Summary
Il documento seguente presenta un protocollo per misurare la germinazione dei semi, la crescita delle piantine e gli indici fisiologici di due varietà di peperoni con differenze di tolleranza alla salinità in risposta a sei concentrazioni di sale miste. Questo protocollo può essere utilizzato per valutare la tolleranza al sale delle varietà di pepe.
Abstract
Per determinare la tolleranza al sale e il meccanismo fisiologico del pepe (Capsicum annuum L.) nella fase di germinazione, le varietà Hongtianhu 101 e Xinxiang 8, che hanno grandi differenze nella tolleranza al sale, sono impiegate come materiali di studio. Vengono utilizzate sei concentrazioni di sale miste di 0, 3, 5, 10, 15 e 20 g/L derivate utilizzando rapporti molari uguali di Na 2 CO 3, NaHCO3, NaCl, CaCl 2, MgCl 2, MgSO 4 e Na 2 SO4. Per determinare i loro effetti, vengono misurati i relativi indici di germinazione dei semi, crescita della piantina e fisiologia e la tolleranza al sale viene valutata in modo completo utilizzando l'analisi della funzione di appartenenza. I risultati mostrano che all'aumentare della concentrazione di sale misto, il potenziale di germinazione, l'indice di germinazione, il tasso di germinazione, l'indice di vigore della germinazione dei semi, la lunghezza delle radici e il peso fresco delle due cultivar diminuiscono significativamente, mentre il tasso di sale relativo aumenta gradualmente. La lunghezza dell'ipocotile e il peso fresco fuori terra aumentano prima e poi diminuiscono, mentre l'attività di malondialdeide (MDA), prolina (Pro), catalasi (CAT), perossidasi (POD) e superossido dismutasi (SOD) diminuisce e poi aumenta. Il potenziale germinativo, l'indice di germinazione, il tasso di germinazione, l'indice di vigore della germinazione dei semi, la lunghezza della radice, il peso fresco della radice, il contenuto di MDA e Pro e l'attività CAT dei semi di Hongtianhu 101 sono superiori a quelli di Xinxiang 8 per tutte le concentrazioni di sale impiegate qui. Tuttavia, la lunghezza dell'ipocotile, il peso fresco fuori terra e il tasso di sale relativo sono inferiori in Hongtianhu 101 rispetto a Xinxiang 8. La valutazione completa della tolleranza al sale rivela che i valori ponderati totali dei due indici delle funzioni di appartenenza aumentano prima e poi diminuiscono all'aumentare della concentrazione di sale misto. Rispetto a 5 g / L, che ha il più alto valore di funzione di appartenenza, l'indice sotto le concentrazioni di sale di 3 g / L, 10 g / L e 15 g / L diminuisce rispettivamente del 4,7% -11,1%, 25,3% -28,3% e 41,4% -45,1%. Questo studio fornisce una guida teorica per l'allevamento di varietà di pepe tolleranti al sale e un'analisi dei meccanismi fisiologici coinvolti nella tolleranza al sale e nella coltivazione tollerante al sale.
Introduction
La salinità è un importante fattore limitante per la produttività delle colture in tutto il mondo1. Attualmente, quasi il 19,5% delle terre irrigate del mondo e il 2,1% delle terre aride sono colpite dalla salinità e circa l'1% dei terreni agricoli degenera in terreni salino-alcalini ogni anno. Entro il 2050, si prevede che il 50% dei seminativi sarà interessato dalla salinizzazione 2,3. Oltre ai fattori naturali, come gli agenti atmosferici naturali delle rocce e l'acqua piovana salata vicino o intorno alla costa, la rapida evaporazione superficiale, le scarse precipitazioni e i metodi di gestione agricola irragionevoli hanno esacerbato il processo di salinizzazione del suolo. La salinizzazione del suolo inibisce la crescita delle radici delle piante e riduce l'assorbimento e il trasporto di acqua e sostanze nutritive dalle radici delle piante alle foglie. Questa inibizione provoca carenze fisiologiche di acqua, squilibri nutrizionali e tossicità ionica, che portano a una riduzione della produttività delle colture e a una completa perdita di resa delle colture. La salinizzazione dei terreni coltivati sta gradualmente diventando uno dei fattori di stress abiotici più critici che influenzano la produzione alimentare agricola globale4. Lo stress salino riduce i seminativi disponibili per l'agricoltura, il che può comportare uno squilibrio significativo tra l'offerta e la domanda di futuri prodotti agricoli. Pertanto, esplorare gli effetti della salinizzazione del suolo sulla crescita delle colture e sui meccanismi fisiologici e biochimici favorisce l'allevamento di varietà tolleranti al sale, l'utilizzo sostenibile del suolo salino e la sicurezza dei prodotti agricoli.
Il pepe (Capsicum annuum L.) è piantato in tutto il mondo grazie al suo alto valore nutrizionale e medicinale. Ad esempio, la capsaicina è un alcaloide responsabile del sapore piccante del pepe. La capsaicina può essere utilizzata per alleviare il dolore, perdita di peso, migliorare cardiovascolare, tratto gastrointestinale, e sistemi respiratori, e in diverse altre applicazioni5. Il pepe è anche ricco di sostanze bioattive, in particolare diversi composti antiossidanti (carotenoidi, fenoli e flavonoidi) e vitamina C6. Attualmente, il pepe è segnalato per essere la coltura vegetale con la più grande area di coltivazione in Cina, con un'area di piantagione annuale di oltre 1,5 x 106 ettari, rappresentando così l'8% -10% della superficie totale di piantagione di ortaggi in Cina. L'industria del pepe è diventata una delle più grandi industrie vegetali in Cina e ha il più alto valore di produzione7. Tuttavia, la coltivazione del peperone è spesso soggetta a una varietà di stress biologici (parassiti e funghi) e abiotici, in particolare lo stress salino, che ha un impatto negativo diretto sulla germinazione, la crescita e lo sviluppo dei semi, con conseguente riduzione della resa e della qualità del frutto del pepe8.
La germinazione dei semi è il primo stadio di interazione tra le piante e l'ambiente. La germinazione dei semi è altamente sensibile alle fluttuazioni dei mezzi circostanti, in particolare allo stress salino del suolo, che può esercitare effetti invertiti sulla fisiologia e sul metabolismo e alla fine disturbare la normale crescita, lo sviluppo e la morfogenesi delle colture9. In studi precedenti, la germinazione dei semi di pepe e la crescita della piantina sotto stress salino sono state ampiamente studiate; tuttavia, la maggior parte degli studi ha utilizzato NaCl come unico sale per l'induzione dello stress10,11,12. Tuttavia, il danno salino del suolo è dovuto principalmente alla tossicità degli ioni Na+, Ca 2+, Mg 2+, Cl-, CO3 2- e SO42- generata dalla dissociazione dei sali di sodio, calcio e magnesio. A causa della sinergia e dell'antagonismo tra ioni, gli effetti del sale misto e del sale singolo sulla crescita e lo sviluppo delle colture possono essere molto diversi. Tuttavia, le caratteristiche corrispondenti della germinazione dei semi di pepe e della crescita nel sale misto non sono ancora chiare. Pertanto, due varietà di pepe con notevoli differenze nella tolleranza al sale sono utilizzate come materiali in questo studio. L'analisi degli effetti delle diverse concentrazioni di sale sulla germinazione dei semi di pepe, sulla crescita e sugli indici fisiologici e biochimici dopo la miscelazione equimolare di sette sali può rivelare il meccanismo di risposta della germinazione dei semi di pepe allo stress di salinità. Può anche fornire una base teorica per la coltivazione di forti piantine di peperone, nonché una coltivazione ad alta resa e di alta qualità in terreni coltivati a soluzione salina.
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Protocol
NOTA: Qui presentiamo un protocollo per valutare le caratteristiche di risposta e i meccanismi interni della germinazione dei semi di pepe e della crescita della piantina sotto diversi stress salini misti, che può servire come metodo di riferimento per la valutazione della tolleranza al sale di semi.
1. Preparazione sperimentale
- Preparare i semi delle colture per le cultivar: Hongtianhu 101 con forte tolleranza al sale e Xinxiang 8 con bassa tolleranza.
- Preparare la soluzione di KMnO4 allo 0,2% come reagente di disinfezione delle sementi. In primo luogo, pesare 4,0 g di KMnO4, quindi aggiungere 2.000 ml di acqua distillata.
NOTA: Il permanganato di potassio è solitamente instabile a causa della sua forte ossidazione; Di conseguenza, viene preparato immediatamente prima dell'uso. - Preparare i sali miscelati usando sette sali, tra cui carbonato di sodio, bicarbonato di sodio, cloruro di sodio, cloruro di calcio, cloruro di magnesio, solfato di magnesio e solfato di sodio13. Aggiungi la stessa quantità molare di ciascuno, che successivamente rappresenta rispettivamente il 14,8%, 11,7%, 8,2%, 15,5%, 13,3%, 16,7% e 19,8% del rapporto di massa totale dei sali misti.
- Preparare piastre di Petri (monouso) e carta da filtro (carta da filtro qualitativa a media velocità), entrambe con un diametro di 9 cm.
NOTA: Il materiale della capsula di Petri può essere modificato; tuttavia, il diametro della piastra di Petri e della carta da filtro deve essere lo stesso.
2. Ammollo dei semi e preparazione per la germinazione
- Per l'ottimizzazione dei semi, selezionare semi di pepe con dimensioni coerenti e particelle piene da ciascuna varietà, con un diametro medio di 4,2 mm e 3,7 mm per i semi di Hongtianhu 101 e Xinxiang 8, rispettivamente. Calcola il numero totale di semi selezionati in base al carico di lavoro del test.
- Per la disinfezione dei semi, immergere i semi di pepe selezionati in una soluzione KMnO4 allo 0,2% per 15 minuti e quindi risciacquare cinque volte con acqua distillata.
- Per l'ammollo dei semi, trasferire i semi sterilizzati in acqua distillata e lasciarli in ammollo per 24 ore. Risciacquare i semi più volte con acqua distillata e asciugarli per un ulteriore utilizzo.
NOTA: Il tempo di ammollo dei semi per diverse colture può variare.
3. Germinazione dei semi e crescita della piantina
- Preparare sei concentrazioni dei sali miscelati: 0 (controllo), 3, 5, 10, 15 e 20 g/L. Misurare la conducibilità della soluzione salina utilizzando un misuratore di conducibilità; i valori EC di conducibilità della soluzione sono rispettivamente 0,092, 3,05, 4,73, 8,33, 11,53 e 15,22 ms/cm.
- Per la preparazione dei semi, posizionare uniformemente 40 semi di pepe in una piastra di Petri con due strati di carta da filtro. Preparare i semi per sei trattamenti sperimentali e ripetere ogni trattamento cinque volte.
- Per la germinazione dei semi, aggiungere una quantità adeguata delle sei concentrazioni di sale misto alla piastra di Petri per assicurarsi che la carta da filtro sia mantenuta umida. Mettere i semi in un incubatore ad aria a 28 ° C e 80% di umidità dell'aria per la germinazione al buio.
- Dopo la germinazione dei semi, lasciare che le piantine continuino a crescere in luce (intensità luminosa di circa 450 Lux; ciclo luminoso di 12/12h) nell'incubatrice per 14 giorni dopo la semina. La temperatura e l'umidità nella fase di crescita della piantina devono essere le stesse utilizzate nella fase di germinazione.
- Reintegrare la soluzione nel piatto di coltura ogni 12 ore per conservare una carta da filtro umida e lavare completamente la carta da filtro ogni 24 ore con la corrispondente concentrazione della soluzione salina mista per mantenere una concentrazione salina mista costante nella capsula di Petri.
NOTA: La quantità di soluzione salina aggiunta ai semi umidi può essere regolata in base alle fasi di germinazione e crescita dei semi. Sono disponibili molti metodi per mantenere una concentrazione costante di soluzioni saline nei piatti di coltura. Oltre ai metodi descritti in questo esperimento, è possibile utilizzare la strategia di aggiungere acqua distillata in base al peso.
4. Misurazione e calcolo degli indicatori
- Determinazione degli indici di germinazione dei semi
- Determinare il tasso di germinazione giornaliero dopo la semina, con il rivestimento del seme che rompe la radichetta che raggiunge la metà della lunghezza del diametro del seme come marcatore di germinazione.
- Calcolare il tasso di germinazione, il potenziale di germinazione, il tasso di sale relativo, l'indice di germinazione e l'indice di vigore della germinazione dei semi utilizzando le seguenti formule:
Tasso di germinazione (%) = (numero di semi germinati normali il giorno 7 dopo la semina/numero di semi testati) × 100
Potenziale germinativo (%) = (numero di semi germinati normali il giorno 3 dopo la semina/numero di semi testati) × 100
Tasso relativo di sale (%) = (tasso di germinazione di controllo - tasso di germinazione del trattamento)/tasso di germinazione di controllo × 100
calcolato utilizzando il tasso di germinazione dei semi il giorno 7 dopo la semina
Indice di germinazione (GI) = ∑ [Gt/Dt]
dove Gt si riferisce al numero di germinazione dei semi in un periodo di tempo (t) dopo la semina e Dt si riferisce ai corrispondenti giorni di germinazione
Indice di vigoria germinativa dei semi (VI) = GI x S
dove S è la lunghezza della radice
- Determinazione dell'indice di crescita della piantina
- Il giorno 14 dopo la semina, selezionare casualmente 10 piantine rappresentative da ciascuna piastra di Petri e misurare la lunghezza della radice e la lunghezza dell'ipocotile.
- Usa un coltello per dividere le piantine di pepe in due parti: radichetta e parti fuori terra. Rimuovere l'acqua dalle piantine pulendo e pesare le piantine separatamente per determinare il peso fresco.
- Determinare l'attività dell'enzima antiossidante, il livello di malondialdeide (MDA) e il contenuto di prolina (Pro) nel pepe come segue.
- Per preservare le piantine di peperone, selezionare piantine di peperoni interi rappresentativi (circa 24,0 g) da ciascun trattamento il giorno 14 dopo la semina. Dopo aver rimosso l'acqua superficiale, congelare immediatamente le piantine in azoto liquido per 1 minuto e conservarle in frigorifero a temperatura ultrabassa (-80 °C).
NOTA: Il numero di campioni di piantine di peperoni conservate nel frigorifero a temperatura ultrabassa dovrebbe essere sufficiente, nel caso in cui alcuni indicatori debbano essere nuovamente testati. - Prelevare circa 1,0 g di campione di piantina da ogni trattamento raccolto in triplice copia. Mettere il campione di piantina in una provetta da centrifuga, aggiungere azoto liquido e macinare il campione usando una barra di macinazione per determinare gli indici fisiologici delle piantine. Gli indici determinati e lo schema di misurazione sono mostrati di seguito.
- Determinare l'attività enzimatica protettiva della piantina (perossidasi [POD], catalasi [CAT], superossido dismutasi [SOD]), malondialdeide (MDA) e prolina (Pro) utilizzando un kit disponibile in commercio (basato sulla spettrofotometria) per ciascun fattore14.
NOTA: Osservazioni precedenti non hanno rivelato alcuna differenza nello stress salino tra le concentrazioni di sale misto di 15 e 20 g/L. Di conseguenza, vengono misurate solo cinque concentrazioni di sale (0, 3, 5, 10 e 15 g / L).
- Per preservare le piantine di peperone, selezionare piantine di peperoni interi rappresentativi (circa 24,0 g) da ciascun trattamento il giorno 14 dopo la semina. Dopo aver rimosso l'acqua superficiale, congelare immediatamente le piantine in azoto liquido per 1 minuto e conservarle in frigorifero a temperatura ultrabassa (-80 °C).
- Valutazione completa della tolleranza al sale utilizzando il metodo della funzione di appartenenza
NOTA: la funzione di appartenenza utilizza un metodo di matematica fuzzy, che converte la valutazione qualitativa in valutazione quantitativa15, per valutare una varietà di indici fisiologici affetti da danni salini.- Calcola il valore della funzione di appartenenza usando la seguente formula di Zhoubin Liu et al.15:
Ri = (Xi - Xmin)/(Xmax - Xmin)
Se un tratto è correlato negativamente con la tolleranza al sale, calcolare la funzione di appartenenza inversa utilizzando:
Ri = 1 - (Xi - Xmin)/(Xmax - Xmin)
Accumula i valori di appartenenza di ciascun indice fisiologico, dove Xi è il valore misurato di un certo tratto, Xmax e Xmin sono i valori massimo e minimo per Xi, rispettivamente, e Ri è il valore di appartenenza di quel tratto. - Includere i seguenti indicatori rilevanti: caratteristiche di germinazione dei semi (potenziale di germinazione, tasso di germinazione, indice di germinazione e indice di vigore della germinazione dei semi), caratteristiche di crescita della piantina nella fase di germinazione (lunghezza della radice, lunghezza dell'ipocotile, peso fresco della radice e peso fresco fuori terra), MDA, Pro e attività enzimatica protettiva (CAT, POD, SOD) per il calcolo del valore della funzione di appartenenza. I valori della funzione di appartenenza sono ottenuti da ciascun indicatore.
- Calcola il valore della funzione di appartenenza usando la seguente formula di Zhoubin Liu et al.15:
- Utilizzare fogli di calcolo e software SPSS (versione 22.0) per analizzare ed elaborare i dati del test e applicare il metodo della differenza meno significativa (LSD) per confronti multipli per identificare differenze significative. Utilizza l'analisi di correlazione di Pearson per studiare la correlazione tra la germinazione dei semi e gli indici fisiologici della piantina di pepe sotto stress salino composto.
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Representative Results
Caratteristiche di germinazione dei semi
All'aumentare della concentrazione di sale misto, il potenziale di germinazione e l'indice di germinazione di Hongtianhu 101 e Xinxiang 8 diminuiscono significativamente. Entrambe le cultivar hanno un forte calo delle concentrazioni di sale da 0-3 g / L e un lento e costante declino per le concentrazioni di sale da 3-20 g / L (Figura 1A, B). Il tasso di germinazione delle due varietà diminuisce gradualmente all'aumentare delle concentrazioni di sale misto e il tasso di sale relativo per le varietà aumenta gradualmente. Non vi è alcuna differenza significativa nel tasso di germinazione e nel tasso di sale relativo a concentrazioni di sale di 3-15 g / L. Tuttavia, la differenza è significativa a tutte le altre concentrazioni di sale (Figura 1C,D). Per quanto riguarda la tolleranza al sale tra le due varietà, il potenziale di germinazione, l'indice di germinazione e il tasso di germinazione dei semi di Hongtianhu 101 con concentrazioni di sale misto crescenti sono superiori a quelli di Xinxiang 8, mentre il tasso di sale relativo è inferiore a quello di Xinxiang 8.
All'aumentare della concentrazione di sale misto (0-15 g/L), l'indice di vigore germinativo dei semi delle due varietà diminuisce significativamente. Quando la concentrazione di sale misto è di 15 g/L, l'indice di vigore germinativo dei semi di Hongtianhu 101 e Xinxiang 8 diminuisce rispettivamente del 91,0% e del 94,6% rispetto a quello del controllo. Da notare che la diminuzione non è significativa quando la concentrazione di sale misto aumenta ulteriormente da 15 a 20 g/L. L'indice di vigore della germinazione dei semi di Hongtianhu 101 è superiore a quello di Xinxiang 8 ad ogni livello di concentrazione di sale misto (Figura 1E).
Caratteristiche di crescita della piantina
All'aumentare della concentrazione di sale misto (0-15 g / L), la lunghezza della radice e il peso fresco della radice di Hongtianhu 101 e Xinxiang 8 diminuiscono significativamente. Quando la concentrazione di sale misto è di 15 g / L, la lunghezza della radice di Hongtianhu 101 e Xinxiang 8 diminuisce rispettivamente dell'89,4% e del 91,1%, e il peso fresco della radice diminuisce rispettivamente dell'81,7% e del 71,2%, rispetto a quelli del controllo. Tuttavia, quando la concentrazione di sale è di 15-20 g/L, la lunghezza della radice e il peso fresco delle due varietà non cambiano significativamente (Figura 2A,C). La lunghezza della radice e il peso fresco della radice di Hongtianhu 101 sono generalmente superiori a quelli di Xinxiang 8 con livelli crescenti di sale misto, con evidenti differenze a concentrazioni comprese tra 0 e 10 g / L.
La lunghezza ipocotilicica e il peso fresco fuori terra delle due varietà aumentano e poi diminuiscono con l'aumentare della concentrazione di sale misto. Entrambi gli indici raggiungono i valori massimi con una concentrazione salina di 5 g/L. Allo stesso modo, quando la concentrazione salina è di 15-20 g/L, la lunghezza dell'ipocotile e il peso fresco fuori terra delle due varietà diminuiscono leggermente. Sulla base delle differenze varietali, la lunghezza dell'ipocotile e il peso fresco fuori terra di Xinxiang 8 sono superiori a quelli di Hongtianhu 101 ad ogni concentrazione di sale (Figura 2B,D).
Perossidazione lipidica di membrana e contenuto di sostanze di regolazione osmotica
All'aumentare della concentrazione di sale misto, i contenuti MDA e Pro delle due varietà diminuiscono e poi aumentano. I contenuti di MDA e Pro raggiungono i valori più bassi a concentrazioni rispettivamente di 5 g/L e 3 g/L (Figura 3A,B). Il contenuto di MDA diminuisce leggermente a concentrazioni saline di 0-5 g/L e aumenta rapidamente a 10 g/L. Rispetto al trattamento con 5 g/L, il contenuto di MDA dopo il trattamento con 10 g/L aumenta del 59,9%-64,8%, e rimane quindi invariato. Il contenuto di MDA di Hongtianhu 101 è superiore a quello di Xinxiang 8 a diverse concentrazioni di sale (Figura 3A). La diminuzione del contenuto di Pro a 0-3 g / L non è significativa e si riscontra poca differenza tra le due varietà. Quando la concentrazione di sale è di 3-15 g/L, il contenuto di Pro di Xinxiang 8 aumenta lentamente e rimane relativamente stabile, mentre il contenuto di Pro di Hongtianhu 101 aumenta rapidamente. Rispetto a 3 g/L, il contenuto Pro di Hongtianhu 101 aumenta significativamente del 440,2% a 15 g/L (Figura 3B).
Attività enzimatica protettiva
All'aumentare della concentrazione di sale misto, le attività CAT, POD e SOD delle piantine di Hongtianhu 101 e Xinxiang 8 diminuiscono e poi aumentano, con i valori più bassi ottenuti ad una concentrazione di 3 g / L (Figura 4A-C). Le attività CAT e POD delle due varietà variano leggermente a concentrazioni di sale di 0-5 g / L e la differenza tra loro è piccola. Successivamente, le attività CAT e POD delle due varietà aumentano significativamente con l'aumentare della concentrazione di sale. Inoltre, le attività CAT e POD di Hongtianhu 101 sono superiori a quelle di Xinxiang 8 e la differenza tra loro aumenta gradualmente (Figura 4A,B). L'attività SOD delle due varietà varia leggermente a concentrazioni di sale da 0-10 g / L, e poi aumenta rapidamente. L'attività SOD di Xinxiang 8 è superiore a quella di Hongtianhu 101 a concentrazioni di sale da 0-10 g/L; per le restanti concentrazioni, la sua attività è inferiore a quella di Hongtianhu 101 (Figura 4C).
Analisi di correlazione degli indici di germinazione dei semi del pepe e valutazione completa dello stress salino
L'analisi di correlazione (Tabella 1) rivela che la lunghezza della radice e il peso fresco della radice per gli indici caratteristici di crescita della piantina sono significativamente correlati positivamente con gli indici di germinazione (potenziale di germinazione, tasso di germinazione, indice di germinazione, indice di vigore della germinazione dei semi, ecc.); Tuttavia, non si trova alcuna rilevanza esplicita tra la lunghezza dell'ipocotile, il peso fresco fuori terra e gli indici di germinazione. Una significativa correlazione negativa si trova tra gli indici delle caratteristiche di crescita della piantina e l'attività degli enzimi protettivi (CAT, POD e SOD). Una significativa correlazione negativa si trova anche tra la lunghezza dell'ipocotile e il contenuto di MDA e Pro, e tra il peso fresco del germoglio e il contenuto di MDA. Ad eccezione della correlazione significativa tra l'indice di vigore della germinazione dei semi e l'attività enzimatica protettiva, non si riscontra alcuna correlazione significativa tra gli indici caratteristici della germinazione e gli indici fisiologici della piantina (attività enzimatica protettiva e contenuto di MDA e Pro).
La tolleranza al sale delle due varietà di pepe sotto stress salino composto viene valutata utilizzando il metodo della funzione di appartenenza per più tratti. Poiché le piantine di peperone non sono soggette a stress salino quando la concentrazione di sale misto è di 0 g / L, il loro valore di funzione di appartenenza non viene calcolato. Di conseguenza, solo il trattamento con stress salino viene valutato utilizzando l'analisi della funzione di appartenenza. MDA è risultato essere negativamente correlato con la tolleranza al sale delle piantine di pepe e viene calcolato utilizzando il metodo della funzione di appartenenza inversa; Gli altri indici vengono calcolati utilizzando il metodo della funzione di appartenenza. La tabella 2 mostra che, all'aumentare della concentrazione di sale misto, i valori totali ponderati di ciascuna funzione indice delle due varietà aumentano e poi diminuiscono, raggiungendo infine un massimo ad una concentrazione salina di 5 g/L. Rispetto al trattamento con 5 g/L, i valori ottenuti con il 3 g/L, 10 g/L, e 15 g / L i trattamenti con concentrazione di sale diminuiscono rispettivamente del 4,7% -11,1%, 25,3% -28,3% e 41,4% -45,1%. Pertanto, la tolleranza al sale del pepe sottoposto a trattamenti di concentrazione salina di 5 g / L, 3 g / L, 10 g / L e 15 g / L può essere classificata come migliore, seconda migliore, cattiva e peggiore, rispettivamente.
Figura 1: Effetti dell'aumento delle concentrazioni di sale misto sulla germinazione dei semi di pepe. (A), (B), (C), (D) ed (E) rappresentano rispettivamente le caratteristiche di risposta del potenziale di germinazione dei semi di pepe, dell'indice di germinazione, del tasso di germinazione, del tasso di sale relativo e dell'indice di vigore della germinazione dei semi allo stress salino composto. Diverse lettere minuscole nella figura indicano differenze significative tra i trattamenti, che vengono analizzate dal test a gamma multipla di Tukey (p < 0,05). Le barre di errore indicano deviazioni standard (n = 5). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Effetti dell'aumento delle concentrazioni di sale misto sulla germinazione dei semi e sugli indici morfologici del pepe. (A), (B), (C) e (D) rappresentano rispettivamente le caratteristiche di risposta della lunghezza della radice della piantina di pepe, della lunghezza dell'ipocotile, del peso fresco della radice e del peso fresco fuori terra allo stress salino composto. Diverse lettere minuscole nella figura indicano differenze significative tra i trattamenti, che vengono analizzate dal test a gamma multipla di Tukey (p < 0,05). Le barre di errore indicano la deviazione standard (n = 5). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Effetti dell'aumento delle concentrazioni di sale misto sul contenuto di MDA e Pro delle piantine di pepe. (A) e (B) rappresentano rispettivamente le caratteristiche di risposta del contenuto di MDA e Pro della piantina di pepe allo stress salino composto. Diverse lettere minuscole nella figura indicano differenze significative tra i trattamenti, che vengono analizzate dal test a gamma multipla di Tukey (p < 0,05). Le barre di errore indicano la deviazione standard (n = 3). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Effetti dell'aumento delle concentrazioni di sale misto sulle attività di CAT, POD e SOD delle piantine di pepe. (A), (B) e (C) rappresentano rispettivamente le caratteristiche di risposta delle attività CAT, POD e SOD delle piantine di pepe allo stress salino composto. Diverse lettere minuscole nella figura indicano differenze significative tra i trattamenti, che vengono analizzate dal test a gamma multipla di Tukey (p < 0,05). Le barre di errore indicano la deviazione standard (n = 3). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Tabella 1: Analisi di correlazione tra germinazione del pepe e indicatori fisiologici sotto stress salino composto (n = 30). L'analisi di correlazione di Pearson viene utilizzata per studiare la correlazione tra la germinazione dei semi e gli indici fisiologici della piantina di pepe sotto stress salino composto. * p < 0,05; ** p < 0,01. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 2: Il valore ponderato della funzione di appartenenza della germinazione del pepe e degli indicatori fisiologici delle piantine sotto stress salino misto. Clicca qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
Questo metodo di ricerca comprende quattro passaggi chiave che influenzano l'accuratezza dei risultati sperimentali. In primo luogo, a causa della scarsa dissoluzione dei sali misti causata dall'aumento del contenuto di soluti nelle soluzioni ad alta concentrazione salina e della bassa solubilità di reagenti come il cloruro di calcio, che sono più difficili da solubilizzare in acqua, i reagenti pesati devono essere completamente macinati in una malta. Inoltre, i reagenti devono essere sciolti tramite onde ultrasoniche prima di determinare la capacità. In secondo luogo, la soluzione salina configurata deve essere completamente agitata ogni volta e aggiunta alla capsula di Petri per l'uso. In terzo luogo, le piastre di Petri devono mantenere uno strato d'acqua adatto dopo l'aggiunta della soluzione salina e lo stato dell'acqua di ciascuna capsula di Petri deve essere relativamente coerente. Infine, le condizioni di luce devono essere coerenti dopo la germinazione dei semi.
In questo studio, il numero di semi di prova in una singola capsula di Petri può essere regolato variando il diametro della capsula di Petri selezionata. In funzione della situazione specifica dello stress salino del suolo nelle diverse aree di impianto, la proporzione di ogni singola aggiunta di sale potrebbe essere regolata per consentire la coerenza con la situazione effettiva dello stress salino nel suolo locale. Mentre questo metodo è pratico, per semi più piccoli (come colza, pianta del ghiaccio e amaranto) o semi più grandi (come fagioli spada e fave), problemi come difficoltà operative nella determinazione della lunghezza della piantina e del peso fresco, o la disponibilità di pochissimi semi in un singolo piatto di coltura per ripetere i dati, portano a difficoltà nello studio della tolleranza al sale usando questo metodo.
Il metodo qui descritto viene utilizzato per determinare le caratteristiche di germinazione dei semi e la crescita della piantina sotto diverse concentrazioni di sale misto e rivelare il meccanismo di cambiamento attraverso l'attività enzimatica fisiologica interna, che è di grande importanza per valutare obiettivamente le caratteristiche di tolleranza al sale dei semi. Questa tecnologia può fornire un riferimento tecnico per la valutazione della tolleranza al sale di altre colture. La germinazione dei semi e la crescita della piantina sono le fasi in cui le colture sono più sensibili allo stress salino. Pertanto, questo metodo può fornire efficacemente un riferimento per la coltivazione tollerante al sale e l'allevamento delle colture.
Nella maggior parte delle colture, lo stress salino può inibire la germinazione dei semi e la crescita della piantina sotto stress biotico. Tale inibizione può essere dovuta ad una riduzione dell'assorbimento di acqua di seme riducendo il potenziale osmotico della soluzione salina in condizioni saline. Lo stress e la tossicità degli ioni salini possono modificare l'attività degli enzimi protettivi (POD, CAT, SOD, ecc.) e il metabolismo proteico durante la germinazione dei semi e distruggere l'equilibrio ormonale endogeno11,16. Zhani et al. hanno riferito che il processo di germinazione è stato principalmente modificato da un ridotto tasso di germinazione e da una germinazione prolungata sotto stress salino (NaCl). Inoltre, è stata riscontrata una differenza significativa nel tasso di germinazione tra le diverse varietà (10% -50%) con una concentrazione salina di 8 g / L17. Il presente studio rivela anche che all'aumentare della concentrazione di sale misto, il potenziale di germinazione, l'indice di germinazione, il tasso di germinazione e l'indice di vigore della germinazione dei semi di Hongtianhu 101 e Xinxiang 8 diminuiscono significativamente e il tasso di sale relativo aumenta gradualmente. Secondo Patanè et al., sebbene lo stress salino abbia prolungato il tempo di germinazione dei semi di sorgo dolce, l'aumento dello stress salino ha avuto un effetto negativo sulla germinazione finale dei semi18. Tuttavia, studi correlati suggeriscono che il trattamento con NaCl può promuovere la germinazione e la crescita dei semi di pepe19, che possono essere correlate alle differenze nei livelli di concentrazione di sale.
L'aumento del livello di stress salino ha un effetto significativo sulla crescita delle piantine di pepe e, sulla base di questo studio, la lunghezza della radice e il peso fresco delle due varietà sono diminuiti significativamente con l'aumentare delle concentrazioni di sale misto. Questa scoperta è simile a quella di Mirosavljević et al., che ha suggerito che la lunghezza e il peso della radice diminuivano con l'aumentare dello stress salino e le differenze tra i trattamenti erano significative20. Questo risultato indica che il sistema radicale è stato posto nel terreno a diretto contatto con la soluzione del terreno e la lunghezza e il peso della radice erano più sensibili allo stress osmotico NaCl. La lunghezza e il peso delle radici sono indicatori chiave della risposta delle piante allo stress salino. Secondo questo studio, all'aumentare della concentrazione di sale, la lunghezza dell'ipocotile e il peso fresco delle parti fuori terra aumentano e poi diminuiscono, con valori massimi raggiunti a 5 g / L. Khan et al. hanno anche suggerito che all'aumentare della salinità (NaCl) (0-9 ms / cm), la lunghezza del germoglio del pepe aumenta prima e poi diminuisce, con le migliori prestazioni ottenute a 3 ms / cm12, 21. La conduttività della concentrazione di sale in questo studio era di 4,73 ms / cm quando il valore della lunghezza dell'ipocotile della piantina e del peso fresco fuori terra erano i più alti, che è superiore al valore riportato da Khan et al.21. Questo risultato potrebbe essere dovuto all'elevata tolleranza del pepe fuori terra allo stress salino composto rispetto allo stress salino singolo.
Lo stress salino non solo ostacola la crescita delle colture, ma provoca anche significativi cambiamenti fisiologici nelle piante. Lo stress salino può aumentare i livelli di specie reattive dell'ossigeno (ROS). Se i ROS non vengono eliminati in tempo, possono verificarsi perossidazione lipidica di membrana e stress ossidativo, che possono causare gravi danni alla membrana cellulare vegetale. MDA è il metabolita finale della perossidazione lipidica di membrana e la concentrazione intracellulare di MDA è spesso utilizzata come indicatore per valutare il grado di danno alle piante sotto stress22. Nel presente studio, all'aumentare della concentrazione di sale misto, il contenuto di MDA delle piantine delle due varietà diminuisce prima e poi aumenta. Da notare che la diminuzione non è significativa a concentrazioni di sale comprese tra 0-5 g / L. Tuttavia, si osserva un rapido aumento da 5-10 g / L. Successivamente, i valori rimangono invariati, indicando che il grado di perossido lipidico di membrana dei semi di pepe cambia da generale, a rapidamente crescente, a stabile. Si ipotizza che lo stress salino abbia un grave impatto sulla permeabilità della membrana cellulare quando la concentrazione di sale misto è superiore a 10 g / L. Guzmán-Murillo et al. hanno riportato una conclusione simile di una diminuzione e quindi un aumento del livello di perossido lipidico di membrana nelle piantine di peperoni dolci con l'aumento della concentrazione di NaCl (0-50 nmol / L). Inoltre, il livello di perossidazione lipidica era più basso a 25 nmol / L NaCl23.
Le piante hanno sviluppato diverse strategie per far fronte allo stress salino. Da un lato, le colture migliorano la stabilità delle proteine e l'integrità della membrana aumentando le sostanze di regolazione osmotica, come la prolina, e riducono la perdita di acqua intracellulare, migliorando così la tolleranza al sale24. Nel presente studio, all'aumentare della concentrazione di sale misto, il contenuto Pro delle piantine di Xinxiang 8 e Hongtianhu 101 diminuisce prima e poi aumenta. In particolare, la diminuzione non è significativa a concentrazioni di 0-3 g / L e la differenza tra le due varietà non è significativa, in linea con i risultati sperimentali di Muchate et al25. Anche il contenuto Pro della varietà di pepe Hongtianhu 101 con una buona tolleranza al sale aumenta rapidamente a concentrazioni di sale di 3-15 g / L. Rispetto a 3 g / L, il contenuto Pro di 15 g / L aumenta significativamente del 440,2%, mentre il contenuto Pro di Xinxiang 8 con tolleranza generale al sale aumenta lentamente e mantiene un livello relativamente stabile a concentrazioni di sale di 3-15 g / L. L'effetto scavenging degli enzimi antiossidanti sui ROS indotto dallo stress salino ha dimostrato di essere il componente principale dei meccanismi di difesa delle colture. È stato riportato che le attività di CAT, POD e SOD aumentano in diversi ambienti di stress salino, migliorando così la sua tolleranza al sale25,26. Chen et al. hanno dimostrato che all'aumentare della concentrazione di NaCl, le attività di SOD, POD e CAT nella germinazione dei semi di pomodoro aumentano gradualmente, senza differenze significative in ciascun indice dopo il trattamento con 0-50 nmol / L NaCl27. Questo studio mostra anche che all'aumentare della concentrazione di sale misto, le attività di CAT, POD e SOD nelle piantine di Hongtianhu 101 e Xinxiang 8 diminuiscono e poi aumentano. A basse concentrazioni di sale (0-3 g/L), l'attività degli enzimi antiossidanti non cambia in modo significativo e un ulteriore aumento della concentrazione di sale migliora la tolleranza al sale.
Le caratteristiche di adattabilità e risposta delle colture allo stress salino si riflettono principalmente nella morfologia, nella struttura, nell'ecologia fisiologica, ecc. Una valutazione completa dello stress salino composto viene eseguita utilizzando il metodo del valore della funzione di appartenenza per più tratti. Questo studio mostra che all'aumentare della concentrazione di sale misto, il valore totale ponderato del valore funzionale aumenta prima e poi diminuisce. Le due varietà raggiungono un massimo di 5 g/L, ottenendo il miglior effetto di tolleranza al sale. Rispetto al trattamento a 5 g/L, i valori ponderati dopo il trattamento con le concentrazioni di sale di 3 g/L, 10 g/L e 15 g/L diminuiscono rispettivamente del 4,7%, 25,3% e 41,4% per Hongtianhu 101 e 11,1%, 28,3% e 45,1% per Xinxiang 8. Tali risultati indicano che la tolleranza al sale di Hongtianhu 101 è superiore a quella di Xinxiang 8.
Questo studio fornisce una descrizione completa degli effetti delle diverse concentrazioni di stress salino composto sulla germinazione dei semi di pepe e sulle sue attività enzimatiche fisiologiche e un riferimento tecnico per la ricerca sulla tolleranza al sale in altre colture. Le piantine di pepe sono meno influenzate dallo stress salino sotto concentrazioni di sale misto simulato (0-5 g / L). La germinazione dei semi, l'allungamento della radichetta e la morfogenesi delle piantine di pepe sono significativamente inibite sotto elevato stress salino (>5 g / L), causando una grave perossidazione lipidica della membrana nelle piantine di pepe. Le colture riducono gli effetti negativi dello stress salino aumentando il loro contenuto di Pro e migliorando l'attività degli enzimi protettivi (CAT, POD e SOD). Sotto stress salino, il contenuto di prolina e l'attività enzimatica protettiva delle piantine di Hongtianhu 101 sono più alti, il grado di perossidazione lipidica della membrana è inferiore e la germinazione dei semi e la crescita della piantina sono più evidenti di quelle di Xinxiang 8.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal Dipartimento di Scienza e Tecnologia della Provincia di Jiangxi (20203BBFL63065) e dal Progetto Generale di Ricerca Scientifica e Tecnologica del Dipartimento di Educazione del Jiangxi (GJJ211430). Vorremmo ringraziare Editage (www.editage.cn) per l'editing in lingua inglese.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium chloride | Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd.,China | Analytical reagent | |
| Centrifugal machine | Shanghai Luxianyi Centrifuge Instrument Co., Ltd., China | TGL-16M | |
| Centrifuge tube | None | None | |
| Conductivity meter | Shanghai Instrument&Electronics Science Instrument Co., Ltd., China | DDSJ-308F | |
| Constant temperature and humidity box | Ningbo Laifu Technology Co., Ltd.,China | PSX-280H | |
| Digital display vernier caliper | Deli Group Co., Ltd.,China | DL90150 | |
| Electronic balance | Mettler Toledo Instruments (Shanghai) Co., Ltd.,China | ME802E/02 | |
| Filter paper | Hangzhou Fuyang North Wood Pulp and Paper Co., Ltd.,China | GB/T1914-2017 | |
| Grinding rod | None | None | |
| Hongtianhu 101 | Seminis Seed (Beijing) Co., Ltd.,China | 11933955/100147K1-137 | |
| Ice machine | Shanghai Kehuai Instrument Co., Ltd., China | IM150G | |
| Liquid nitrogen | None | None | |
| Magnesium chloride | Tianjin Kermel Chemical Reagent Co., Ltd.,China | Analytical reagent | |
| Magnesium sulfate | Tianjin Kermel Chemical Reagent Co., Ltd.,China | Analytical reagent | |
| Petri dish | Jiangsu Yizhe Teaching Instrument Co., Ltd.,China | I-000163 | |
| Pocket knife | None | None | |
| Potassium permanganate (KMnO4 | Xilong Scientific Co.,Ltd.,China | Analytical reagent | |
| Pure water equipment | Sichuan Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd.,China | UPT-I-20T | |
| Sodium bicarbonate | Xilong Scientific Co.,Ltd.,China | Analytical reagent | |
| Sodium carbonate | Xilong Scientific Co.,Ltd.,China | Analytical reagent | |
| Sodium chloride | Xilong Scientific Co.,Ltd.,China | Analytical reagent | |
| Sodium sulfate | Xilong Scientific Co.,Ltd.,China | Analytical reagent | |
| Test kit | Suzhou Keming, Biotechnology Co., Ltd, Suzhou.,China | Spectrophotometer method | |
| Ultra-low temperature freezer | SANYO Techno Solution TottoriCo.,Ltd. | MDF-382 | |
| Ultraviolet visible spectrophotometer | Shanghai Precision Scientific Instrument Co., Ltd., China | 760CRT | |
| Xinxiang 8 | Jiangxi Nongwang High Tech Co., Ltd.,China | GPD Pepper 2017(360013) |
References
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