Summary
Diese Methode beschreibt einen lektinbasierten in vitro Sedimentationsassay zur Quantifizierung der Bindungsaffinität von Glucanphosphatase und Amylopektin. Dieser Co-Sedimentations-Assay ist zuverlässig für die Messung der Glucan-Phosphatase-Substratbindung und kann auf verschiedene solubilisierte Glucan-Substrate angewendet werden.
Abstract
Glucan-Phosphatasen gehören zur größeren Familie der Dual-Spezifity-Phosphatasen (DSP), die Glucansubstrate wie Glykogen bei Tieren und Stärke bei Pflanzen dephosphorylieren. Die Kristallstrukturen der Glucan-Phosphatase mit Modell-Glucan-Substraten zeigen unterschiedliche Glucan-bindende Grenzflächen aus DSP- und Kohlenhydrat-bindenden Domänen. Quantitative Messungen von Glucan-Glucan-Phosphatase-Wechselwirkungen mit physiologisch relevanten Substraten sind jedoch grundlegend für das biologische Verständnis der Glucan-Phosphatase-Enzymfamilie und die Regulation des Energiestoffwechsels. Dieses Manuskript berichtet über einen Concanavalin A (ConA)-basierten in vitro Sedimentationsassay, der entwickelt wurde, um die Substratbindungsaffinität von Glucanphosphatasen gegen verschiedene Glucansubstrate nachzuweisen. Als Proof of Concept wurde die Dissoziationskonstante (KD) der Glucanphosphatase Arabidopsis thaliana Starch Excess4 (SEX4) und Amylopektin bestimmt. Die Charakterisierung von SEX4-Mutanten und anderen Mitgliedern der Glucan-Phosphatase-Familie von Enzymen demonstriert die Nützlichkeit dieses Assays zur Beurteilung der differentiellen Bindung von Protein-Kohlenhydrat-Interaktionen. Diese Daten zeigen die Eignung dieses Assays zur Charakterisierung eines breiten Spektrums von Stärke- und Glykogen-interagierenden Proteinen.
Introduction
Glucan-Phosphatasen sind Mitglieder einer funktionell vielfältigen Unterfamilie von Dual-Spezifitäts-Phosphatasen (DSPs) innerhalb der Protein-Tyrosin-Phosphatase (PTP)-Superfamilie1. Sie wurden in den meisten Lebensformen gefunden, einschließlich sehr unterschiedlicher photosynthetischer Organismen, Menschen, Wirbeltieren und einigen wirbellosen Tieren und Protisten 2,3,4. Pflanzen enthalten drei bekannte Glucan-Phosphatasen: Stärkeüberschuss4 (SEX4), Like Sex Four1 (LSF1) und Like Sex Four2 (LSF2)5,6,7. Pflanzen, denen Glucanphosphatasen fehlen, zeigen eine verringerte Rate des vorübergehenden Stärkeabbaus und der Anreicherung von Stärke in den Blättern 8,9. Laforin ist das Gründungsmitglied der Glucan-Phosphatase-Familie, die Glykogen bei Wirbeltieren und Menschen dephosphoryliert 3,10. Die Mutationen von Laforin führen zur neurodegenerativen Lafora-Krankheit, einer tödlich verlaufenden autosomal-rezessiven Form der Epilepsie11. Glucanphosphatasen sind für den Glykogen- und Stärkestoffwechsel notwendig und haben sich als wichtige Enzyme für die Modulation des Stärkegehalts in Pflanzen und die Behandlung der neurodegenerativen Lafora-Krankheit herauskristallisiert12,13. Neuere Röntgenkristallographie-Untersuchungen an Glucanphosphatasen mit Modell-Glucan-Substraten haben Aufschluss über die Substratbindung und den katalytischen Mechanismus der Glucan-Dephosphorylierunggegeben 14,15,16,17. Das derzeitige Verständnis darüber, wie Glucanphosphatasen an ihre physiologischen Substrate binden, ist jedoch unvollständig.
Stärke ist ein unlösliches Glukosepolymer, das zu 80%-90% aus Amylopektin und zu 10%-20% aus Amylosebesteht 18. Die Substrate für pflanzliche Glucanphosphatasen sind phosphorylierte Kohlenhydratmoleküle wie Glykogen- und Stärkekörner. Die phosphorylierten Glucosylreste liegen in einem Phosphat:Glucosyl-Restverhältnis von 1:600 vor. Interessanterweise sind die Phosphate nur auf den Amylopektinmolekülen19 vorhanden. Die pflanzliche Haupt-Glucan-Phosphatase SEX4 wirkt auf die Stärkekörner, um Amylopektinmoleküle zu dephosphorylieren. Die Röntgenkristallstruktur von SEX4 in Kombination mit strukturgesteuerten Mutagenesestudien hat die einzigartigen Substratspezifitäten von SEX4 für verschiedene Positionen innerhalb einer Glucanstruktur gezeigt15. Kürzlich konnten wir zeigen, dass die biologisch relevante Aktivität von SEX4 nur beobachtet werden kann, wenn es auf seine solubilisierten Amylopektinsubstrateeinwirkt 20. Das Verständnis der Glucan-SEX4-Wechselwirkungen hat sich jedoch aufgrund der strukturellen Komplexität des Substrats, der breiteren Bindungsspezifität und der geringen Bindungsaffinitäten zwischen dem Protein und seinen Substraten als schwierig erwiesen. Diese Probleme haben die Fähigkeit behindert, Methoden zu nutzen, die üblicherweise in Protein-Ligand-Interaktionen verwendet werden, wie z. B. die isotherme Titrationskalorimetrie (ITC), die Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) und ELISA-basierte Assays (Enzyme-linked Immunosorbent Assay).
Interessanterweise stammt ein Großteil unseres Verständnisses der Kohlenhydrat-Protein-Wechselwirkungen aus der Untersuchung von Lektinen. Concanavalin A (ConA) ist eine Familie von Leguminosen-Lektinen, die ursprünglich aus der Jackbohne gewonnen wurden. ConA bindet Kohlenhydrate mit hoher Spezifität, was für den Einsatz in Drug-Targeting- und Drug-Delivery-Anwendungen von Vorteil ist. Die Bindung von ConA an eine Vielzahl von Substraten, die nicht-reduzierendes α-D-Mannosyl und α-D-Glucosyl enthalten, wurde umfassend untersucht19,20. Kommerziell erhältliche ConA-gebundene Sepharose-Kügelchen werden üblicherweise zur Reinigung von Glykoproteinen und Glykolipiden verwendet21. ConA bindet an diese Glucane über C3-, C4- und C6-Hydroxylgruppen der Glukosereste. ConA-Sepharose-Beads wurden auch erfolgreich verwendet, um die Bindung von Glykogen-Protein- und Stärke-Protein-Wechselwirkungen zu messen22,23. In dieser Studie haben wir ConA-Sepharose-Beads verwendet, um einen Bindungsassay zu entwickeln, um die Bindungsspezifität von Glucan-Phosphatase-Amylopektin-Interaktionen zu messen.
Zuvor wurde ein ConA-basierter Sedimentationsassay verwendet, um die Bindungsfähigkeit des Glucanphosphatase-Substrats zu beurteilen14,20,24. In dieser Arbeit wurde die gleiche Strategie verwendet, um eine neuartige Methode zur Bestimmung der Bindungsaffinität von Glucan-Glucan-Phosphatase- und Kohlenhydrat-Interaktionen zu entwickeln. Diese Methode hat auch einen Vorteil für die Untersuchung verschiedener solubilisierter Kohlenhydrat-Protein-Wechselwirkungen.
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Protocol
1. Herstellung von ConA-Sepharose-Kügelchen
- Stellen Sie 250 ml eines Bindepuffers her, der 67 mM HEPES (pH 7,5), 10 mMMgCl2 und 0,2 mM CaCl2enthält. Stellen Sie den pH-Wert mit 1 M NaOH-Lösung ein.
- Pipettieren Sie 250 μl ConA-Sepharose-Bead-Suspension in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie den Inhalt bei 10.000 x g für 30 s bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand.
HINWEIS: Für jede für den Assay verwendete Amylopektinkonzentration werden 250 μl ConA-Sepharose-Beads in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen benötigt. - Geben Sie 750 μl des Bindungspuffers in jedes Röhrchen, das 250 μl ConA-Sepharose-Kügelchen enthält. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 10.000 x g für 1 min bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt 2x, um sicherzustellen, dass die Perlen ordnungsgemäß gewaschen und mit dem Bindepuffer im Gleichgewicht sind.
2. Herstellung von Amylopektinlösungen
- Stellen Sie eine Stammlösung von 10 mg/ml Kartoffelamylopektin her. Amylopektin ist wasserunlöslich und kann durch Hitze aufgelöst werden. Zur Solubilisierung 0,1 g Kartoffel-Amylopektin in 10 ml destilliertes Wasser geben. Erhitzen Sie die Suspension im Wasserbad bei 80 °C für 1 h oder bis die Lösung nicht mehr trüb ist.
- Lassen Sie die Lösung wieder auf Raumtemperatur (RT) kommen, wobei Sie wiederholt vortexen, um ein Verklumpen zu vermeiden.
- Die alkoholalkalische Behandlung ist eine alternative Methode zur Solubilisierung von Amylopektinsubstraten. Um mit dieser Methode zu solubilisieren, führen Sie die folgenden Schritte aus.
- 0,5 g Amylopektinsubstrat werden in 5 ml 20%igem Ethanol und 5 ml 2 M NaOH suspendiert. Rühren Sie den Inhalt 15-20 min bei RT kräftig um.
- Als nächstes fügen Sie 10 ml Wasser hinzu und stellen den pH-Wert der Lösung auf 6,5 ein, indem Sie 2 M HCl hinzufügen. Bringen Sie das Volumen der resultierenden Lösung mit destilliertem Wasser auf 50 ml, um eine 10 mg/ml Amylopektinlösung herzustellen.
- Verdünnen Sie die 10 mg/ml gelöste Amylopektinlösung, um eine Reihe von 2 ml verdünnten Amylopektinlösungen herzustellen. Führen Sie beispielsweise halbe Verdünnungen von 10 mg/ml durch, um eine Reihe von Amylopektinkonzentrationen herzustellen (5 mg/ml, 2,5 mg/ml, 1,25 mg/ml, 0,625 mg/ml, 0,3125 mg/ml, 0,156 mg/ml, 0,078 mg/ml, 0,039 mg/ml, 0,019 mg/ml und 0 mg/ml).
3. Herstellung von ConA-Sepharose: Amylopektin-Kügelchen
- Geben Sie 250 μl jeder verdünnten Amylopektinlösung in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit 250 μl ConA-Sepharose-Kügelchen, die in Bindepuffer voräquilibriert sind. Mischen Sie den Inhalt gut. Beschriften Sie die Röhrchen mit der entsprechenden Amylopektinkonzentration.
- Den Inhalt auf einem rotierenden Rad bei 4 °C für 30 min inkubieren.
HINWEIS: Der an ConA-Sepharose:Amylopektin-gebundene Komplex ändert sich nach 20 Minuten nicht im Laufe der Zeit. Die Inkubationszeit von 30 Minuten wurde gewählt, indem die Inkubationszeiten von 10 Minuten bis 1 Stunde variiert wurden, um sicherzustellen, dass ein Gleichgewicht erreicht wurde. - Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 10.000 x g für 1 Min. Sammeln Sie den Überstand in einem neu gekennzeichneten 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Bewahren Sie diese überstehenden Fraktionen auf, um den D-Glukose-Assay12 durchzuführen (saure Hydrolyse von Amylopektin, gefolgt von UV-Bestimmung der Glukose mittels enzymatischem Assay). Dieser Schritt ist notwendig, um sicherzustellen, dass das gesamte Amylopektin an die Kügelchen gebunden ist.
- Fügen Sie 750 μl Bindungspuffer zu den ConA-Sepharose:Amylopektin-Beads hinzu. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 10.000 x g für 1 Min. Verwerfen Sie den Überstand, um alle ungebundenen Amylopektinmoleküle zu entfernen.
- Wiederholen Sie Schritt 3.4, um eine ausreichende Wäsche zu gewährleisten. Jedes Röhrchen enthält nun ConA-Sepharose-Kügelchen, die an unterschiedliche Mengen an Amylopektin-Substraten gebunden sind.
4. Inkubation von SEX4 mit ConA-Sepharose:Amylopektin-Beads
- Mischen Sie 250 μl ConA-Sepharose:Amylopektin-Beads mit 100 μl des Bindungspuffers, der 10 μg SEX4-Protein, 10 mM Dithiothreitol (DTT) und 10 μM Proteaseinhibitor-Cocktail (PIC) enthält. Beachten Sie, dass das Gesamtvolumen in jedem Röhrchen 350 μl beträgt.
HINWEIS: Ein Proteasehemmer-Cocktail wird vorsorglich hinzugefügt, um einen unnötigen SEX4-Abbau zu vermeiden. Dies ist ein optionaler Schritt. In diesem Assay wird das rekombinante Protein Arabidopsis thaliana SEX4 (AtSEX4) verwendet. Das gereinigte Protein enthält einen N-terminalen Histidin-Tag, der für den Nachweis des Proteins mittels Chemilumineszenz erforderlich ist. Detaillierte Informationen zur Aufreinigung von Glucanphosphatasen sind in früheren Veröffentlichungen 14,20,24 beschrieben. - Inkubieren Sie das Protein und die ConA-Sepharose:Amylopektin-Bead-Suspension bei 4 °C für 45 min unter sanfter Rotation.
Anmerkungen: Die Inkubationszeit von 45 Minuten wird gewählt, um sicherzustellen, dass das Gleichgewicht für den Komplex erreicht wird. - Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 10.000 x g für 1 Min. Pipettieren Sie 50 μl des Überstandes vorsichtig mit einer Gelladespitze in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie 20 μl 4x SDS-PAGE-Farbstoff und 10 μl Wasser in jedes Röhrchen, das 50 μl der gesammelten Überstandsfraktionen enthält. Erhitzen Sie die Proben bei 95 °C für 10 min. Speichern Sie diese Beispiele für die Ausführung der SDS-PAGE-Gele. Stellen Sie sicher, dass 10 neue Röhrchen mit der Aufschrift "Überstand (S)" die entsprechenden Substratkonzentrationen aufweisen.
- Geben Sie 750 μl des Bindungspuffers in die ConA-Sepharose:amylopectin: SEX4-Kügelchen, um ungebundenes Protein aus den Kügelchen zu entfernen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 10.000 x g für 1 Min. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal, um eine ordnungsgemäße Wäsche zu gewährleisten. Entsorgen Sie den Überstand.
- Geben Sie 20 μl 4x SDS-PAGE-Farbstoff und 80 μl destilliertes Wasser in die Röhrchen mit gewaschenen ConA-Sepharose:Amylopektin:SEX4-Kügelchen. Erhitzen Sie die Proben 10 min lang bei 95 °C und zentrifugieren Sie sie 1 min lang bei 10.000 x g .
- Entsorgen Sie das Pellet und bewahren Sie den Überstand für den Betrieb der SDS-PAGE-Gele auf. 80 μl des Überstandes in neue Röhrchen pipettieren und als "Pellet (P)" kennzeichnen.
5. Ausführen von SDS-PAGE-Gelen
- Laden Sie 40 μl der ungebundenen Proteinproben (hergestellt in Schritt 2.3, mit S gekennzeichnet) in 4%-12%ige vorgefertigte Polyacrylamid-Gelvertiefungen von der niedrigsten bis zur höchsten, aber lassen Sie die erste Spur frei, um den Proteinmolekulargewichtsmarker zu laden. Verwenden Sie ein zweites Gel, um 10 gebundene Proteinproben zu laden, die in Schritt 2.5 hergestellt wurden (gekennzeichnet als P).
- Frisch zubereiteten SDS-PAGE Laufpuffer in beide Kammern des Gerätes geben. Lassen Sie das Gel 35 Minuten lang bei 150 V laufen oder bis die Farbstofffront den Boden des Gels erreicht.
- Entfernen Sie das Laufgel aus dem Gerät und entfernen Sie die Abstandshalter und Glasplatten. Verwenden Sie das separierte Gel, um eine Western-Blot-Analyse durchzuführen.
6. Western Blot zur Chemilumineszenz-Detektion14,15
HINWEIS: Diese Methode kann leicht modifiziert/angepasst werden, je nachdem, welche Western-Blotting-Geräte die Benutzer in ihren Laboren haben.
- 1 l Transferpuffer mit 5,8 g Tris-Base, 2,9 g Glycin, 0,37 g SDS und 200 ml Methanol herstellen.
- Übertragen Sie die größengetrennten Proteine aus dem Polyacrylamidgel auf eine Nitrozellulosemembran. Schwämme, Filterpapiere, Gel und Nitrozellulosemembran nach westlichem Transferprotokoll14,15 kurz zusammenbauen. 1 h bei 70 V laufen lassen.
- Um eine unspezifische Proteinbindung zu verhindern, inkubiert man die Nitrocellulosemembran, die die Proteinlösung aus 1%-5% Rinderserumalbumin (BSA) oder Milchprotein enthält, in 50 ml TBST-Puffer (20 mM Tris [pH 7,5], 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20) für 1 h. Waschen Sie die Membran 3x mit TBST-Puffer, um ungebundene Blockierlösung zu entfernen.
- Inkubieren Sie die Membran 1 h lang mit einem Meerrettichperoxidase (HRP)-gekoppelten Antikörper, der spezifisch für das His-markierte Protein ist. Waschen Sie die Membran 3x in TBST-Puffer, um ungebundene Antikörper zu entfernen. Verwenden Sie eine 1:2.000-Verdünnung des Antikörpers gegen TBST für optimale Reproduzierbarkeit und Sensitivität.
- Der HRP-Enzym-gekoppelte Antikörper bindet spezifisch an den Histidin-Tag des SEX4-Proteins, was in Gegenwart von Chemilumineszenz-Reagenzien eine Bande ergibt. Stellen Sie für die digitale Bildgebung eine Lösung aus gleichen Teilen chemilumineszierender Substratlösungen (jeweils 750 μl) in einem 1,5-ml-Röhrchen her. Inkubieren Sie die Membran mindestens 5 Minuten lang in der Lösung.
- Legen Sie das Membranprotein mit der Seite nach unten auf den Blot-Scanner und führen Sie die Erfassungssoftware aus, um das Protein sowohl in der Pellet- als auch in der Überstandsfraktion zu quantifizieren.
7. Datenanalyse
- Führen Sie die quantitativen Signalmessungen mit der Erfassungssoftware mit dem Blot-Scanner durch. Normalisieren Sie alle quantitativen Messungen in den Überstands- und Pelletfraktionen auf das insgesamt beladene Protein.
HINWEIS: Die Software ermöglicht die Quantifizierung der Intensität jeder Proteinbande in den Überstands- und Pelletfraktionen. - Im Experiment zur Sättigungsbindung wird der Prozentsatz der proteingebundenen im Vergleich zur Amylopektinkonzentration aufgetragen. Passen Sie die Daten an Y = Bmax x X/(K D + X) an, indem Sie die Datenanalysesoftware verwenden, um KD zu berechnen.
HINWEIS: Bmax ist die maximale spezifische Bindung, die Y-Achse ist der Prozentsatz des gebundenen Proteins, die und die X-Achse ist die Amylopektinkonzentration.
Abbildung 1: Überblick über den Arbeitsablauf des ConA-Sepharose-Sedimentationsassays. (A) Herstellung von ConA-Sepharose-Beads. (B) Inkubation mit Amylopektinsubstrat. (C) Inkubation mit SEX4-Protein. (D) Trennung von gebundenen und ungebundenen Proteinfraktionen durch Zentrifugation. (E) Trennung von Proteinen durch SDS-PAGE. (F) Western-Blot-Analyse. (G) Chemilumineszenz-Nachweis von His-markiertem SEX4-Protein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Representative Results
Eines der Hauptmerkmale der Glucan-Phosphatase-Proteinfamilie ist ihre Fähigkeit, an Glucansubstrate zu binden. Zunächst wurde die Bindungskapazität von SEX4 an ConA-Sepharose:Amylopektin-Beads mittels SDS-PAGE analysiert (Abbildung 2A). Rinderserumalbumin (BSA) diente als Negativkontrolle, um eine unspezifische Bindung von Proteinen an die ConA-Sepharose:Amylopektin-Kügelchen nachzuweisen. Die SDS-PAGE-Analyse von Proteinen zeigte das Vorhandensein von SEX4-Protein in der Pelletfraktion und BSA in der Überstandsfraktion. W278A, eine bekannte SEX4-Mutante mit signifikant reduzierter Glucanbindungsfähigkeit, wurde ebenfalls in den Assay aufgenommen. Die W278A-Mutante erschien in der Überstandsfraktion, was auf den Nutzen und die Spezifität dieses Assays zum Nachweis der Glucan-Bindungsfähigkeit von SEX4-Proteinen hinweist. Während SDS-PAGE die SEX4-Proteine visualisierte, gab es Bedenken hinsichtlich der Empfindlichkeit und Verwendung von kleinen Glucan-Phosphatasen; Zum Beispiel könnte das ConA-Lektin-Protein möglicherweise die Detektion kleiner Proteine wie LSF2 stören. Um zu testen, ob diese Methode nur die Glucan-Phosphatasen nachweisen kann, wurde ein Western-Blot mit einem Antikörper durchgeführt, der spezifisch für den N-terminalen Histidin-Tag ist. In der Tat gab es einen signifikanten Anstieg bei der Detektion von SEX4, und die Methode ist spezifisch für den Nachweis von Glucanphosphatasen mit einem N-terminalen Histidin-Tag (Abbildung 2B). Die quantitative Messung von Ligand-Protein-Interaktionsexperimenten erfordert die Durchführung wesentlicher Kontrollen zur Bestimmung der geeigneten Liganden- und Proteinkonzentrationen. Daher wurde als nächstes der Co-Sedimentations-Assay bei drei verschiedenen SEX4-Konzentrationen getestet (Abbildung 2C-E). Während 2 μg SEX4 für die Visualisierung mittels Chemilumineszenz-Detektion ausreichen, ermöglicht die Verwendung von 5 oder 10 μg SEX4 eine genauere Detektion der partiellen Bindung. Die SEX4-Bindung gegen unterschiedliche Amylopektinkonzentrationen (0,5 mg/ml, 1,0 mg/ml und 5 mg/ml) wurde ebenfalls getestet. Diese Ergebnisse deuten auch auf eine erhöhte SEX4-Bindung bei erhöhter Amylopektinkonzentration hin, wobei eine gesättigte Bindung bei 5 mg/ml Amylopektin vorliegt.
Um die Bindungsaffinität von Amylopektin und SEX4-Wildtyp-Protein zu bestimmen, wurden 10 μg SEX4 mit Amylopektin (bis zu 5 mg/ml) inkubiert und die Bindung bei jeder Konzentration bestimmt (Abbildung 3A). Die Anpassung der prozentualen proteingebundenen Daten an das spezifische One-Site-Bindungsmodell ergab einen KD von 1,03 ± 0,23 mg/ml (Abbildung 3B). Es gibt keine verfügbare Kristallstruktur des SEX4-Wildtyp-Proteins; Stattdessen zeigt die Kristallstruktur der katalytisch inaktiven SEX4 C198S-Mutante die Bindungsschnittstelle von SEX4, die aus DSP- und Kohlenhydrat-bindenden Molekülen (CBM) besteht. Die Bindungsaffinität von SEX4 C198S und der Amylopektin-Interaktion wurde mit einem KD von 0,11 ± 0,05 mg/ml für C198S-mutierte Proteine bestimmt; a ~10-fach erhöhte die Bindungsaffinität im Vergleich zum SEX4-Wildtyp-Protein. Während der genaue Mechanismus der erhöhten Bindung von C198S nicht verstanden ist, ist es faszinierend zu sehen, wie eine Einzelpunktmutation von SEX4 zu einer signifikanten Erhöhung der Glucan-Bindungsfähigkeit führt.
Als nächstes wurde die Anwendbarkeit dieser Methode zur Messung der Bindung von Laforin, LSF2, Mais (Zea mays) SEX4 und Kartoffel (Solanum tuberosum) SEX4 gegen Kartoffelamylopektin untersucht. Unter Verwendung des hier vorgestellten Protokolls zeigten die Ergebnisse, dass Laforin, LSF2 und SEX4 aus agronomisch wichtigen Nutzpflanzen ebenfalls unterschiedlich an Amylopektin binden, was auf unterschiedliche Bindungsmechanismen für jedes Protein hindeutet (Abbildung 4A,B). Insgesamt zeigten diese Ergebnisse eine erfolgreiche Methodenentwicklung zur Bestimmung der Substratbindung von Glucanphosphatase mit Amylopektinsubstraten.
Abbildung 2: Visualisierung der SEX4-Fraktionen von Pellet (P) und Überstand (S) und Optimierung der Assay-Parameter. (A) Visualisierung von 5 μg SEX4-Protein (34 kDa) in den Pellet- und Überstandsfraktionen mittels SDS-PAGE- und Coomassie-Färbung. Die Proteinbanden bei 25 kDa und darunter sind für das ConA-Protein, das an Sepharose-Beads gebunden ist. (B) Visualisierung von SEX4-Proteinen in den Pellet- und Überstandsfraktionen mittels westlicher Analyse. 5 μg des SEX4-Proteins wurden über einen Antikörper nachgewiesen, der für den Histidin-Tag entwickelt wurde. (C-E) Die westliche Analyse wurde mit unterschiedlichen Mengen an SEX4-Protein (2 μg, 5 μg und 10 μg) und Amylopektinkonzentrationen (0,5 mg/ml, 1,0 mg/ml und 5,0 mg/ml) durchgeführt. Für alle Experimente wurde ein Volumen von 250 μL Beads und eine Inkubationszeit von 30 min verwendet, um eine Gleichgewichtsbindung zu gewährleisten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Quantitativer In-vitro-Sedimentationsassay . (A) Repräsentative Daten zur Erschöpfung des Überstandes und zum allmählichen Anstieg des Pelletsignals des SEX4-Wildtyp-Proteins, wenn die Amylopektinkonzentration von 0 mg/ml auf 5 mg/ml anstieg. (B) Der Prozentsatz des SEX4-Wildtyp-Proteins, das gegen unterschiedliche Mengen an Amylopektin gebunden ist, die auf ConA-Sepharose-Beads immobilisiert sind. Die Kügelchen wurden 1 Minute lang bei 10.000 x g pelletiert, und sowohl der Überstand als auch die Pelletproteine wurden durch SDS-PAGE getrennt, durch westliche Analysen detektiert und quantifiziert, um die prozentuale Bindung zu messen. Die Daten stellen die durchschnittliche ± SD von drei Replikaten dar. (C) Repräsentative Daten über die Depletion des Überstands und den allmählichen Anstieg des Pelletsignals des SEX4 C198S-Proteins bei Erhöhung der Amylopektinkonzentration von 0 mg/ml auf 5 mg/ml. (D) Der prozentuale Anteil des SEX4 C198S-Proteins, das gegen unterschiedliche Mengen an Amylopektin gebunden ist, das auf ConA-Sepharose-Beads immobilisiert ist. Die Kügelchen wurden 1 Minute lang bei 10.000 x g pelletiert, und sowohl der Überstand als auch die Pelletproteine wurden durch SDS-PAGE getrennt, durch westliche Analysen detektiert und quantifiziert, um die prozentuale Bindung zu messen. Die Daten stellen die durchschnittliche ± SD von drei Replikaten dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Substratbindung von SEX4-Orthologen, Laforin, LSF2 gegen solubilisiertes Amylopektin. (A) Repräsentative Bindung jedes Proteins mit 5 mg/ml Amylopektin, immobilisiert in ConA-Sepharose-Beads. (B) Der prozentuale Anteil des gebundenen Proteins wurde unter Verwendung der normalisierten Chemilumineszenzsignale berechnet, die für drei unabhängige Experimente erhalten wurden. Die Daten stellen den Mittelwert ± SD von drei Replikaten dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Diese Arbeit demonstriert die erfolgreiche Entwicklung eines neuartigen in vitro Sedimentationsassays, der die Bestimmung der Bindungsaffinität von Glucan-Glucan-Phosphatase-Interaktionen ermöglicht. Das Assay-Design nutzt die spezifische Bindung von Lektin ConA an Glucane über die Hydroxylreste der Glukose, um gelöste Kohlenhydratsubstrate indirekt auf Sepharose-Beads einzufangen. Dies ermöglicht die Trennung von gebundenen und ungebundenen Proteinfraktionen durch Zentrifugation und Bestimmung der Bindungsaffinität von solubilisierten Glucansubstraten und Glucanphosphatasen. Es wurde festgestellt, dass alle getesteten Glucan-Phosphatasen spezifisch an Amylopektin binden, ohne dass eine Bindung an ConA-Sepharose-Beads in Abwesenheit von Amylopektin nachweisbar ist.
Das Experiment wurde durchgeführt, um die Bindungsaffinität mit einer kleinen, festen Menge des SEX4-Proteins und einer Reihe von Amylopektinkonzentrationen zu messen, die an ConA-Sepharose-Beads gebunden sind. Ein Überschuss an ConA-Sepharose-Kügelchen wurde verwendet, um die höchste Amylopektinkonzentration zu gewährleisten, die an die Kügelchen bindet. Die vollständige Bindung von Amylopektin wurde mittels eines Glukose-Assays getestet. Das im Manuskript vorgestellte Protokoll verwendet quantitative Sedimentation, um gebundene und ungebundene Proteinfraktionen zu trennen, sowie Gelelektrophorese und westliche Analysen, um die Menge an SEX4 im Überstand im Vergleich zu der Menge zu messen, die an die ConA-Sepharose:Amylopektin-Beads gebunden ist. Die Quantifizierung des Pelletanteils erfordert nur minimales Waschen, um das Bindungsgleichgewicht nicht zu stören. Um eine Unterschätzung der Pelletfraktion zu vermeiden, reicht es aus, die Konzentration von freiem SEX4 im Überstand zu messen und die Differenz des gebundenen SEX4:Amylopektin-Komplexes zu berechnen, anstatt das Pellet zu untersuchen.
Der hier beschriebene in vitro Sedimentationsassay bestimmte die differentielle Bindungsaffinität des SEX4-Wildtyp-Proteins. Interessanterweise liegt die Bestimmung der Bindungsaffinität des SEX4-Wildtyp-Proteins unter Verwendung des entwickelten in vitro Sedimentationsassays in den höheren Bereich des berichteten Wertes, der mit einem Gel-Shift-Assay25 bestimmt wurde. Der Bindungsassay sollte empfindlich auf niedrigere Substratkonzentrationen reagieren und unkompliziert sein, während der Gel-Shift-Assay die Herstellung einzelner nativer Gele in Gegenwart unterschiedlicher Mengen an Glucansubstraten erfordert. Diese zeitaufwändige Methode begrenzt die Anzahl der Konzentrationen, die getestet werden können, und ein begrenzter Substratkonzentrationsbereich kann getestet werden. Stattdessen ist die Probenvorbereitung mit unserem In-vitro-Sedimentationsassay schnell und zuverlässig. Der Vergleich des SEX4-Wildtyp-Proteins und der SEX4 C198S-Mutante zeigt einen zehnfachen Unterschied in der Bindungsaffinität. In dieser Hinsicht ist dieser Assay sensitiv, um die Bindung von SEX4-mutierten Proteinen quantitativ und qualitativ zu bestimmen.
Protein-Kohlenhydrat-Interaktionen sind für viele wichtige biologische Prozesse von entscheidender Bedeutung, darunter Katalyse, Zellsignalisierung und Erkennung. Sie gewinnen auch aufgrund ihrer wichtigen Rolle in der Pharma- und Lebensmittelindustrie zunehmend an Aufmerksamkeit. Die Röntgenkristallographie wird häufig eingesetzt, um Proteinstrukturen auf atomarer Ebene zu erhalten. Die strukturelle Heterogenität und Flexibilität von Kohlenhydratsubstraten erschwert jedoch die Gewinnung kohlenhydratgebundener Proteinstrukturen. In jüngster Zeit wurden auch Kryo-EM und Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) eingesetzt, um die Strukturen von kohlenhydratbindenden Proteinen zu bestimmen26. Trotz der vielen Fortschritte in hochauflösenden Strukturtechniken ist es schwierig, Strukturen von Kohlenhydrat-Protein-Komplexen zu erhalten. Infolgedessen konnte nur eine begrenzte Anzahl von Protein-Kohlenhydrat-Komplexstrukturen experimentell gelöst werden. Darüber hinaus liefern Kristallstrukturen nur eine Momentaufnahme eines Proteins bei einer bestimmten Konformation und nicht die dynamische Natur der Substratbindung. Alternativ werden verschiedene biophysikalische Techniken, einschließlich der isothermen Titrationskalorimetrie (ITC) und der Oberflächenplasmonenresonanz (SPR), verwendet, um Protein-Kohlenhydrat-Wechselwirkungen zu messen27. Allerdings sind auch diese Methoden nicht ohne Einschränkungen. Eine große Herausforderung bei der Bestimmung von Protein-Kohlenhydrat-Interaktionen sind ihre relativ schwachen Wechselwirkungen im Vergleich zu anderen Protein-Ligand-Interaktionen. Die Wechselwirkungen im Bereich von hohen mikromolaren bis niedrigen mikromolaren Bereichen verringern die Verwendbarkeit von ITC und SPR erheblich. Indirekte Methoden, wie Gel-Shift- und Pull-Down-Assays, haben bei der Bestimmung von Wechselwirkungen, die mit anderen Methoden schwer zu beurteilen sind, erhebliche Aufmerksamkeit erlangt25. Daher ist dieser Bindungsassay ein breit anwendbarer Ansatz für empfindliche Messungen von Protein- und löslichen Kohlenhydrat-Interaktionen.
Glykogen und Stärke sind wichtige Kohlenhydratspeichermoleküle, die aus verzweigten Polymeren der Glukose bestehen. Das Verzweigungsmuster, die Flexibilität und das Vorhandensein verschiedener Mikrodomänen innerhalb der Stärke und des Glykogens erfordern interagierende Proteine, um einzigartige Substratbindungsmechanismen anzunehmen. Ein Großteil des Verständnisses der Substraterkennungsmechanismen von SEX4 wurde durch röntgenkristallographische Studien in Verbindung mit strukturgesteuerter Mutagenese gewonnen. Um Stärke zu dephosphorylieren, muss SEX4 mit signifikant unterschiedlichen Mikrodomänen des Stärkegranulats interagieren, um Phosphate für die positionsspezifische Dephosphorylierung zu lokalisieren. Experimentell bleibt es eine Herausforderung, die Bindungsaffinitäten von Glucanphosphatasen zu bestimmen, da die Wechselwirkungen zwischen dem Protein und den Glucanen schwach sind und die Kohlenhydrate strukturell flexibel und heterogen sind. In diesem Manuskript wird eine Methode zur Bestimmung der Bindungsaffinitäten von Glucan-Phosphatase-Kohlenhydrat-Interaktionen mit Hilfe eines Concanavalin A (ConA)-basierten in vitro Sedimentationsassays vorgestellt. Glucanphosphatasen nutzen unterschiedliche Mechanismen, um Kohlenhydrate zu binden, zu lokalisieren und zu dephosphorylieren. Bisher wurde die ITC eingesetzt, um die Bindungsaffinität von Laforin- und linearen Oligosaccharidketten zu messen. Es gab jedoch keine Studie, die die Bindungsaffinitäten von Glucanphosphatasen mit ihren physiologischen Substraten über direkte Techniken wie ITC und SPR aufdeckte. Um den Nutzen dieses Assays zur Bestimmung der Substratbindung von Glucanphosphatasen besser zu verstehen, wurde die Bindung von Laforin, LSF2 und SEX4 gegen Amylopektin untersucht. Zukünftige Studien können durchgeführt werden, um die Bindungsaffinität aller Glucanphosphatasen und ihrer physiologisch relevanten Glucansubstrate experimentell zu bestimmen. Einer der kritischen Schritte der Methode besteht darin, die optimalen Inkubationszeiten und den Substratkonzentrationsbereich für den Assay zu bestimmen. Jede Glucanphosphatase bindet unterschiedlich an das Substrat, und die Methode ist für SEX4 optimiert. Es ist wichtig, erste Optimierungsexperimente durchzuführen, um diese Parameter herauszufinden. Eine weitere Einschränkung ist die Verwendung von Histidin-markiertem Protein für den Assay. Wenn jedoch Antikörper für das Studienprotein vorhanden sind, kann die Methode leicht für jedes Glucan-interagierende Protein optimiert werden.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Studie wurde durch den Preis der National Science Foundation MCB-2012074 unterstützt. Die Autoren danken Dr. Craig W. Vander Kooi vom Department of Biochemistry and Molecular Biology der University of Florida für wertvolle Gespräche und Unterstützung. Die Autoren danken auch Dr. Matthew S. Gentry vom Department of Biochemistry and Molecular Biology der University of Florida für seine Unterstützung. Wir bedanken uns bei Dr. Sara Lagalwar, Vorsitzende des Neurowissenschaftsprogramms des Skidmore College, für die Erlaubnis, den LICOR C-Digit-Blot-Scanner für die Western-Blot-Bildgebung zu verwenden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6x-His Tag monoclonal antibody (HIS.H8), HRP | Therm Fisher Scientific | MA1-21315-HRP | |
| Biorad gel electrophoresis and Western blot kit | Biorad | 1703930 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 208291 | |
| C-Digit blot scanner | LICOR | 3600-00 | Blot scanner |
| Complete protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | |
| Concanavalin A-sepharose beads | Sigma-Aldrich | C9017 | This product contains in 0.1 M acetate buffer, pH 6, containing 1 M NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, and 1 mM MgCl2 in 20% ethanol |
| Centrifuge | Eppendorf | 5425R | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| GraphPad Prism 8.0 software | GraphPad | Version 8.0 | Data analysis software |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H8651 | |
| Image Studio | LICOR | 3600-501 | Acquisition Software |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A452SK-4 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | PI28312 | |
| Potato amylopectin | Sigma-Aldrich | A8515 | |
| Precast SDSPAGE Gels | Genscript | M00653S | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP154-1 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | MP1TWEEN201 | |
| Westernsure premium chemiluminescence substrate | LI-COR | 926-95000 |
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