Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Анализ влияния сложного солевого стресса на прорастание семян и анализ солеустойчивости перца (Capsicum annuum L.)

Published: November 30, 2022 doi: 10.3791/64702
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Life Sciences College, Gannan Normal University

Summary

В приведенной ниже статье представлен протокол измерения всхожести семян, роста рассады и физиологических показателей двух сортов перца с различиями толерантности к солености в ответ на шесть смешанных концентраций соли. Этот протокол может быть использован для оценки толерантности к соли сортов перца.

Abstract

Для определения солеустойчивости и физиологического механизма перца (Capsicum annuum L.) на стадии прорастания в качестве материалов исследования используются сорта Hongtianhu 101 и Xinxiang 8, имеющие большие различия в толерантности к соли. Используют шесть смешанных концентраций соли 0, 3, 5, 10, 15 и 20 г/л, полученных с использованием равных молярных соотношений Na2CO3, NaHCO3, NaCl, CaCl2, MgCl2, MgSO4 и Na2SO4 . Чтобы определить их эффекты, измеряются соответствующие показатели прорастания семян, роста рассады и физиологии, а толерантность к соли всесторонне оценивается с использованием анализа функции принадлежности. Результаты показывают, что по мере увеличения концентрации смешанных солей потенциал всхожести, индекс всхожести, скорость прорастания, индекс всхожести семян, длина корня и свежий вес корней двух сортов значительно уменьшаются, тогда как относительная скорость соли постепенно увеличивается. Длина гипокотила и свежий вес над землей сначала увеличиваются, а затем уменьшаются, в то время как активность малондиальдегида (MDA), пролина (Pro), каталазы (CAT), пероксидазы (POD) и супероксиддисмутазы (SOD) уменьшаются, а затем увеличиваются. Потенциал всхожести, индекс прорастания, скорость прорастания, индекс силы прорастания семян, длина корня, свежий вес корня, содержание MDA и Pro и активность CAT семян Hongtianhu 101 выше, чем у Xinxiang 8 для всех концентраций соли, используемых здесь. Тем не менее, длина гипокотила, свежий вес над землей и относительная норма соли в Hongtianhu 101 ниже, чем в Xinxiang 8. Всесторонняя оценка толерантности к соли показывает, что общие взвешенные значения двух индексов функции членства сначала увеличиваются, а затем уменьшаются по мере увеличения концентрации смешанной соли. По сравнению с 5 г/л, который имеет наибольшее значение функции принадлежности, индекс при концентрациях соли 3 г/л, 10 г/л и 15 г/л снижается на 4,7%-11,1%, 25,3%-28,3% и 41,4%-45,1% соответственно. Это исследование обеспечивает теоретическое руководство по разведению солеустойчивых сортов перца и анализ физиологических механизмов, участвующих в солеустойчивости и солеустойчивом культивировании.

Introduction

Соленость является основным ограничивающим фактором для урожайности сельскохозяйственных культур во всем мире1. В настоящее время почти 19,5% орошаемых земель в мире и 2,1% засушливых земель страдают от солености, и примерно 1% сельскохозяйственных земель ежегодно вырождается в соленые щелочные земли. Ожидается, что к 2050 году 50% пахотных земель будут затронуты засолением 2,3. В дополнение к природным факторам, таким как естественное выветривание горных пород и соленая дождевая вода вблизи или вокруг побережья, быстрое поверхностное испарение, малое количество осадков и необоснованные методы управления сельским хозяйством усугубили процесс засоления почвы. Засоление почвы подавляет рост корней растений и уменьшает поглощение и транспортировку воды и питательных веществ от корней растений к листьям. Это торможение приводит к физиологической нехватке воды, дисбалансу питательных веществ и токсичности ионов, что приводит к снижению урожайности сельскохозяйственных культур и полной потере урожайности. Засоление обрабатываемых земель постепенно становится одним из наиболее критических абиотических стрессовых факторов, влияющих на мировое сельскохозяйственное производство продовольствия4. Солевой стресс уменьшает пахотные земли, доступные для сельского хозяйства, что может привести к значительному дисбалансу между спросом и предложением будущей сельскохозяйственной продукции. Таким образом, изучение влияния засоления почв на рост сельскохозяйственных культур и физиологические и биохимические механизмы способствует выведению солеустойчивых сортов, устойчивому использованию засоленной почвы и безопасности сельскохозяйственной продукции.

Перец (Capsicum annuum L.) высаживается во всем мире благодаря своей высокой питательной и лекарственной ценности. Например, капсаицин является алкалоидом, отвечающим за пряный вкус перца. Капсаицин может быть использован для облегчения боли, потери веса, улучшения сердечно-сосудистой системы, желудочно-кишечного тракта и дыхательной системы, а также в ряде других применений5. Перец также богат биологически активными веществами, особенно различными антиоксидантными соединениями (каротиноидами, фенолами и флавоноидами) и витаминомС6. В настоящее время перец, как сообщается, является овощной культурой с самой большой площадью выращивания в Китае, с ежегодной площадью посадки более 1,5 х 106 га, что составляет 8%-10% от общей площади посадки овощей в Китае. Перечная промышленность стала одной из крупнейших овощных отраслей в Китае и имеет самую высокую стоимость выпуска7. Однако выращивание перца часто подвергается различным биологическим (вредители и грибы) и абиотическим стрессам, особенно соляному стрессу, который оказывает прямое негативное влияние на прорастание, рост и развитие семян, что приводит к снижению урожайности плодов перца и качества8.

Прорастание семян является первым этапом взаимодействия растений и окружающей среды. Прорастание семян очень чувствительно к колебаниям в окружающих средах, особенно к соляному стрессу почвы, который может оказывать обратное влияние на физиологию и метаболизм и в конечном итоге нарушать нормальный рост, развитие и морфогенез культур9. В предыдущих исследованиях широко изучалось прорастание семян перца и рост рассады в условиях солевого стресса; однако в большинстве исследований NaCl использовался в качестве единственной соли для индукции стресса 10,11,12. Однако повреждение почвенных солей в основном обусловлено токсичностью ионов Na+, Ca2+, Mg 2+, Cl-,CO32- и SO 4 2-ионной токсичностью, вызванной диссоциацией солей натрия, кальция и магния. Из-за синергизма и антагонизма между ионами воздействие смешанной соли и одной соли на рост и развитие сельскохозяйственных культур может быть совершенно различным. Однако соответствующие характеристики прорастания семян перца и роста в смешанной соли до сих пор неясны. Поэтому в качестве материалов в этом исследовании используются два сорта перца с заметными различиями в толерантности к соли. Анализ влияния различных концентраций соли на прорастание, рост семян перца, физиологические и биохимические показатели после эквимолярного смешивания семи солей может выявить механизм реакции прорастания семян перца на стресс солености. Это также может обеспечить теоретическую основу для выращивания крепких саженцев перца, а также высокой урожайности и качественного выращивания на засоленных обрабатываемых землях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы представляем протокол оценки характеристик реакции и внутренних механизмов прорастания семян перца и роста рассады при различных смешанных солевых стрессах, который может служить эталонным методом оценки толерантности семян к соли.

1. Экспериментальная подготовка

  1. Подготовьте семена сельскохозяйственных культур для сортов - Hongtianhu 101 с сильной толерантностью к соли и Xinxiang 8 с низкой толерантностью.
  2. Готовят 0,2% раствор KMnO4 в качестве реагента для дезинфекции семян. Сначала взвесьте 4,0 г KMnO4, а затем добавьте 2000 мл дистиллированной воды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перманганат калия обычно нестабилен из-за его сильного окисления; соответственно, его готовят непосредственно перед употреблением.
  3. Приготовьте смешанные соли, используя семь солей, включая карбонат натрия, бикарбонат натрия, хлорид натрия, хлорид кальция, хлорид магния, сульфат магния и сульфат натрия13. Добавьте одинаковое молярное количество каждого, которое последовательно составляет 14,8%, 11,7%, 8,2%, 15,5%, 13,3%, 16,7% и 19,8% от общего массового соотношения смешанных солей соответственно.
  4. Готовьте чашки Петри (одноразовая) и фильтровальную бумагу (среднескоростная качественная фильтровальная бумага), обе диаметром 9 см.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Материал чашки Петри может быть изменен; однако диаметр чашки Петри и фильтровальной бумаги должен быть одинаковым.

2. Замачивание семян и подготовка к прорастанию

  1. Для оптимизации семян выбирайте семена перца с одинаковым размером и полными частицами из каждого сорта, со средним диаметром 4,2 мм и 3,7 мм для семян Hongtianhu 101 и Xinxiang 8 соответственно. Рассчитайте общее количество выбранных семян в соответствии с тестовой рабочей нагрузкой.
  2. Для обеззараживания семян замочите выбранные семена перца в 0,2% растворе KMnO4 в течение 15 мин, а затем пять раз промойте дистиллированной водой.
  3. Для замачивания семян переложите стерилизованные семена в дистиллированную воду и дайте им замочиться в течение 24 ч. Смойте семена несколько раз дистиллированной водой и высушите для дальнейшего использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время замачивания семян для разных культур может варьироваться.

3. Прорастание семян и рост рассады

  1. Готовят шесть концентраций смешанных солей: 0 (контрольная), 3, 5, 10, 15 и 20 г/л. Измерьте проводимость солевого раствора с помощью измерителя проводимости; значения EC проводимости раствора составляют 0,092, 3,05, 4,73, 8,33, 11,53 и 15,22 мс/см соответственно.
  2. Для приготовления семян равномерно поместите 40 семян перца в чашку Петри с двумя слоями фильтровальной бумаги. Подготовьте семена к шести экспериментальным обработкам и повторите каждую обработку пять раз.
  3. Для прорастания семян добавьте подходящее количество шести смешанных концентраций соли в чашку Петри, чтобы фильтровальная бумага оставалась влажной. Поместите семена в воздушный инкубатор при 28 °C и влажности воздуха 80% для прорастания в темноте.
  4. После прорастания семян дайте саженцам продолжать расти в свете (интенсивность света около 450 люкс; световой цикл 12/12ч) в инкубаторе в течение 14 дней после посева. Температура и влажность на стадии роста рассады должны быть такими же, как и на стадии прорастания.
  5. Пополняйте раствор в чашке для культивирования каждые 12 ч, чтобы сохранить влажную фильтровальную бумагу, и полностью промывайте фильтровальную бумагу каждые 24 ч соответствующей концентрацией смешанного солевого раствора, чтобы поддерживать постоянную концентрацию смешанной соли в чашке Петри.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество раствора соли, добавляемого во влажные семена, может регулироваться в зависимости от стадий прорастания и роста семян. Существует множество методов поддержания постоянной концентрации солевых растворов в культуральных блюдах. Помимо методов, описанных в данном эксперименте, может быть использована стратегия добавления дистиллированной воды по весу.

4. Измерение и расчет показателей

  1. Определение показателей всхожести семян
    1. Определите норму всхожести ежедневно после посева, при этом в качестве маркера прорастания в качестве маркера всхожести костыль разрушается семенная оболочка, достигающая половины длины диаметра семени.
    2. Рассчитайте скорость всхожести, потенциал прорастания, относительную скорость соли, индекс всхожести и индекс силы прорастания семян, используя следующие формулы:
      Всхожесть (%) = (количество нормальных проросших семян на 7-й день после посева/количество испытуемых семян) × 100
      Всхожесть (%) = (количество нормальных проросших семян на 3-й день после посева/количество испытуемых семян) × 100
      Относительная скорость соли (%) = (контрольная всхожесть - скорость прорастания лечения)/контрольная скорость всхожести × 100
      рассчитывается с использованием нормы всхожести семян на 7 день после посева
      Индекс прорастания (GI) = ∑ [Gt/Dt]
      где Gt относится к числу всхожести семян в период времени (t) после посева, а Dt относится к соответствующим дням прорастания
      Индекс силы прорастания семян (VI) = GI x S
      где S — длина корня
  2. Определение индекса роста рассады
    1. На 14 день после посева случайным образом выберите 10 представительных саженцев из каждой чашки Петри и измерьте длину корня и длину гипокотила.
    2. С помощью ножа разделите рассаду перца на две части: радикулярную и надземную. Удалите воду из рассады, протирая, и взвесьте рассаду отдельно, чтобы определить свежий вес.
  3. Определите активность антиоксидантного фермента, уровень малондиальдегида (MDA) и содержание пролина (Pro) в перце следующим образом.
    1. Чтобы сохранить рассаду перца, отбирайте репрезентативные цельные саженцы перца (примерно 24,0 г) из каждой обработки на 14-й день после посева. После удаления поверхностных вод немедленно заморозьте рассаду в жидком азоте на 1 мин и храните их в холодильнике при сверхнизкой температуре (-80 °С).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество образцов саженцев перца, хранящихся в холодильнике со сверхнизкой температурой, должно быть достаточным на случай необходимости повторного тестирования некоторых показателей.
    2. Извлеките приблизительно 1,0 г образца рассады из каждой обработки, собранной в трех экземплярах. Поместите образец рассады в центрифужную трубку, добавьте жидкий азот и измельчите образец с помощью шлифовального стержня для определения физиологических показателей рассады. Определяемые индексы и схема измерения приведены ниже.
    3. Определение активности защитного фермента рассада (пероксидазы [POD], каталазы [CAT], супероксиддисмутазы [SOD]), содержания малонового сильдегида (MDA) и пролина (Pro) с использованием коммерчески доступного набора (на основе спектрофотометрии) для каждого фактора14.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более ранние наблюдения не выявили различий в солевом стрессе между концентрациями смешанных солей 15 и 20 г/л. В результате измеряется только пять концентраций соли (0, 3, 5, 10 и 15 г/л).
  4. Комплексная оценка толерантности к соли с использованием метода функции членства
    ПРИМЕЧАНИЕ: Функция членства использует метод нечеткой математики, который преобразует качественную оценку в количественную оценку15 для оценки различных физиологических показателей, затронутых повреждением солями.
    1. Вычислите значение функции членства, используя следующую формулу Zhoubin Liu et al.15:
      Ri = (Xi - Xmin)/(Xmax - Xmin)
      Если признак отрицательно коррелирует с солевой толерантностью, вычислите обратную функцию членства, используя:
      Ri = 1 - (Xi - Xmin)/(Xmax - Xmin)
      Накапливайте значения принадлежности каждого физиологического индекса, где Xi — измеренное значение определенного признака, Xmax и Xmin — максимальное и минимальное значения для Xi, соответственно, а Ri — значение принадлежности этого признака.
    2. Включите следующие соответствующие показатели: характеристики прорастания семян (потенциал прорастания, скорость прорастания, индекс всхожести и индекс силы прорастания семян), характеристики роста рассады на стадии прорастания (длина корня, длина гипокотила, свежий вес корня и свежий вес над землей), MDA, Pro и активность защитных ферментов (CAT, POD, SOD) для расчета значения функции принадлежности. Значения функции членства получены из каждого индикатора.
  5. Используйте электронные таблицы и программное обеспечение SPSS (версия 22.0) для анализа и обработки тестовых данных и применяйте метод наименьшей значимой разницы (LSD) для нескольких сравнений для выявления существенных различий. Используйте корреляционный анализ Пирсона, чтобы исследовать корреляцию между всхожестью семян и физиологическими показателями рассады перца при сложном солевом стрессе.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Характеристики прорастания семян
По мере увеличения концентрации смешанных солей потенциал прорастания и индекс прорастания Hongtianhu 101 и Xinxiang 8 значительно снижаются. Оба сорта имеют резкое снижение концентрации соли с 0-3 г/л и медленное и устойчивое снижение концентрации соли с 3-20 г/л (рисунок 1A,B). Скорость прорастания двух сортов постепенно уменьшается по мере увеличения концентрации смешанных солей, а относительная норма соли для сортов постепенно увеличивается. Достоверной разницы в скорости прорастания и относительной скорости соли при концентрациях соли 3-15 г/л нет. Однако разница значительна при всех других концентрациях соли (рис. 1С,D). Что касается толерантности к соли между двумя сортами, потенциал всхожести, индекс прорастания и скорость прорастания семян Hongtianhu 101 с увеличением концентрации смешанных солей выше, чем у Xinxiang 8, тогда как относительная скорость соли ниже, чем у Xinxiang 8.

По мере увеличения концентрации смешанных солей (0-15 г/л) индекс всхожести семян двух сортов значительно снижается. Когда концентрация смешанной соли составляет 15 г/л, индекс всхожести семян Hongtianhu 101 и Xinxiang 8 снижается на 91,0% и 94,6% соответственно по сравнению с контрольной группой. Следует отметить, что снижение не является значительным, когда концентрация смешанных солей дополнительно увеличивается с 15 до 20 г / л. Индекс силы прорастания семян Hongtianhu 101 выше, чем у Xinxiang 8 при каждом уровне концентрации смешанной соли (рисунок 1E).

Характеристики роста рассады
По мере увеличения концентрации смешанных солей (0-15 г/л) длина корня и свежий вес корня Hongtianhu 101 и Xinxiang 8 значительно уменьшаются. Когда концентрация смешанной соли составляет 15 г/л, длина корня Hongtianhu 101 и Xinxiang 8 уменьшается на 89,4% и 91,1% соответственно, а масса корней в свежем виде уменьшается на 81,7% и 71,2% соответственно по сравнению с контрольной массой. Однако, когда концентрация соли составляет 15-20 г/л, длина корня и свежий вес корней двух сортов существенно не изменяются (рисунок 2A,C). Длина корня и свежий вес корня Hongtianhu 101, как правило, выше, чем у Xinxiang 8 с увеличением уровня смешанных солей, с очевидными различиями в концентрациях от 0 до 10 г / л.

Длина гипокотила и свежий вес над землей двух сортов увеличиваются, а затем уменьшаются с увеличением концентрации смешанной соли. Оба индекса достигают своих наивысших значений при концентрации соли 5 г/л. Аналогичным образом, когда концентрация соли составляет 15-20 г/л, длина гипокотила и свежий вес над землей двух сортов несколько уменьшаются. Исходя из сортовых различий, длина гипокотила и свежий вес над землей Xinxiang 8 выше, чем у Hongtianhu 101 при каждой концентрации соли (рисунок 2B, D).

Перекисное окисление мембранных липидов и содержание вещества осмотической регулировки
По мере увеличения концентрации смешанной соли содержание MDA и Pro в двух сортах уменьшается, а затем увеличивается. Содержание MDA и Pro достигает своих самых низких значений при концентрациях 5 г/л и 3 г/л соответственно (рисунок 3A,B). Содержание MDA несколько снижается при концентрациях соли 0-5 г/л и быстро увеличивается при 10 г/л. По сравнению с обработкой 5 г/л содержание MDA после обработки 10 г/л увеличивается на 59,9%-64,8%, а затем остается неизменным. Содержание MDA в Hongtianhu 101 выше, чем в Xinxiang 8 при различных концентрациях соли (рисунок 3A). Снижение содержания Pro при 0-3 г/л не является существенным, и между двумя разновидностями обнаружена небольшая разница. Когда концентрация соли составляет 3-15 г/л, содержание Pro в Xinxiang 8 медленно увеличивается и остается относительно стабильным, тогда как содержание Pro в Hongtianhu 101 быстро увеличивается. По сравнению с 3 г/л содержание Pro в Hongtianhu 101 значительно увеличивается на 440,2% при 15 г/л (рисунок 3B).

Активность защитных ферментов
По мере увеличения концентрации смешанных солей активность CAT, POD и SOD саженцев Hongtianhu 101 и Xinxiang 8 уменьшается, а затем увеличивается, причем самые низкие значения получаются при концентрации 3 г/л (рисунок 4A-C). Активность CAT и POD этих двух разновидностей незначительно варьируется при концентрациях соли 0-5 г/л, и разница между ними невелика. После этого активность CAT и POD этих двух сортов значительно увеличивается с увеличением концентрации соли. Кроме того, активность CAT и POD Hongtianhu 101 выше, чем у Xinxiang 8, и разница между ними постепенно увеличивается (рисунок 4A, B). Активность СОД двух разновидностей незначительно варьируется при концентрациях соли от 0-10 г/л, а затем быстро возрастает. Активность SOD Xinxiang 8 выше, чем у Hongtianhu 101 при концентрациях соли от 0-10 г/л; для остальных концентраций его активность ниже, чем у Hongtianhu 101 (рисунок 4C).

Корреляционный анализ показателей всхожести семян перца и комплексная оценка соляного стресса
Корреляционный анализ (таблица 1) показывает, что длина корня и свежий вес корня для характерных показателей роста рассады достоверно положительно коррелируют с показателями всхожести (потенциал всхожести, скорость прорастания, индекс всхожести, индекс силы всхожести семян и др.); однако не обнаружено явной релевантности между гипокотильной длиной, свежим весом над землей и индексами прорастания. Выявлена значительная отрицательная корреляция между показателями характеристик роста рассады и активностью защитных ферментов (CAT, POD, SOD). Также обнаружена значительная отрицательная корреляция между длиной гипокотила и содержимым MDA и Pro, а также между свежим весом побега и содержанием MDA. За исключением значимой корреляции между индексом силы прорастания семян и активностью защитных ферментов, не обнаружено значимой корреляции между показателями характеристик прорастания и физиологическими показателями рассады (активность защитных ферментов и содержание MDA и Pro).

Толерантность к соли двух сортов перца при сложном солевом стрессе оценивается с использованием метода функции принадлежности для нескольких признаков. Поскольку саженцы перца не подвергаются соляному стрессу при концентрации смешанной соли 0 г/л, величина их членской функции не рассчитывается. В результате только лечение солевым стрессом оценивается с помощью анализа функции членства. Установлено, что MDA отрицательно коррелирует с соленосимостью саженцев перца и рассчитывается с использованием метода обратной функции членства; другие индексы вычисляются с помощью метода функции членства. Таблица 2 показывает, что по мере увеличения концентрации смешанных солей общие взвешенные значения каждой индексной функции двух разновидностей увеличиваются, а затем уменьшаются, в конечном счете достигая максимума при концентрации соли 5 г/л. По сравнению с обработкой 5 г/л значения, полученные с 3 г/л, 10 г/л, и 15 г/л концентрации соли снижаются на 4,7%-11,1%, 25,3%-28,3% и 41,4%-45,1%, соответственно. Таким образом, соляная толерантность перца, подвергнутого обработке 5 г / л, 3 г / л, 10 г / л и 15 г / л с концентрацией соли, может быть классифицирована как лучшая, вторая лучшая, плохая и худшая, соответственно.

Figure 1
Рисунок 1: Влияние увеличения концентрации смешанных солей на всхожесть семян перца. (A), (B), (C), (D) и (E) представляют собой характеристики реакции потенциала прорастания семян перца, индекса прорастания, скорости прорастания, относительной скорости соли и индекса силы прорастания семян на сложный солевой стресс, соответственно. Различные строчные буквы на рисунке указывают на значительные различия между методами лечения, которые анализируются с помощью теста множественного диапазона Туки (p < 0,05). Полосы ошибок указывают на стандартные отклонения (n = 5). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Влияние увеличения концентрации смешанных солей на прорастание семян и морфологические показатели перца. (A), (B), (C) и (D) представляют собой характеристики реакции длины корня рассады перца, длины гипокотила, свежей массы корней и свежей массы над землей на сложный солевой стресс, соответственно. Различные строчные буквы на рисунке указывают на значительные различия между методами лечения, которые анализируются с помощью теста туки с множественным диапазоном (p < 0,05). Полосы погрешностей указывают на стандартное отклонение (n = 5). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Влияние увеличения концентрации смешанных солей на содержание MDA и Pro в саженцах перца. (A) и (B) представляют собой характеристики реакции рассады перца MDA и Pro на сложный солевой стресс, соответственно. Различные строчные буквы на рисунке указывают на значительные различия между методами лечения, которые анализируются с помощью теста туки с множественным диапазоном (p < 0,05). Полосы ошибок указывают на стандартное отклонение (n = 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Влияние увеличения концентрации смешанных солей на деятельность CAT, POD и SOD в саженцах перца. (A), (B) и (C) представляют собой характеристики реакции рассады перца CAT, POD и SOD на сложный солевой стресс, соответственно. Различные строчные буквы на рисунке указывают на значительные различия между методами лечения, которые анализируются с помощью теста туки с множественным диапазоном (p < 0,05). Полосы ошибок указывают на стандартное отклонение (n = 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Корреляционный анализ между всхожестью перца и физиологическими показателями при сложном солевом стрессе (n = 30). Корреляционный анализ Пирсона используется для исследования корреляции между прорастанием семян и физиологическими показателями рассады перца при сложном солевом стрессе. * p < 0,05; ** p < 0,01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 2: Значение функции взвешенного членства в прорастании перца и физиологические показатели рассада при смешанном солевом стрессе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот метод исследования состоит из четырех ключевых этапов, которые влияют на точность экспериментальных результатов. Во-первых, из-за плохого растворения смешанных солей, вызванного повышенным содержанием растворенных веществ в растворах с высокой концентрацией соли, и низкой растворимости реагентов, таких как хлорид кальция, которые труднее солюбилизировать в воде, взвешенные реагенты должны быть полностью измельчены в ступе. Кроме того, реагенты должны быть растворены с помощью ультразвуковых волн перед определением емкости. Во-вторых, настроенный солевой раствор необходимо каждый раз полностью встряхивать и добавлять в чашку Петри для использования. В-третьих, чашки Петри должны сохранять подходящий слой воды после добавления солевого раствора, а водный статус каждой чашки Петри должен быть относительно постоянным. Наконец, условия освещения должны быть постоянными после прорастания семян.

В этом исследовании количество тестовых семян в одной чашке Петри можно регулировать, изменяя диаметр выбранной чашки Петри. В зависимости от конкретной ситуации стресса почвенных солей в различных районах посадки доля каждого отдельного добавления соли может быть скорректирована таким образом, чтобы обеспечить согласованность с фактической ситуацией солевого стресса в местной почве. Хотя этот метод практичен, для более мелких семян (таких как рапс, ледяное растение и амарант) или более крупных семян (таких как бобы меча и широкие бобы) такие проблемы, как эксплуатационные трудности при определении длины рассады и свежего веса или наличие очень небольшого количества семян в одной чашке для культивирования для повторения данных, приводят к трудностям в изучении толерантности к соли с использованием этого метода.

Описанный здесь способ используется для определения характеристик прорастания семян и роста рассады при различных концентрациях смешанных солей и выявления механизма изменения через внутреннюю физиологическую активность ферментов, что имеет большое значение для объективной оценки солеустойчивых характеристик семян. Эта технология может обеспечить технический справочник для оценки солеустойчивости других культур. Прорастание семян и рост рассады являются стадиями, на которых культуры наиболее чувствительны к соляному стрессу. Таким образом, этот метод может эффективно служить ориентиром для солеустойчивого выращивания и селекции сельскохозяйственных культур.

В большинстве сельскохозяйственных культур солевой стресс может препятствовать прорастанию семян и росту рассады при биотическом стрессе. Такое ингибирование может быть связано с уменьшением поглощения семенной воды за счет снижения осмотического потенциала солевого раствора в солевых условиях. Стресс и токсичность солей-ионов могут изменять активность защитных ферментов (POD, CAT, SOD и др.) и белковый обмен во время прорастания семян, а также разрушать эндогенный гормональный баланс11,16. Zhani et al. сообщили, что процесс прорастания в основном изменялся снижением скорости прорастания и длительным всхожением при солевом (NaCl) стрессе. Кроме того, была обнаружена существенная разница в скорости прорастания среди разных сортов (10%-50%) при концентрации соли 8 г/л17. Настоящее исследование также показывает, что по мере увеличения концентрации смешанных солей потенциал прорастания, индекс прорастания, скорость прорастания и индекс силы прорастания семян Hongtianhu 101 и Xinxiang 8 значительно снижаются, а относительная скорость соли постепенно увеличивается. Согласно Patanè et al., хотя солевой стресс продлевал время прорастания семян сладкого сорго, увеличение соляного стресса оказывало неблагоприятное влияние на окончательное прорастание семян18. Тем не менее, соответствующие исследования показывают, что обработка NaCl может способствовать прорастанию семян перца и росту19, что может быть связано с различиями в уровнях концентрации соли.

Повышение уровня соляного стресса оказывает значительное влияние на рост рассады перца, и на основании этого исследования длина корня и свежая масса корней двух сортов значительно уменьшились с увеличением концентрации смешанных солей. Этот вывод аналогичен результату Mirosavljević et al., которые предположили, что длина корня и вес корней уменьшаются по мере увеличения солевого стресса, а различия между методами лечения были значительными20. Этот результат указывает на то, что корневая система была помещена в почвенную среду в непосредственном контакте с почвенным раствором, а длина корня и вес корня были более чувствительны к осмотическому стрессу NaCl. Длина корня и вес корней являются ключевыми показателями реакции растений на солевой стресс. Согласно этому исследованию, по мере увеличения концентрации соли длина гипокотила и свежий вес надземных частей увеличиваются, а затем уменьшаются, причем максимальные значения достигаются при 5 г / л. Хан и др. также предположили, что по мере увеличения солености (NaCl) (0-9 мс / см) длина побега перца сначала увеличивается, а затем уменьшается, причем наилучшая производительность достигается при 3 мс / см12, 21. Проводимость концентрации соли в этом исследовании составляла 4,73 мс/см, когда значение длины рассады гипокотила и свежего веса над землей было самым высоким, что выше значения, сообщенного Khan et al.21. Этот результат может быть связан с высокой устойчивостью перца над землей к сложному солевому стрессу по сравнению с одиночным солевым стрессом.

Солевой стресс не только препятствует росту сельскохозяйственных культур, но и вызывает значительные физиологические изменения в растениях. Солевой стресс может увеличить уровень активных форм кислорода (АФК). Если АФК не очистить вовремя, может произойти перекисное окисление мембранных липидов и окислительный стресс, которые могут привести к серьезному повреждению мембраны растительных клеток. MDA является конечным метаболитом перекисного окисления мембранных липидов, а внутриклеточная концентрация MDA часто используется в качестве показателя для оценки степени повреждения растений в условиях стресса22. В настоящем исследовании по мере увеличения концентрации смешанных солей содержание МДА в саженцах двух сортов сначала уменьшается, а затем увеличивается. Следует отметить, что снижение не является значительным при концентрациях соли в пределах 0-5 г/л. Однако наблюдается быстрое увеличение от 5-10 г/л. После этого значения остаются неизменными, что свидетельствует о том, что степень мембранной перекиси липидов семян перца изменяется от общей, к быстро увеличивающейся, к стабильной. Предполагается, что солевой стресс оказывает серьезное влияние на проницаемость клеточных мембран, когда концентрация смешанной соли превышает 10 г / л. Guzmán-Murillo et al. сообщили об аналогичном выводе о снижении, а затем об увеличении уровня перекиси мембранных липидов в саженцах сладкого перца по мере увеличения концентрации NaCl (0-50 нмоль / л). Кроме того, уровень перекисного окисления липидов был самым низким при 25 нмоль/л NaCl23.

Растения разработали несколько стратегий борьбы с солевым стрессом. С одной стороны, сельскохозяйственные культуры повышают стабильность белка и целостность мембран за счет увеличения осмотических корректирующих веществ, таких как пролин, и уменьшают потерю внутриклеточной воды, тем самым улучшая солеустойчивость24. В настоящем исследовании, по мере увеличения концентрации смешанной соли, содержание Pro в саженцах Xinxiang 8 и Hongtianhu 101 сначала уменьшается, а затем увеличивается. Примечательно, что снижение не является значительным при концентрациях 0-3 г/л, и разница между двумя разновидностями не является существенной, что согласуется с экспериментальными результатами Muchate et al25. Содержание Pro в перечном сорте Hongtianhu 101 с хорошей переносимостью соли также быстро увеличивается при концентрациях соли 3-15 г/л. По сравнению с 3 г/л содержание Pro 15 г/л значительно увеличивается на 440,2%, тогда как содержание Pro в Xinxiang 8 с общей солевой толерантностью увеличивается медленно и поддерживает относительно стабильный уровень при концентрациях соли 3-15 г/л. Поглотительное действие антиоксидантных ферментов на АФК, вызванное солевым стрессом, оказалось основным компонентом защитных механизмов сельскохозяйственных культур. Сообщалось, что активность CAT, POD и SOD увеличивается в различных средах, подверженных соляному стрессу, тем самым повышая его толерантность к соли25,26. Chen et al. показали, что по мере увеличения концентрации NaCl активность SOD, POD и CAT в прорастании семян томатов увеличивается постепенно, без существенной разницы в каждом показателе после обработки 0-50 нмоль/л NaCl27. Это исследование также показывает, что по мере увеличения концентрации смешанной соли активность CAT, POD и SOD в саженцах Hongtianhu 101 и Xinxiang 8 уменьшается, а затем увеличивается. При низких концентрациях соли (0-3 г/л) активность антиоксидантных ферментов существенно не изменяется, а дальнейшее повышение концентрации соли улучшает солеустойчивость.

Приспособляемость и характеристики реакции сельскохозяйственных культур на солевой стресс в основном отражаются на морфологии, структуре, физиологической экологии и т.д. Комплексная оценка сложного солевого стресса проводится с использованием метода значения функции принадлежности для множественных признаков. Это исследование показывает, что по мере увеличения концентрации смешанных солей общее взвешенное значение значения функции сначала увеличивается, а затем уменьшается. Эти два сорта достигают максимума в 5 г / л, что приводит к наилучшему эффекту толерантности к соли. По сравнению с обработкой 5 г/л взвешенные значения после обработки концентрациями соли 3 г/л, 10 г/л и 15 г/л снижаются на 4,7%, 25,3% и 41,4%, соответственно, для Hongtianhu 101 и 11,1%, 28,3% и 45,1%, соответственно, для Xinxiang 8. Такие результаты указывают на то, что толерантность к соли Hongtianhu 101 выше, чем у Xinxiang 8.

Это исследование содержит всестороннее описание влияния различных концентраций сложного солевого стресса на прорастание семян перца и его физиологическую ферментную активность, а также технический справочник по исследованиям солеустойчивости в других культурах. Саженцы перца в меньшей степени подвержены солевому стрессу при смоделированных смешанных концентрациях соли (0-5 г/л). Всхожесть семян, удлинение радика и морфогенез рассады перца значительно ингибируются при высоком солевом стрессе (>5 г/л), вызывая серьезное перекисное окисление мембранных липидов в рассаде перца. Сельскохозяйственные культуры уменьшают неблагоприятные последствия солевого стресса за счет увеличения их содержания Pro и усиления активности защитных ферментов (CAT, POD и SOD). При солевом стрессе содержание пролина и активность защитных ферментов у саженцев Hongtianhu 101 выше, степень перекисного окисления мембранных липидов ниже, а прорастание семян и рост рассады более очевидны, чем у Xinxiang 8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Департаментом науки и техники провинции Цзянси (20203BBFL63065) и Общим проектом научно-технического исследовательского проекта Департамента образования Цзянси (GJJ211430). Мы хотели бы поблагодарить Editage (www.editage.cn) за редактирование на английском языке.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Calcium chloride Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd.,China Analytical reagent
Centrifugal machine Shanghai Luxianyi Centrifuge Instrument Co., Ltd., China TGL-16M
Centrifuge tube None None
Conductivity meter Shanghai Instrument&Electronics Science Instrument Co., Ltd., China DDSJ-308F
Constant temperature and humidity box Ningbo Laifu Technology Co., Ltd.,China PSX-280H
Digital display vernier caliper Deli Group Co., Ltd.,China DL90150
Electronic balance Mettler Toledo Instruments (Shanghai) Co., Ltd.,China ME802E/02
Filter paper Hangzhou Fuyang North Wood Pulp and Paper Co., Ltd.,China GB/T1914-2017
Grinding rod None None
Hongtianhu  101 Seminis Seed (Beijing) Co., Ltd.,China 11933955/100147K1-137
Ice machine Shanghai Kehuai Instrument Co., Ltd., China IM150G
Liquid nitrogen None None
Magnesium chloride Tianjin Kermel Chemical Reagent Co., Ltd.,China Analytical reagent
Magnesium sulfate Tianjin Kermel Chemical Reagent Co., Ltd.,China Analytical reagent
Petri dish Jiangsu Yizhe Teaching Instrument Co., Ltd.,China I-000163
Pocket knife None None
Potassium permanganate (KMnO4 Xilong Scientific Co.,Ltd.,China Analytical reagent
Pure water equipment Sichuan Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd.,China UPT-I-20T
Sodium bicarbonate Xilong Scientific Co.,Ltd.,China Analytical reagent
Sodium carbonate Xilong Scientific Co.,Ltd.,China Analytical reagent
Sodium chloride Xilong Scientific Co.,Ltd.,China Analytical reagent
Sodium sulfate  Xilong Scientific Co.,Ltd.,China Analytical reagent
Test kit Suzhou Keming, Biotechnology Co., Ltd, Suzhou.,China Spectrophotometer method
Ultra-low temperature freezer SANYO Techno Solution TottoriCo.,Ltd. MDF-382
Ultraviolet visible spectrophotometer Shanghai Precision Scientific Instrument Co., Ltd., China  760CRT
Xinxiang 8 Jiangxi Nongwang High Tech Co., Ltd.,China GPD Pepper 2017(360013)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Szabolcs, I. Soils sand salinisation. Handbook of Plant and Crop Stress. , Marcel Dekker. New York. 3-11 (1994).
  2. Global network on integrated soil management for sustainable use of salt effected soils. FAO. , Available from: http://www.fao.org/ag/AGL/agll/spush/intro.htm (2005).
  3. Lakhdar, A., et al. Effectiveness of compost use in salt-affected soil. Journal of Hazardous Materials. 171 (1-3), 29-37 (2009).
  4. Cheng, Z., Chen, Y., Zhang, F. Effect of cropping systems after abandoned salinized farmland reclamation on soil bacterial communities in arid northwest China. Soil and Tillage Research. 187, 204-213 (2019).
  5. Shrivastava, P., Kumar, R. Soil salinity: A serious environmental issue and plant growth promoting bacteria as one of the tools for its alleviation. Saudi Journal of Biological Sciences. 22 (2), 123-131 (2015).
  6. Fattori, V., Hohmann, M. S., Rossaneis, A. C., Pinho-Ribeiro, F. A., Verri, W. A. Capsaicin: Current understanding of its mechanisms and therapy of pain and other pre-clinical and clinical uses. Molecules. 21 (7), 844-878 (2016).
  7. Zhao, Z., et al. Investigation, collection and identification of pepper germplasm resources in Guangxi. Journal of Plant Genetic .Resources. 21 (4), 908-913 (2020).
  8. Zhang, J., et al. Biochar alleviated the salt stress of induced saline paddy soil and improved the biochemical characteristics of rice seedlings differing in salt tolerance. Soil and Tillage Research. 195, 104372-104381 (2019).
  9. Ashraf, M., Foolad, M. R. Pre-sowing seed treatment-A shotgun approach to improve germination, plant growth, and crop yield under saline and non-saline conditions. Advances in Agronomy. 88, 223-271 (2005).
  10. Esra, K. O. Ç, Üstün, A. S., İşlek, C., Arici, Y. K. Effect of exogenously applied spermine and putrescine on germination and in vitro growth of pepper (Capsicum annuum l.) seeds under salt stress. Anadolu University Journal of Science and Technology C-Life Sciences and Biotechnology. 3 (2), 63-71 (2014).
  11. Demir, I., Mavi, K. Effect of salt and osmotic stresses on the germination of pepper seeds of different maturation stages. Brazilian Archives of Biology and Technology. 51 (5), 897-902 (2008).
  12. Khan, H. A., et al. Effect of seed priming with NaCl on salinity tolerance of hot pepper (Capsicum annuum L.) at seedling stage. Soil and Environment. 28 (1), 81-87 (2009).
  13. Zhou, L. L. Effects of salinity stress on cotton (Gossypium hirsutum L.) root growth and cotton field soil micro-ecology. Nanjing Agricultural University. , (2010).
  14. Ding, D. X., et al. Exogenous zeaxanthin alleviates low temperature combined with low light induced photosynthesis inhibition and oxidative stress in pepper (Capsicum annuum L.) plants. Current Issues in Molecular Biology. 44 (6), 2453-2471 (2022).
  15. Liu, Z. B., Yang, B. Z., Ou, L. J., Zou, X. X. The impact of different Ca2+ spraying period on alleviating pepper injury under the waterlogging stress. Acta Horticulturae Sinica. 42 (8), 1487-1494 (2015).
  16. Aloui, H., Souguir, M., Latique, S., Hannachi, C. Germination and growth in control and primed seeds of pepper as affected by salt stress. Cercetări agronomice în Moldova. 47 (3), 83-95 (2014).
  17. Zhani, K., Elouer, M. A., Aloui, H., Hannachi, C. Selection of a salt tolerant Tunisian cultivar of chili pepper (Capsicum frutescens). EurAsian Journal of Biosciences. 6, 47-59 (2012).
  18. Patanè, C., Saita, A., Sortino, O. Comparative effects of salt and water stress on seed germination and early embryo growth in two cultivars of sweet sorghum. Journal of Agronomy and Crop Science. 199 (1), 30-37 (2013).
  19. Smith, P. T., Cobb, B. G. Accelerated germination of pepper seed by priming with salt solutions and water. Hortscience. 26 (4), 417-419 (2019).
  20. Mirosavljević, M., et al. Maize germination parameters and early seedlings growth under different levels of salt stress. Ratarstvo i Povrtarstvo. 50 (1), 49-53 (2013).
  21. Khan, H. A., et al. Hormonal priming alleviates salt stress in hot pepper (Capsicum annuum L.). Soil and Environment. 28 (2), 130-135 (2009).
  22. Zhang, B. B., et al. Effects of simulated salinization on seed germination and physiological characteristics of muskmelon seedlings. Chinese Journal of Tropical Crops. 41 (5), 912-920 (2020).
  23. Guzmán-Murillo, M. A., Ascencio, F., Larrinaga-Mayoral, J. A. Germination and ROS detoxification in bell pepper (Capsicum annuum L.) under NaCl stress and treatment with microalgae extracts. Protoplasma. 250 (1), 33-42 (2013).
  24. Slama, I., Abdelly, C., Bouchereau, A., Flowers, T., Savoure, A. Diversity, distribution and roles of osmoprotective compounds accumulated in halophytes under abiotic stress. Annals of Botany. 115 (3), 433-447 (2015).
  25. Muchate, N. S., Nikalje, G. C., Rajurkar, N. S., Suprasanna, P., Nikamd, T. D. Physiological responses of the halophyte Sesuvium portulacastrum to salt stress and their relevance for saline soil bio-reclamation. Flora. 224, 96-105 (2016).
  26. Javed, S. A., et al. Can different salt formulations revert the depressing effect of salinity on maize by modulating plant biochemical attributes and activating stress regulators through improved N supply. Sustainability. 13 (14), 8022-8037 (2021).
  27. Chen, J., et al. Effects of salt stress on form of polyamine and antioxidation in germinating tomato seed. Acta Pedologica Sinica. 58 (6), 1598-1609 (2021).

Tags

Биология выпуск 189 перец сложный солевой стресс прорастание семян толерантность к соли функция членства
Анализ влияния сложного солевого стресса на прорастание семян и анализ солеустойчивости перца (<em>Capsicum annuum</em> L.)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cheng, C., Liu, J., Wang, Z., Liu,… More

Cheng, C., Liu, J., Wang, Z., Liu, J., Wang, Y., Liao, Y., Gao, Z., Lu, Z., Zhu, B., Yao, F. Analysis of Effect of Compound Salt Stress on Seed Germination and Salt Tolerance Analysis of Pepper (Capsicum annuum L.). J. Vis. Exp. (189), e64702, doi:10.3791/64702 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter