Summary
Papiret nedenfor præsenterer en protokol til måling af frøspiring, frøplantevækst og fysiologiske indekser for to pebersorter med saltholdighedstoleranceforskelle som reaktion på seks blandede saltkoncentrationer. Denne protokol kan bruges til at evaluere salttolerancen for peber sorter.
Abstract
For at bestemme salttolerancen og den fysiologiske mekanisme for peber (Capsicum annuum L.) på spiringsstadiet anvendes sorterne Hongtianhu 101 og Xinxiang 8, der har store forskelle i salttolerance, som studiematerialer. Der anvendes seks blandede saltkoncentrationer på 0, 3, 5, 10, 15 og 20 g/l afledt under anvendelse af lige molære forhold mellemNa2CO3, NaHCO3, NaCl, CaCl2,MgCl2, MgSO4 ogNa2SO4. For at bestemme deres virkninger måles de relaterede indekser for frøspiring, frøplantevækst og fysiologi, og salttolerance evalueres omfattende ved hjælp af medlemsfunktionsanalyse. Resultaterne viser, at når koncentrationen af blandet salt stiger, falder spirepotentialet, spiringsindekset, spiringshastigheden, frøspiringskraftindekset, rodlængden og rodfriskvægten af de to sorter markant, mens den relative salthastighed gradvist stiger. Hypocotyllængden og den friske vægt over jorden stiger først og falder derefter, mens malondialdehyd (MDA), prolin (Pro) indhold, katalase (CAT), peroxidase (POD) og superoxiddismutase (SOD) aktivitet falder og derefter øges. Spirepotentialet, spiringsindekset, spiringshastigheden, frøspiringskraftindekset, rodlængden, rodfriskvægten, MDA- og Pro-indholdet og CAT-aktiviteten af Hongtianhu 101-frøene er højere end Xinxiang 8 for alle saltkoncentrationer, der anvendes her. Imidlertid er hypocotyllængde, frisk vægt over jorden og relativ salthastighed lavere i Hongtianhu 101 end i Xinxiang 8. Den omfattende evaluering af salttolerance afslører, at de samlede vægtede værdier af de to medlemsfunktionsindekser stiger først og derefter falder, når koncentrationen af blandet salt stiger. Sammenlignet med 5 g / L, som har den højeste medlemsfunktionsværdi, falder indekset under saltkoncentrationer på 3 g / L, 10 g / L og 15 g / L med henholdsvis 4,7% -11,1%, 25,3% -28,3% og 41,4% -45,1%. Denne undersøgelse giver teoretisk vejledning til opdræt af salttolerante sorter af peber og en analyse af de fysiologiske mekanismer, der er involveret i salttolerance og salttolerant dyrkning.
Introduction
Saltholdighed er en væsentlig begrænsende faktor for afgrødeproduktivitet på verdensplan1. På nuværende tidspunkt påvirkes næsten 19,5% af verdens kunstvandede jord og 2,1% af tørt land af saltholdighed, og ca. 1% af landbrugsjorden degenererer til saltvand-alkalijord hvert år. I 2050 forventes 50% af agerjorden at være påvirket af tilsaltning 2,3. Ud over naturlige faktorer, såsom naturlig stenforvitring og salt regnvand nær eller omkring kysten, har hurtig overfladefordampning, lav nedbør og urimelige landbrugsforvaltningsmetoder forværret processen med jordsaltning. Jordsaltning hæmmer væksten af planterødder og reducerer absorptionen og transporten af vand og næringsstoffer fra plantens rødder til bladene. Denne hæmning resulterer i fysiologisk vandmangel, ernæringsmæssige ubalancer og iontoksicitet, hvilket fører til reduceret afgrødeproduktivitet og et fuldstændigt tab af afgrødeudbytte. Tilsaltning af dyrket jord er gradvist ved at blive en af de mest kritiske abiotiske stressfaktorer, der påvirker den globale landbrugsfødevareproduktion4. Saltstress reducerer den agerjord, der er til rådighed for landbruget, hvilket kan resultere i en betydelig ubalance mellem udbud og efterspørgsel efter fremtidige landbrugsprodukter. Derfor er udforskning af virkningerne af jordsaltning på afgrødevækst og fysiologiske og biokemiske mekanismer befordrende for opdræt af salttolerante sorter, bæredygtig udnyttelse af saltvand og landbrugsprodukters sikkerhed.
Peber (Capsicum annuum L.) plantes over hele verden på grund af dens høje ernæringsmæssige og medicinske værdi. For eksempel er capsaicin et alkaloid, der er ansvarlig for den krydrede smag af peber. Capsaicin kan bruges til smertelindring, vægttab, forbedring hjerte-kar-sygdomme, mave-tarmkanalen, og åndedrætsorganer, og i flere andre applikationer5. Peber er også rig på bioaktive stoffer, især forskellige antioxidantforbindelser (carotenoider, phenoler og flavonoider) og C-vitamin6. I øjeblikket rapporteres peber at være grøntsagsafgrøden med det største dyrkningsområde i Kina med et årligt plantningsareal på mere end 1,5 x 106 ha, hvilket tegner sig for 8% -10% af det samlede grøntsagsplantningsareal i Kina. Peberindustrien er blevet en af de største grøntsagsindustrier i Kina og har den højeste produktionsværdi7. Imidlertid udsættes peberdyrkning ofte for en række biologiske (skadedyr og svampe) og abiotiske belastninger, især saltstress, som har en direkte negativ indvirkning på frøspiring, vækst og udvikling, hvilket resulterer i reduktion af peberfrugtudbytte og kvalitet8.
Frøspiring er den første fase af interaktion mellem planter og miljø. Frøspiring er meget følsom over for udsving i de omgivende medier, især jordsaltstress, som kan udøve omvendte virkninger på fysiologi og stofskifte og i sidste ende forstyrre den normale vækst, udvikling og morfogenese af afgrøder9. I tidligere undersøgelser blev spiring af peberfrø og frøplantevækst under saltstress grundigt undersøgt; de fleste undersøgelser brugte imidlertid NaCl som det eneste salt til stressinduktion10,11,12. Imidlertid skyldes jordsaltskader hovedsageligt Na+, Ca 2+, Mg 2+, Cl-, CO3 2- ogSO42- iontoksicitet genereret ved dissociation af natrium-, calcium- og magnesiumsalte. På grund af synergien og antagonismen mellem ioner kan virkningerne af blandet salt og enkeltsalt på afgrødevækst og udvikling være helt forskellige. Imidlertid er de tilsvarende egenskaber ved spiring af peberfrø og vækst i blandet salt stadig uklare. Derfor anvendes to pebersorter med bemærkelsesværdige forskelle i salttolerance som materialer i denne undersøgelse. Analyse af virkningerne af forskellige saltkoncentrationer på spiring af peberfrø, vækst og fysiologiske og biokemiske indekser efter ækvimolær blanding af syv salte kan afsløre responsmekanismen for spiring af peberfrø til saltholdighedsstress. Det kan også give et teoretisk grundlag for dyrkning af stærke peberplanter samt højt udbytte og dyrkning af høj kvalitet i saltvandsdyrket jord.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Her præsenterer vi en protokol til vurdering af responskarakteristika og interne mekanismer for spiring af peberfrø og frøplantevækst under forskellige blandede saltspændinger, som kan tjene som referencemetode til evaluering af frøsalttolerance.
1. Eksperimentel forberedelse
- Forbered afgrødefrø til sorter-Hongtianhu 101 med stærk salttolerance og Xinxiang 8 med lav tolerance.
- Forbered 0,2% KMnO4-opløsning som et frødesinfektionsreagens. Vej først 4,0 g KMnO4, og tilsæt derefter 2.000 ml destilleret vand.
BEMÆRK: Kaliumpermanganat er normalt ustabilt på grund af dets stærke oxidation; Derfor fremstilles den umiddelbart før brug. - Forbered de blandede salte ved hjælp af syv salte, herunder natriumcarbonat, natriumbicarbonat, natriumchlorid, calciumchlorid, magnesiumchlorid, magnesiumsulfat og natriumsulfat13. Tilsæt den samme molære mængde af hver, som successivt tegner sig for henholdsvis 14,8%, 11,7%, 8,2%, 15,5%, 13,3%, 16,7% og 19,8% af det samlede masseforhold mellem de blandede salte.
- Tilbered petriskåle (engangsbrug) og filterpapir (kvalitativt filterpapir med medium hastighed), begge med en diameter på 9 cm.
BEMÆRK: Petriskålens materiale kan ændres; dog skal diameteren på petriskålen og filterpapiret være den samme.
2. Iblødsætning af frø og forberedelse til spiring
- Til frøoptimering skal du vælge peberfrø med ensartet størrelse og fulde partikler fra hver sort med en gennemsnitlig diameter på 4,2 mm og 3,7 mm for henholdsvis Hongtianhu 101 og Xinxiang 8 frø. Beregn det samlede antal frø, der er valgt i henhold til testbelastningen.
- Til desinfektion af frø blødlægges udvalgte peberfrø i 0,2% KMnO4-opløsning i 15 minutter og skylles derefter fem gange med destilleret vand.
- Til frøblødning overføres de steriliserede frø til destilleret vand og lad dem trække i 24 timer. Skyl frøene flere gange med destilleret vand og tør til videre brug.
BEMÆRK: Opblødningstiden for frø til forskellige afgrøder kan variere.
3. Frøspiring og frøplantevækst
- Der fremstilles seks koncentrationer af de blandede salte: 0 (kontrol), 3, 5, 10, 15 og 20 g/l. Saltopløsningens ledningsevne måles ved hjælp af en ledningsevnemåler; opløsningens ledningsevne EC-værdier er henholdsvis 0,092, 3,05, 4,73, 8,33, 11,53 og 15,22 ms/cm.
- Til frøforberedelse placeres jævnt 40 peberfrø i en petriskål med to lag filterpapir. Forbered frøene til seks eksperimentelle behandlinger og gentag hver behandling fem gange.
- Til frøspiring tilsættes en passende mængde af de seks blandede saltkoncentrationer til petriskålen for at sikre, at filterpapiret holdes fugtigt. Placer frøene i en luftinkubator ved 28 ° C og 80% luftfugtighed til spiring i mørket.
- Efter frøspiring skal frøplanterne fortsætte med at vokse i lys (lysintensitet på ca. 450 Lux; lyscyklus på 12/12 timer) i inkubatoren i 14 dage efter såning. Temperaturen og fugtigheden på frøplantevækststadiet skal være den samme som dem, der anvendes i spiringstrinnet.
- Opløsningen genopfyldes i kulturskålen hver 12. time for at bevare et fugtigt filterpapir, og filterpapiret vaskes helt hver 24. time med den tilsvarende koncentration af den blandede saltopløsning for at holde en konstant blandet saltkoncentration i petriskålen.
BEMÆRK: Mængden af saltopløsning, der tilsættes våde frø, kan justeres i henhold til frøspiring og vækststadier. Mange metoder er tilgængelige til opretholdelse af en konstant koncentration af saltopløsninger i kulturretter. Ud over de metoder, der er beskrevet i dette eksperiment, kan strategien for tilsætning af destilleret vand efter vægt anvendes.
4. Måling og beregning af indikatorer
- Bestemmelse af frøspiringsindekserne
- Bestem spiringshastigheden dagligt efter såning, hvor radikelbrydende frøbeklædning når halvdelen af frødiameterlængden som spiremarkør.
- Beregn spiringshastighed, spirepotentiale, relativ salthastighed, spiringsindeks og frøspiringskraftindeks ved hjælp af følgende formler:
Spireevne (%) = (antal normale spirede frø på dag 7 efter såning/antal testede frø) × 100
Spireevne (%) = (antal normale spirede frø på dag 3 efter såning/antal testede frø) × 100
Relativ salthastighed (%) = (kontrolspiringshastighed - behandlingsspiringshastighed)/kontrolspiringshastighed × 100
beregnet ved hjælp af frøspiringshastigheden på dag 7 efter såning
Spireindeks (GI) = ∑ [Gt/Dt]
hvor Gt henviser til frøspiretallet i et tidsrum (t) efter såning, og Dt henviser til de tilsvarende spiredage
Frøspiring vigor indeks (VI) = GI x S
hvor S er rodlængden
- Bestemmelse af frøplantevækstindekset
- På dag 14 efter såning vælges tilfældigt 10 repræsentative frøplanter fra hver petriskål og måler rodlængden og hypocotyllængden.
- Brug en kniv til at opdele peberplanterne i to dele: radicle og overjordiske dele. Fjern vandet fra frøplanterne ved at tørre, og vej frøplanterne separat for at bestemme den friske vægt.
- Bestem antioxidantenzymaktiviteten, malondialdehyd (MDA) niveau og prolin (Pro) indhold i peber som følger.
- For at bevare peberplanterne skal du vælge repræsentative hele peberplanter (ca. 24,0 g) fra hver behandling på dag 14 efter såning. Efter fjernelse af overfladevandet fryses frøplanterne straks i flydende nitrogen i 1 min og opbevares i køleskab ved ultralav temperatur (-80 °C).
BEMÆRK: Prøveantallet af peberplanter, der opbevares i køleskabet med ultralav temperatur, skal være tilstrækkeligt, hvis nogle indikatorer skal testes igen. - Udtag ca. 1,0 g frøplanteprøve fra hver behandling indsamlet i tre eksemplarer. Placer frøplanteprøven i et centrifugerør, tilsæt flydende nitrogen, og mal prøven ved hjælp af en slibestang for at bestemme plantens fysiologiske indekser. De fastlagte indekser og måleskemaet er vist nedenfor.
- Bestem indholdet af frøplantebeskyttende enzymaktivitet (peroxidase [POD], katalase [CAT], superoxiddismutase [SOD]), malondialdehyd (MDA) og prolin (Pro) ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt kit (spektrofotometribaseret) for hver faktor14.
BEMÆRK: Tidligere observationer viste ingen forskel i saltspænding mellem 15 og 20 g / L blandede saltkoncentrationer. Som følge heraf måles kun fem saltkoncentrationer (0, 3, 5, 10 og 15 g / L).
- For at bevare peberplanterne skal du vælge repræsentative hele peberplanter (ca. 24,0 g) fra hver behandling på dag 14 efter såning. Efter fjernelse af overfladevandet fryses frøplanterne straks i flydende nitrogen i 1 min og opbevares i køleskab ved ultralav temperatur (-80 °C).
- Omfattende evaluering af salttolerance ved hjælp af medlemskabsfunktionsmetoden
BEMÆRK: Medlemskabsfunktionen bruger en fuzzy matematikmetode, der konverterer kvalitativ evaluering til kvantitativ evaluering15, til at evaluere en række fysiologiske indekser, der er påvirket af saltskader.- Beregn værdien af medlemskabsfunktionen ved hjælp af følgende formel af Zhoubin Liu et al.15:
Ri = (Xi - Xmin)/(Xmax - Xmin)
Hvis et træk er negativt korreleret med salttolerance, beregnes den inverse medlemskabsfunktion ved hjælp af:
Ri = 1 - (Xi - Xmin)/(Xmax - Xmin)
Akkumulere medlemsværdierne for hvert fysiologisk indeks, hvor Xi er den målte værdi af et bestemt træk, Xmax og Xmin er henholdsvis maksimum- og minimumsværdierne for Xi, og Ri er medlemsværdien af dette træk. - Medtag følgende relevante indikatorer: frøspiringsegenskaber (spirepotentiale, spiringshastighed, spiringsindeks og frøspiringskraftindeks), frøplantevækstegenskaber på spiringsstadiet (rodlængde, hypocotyllængde, rodfrisk vægt og frisk vægt over jorden), MDA, Pro og beskyttende enzymaktivitet (CAT, POD, SOD) til beregning af medlemsfunktionsværdi. Medlemskabsfunktionsværdierne fås fra hver indikator.
- Beregn værdien af medlemskabsfunktionen ved hjælp af følgende formel af Zhoubin Liu et al.15:
- Brug regneark og SPSS-software (version 22.0) til at analysere og behandle testdataene og anvende LSD-metoden (least significant difference) til flere sammenligninger for at identificere signifikante forskelle. Brug Pearsons korrelationsanalyse til at undersøge sammenhængen mellem frøspiring og frøplantefysiologiske indekser af peber under sammensat saltstress.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Frøspiring egenskaber
Når koncentrationen af blandet salt stiger, falder spiringspotentialet og spiringsindekset for Hongtianhu 101 og Xinxiang 8 betydeligt. Begge sorter har et kraftigt fald i saltkoncentrationerne fra 0-3 g/l og et langsomt og støt fald for saltkoncentrationer fra 3-20 g/l (figur 1A,B). Spiringshastigheden for de to sorter falder gradvist, når de blandede saltkoncentrationer stiger, og den relative salthastighed for sorterne stiger gradvist. Der er ingen signifikant forskel i spireevne og relativ salthastighed ved saltkoncentrationer på 3-15 g/l. Forskellen er dog signifikant ved alle andre saltkoncentrationer (figur 1C, D). Med hensyn til salttolerance mellem de to sorter er spiringspotentialet, spiringsindekset og spiringshastigheden for Hongtianhu 101 frø med stigende blandede saltkoncentrationer højere end for Xinxiang 8, mens den relative salthastighed er lavere end for Xinxiang 8.
Når koncentrationen af blandet salt stiger (0-15 g/L), falder frøspiringskraftindekset for de to sorter betydeligt. Når den blandede saltkoncentration er 15 g / L, falder frøspiringskraftindekset for Hongtianhu 101 og Xinxiang 8 med henholdsvis 91,0% og 94,6% sammenlignet med kontrolgruppens. Det skal bemærkes, at faldet ikke er signifikant, når koncentrationen af blandet salt stiger yderligere fra 15 til 20 g / L. Frøspiringskraftindekset for Hongtianhu 101 er højere end for Xinxiang 8 ved hvert blandet saltkoncentrationsniveau (figur 1E).
Frøplante vækstegenskaber
Når koncentrationen af blandet salt stiger (0-15 g / L), falder rodlængden og rodfriskvægten af Hongtianhu 101 og Xinxiang 8 betydeligt. Når den blandede saltkoncentration er 15 g / L, falder rodlængden af Hongtianhu 101 og Xinxiang 8 med henholdsvis 89,4% og 91,1%, og rodfriskvægten falder med henholdsvis 81,7% og 71,2% sammenlignet med kontrolgruppens. Når saltkoncentrationen er 15-20 g/L, ændres rodlængden og rodfriskvægten af de to sorter imidlertid ikke væsentligt (figur 2A,C). Rodlængden og rodfriskvægten af Hongtianhu 101 er generelt højere end Xinxiang 8 med stigende blandede saltniveauer, med åbenlyse forskelle i koncentrationer fra 0 til 10 g / L.
Hypocotyllængden og den friske vægt over jorden af de to sorter stiger og falder derefter med stigende blandet saltkoncentration. Begge indekser når deres højeste værdier ved en saltkoncentration på 5 g / L. Tilsvarende, når saltkoncentrationen er 15-20 g / L, falder hypocotyllængden og friskvægten over jorden af de to sorter lidt. Baseret på sortsforskellene er hypocotyllængden og friskvægten over jorden af Xinxiang 8 højere end Hongtianhu 101 ved hver saltkoncentration (figur 2B, D).
Indhold af membranlipidperoxidering og osmotisk justering
Når koncentrationen af blandet salt stiger, falder MDA- og Pro-indholdet i de to sorter og stiger derefter. MDA- og Pro-indholdet når deres laveste værdier ved koncentrationer på henholdsvis 5 g/l og 3 g/l (figur 3A,B). MDA-indholdet falder lidt ved saltkoncentrationer på 0-5 g / L og stiger hurtigt ved 10 g / L. Sammenlignet med 5 g / L-behandlingen stiger MDA-indholdet efter 10 g / L-behandlingen med 59,9% -64,8% og forbliver derefter uændret. MDA-indholdet i Hongtianhu 101 er højere end Xinxiang 8 ved forskellige saltkoncentrationer (figur 3A). Faldet i Pro-indholdet ved 0-3 g/l er ikke signifikant, og der findes kun lille forskel mellem de to sorter. Når saltkoncentrationen er 3-15 g / L, øges Pro-indholdet i Xinxiang 8 langsomt og forbliver relativt stabilt, mens Pro-indholdet i Hongtianhu 101 stiger hurtigt. Sammenlignet med 3 g / L stiger Pro-indholdet i Hongtianhu 101 signifikant med 440.2% ved 15 g / L (figur 3B).
Beskyttende enzymaktivitet
Når koncentrationen af blandet salt stiger, falder CAT-, POD- og SOD-aktiviteterne hos frøplanterne i Hongtianhu 101 og Xinxiang 8 og øges derefter med de laveste værdier opnået i en koncentration på 3 g / L (figur 4A-C). CAT- og POD-aktiviteterne for de to sorter varierer lidt ved saltkoncentrationer på 0-5 g / L, og forskellen mellem dem er lille. Derefter øges CAT- og POD-aktiviteterne for de to sorter betydeligt med stigende saltkoncentration. Endvidere er CAT- og POD-aktiviteterne i Hongtianhu 101 højere end Xinxiang 8, og forskellen mellem dem øges gradvist (figur 4A, B). SOD-aktiviteten for de to sorter varierer lidt ved saltkoncentrationer fra 0-10 g / L og stiger derefter hurtigt. SOD-aktiviteten af Xinxiang 8 er højere end Hongtianhu 101 ved saltkoncentrationer fra 0-10 g / L; for de resterende koncentrationer er dens aktivitet lavere end Hongtianhu 101 (figur 4C).
Korrelationsanalyse af frøspiringsindekserne for peber og omfattende evaluering af saltstress
Korrelationsanalyse (tabel 1) afslører, at rodlængden og rodfriskvægten for frøplantevækstkarakteristikkeindekserne er signifikant positivt korreleret med spiringsindekserne (spirepotentiale, spiringshastighed, spiringsindeks, frøspiringskraftindeks osv.); Imidlertid findes der ingen eksplicit relevans mellem hypocotyllængden, frisk vægt over jorden og spiringsindekserne. En signifikant negativ sammenhæng findes mellem indekserne for frøplantevækstegenskaber og aktiviteten af beskyttende enzymer (CAT, POD og SOD). En signifikant negativ korrelation findes også mellem hypocotyllængden og indholdet af MDA og Pro og mellem skuddets friske vægt og MDA-indholdet. Med undtagelse af den signifikante korrelation mellem frøspiringskraftindeks og beskyttende enzymaktivitet findes der ingen signifikant korrelation mellem spiringskarakteristiske indekser og fysiologiske indekser for frøplanter (beskyttende enzymaktivitet og MDA- og Pro-indhold).
Salttolerancen for de to pebersorter under sammensat saltspænding vurderes ved hjælp af medlemskabsfunktionsmetoden for flere træk. Da peberfrøplanterne ikke udsættes for saltstress, når den blandede saltkoncentration er 0 g / L, beregnes deres medlemsfunktionsværdi ikke. Som følge heraf vurderes kun behandlingen med saltstress ved hjælp af medlemsfunktionsanalyse. MDA viser sig at være negativt korreleret med salttolerancen for peberplanter og beregnes ved hjælp af den inverse medlemskabsfunktionsmetode; Andre indekser beregnes ved hjælp af medlemskabsfunktionsmetoden. Tabel 2 viser, at når koncentrationen af blandet salt stiger, stiger og falder de samlede vægtede værdier for hver indeksfunktion af de to sorter, hvorefter de til sidst når et maksimum ved en saltkoncentration på 5 g/l. Sammenlignet med 5 g/l-behandlingen er de værdier, der opnås med 3 g/l, 10 g/l, og 15 g / L saltkoncentrationsbehandlinger falder med henholdsvis 4,7% -11,1%, 25,3% -28,3% og 41,4% -45,1%. Derfor kan salttolerancen for peber, der udsættes for 5 g / L, 3 g / L, 10 g / L og 15 g / L saltkoncentrationsbehandlinger, kategoriseres som henholdsvis bedste, næstbedste, dårlige og værste.
Figur 1: Virkninger af stigende koncentrationer af blandet salt på frøspiring af peber . (A), (B), (C), (D) og (E) repræsenterer responsegenskaberne for henholdsvis peberfrøspiringspotentiale, spiringsindeks, spiringshastighed, relativ salthastighed og frøspiringskraftindeks til sammensat saltstress. Forskellige små bogstaver i figuren indikerer signifikante forskelle mellem behandlinger, som analyseres ved Tukeys multiple range test (p < 0,05). Fejlbjælker angiver standardafvigelser (n = 5). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Virkninger af stigende blandede saltkoncentrationer på frøspiring og morfologiske indekser for peber . (A), (B), (C) og (D) repræsenterer responsegenskaberne for henholdsvis peberfrøplanterodlængde, hypocotyllængde, rodfrisk vægt og frisk vægt over jorden til sammensat saltspænding. Forskellige små bogstaver i figuren indikerer signifikante forskelle mellem behandlinger, som analyseres ved Tukeys multiple range test (p < 0,05). Fejlbjælker angiver standardafvigelse (n = 5). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Virkninger af stigende blandede saltkoncentrationer på MDA- og Pro-indholdet i peberplanter. (A) og (B) repræsenterer responsegenskaberne for henholdsvis peberfrøplante MDA og Pro-indhold til sammensat saltspænding. Forskellige små bogstaver i figuren indikerer signifikante forskelle mellem behandlinger, som analyseres ved Tukeys multiple range test (p < 0,05). Fejlbjælker angiver standardafvigelse (n = 3). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Effekter af stigende blandede saltkoncentrationer på CAT-, POD- og SOD-aktiviteter hos peberfrøplanter. (A), (B) og (C) repræsenterer responsegenskaberne for henholdsvis peberfrøplante CAT-, POD- og SOD-aktiviteter til sammensat saltstress. Forskellige små bogstaver i figuren indikerer signifikante forskelle mellem behandlinger, som analyseres ved Tukeys multiple range test (p < 0,05). Fejlbjælker angiver standardafvigelse (n = 3). Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Korrelationsanalyse mellem peberspiring og fysiologiske indikatorer under sammensat saltstress (n = 30). Pearsons korrelationsanalyse bruges til at undersøge sammenhængen mellem frøspiring og frøplantefysiologiske indekser af peber under sammensat saltstress. * p < 0,05; ** p < 0,01. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 2: Den vægtede medlemsfunktionsværdi af peberspiring og frøplanternes fysiologiske indikatorer under blandet saltstress. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne forskningsmetode består af fire nøgletrin, der påvirker nøjagtigheden af de eksperimentelle resultater. For det første skal de vejede reagenser på grund af den dårlige opløsning af blandede salte forårsaget af det øgede opløste indhold i opløsninger med høj saltkoncentration og den lave opløselighed af reagenser såsom calciumchlorid, som er vanskeligere at opløse i vand, males helt i en mørtel. Endvidere skal reagenserne opløses via ultralydbølger, inden kapaciteten bestemmes. For det andet skal den konfigurerede saltopløsning rystes fuldstændigt hver gang og tilsættes petriskålen til brug. For det tredje skal petriskålene bevare et passende vandlag efter tilsætning af saltopløsningen, og vandtilstanden for hver petriskål skal være relativt konsistent. Endelig skal lysforholdene være konsistente efter frøspiring.
I denne undersøgelse kan antallet af testfrø i en enkelt petriskål justeres ved at variere diameteren på den valgte petriskål. I henhold til den specifikke situation med jordsaltstress i forskellige plantningsområder kan andelen af hver enkelt salttilsætning justeres for at muliggøre overensstemmelse med den faktiske situation med saltstress i den lokale jord. Selvom denne metode er praktisk, for mindre frø (såsom raps, isplante og amarant) eller større frø (såsom sværdbønner og brede bønner), fører problemer som driftsvanskeligheder ved bestemmelse af frøplantelængde og frisk vægt eller tilgængeligheden af meget få frø i en enkelt kulturskål til at gentage dataene til vanskeligheder med at studere salttolerance ved hjælp af denne metode.
Metoden beskrevet her bruges til at bestemme frøspiringskarakteristika og frøplantevækst under forskellige blandede saltkoncentrationer og afsløre ændringsmekanismen gennem intern fysiologisk enzymaktivitet, hvilket er af stor betydning for objektivt at evaluere frøets salttoleranceegenskaber. Denne teknologi kan give en teknisk reference til evaluering af salttolerance af andre afgrøder. Frøspiring og frøplantevækst er de stadier, hvor afgrøder er mest følsomme over for saltstress. Således kan denne metode effektivt give en reference til salttolerant dyrkning og afgrødeavl.
I de fleste afgrøder kan saltstress hæmme frøspiring og frøplantevækst under biotisk stress. En sådan hæmning kan skyldes en reduktion i optagelsen af frøvand ved at reducere saltopløsningens osmotiske potentiale under saltvandsbetingelser. Saltionstress og toksicitet kan ændre aktiviteten af beskyttende enzymer (POD, CAT, SOD osv.) og proteinmetabolisme under frøspiring og ødelægge den endogene hormonbalance11,16. Zhani et al. rapporterede, at spiringsprocessen hovedsageligt blev ændret af en reduceret spiringshastighed og langvarig spiring under salt (NaCl) stress. Endvidere blev der fundet en signifikant forskel i spireevnen mellem forskellige sorter (10% -50%) ved en saltkoncentration på 8 g / L17. Denne undersøgelse afslører også, at når koncentrationen af blandet salt stiger, falder spiringspotentialet, spiringsindekset, spiringshastigheden og frøspiringskraftindekset for Hongtianhu 101 og Xinxiang 8 betydeligt, og den relative salthastighed stiger gradvist. Ifølge Patanè et al., Selvom saltstress forlængede spiringstiden for søde sorghumfrø, havde stigende saltstress en negativ effekt på den endelige spiring af frø18. Imidlertid tyder relaterede undersøgelser på, at NaCl-behandling kan fremme spiring og vækst af peberfrø19, hvilket kan være relateret til forskelle i saltkoncentrationsniveauer.
Forøgelse af niveauet af saltstress har en signifikant effekt på væksten af peberplanter, og baseret på denne undersøgelse faldt rodlængden og rodfriskvægten af de to sorter signifikant med stigende blandede saltkoncentrationer. Dette fund svarer til Mirosavljević et al., Der foreslog, at rodlængde og rodvægt faldt, da saltstress steg, og forskellene mellem behandlingerne var signifikante20. Dette resultat indikerer, at rodsystemet blev placeret i jordmediet i direkte kontakt med jordopløsningen, og rodlængden og rodvægten var mere følsomme over for NaCl osmotisk stress. Rodlængde og rodvægt er nøgleindikatorer for plantens reaktion på saltstress. Ifølge denne undersøgelse, når saltkoncentrationen stiger, øges hypocotyllængden og den friske vægt af de overjordiske dele og falder derefter, med maksimale værdier opnået ved 5 g / L. Khan et al. foreslog også, at når saltholdigheden (NaCl) stiger (0-9 ms / cm), øges skudlængden af peber først og falder derefter med den bedste ydeevne opnået ved 3 ms / cm12, 21. Konduktiviteten af saltkoncentrationen i denne undersøgelse var 4,73 ms / cm, når værdien af frøplantehypocotyllængde og frisk vægt over jorden var den højeste, hvilket er højere end værdien rapporteret af Khan et al.21. Dette resultat kan skyldes den høje tolerance af peber over jorden til sammensat saltspænding sammenlignet med enkelt saltstress.
Saltstress hindrer ikke kun afgrødevækst, men forårsager også betydelige fysiologiske ændringer i planter. Saltstress kan øge niveauerne af reaktive iltarter (ROS). Hvis ROS ikke ryddes i tide, kan membranlipidperoxidering og oxidativ stress, som kan forårsage alvorlig skade på plantecellemembranen, forekomme. MDA er den endelige metabolit af membranlipidperoxidation, og intracellulær MDA-koncentration bruges ofte som indikator til at vurdere graden af skade på planter under stress22. I denne undersøgelse, når koncentrationen af blandet salt stiger, falder MDA-indholdet i frøplanterne af de to sorter først og stiger derefter. Det skal bemærkes, at faldet ikke er signifikant ved saltkoncentrationer fra 0-5 g/L. Der ses dog en hurtig stigning fra 5-10 g/l. Derefter forbliver værdierne uændrede, hvilket indikerer, at graden af membranlipidperoxid af peberfrø ændres fra generel til hurtigt stigende til stabil. Saltstress spekuleres i at have en alvorlig indvirkning på cellemembranpermeabiliteten, når den blandede saltkoncentration er større end 10 g / L. Guzmán-Murillo et al. rapporterede en lignende konklusion om et fald og derefter en stigning i membranlipidperoxidniveauet i sød peberplanter, da NaCl-koncentrationen steg (0-50 nmol / L). Endvidere var niveauet af lipidperoxidering lavest ved 25 nmol/lNaCl23.
Planter har udviklet flere strategier til at klare saltstress. På den ene side forbedrer afgrøder proteinstabilitet og membranintegritet ved at øge osmotiske justeringsstoffer, såsom prolin, og reducere tabet af intracellulært vand og derved forbedre salttolerancen24. I den nuværende undersøgelse, når koncentrationen af blandet salt stiger, falder Pro-indholdet i Xinxiang 8 og Hongtianhu 101 frøplanter først og stiger derefter. Især er faldet ikke signifikant ved koncentrationer på 0-3 g / L, og forskellen mellem de to sorter er ikke signifikant, hvilket stemmer overens med de eksperimentelle resultater af Muchate et al25. Pro-indholdet i Hongtianhu 101 pebersorten med god salttolerance stiger også hurtigt ved saltkoncentrationer på 3-15 g / L. Sammenlignet med 3 g / L stiger Pro-indholdet på 15 g / L betydeligt med 440,2%, mens Pro-indholdet i Xinxiang 8 med generel salttolerance stiger langsomt og opretholder et relativt stabilt niveau ved saltkoncentrationer på 3-15 g / L. Antioxidantenzymernes skyllevirkning på ROS induceret af saltstress har vist sig at være hovedkomponenten i afgrødeforsvarsmekanismer. Aktiviteterne i CAT, POD og SOD er blevet rapporteret at stige under forskellige saltstressmiljøer og derved forbedre dens salttolerance25,26. Chen et al. viste, at når NaCl-koncentrationen stiger, øges SOD's, PODS, og CAT's aktiviteter i spiring af tomatfrø gradvist, uden signifikant forskel i hvert indeks efter behandling med 0-50 nmol/L NaCl27. Denne undersøgelse viser også, at når koncentrationen af blandet salt stiger, falder aktiviteterne af CAT, POD og SOD i frøplanterne af Hongtianhu 101 og Xinxiang 8 og øges derefter. Ved lave saltkoncentrationer (0-3 g/l) ændres aktiviteten af antioxidantenzymer ikke væsentligt, og en yderligere stigning i saltkoncentrationen forbedrer salttolerancen.
Afgrødernes tilpasningsevne og responsegenskaber til saltstress afspejles hovedsageligt i morfologi, struktur, fysiologisk økologi mv. En omfattende evaluering af sammensat saltspænding udføres ved hjælp af medlemskabsfunktionsværdimetoden for flere træk. Denne undersøgelse viser, at når koncentrationen af blandet salt stiger, stiger den samlede vægtede værdi af funktionsværdien først og falder derefter. De to sorter når et maksimum på 5 g / L, hvilket fører til den bedste salttoleranceeffekt. Sammenlignet med 5 g / L-behandlingen falder de vægtede værdier efter behandling med saltkoncentrationerne på 3 g / L, 10 g / L og 15 g / L med henholdsvis 4,7%, 25,3% og 41,4% for Hongtianhu 101 og henholdsvis 11,1%, 28,3% og 45,1% for Xinxiang 8. Sådanne fund indikerer, at salttolerancen for Hongtianhu 101 er højere end for Xinxiang 8.
Denne undersøgelse giver en omfattende beskrivelse af virkningerne af forskellige koncentrationer af sammensat saltstress på spiring af peberfrø og dets fysiologiske enzymaktiviteter og en teknisk reference for forskning i salttolerance i andre afgrøder. Peberfrøplanter påvirkes mindre af saltstress under simulerede blandede saltkoncentrationer (0-5 g / L). Frøspiring, radikelforlængelse og frøplantemorfogenese af peber hæmmes signifikant under høj saltstress (>5 g / L), hvilket forårsager alvorlig membranlipidperoxidering i peberplanter. Afgrøder reducerer de negative virkninger af saltstress ved at øge deres Pro-indhold og øge aktiviteten af beskyttende enzymer (CAT, POD og SOD). Under saltstress er prolinindholdet og den beskyttende enzymaktivitet af Hongtianhu 101-frøplanter højere, graden af membranlipidperoxidering er lavere, og frøspiring og frøplantevækst er mere indlysende end Xinxiang 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af videnskabs- og teknologiafdelingen i Jiangxi-provinsen (20203BBFL63065) og det generelle projekt for videnskab og teknologiforskningsprojekt fra Jiangxi Education Department (GJJ211430). Vi vil gerne takke Editage (www.editage.cn) for engelsksproget redigering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium chloride | Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd.,China | Analytical reagent | |
| Centrifugal machine | Shanghai Luxianyi Centrifuge Instrument Co., Ltd., China | TGL-16M | |
| Centrifuge tube | None | None | |
| Conductivity meter | Shanghai Instrument&Electronics Science Instrument Co., Ltd., China | DDSJ-308F | |
| Constant temperature and humidity box | Ningbo Laifu Technology Co., Ltd.,China | PSX-280H | |
| Digital display vernier caliper | Deli Group Co., Ltd.,China | DL90150 | |
| Electronic balance | Mettler Toledo Instruments (Shanghai) Co., Ltd.,China | ME802E/02 | |
| Filter paper | Hangzhou Fuyang North Wood Pulp and Paper Co., Ltd.,China | GB/T1914-2017 | |
| Grinding rod | None | None | |
| Hongtianhu 101 | Seminis Seed (Beijing) Co., Ltd.,China | 11933955/100147K1-137 | |
| Ice machine | Shanghai Kehuai Instrument Co., Ltd., China | IM150G | |
| Liquid nitrogen | None | None | |
| Magnesium chloride | Tianjin Kermel Chemical Reagent Co., Ltd.,China | Analytical reagent | |
| Magnesium sulfate | Tianjin Kermel Chemical Reagent Co., Ltd.,China | Analytical reagent | |
| Petri dish | Jiangsu Yizhe Teaching Instrument Co., Ltd.,China | I-000163 | |
| Pocket knife | None | None | |
| Potassium permanganate (KMnO4 | Xilong Scientific Co.,Ltd.,China | Analytical reagent | |
| Pure water equipment | Sichuan Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd.,China | UPT-I-20T | |
| Sodium bicarbonate | Xilong Scientific Co.,Ltd.,China | Analytical reagent | |
| Sodium carbonate | Xilong Scientific Co.,Ltd.,China | Analytical reagent | |
| Sodium chloride | Xilong Scientific Co.,Ltd.,China | Analytical reagent | |
| Sodium sulfate | Xilong Scientific Co.,Ltd.,China | Analytical reagent | |
| Test kit | Suzhou Keming, Biotechnology Co., Ltd, Suzhou.,China | Spectrophotometer method | |
| Ultra-low temperature freezer | SANYO Techno Solution TottoriCo.,Ltd. | MDF-382 | |
| Ultraviolet visible spectrophotometer | Shanghai Precision Scientific Instrument Co., Ltd., China | 760CRT | |
| Xinxiang 8 | Jiangxi Nongwang High Tech Co., Ltd.,China | GPD Pepper 2017(360013) |
References
- Szabolcs, I. Soils sand salinisation. Handbook of Plant and Crop Stress. , Marcel Dekker. New York. 3-11 (1994).
- Global network on integrated soil management for sustainable use of salt effected soils. FAO. , Available from: http://www.fao.org/ag/AGL/agll/spush/intro.htm (2005).
- Lakhdar, A., et al. Effectiveness of compost use in salt-affected soil. Journal of Hazardous Materials. 171 (1-3), 29-37 (2009).
- Cheng, Z., Chen, Y., Zhang, F. Effect of cropping systems after abandoned salinized farmland reclamation on soil bacterial communities in arid northwest China. Soil and Tillage Research. 187, 204-213 (2019).
- Shrivastava, P., Kumar, R. Soil salinity: A serious environmental issue and plant growth promoting bacteria as one of the tools for its alleviation. Saudi Journal of Biological Sciences. 22 (2), 123-131 (2015).
- Fattori, V., Hohmann, M. S., Rossaneis, A. C., Pinho-Ribeiro, F. A., Verri, W. A. Capsaicin: Current understanding of its mechanisms and therapy of pain and other pre-clinical and clinical uses. Molecules. 21 (7), 844-878 (2016).
- Zhao, Z., et al. Investigation, collection and identification of pepper germplasm resources in Guangxi. Journal of Plant Genetic .Resources. 21 (4), 908-913 (2020).
- Zhang, J., et al. Biochar alleviated the salt stress of induced saline paddy soil and improved the biochemical characteristics of rice seedlings differing in salt tolerance. Soil and Tillage Research. 195, 104372-104381 (2019).
- Ashraf, M., Foolad, M. R. Pre-sowing seed treatment-A shotgun approach to improve germination, plant growth, and crop yield under saline and non-saline conditions. Advances in Agronomy. 88, 223-271 (2005).
- Esra, K. O. Ç, Üstün, A. S., İşlek, C., Arici, Y. K. Effect of exogenously applied spermine and putrescine on germination and in vitro growth of pepper (Capsicum annuum l.) seeds under salt stress. Anadolu University Journal of Science and Technology C-Life Sciences and Biotechnology. 3 (2), 63-71 (2014).
- Demir, I., Mavi, K. Effect of salt and osmotic stresses on the germination of pepper seeds of different maturation stages. Brazilian Archives of Biology and Technology. 51 (5), 897-902 (2008).
- Khan, H. A., et al. Effect of seed priming with NaCl on salinity tolerance of hot pepper (Capsicum annuum L.) at seedling stage. Soil and Environment. 28 (1), 81-87 (2009).
- Zhou, L. L. Effects of salinity stress on cotton (Gossypium hirsutum L.) root growth and cotton field soil micro-ecology. Nanjing Agricultural University. , (2010).
- Ding, D. X., et al. Exogenous zeaxanthin alleviates low temperature combined with low light induced photosynthesis inhibition and oxidative stress in pepper (Capsicum annuum L.) plants. Current Issues in Molecular Biology. 44 (6), 2453-2471 (2022).
- Liu, Z. B., Yang, B. Z., Ou, L. J., Zou, X. X. The impact of different Ca2+ spraying period on alleviating pepper injury under the waterlogging stress. Acta Horticulturae Sinica. 42 (8), 1487-1494 (2015).
- Aloui, H., Souguir, M., Latique, S., Hannachi, C. Germination and growth in control and primed seeds of pepper as affected by salt stress. Cercetări agronomice în Moldova. 47 (3), 83-95 (2014).
- Zhani, K., Elouer, M. A., Aloui, H., Hannachi, C. Selection of a salt tolerant Tunisian cultivar of chili pepper (Capsicum frutescens). EurAsian Journal of Biosciences. 6, 47-59 (2012).
- Patanè, C., Saita, A., Sortino, O. Comparative effects of salt and water stress on seed germination and early embryo growth in two cultivars of sweet sorghum. Journal of Agronomy and Crop Science. 199 (1), 30-37 (2013).
- Smith, P. T., Cobb, B. G. Accelerated germination of pepper seed by priming with salt solutions and water. Hortscience. 26 (4), 417-419 (2019).
- Mirosavljević, M., et al. Maize germination parameters and early seedlings growth under different levels of salt stress. Ratarstvo i Povrtarstvo. 50 (1), 49-53 (2013).
- Khan, H. A., et al. Hormonal priming alleviates salt stress in hot pepper (Capsicum annuum L.). Soil and Environment. 28 (2), 130-135 (2009).
- Zhang, B. B., et al. Effects of simulated salinization on seed germination and physiological characteristics of muskmelon seedlings. Chinese Journal of Tropical Crops. 41 (5), 912-920 (2020).
- Guzmán-Murillo, M. A., Ascencio, F., Larrinaga-Mayoral, J. A. Germination and ROS detoxification in bell pepper (Capsicum annuum L.) under NaCl stress and treatment with microalgae extracts. Protoplasma. 250 (1), 33-42 (2013).
- Slama, I., Abdelly, C., Bouchereau, A., Flowers, T., Savoure, A. Diversity, distribution and roles of osmoprotective compounds accumulated in halophytes under abiotic stress. Annals of Botany. 115 (3), 433-447 (2015).
- Muchate, N. S., Nikalje, G. C., Rajurkar, N. S., Suprasanna, P., Nikamd, T. D. Physiological responses of the halophyte Sesuvium portulacastrum to salt stress and their relevance for saline soil bio-reclamation. Flora. 224, 96-105 (2016).
- Javed, S. A., et al. Can different salt formulations revert the depressing effect of salinity on maize by modulating plant biochemical attributes and activating stress regulators through improved N supply. Sustainability. 13 (14), 8022-8037 (2021).
- Chen, J., et al. Effects of salt stress on form of polyamine and antioxidation in germinating tomato seed. Acta Pedologica Sinica. 58 (6), 1598-1609 (2021).
