Tiere während des gesamten Verlaufs eines Experiments auf einem Multiwell-Gerät zu überwachen, geht mit mehreren Einschränkungen einher. Erstens benötigen diese Geräte selbst mit einem optimierten Protokoll mehr Zeit für die Einrichtung pro Tier als Standardkulturen auf Petriplatten, wodurch Einzeltierdaten auf Kosten der Gesamtprobengröße bereitgestellt werden. Die Würmer werden jedoch auch in individualisierten Vertiefungen isoliert, wodurch einige der Komplikationen beseitigt werden, die mit der automatisierten Messung der Lebensdauer verbunden sind, wie z. B. die automatische Erkennung einzelner Tiere, die sich nicht mehr bewegen, während sie sich berühren. Die Automatisierung macht die Zeit, die durch die komplexere Einrichtung verloren geht, mehr als wett und bietet die Möglichkeit für ein höheres Hochdurchsatz-Screening13,18. Zweitens führen experimentelle Bedingungen, die die Würmer mehr ablehnen als den Kupfersulfatgraben, wie z. B. starke Stressmittel (z. B. Paraquat) oder Nahrungseinschränkungen, dazu, dass die Würmer aus den Brunnen in den Graben fliehen. Drittens ermöglichen die PDMS-Geräte zwar Hellfeld- und Dunkelfeldmikroskopie, das PDMS-Material neigt jedoch dazu, sowohl eine hohe als auch eine ungleichmäßige Hintergrundfluoreszenz zu aufweisen, wobei letztere wahrscheinlich darauf zurückzuführen ist, dass Staub oder andere Mikropartikel während des Formens in das PDMS eingebettet werden, was ihre Anwendung in der Fluoreszenzmikroskopie einschränkt. Schließlich deuten die im PDMS beobachteten Verfärbungen bei Geräten, die über mehrere Experimente wiederverwendet wurden, und die damit verbundene Verkürzung der Lebensdauer und die Zunahme der Flucht darauf hin, dass die Medienkomponenten und andere zugesetzte Chemikalien im Laufe der Zeit in das PDMS gelangen. In welchem Ausmaß sich dies auf Alterungsphänotypen oder medikamentöse Behandlungen auswirken kann, wird derzeit untersucht. Wie bereits erwähnt, gibt es eine alternative Methode für eine Einzelwurmkultur, die den PDMS-Multiwell-Geräten ähnelt, aber stattdessen kommerziell erhältliche Mikroschalen verwendet, um isolierte Tiere zu kultivieren16. Diese Mikroschalen bestehen aus Polystyrol, wodurch das potenzielle Problem des Auslaugens von Medienkomponenten vermieden wird, und verfügen über einen konsistenten Fluoreszenzhintergrund, der eine direkte In-vivo-Fluoreszenzbildgebung direkt auf der Platte ermöglicht. Die Microtray-Vertiefungen sind auch von Palmitinsäure umgeben, anstelle des Kupfersulfats, das in dem hier beschriebenen Protokoll verwendet wird, was aversiver ist und den Anteil der Würmer reduziert, die ihre Vertiefungen verlassen, selbst im Falle von stressauslösenden Stoffen und diätetischen Einschränkungen. Diese Vorteile werden auf Kosten einer geringeren Verpackungseffizienz der Wells realisiert, da die Mikroschalen im Gegensatz zu den 240 Schnecken der PDMS-Geräte die Kultivierung von maximal 96 Schnecken in einem einzigen Tray ermöglichen. Die Spezifika des gewünschten Ergebnisses eines Experiments beeinflussen, welches dieser Systeme verwendet werden soll.

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Disclosures

Die Autoren geben an, dass sie keine Interessenkonflikte offenzulegen haben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde unterstützt durch NIH R35GM133588 an G.L.S., einen United States National Academy of Medicine Catalyst Award an G.L.S., den State of Arizona Technology and Research Initiative Fund, der vom Arizona Board of Regents verwaltet wird, und die Ellison Medical Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.5 lb weight CAP Barbell RP-002.5
Acrylic sheets (6 in x 4 in x 3/8 in) Falken Design ACRYLIC-CL-3-8/1224 Large sheet cut to smaller sizes 
Ampicillin sodium salt Sigma-Aldrich A9518
Autoclavable squeeze bottle Nalgene 2405-0500
Bacto agar BD Difco 214030
Bacto peptone Thermo Scientific 211677
Basin, 25 mL VWR 89094-664 Disposable pipette basin 
Cabinet style vacuum desiccator  SP Bel-Art F42400-4001 Do not need to use dessicant, only using as a vacuum chamber. 
CaCl2 Acros Organics 349615000
Caenorhabditis elegans N2 Caenorhabditis Genetics Center (CGC) N2 Wildtype strain
Carbenicillin  GoldBio C-103-25
Centrifuge Beckman 360902
Cholesterol ICN Biomedicals Inc 101380
Compressed oxygen tank Airgas UN1072
CuSO4 Fisher Chemical C493-500
Dry bead bath incubator Fisher Scientific 11-718-2
Escherichia coli OP50  Caenorhabditis Genetics Center (CGC) OP50 Standard labratory food for C. elegans
Ethanol Millipore ex0276-4
Floxuridine Research Products International F10705-1.0
Hybridization oven Techne 731-0177 Used to cure PDMS mixture, any similar oven will suffice
Incubators Shel Lab 2020 20 °C incubator for maintaining worm strains and 37 °C incubator to grow bacteria 
Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) GoldBio I2481C100
K2HPO4 Fisher Chemical P288-500
KH2PO4 Fisher Chemical P286-1
Kimwipes KimTech 34155 Task wipes
LB Broth, Lennox BD Difco 240230
Low melt agarose Research Products International A20070-250.0
MgSO4 Fisher Chemical M-8900
Microwave  Sharp R-530DK
Multichannel repeat pipette, 20–200 µL LTS EDP3 Rainin 17013800 The exact model used is no longer sold, a similar model's catalog number has been provided
NaCl Fisher Bioreagents BP358-1
Nunc OmniTray Thermo Scientific 264728 Clear polystyrene trays
Parafilm M Fisher Scientific 13-374-10 Double-wide (4 in)
Petri plate, 100 mM  VWR 25384-342
Petri plate, 60 mM  Fisher Scientific FB0875713A
Plasma cleaner Plasma Etch, Inc. PE-50
PLATINUM vacuum pump JB Industries DV-142N 
PolyJet 3D printer Stratasys  Objet500 Connex3 PolyJet 3D printing services provided by ProtoCAM (Matrial: Vero Rigid; Finish: Matte; Color: Gloss; Resolution: X-axis: 600 dpi, Y-axis: 600 dpi, Z-axis: 1600 dpi)
Shaking incubator Lab-Line 3526CC
smartSpatula LevGo, Inc. 17211 Disposable spatula
Superabsorbent polymer (AgSAP Type S) M2 Polymer Technologies Type S Referred to in main text as "water crystals"
SYLGARD 184 Silicone Elastomer base The Dow Chemical Company 2065622
SYLGARD 184 Silicone Elastomer curing agent The Dow Chemical Company 2085925
Syringe filter (0.22 µm) Nest Scientific USA Inc.  380111
Syringe, 10 mL  Fisher Scientific 14955453
TWEEN 20 Thermo Scientific J20605-AP Detergent
Vacuum pump oil VWR 54996-082
VeroBlackPlus Stratasys  RGD875 Rigid 3D printing filament
Weigh boat Thermo Scientific WB30304 Large enough for PDMS mixture volume

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References

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