Summary
Papiret nedenfor presenterer en protokoll for måling av frøspredning, frøplantevekst og fysiologiske indekser av to peppervarianter med saltholdighetstoleranseforskjeller som respons på seks blandede saltkonsentrasjoner. Denne protokollen kan brukes til å evaluere salttoleransen til peppervarianter.
Abstract
For å bestemme salttoleransen og den fysiologiske mekanismen til pepper (Capsicum annuum L.) på spiringstrinnet, brukes Hongtianhu 101 og Xinxiang 8-varianter, som har store forskjeller i salttoleranse, som studiematerialer. Seks blandede saltkonsentrasjoner på 0, 3, 5, 10, 15 og 20 g / l avledet ved bruk av like molare forhold mellom Na 2 CO 3, NaHCO3, NaCl, CaCl 2, MgCl 2, MgSO 4 og Na 2 SO4 brukes. For å bestemme deres effekter måles de relaterte indeksene for frøspredning, frøplantevekst og fysiologi, og salttoleranse evalueres grundig ved hjelp av medlemsfunksjonsanalyse. Resultatene viser at når den blandede saltkonsentrasjonen øker, reduseres spiringspotensialet, spiringsindeksen, spiringshastigheten, frøspredningskraftindeksen, rotlengden og rotvekten til de to sortene betydelig, mens den relative salthastigheten gradvis øker. Hypokotyllengden og friskvekten over bakken øker først og reduseres deretter, mens malondialdehyd (MDA), prolin (Pro) innhold, katalase (CAT), peroksidase (POD) og superoksiddismutase (SOD) aktivitet reduseres og deretter øker. Spiringspotensialet, spiringsindeksen, spiringshastigheten, frøspiringskraftindeksen, rotlengden, rotens ferskvekt, MDA- og Pro-innhold og CAT-aktiviteten til Hongtianhu 101-frøene er høyere enn for Xinxiang 8 for alle saltkonsentrasjoner som brukes her. Imidlertid er hypokotyllengde, ferskvekt over bakken og relativ salthastighet lavere i Hongtianhu 101 enn i Xinxiang 8. Den omfattende evalueringen av salttoleranse viser at de totale vektede verdiene til de to medlemsfunksjonsindeksene øker først og deretter reduseres når den blandede saltkonsentrasjonen øker. Sammenlignet med 5 g / L, som har den høyeste medlemsfunksjonsverdien, reduseres indeksen under saltkonsentrasjoner på 3 g / L, 10 g / L og 15 g / L med henholdsvis 4,7% -11,1%, 25,3% -28,3% og 41,4% -45,1%. Denne studien gir teoretisk veiledning for avl av salttolerante varianter av pepper og en analyse av de fysiologiske mekanismene som er involvert i salttoleranse og salttolerant dyrking.
Introduction
Saltholdighet er en viktig begrensende faktor for avlingenes produktivitet over hele verden1. I dag er nesten 19,5% av verdens vannet land og 2,1% av tørt land påvirket av saltholdighet, og ca 1% av jordbruksarealet degenererer til saltvann-alkali land hvert år. I 2050 forventes 50% av dyrkbar jord å bli påvirket av salinisering 2,3. I tillegg til naturlige faktorer, som naturlig bergforvitring og salt regnvann nær eller rundt kysten, har rask overflatefordampning, lite nedbør og urimelige landbruksstyringsmetoder forverret prosessen med jordsalinisering. Jordsalinisering hemmer veksten av planterøtter og reduserer absorpsjon og transport av vann og næringsstoffer fra planterøttene til bladene. Denne hemmingen resulterer i fysiologisk vannmangel, ernæringsmessige ubalanser og iontoksisitet, noe som fører til redusert avlingsproduktivitet og et fullstendig tap av avlinger. Salinisering av dyrket blir gradvis en av de mest kritiske abiotiske stressfaktorene som påvirker global landbruksmatproduksjon4. Saltstress reduserer dyrkbar jord tilgjengelig for landbruk, noe som kan føre til en betydelig ubalanse mellom tilbud og etterspørsel av fremtidige landbruksprodukter. Derfor undersøker effekten av jordsalinisering på vekst av avlinger og fysiologiske og biokjemiske mekanismer bidrar til avl av salttolerante varianter, bærekraftig utnyttelse av saltholdig jord og sikkerheten til landbruksprodukter.
Pepper (Capsicum annuum L.) er plantet over hele verden på grunn av sin høye ernæringsmessige og medisinske verdi. For eksempel er capsaicin et alkaloid som er ansvarlig for krydret smak av pepper. Capsaicin kan brukes til smertelindring, vekttap, forbedring av kardiovaskulære, gastrointestinale og respiratoriske systemer, og i flere andre applikasjoner5. Pepper er også rik på bioaktive stoffer, spesielt forskjellige antioksidantforbindelser (karotenoider, fenoler og flavonoider) og vitamin C6. For tiden rapporteres pepper å være vegetabilsk avling med det største dyrkingsområdet i Kina, med et årlig plantingsområde på mer enn 1,5 x 106 ha, og står dermed for 8% -10% av det totale vegetabilske plantearealet i Kina. Pepperindustrien har blitt en av de største grønnsaksindustriene i Kina og har den høyeste produksjonsverdien7. Imidlertid blir pepperdyrking ofte utsatt for en rekke biologiske (og sopp) og abiotiske påkjenninger, spesielt saltstress, som har en direkte negativ innvirkning på frøspredning, vekst og utvikling, noe som resulterer i reduksjon av pepperfruktutbytte og kvalitet8.
Frøspredning er den første fasen av samspillet mellom planter og miljø. Frøspredning er svært følsom for svingninger i de omkringliggende mediene, spesielt jordsaltstress, som kan utøve reverserte effekter på fysiologi og metabolisme, og til slutt forstyrre normal vekst, utvikling og morfogenese av avlinger9. I tidligere studier ble spiring av pepperfrø og frøplantevekst under saltstress grundig undersøkt; Imidlertid brukte de fleste studier NaCl som det eneste saltet for stressinduksjon10,11,12. Imidlertid skyldes jordsaltskader hovedsakelig Na +, Ca 2 +, Mg 2 +, Cl-, CO3 2- og SO4 2- ion toksisitet generert ved dissosiasjon av natrium-, kalsium- og magnesiumsalter. På grunn av synergien og antagonismen mellom ioner, kan effekten av blandet salt og enkelt salt på vekst og utvikling av avlinger være ganske forskjellige. Imidlertid er de tilsvarende egenskapene til pepperfrøspredning og vekst i blandet salt fortsatt uklare. Derfor brukes to peppervarianter med bemerkelsesverdige forskjeller i salttoleranse som materialer i denne studien. Analyse av effekten av forskjellige saltkonsentrasjoner på spiring av pepperfrø, vekst og fysiologiske og biokjemiske indekser etter ekvimolar blanding av syv salter kan avsløre responsmekanismen for pepperfrøspiring til saltholdighetsstress. Det kan også gi et teoretisk grunnlag for dyrking av sterke pepperplanter, samt høyt utbytte og dyrking av høy kvalitet i saltvannsdyrket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Her presenterer vi en protokoll for å vurdere responsegenskapene og interne mekanismer for spiring av pepperfrø og frøplantevekst under forskjellige blandede saltspenninger, som kan tjene som en referansemetode for evaluering av frøsalttoleranse.
1. Eksperimentell forberedelse
- Forbered avlingsfrø til kultivarer-Hongtianhu 101 med sterk salttoleranse og Xinxiang 8 med lav toleranse.
- Forbered 0,2% KMnO4 løsning som et frø desinfeksjonsreagens. Veie først 4,0 g KMnO4, og tilsett deretter 2,000 ml destillert vann.
MERK: Kaliumpermanganat er vanligvis ustabilt på grunn av sin sterke oksidasjon; Følgelig tilberedes den umiddelbart før bruk. - Forbered de blandede saltene ved hjelp av syv salter, inkludert natriumkarbonat, natriumbikarbonat, natriumklorid, kalsiumklorid, magnesiumklorid, magnesiumsulfat og natriumsulfat13. Legg til samme molare mengde av hver, som suksessivt står for henholdsvis 14, 8%, 11, 7%, 8, 2%, 15, 5%, 13, 3%, 16, 7% og 19, 8% av det totale masseforholdet mellom blandede salter.
- Forbered petriskåler (engangsbruk) og filterpapir (middels hastighet kvalitativt filterpapir), begge med en diameter på 9 cm.
MERK: Materialet i petriskålen kan endres; Diameteren på petriskålen og filterpapiret må imidlertid være den samme.
2. Frøbløtlegging og forberedelse til spiring
- For frøoptimalisering, velg pepperfrø med konsistent størrelse og fulle partikler fra hver variasjon, med en gjennomsnittlig diameter på 4,2 mm og 3,7 mm for henholdsvis Hongtianhu 101 og Xinxiang 8 frø. Beregn totalt antall frø valgt i henhold til testarbeidsbelastningen.
- For frødesinfeksjon, suge utvalgte pepperfrø i 0,2% KMnO4 løsning i 15 minutter og skyll deretter fem ganger med destillert vann.
- For frøbløtlegging, overfør de steriliserte frøene til destillert vann og la dem suge i 24 timer. Skyll frøene flere ganger med destillert vann og tørk for videre bruk.
MERK: Bløtleggingstiden for frø for forskjellige avlinger kan variere.
3. Frøspredning og frøplantevekst
- Forbered seks konsentrasjoner av de blandede saltene: 0 (kontroll), 3, 5, 10, 15 og 20 g/l. Mål konduktiviteten til saltløsningen ved hjelp av en konduktivitetsmåler; EC-verdiene for løsningskonduktivitet er henholdsvis 0,092, 3,05, 4,73, 8,33, 11,53 og 15,22 ms/cm.
- For frøforberedelse, legg jevnt 40 pepperfrø i en petriskål med to lag filterpapir. Forbered frøene for seks eksperimentelle behandlinger og gjenta hver behandling fem ganger.
- For frøspiring, tilsett en passende mengde av de seks blandede saltkonsentrasjonene i petriskålen for å sikre at filterpapiret holdes fuktig. Legg frøene i en luftinkubator ved 28 °C og 80 % luftfuktighet for spiring i mørket.
- Etter frøspredning, la plantene fortsette å vokse i lys (lysintensitet på ca. 450 lux, lyssyklus på 12/12h) i inkubatoren i 14 dager etter sådd. Temperaturen og fuktigheten i frøplantevekststadiet må være den samme som de som brukes i spiringstrinnet.
- Fyll på løsningen i kulturskålen hver 12. time for å beholde et fuktig filterpapir, og vask filterpapiret helt hver 24. time med tilsvarende konsentrasjon av den blandede saltoppløsningen for å holde en konstant blandet saltkonsentrasjon i petriskålen.
MERK: Mengden saltoppløsning tilsatt våte frø kan justeres i henhold til frøspredning og vekststadier. Mange metoder er tilgjengelige for å opprettholde en konstant konsentrasjon av saltløsninger i kulturretter. I tillegg til metodene beskrevet i dette forsøket, kan strategien for å tilsette destillert vann etter vekt brukes.
4. Måling og beregning av indikatorer
- Bestemmelse av frøspredningsindeksene
- Bestem spiringshastigheten daglig etter sådd, med radicle breaking frøbelegg som når halvparten av frødiameterlengden som spiringsmarkør.
- Beregn spiringshastighet, spiringspotensial, relativ salthastighet, spiringsindeks og frøspiringskraftindeks ved hjelp av følgende formler:
Spirehastighet (%) = (antall normale spirefrø dag 7 etter såing/antall testede frø) × 100
Spirepotensial (%) = (antall normale spirefrø på dag 3 etter såing/antall testede frø) × 100
Relativ salthastighet (%) = (kontrollspiringshastighet - behandlingsspiringshastighet)/kontrollspiringshastighet × 100
beregnet ved hjelp av frøspredningshastigheten på dag 7 etter sådd
Spiringsindeks (GI) = ∑ [gt/dt]
der Gt refererer til frøspiringsnummeret i en periode (t) etter såing og Dt refererer til de tilsvarende spiredagene
Frøspredningskraftindeks (VI) = GI x S
hvor S er rotlengden
- Bestemmelse av vekstindeksen for frøplanter
- På dag 14 etter sådd, velg tilfeldig 10 representative frøplanter fra hver petriskål og måle rotlengden og hypokotyllengden.
- Bruk en kniv til å dele pepperplantene i to deler: radicle og overground deler. Fjern vannet fra plantene ved å tørke, og vei plantene separat for å bestemme den friske vekten.
- Bestem antioksidantenzymaktiviteten, malondialdehyd (MDA) -nivået og prolin (Pro) -innholdet i pepper som følger.
- For å bevare pepperplantene, velg representative fullpepperplanter (ca. 24,0 g) fra hver behandling på dag 14 etter sådd. Etter å ha fjernet overflatevannet, frys plantene umiddelbart i flytende nitrogen i 1 min og oppbevar dem i kjøleskap ved ultralav temperatur (-80 °C).
MERK: Prøveantallet pepperplanter som er lagret i kjøleskapet med ultralav temperatur, bør være tilstrekkelig, i tilfelle noen indikatorer må testes på nytt. - Hent ca. 1,0 g frøplanteprøve fra hver behandling samlet i tre eksemplarer. Plasser frøplanteprøven i et sentrifugerør, tilsett flytende nitrogen og slip prøven med en slipestang for å bestemme plantens fysiologiske indekser. De bestemte indeksene og måleskjemaet er vist nedenfor.
- Bestem frøplantebeskyttende enzymaktivitet (peroksidase [POD], katalase [CAT], superoksiddismutase [SOD]), malondialdehyd (MDA) og prolin (Pro) innhold ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig sett (spektrofotometribasert) for hver faktor14.
MERK: Tidligere observasjoner viste ingen forskjell i saltspenning mellom 15 og 20 g / l blandede saltkonsentrasjoner. Som et resultat måles bare fem saltkonsentrasjoner (0, 3, 5, 10 og 15 g / L).
- For å bevare pepperplantene, velg representative fullpepperplanter (ca. 24,0 g) fra hver behandling på dag 14 etter sådd. Etter å ha fjernet overflatevannet, frys plantene umiddelbart i flytende nitrogen i 1 min og oppbevar dem i kjøleskap ved ultralav temperatur (-80 °C).
- Omfattende evaluering av salttoleranse ved bruk av medlemskapsfunksjonsmetoden
MERK: Medlemskapsfunksjonen bruker en uklar matematikkmetode, som konverterer kvalitativ evaluering til kvantitativ evaluering15, for å evaluere en rekke fysiologiske indekser påvirket av saltskade.- Beregn verdien av medlemskapsfunksjonen ved hjelp av følgende formel av Zhoubin Liu et al.15:
Ri = (Xi - Xmin)/(Xmax - Xmin)
Hvis et trekk er negativt korrelert med salttoleranse, beregner du den inverse medlemskapsfunksjonen ved å bruke:
Ri = 1 - (Xi - Xmin) / (Xmax - Xmin)
Akkumuler medlemsverdiene til hver fysiologiske indeks, der Xi er den målte verdien av en bestemt egenskap, Xmax og Xmin er henholdsvis maksimums- og minimumsverdiene for Xi, og Ri er medlemsverdien til den egenskapen. - Inkluder følgende relevante indikatorer: frøspredningsegenskaper (spiringspotensial, spirehastighet, spiringsindeks og frøspredningskraftindeks), frøplantevekstegenskaper på spiringsstadiet (rotlengde, hypokotyllengde, rotvekt og ferskvekt over bakken), MDA, Pro og beskyttende enzymaktivitet (CAT, POD, SOD) for beregning av medlemsfunksjonsverdi. Verdiene for medlemskapsfunksjonen hentes fra hver indikator.
- Beregn verdien av medlemskapsfunksjonen ved hjelp av følgende formel av Zhoubin Liu et al.15:
- Bruk regneark- og SPSS-programvare (versjon 22.0) til å analysere og behandle testdataene og bruke LSD-metoden (least significant difference) for flere sammenligninger for å identifisere signifikante forskjeller. Bruk Pearsons korrelasjonsanalyse for å undersøke sammenhengen mellom frøspredning og frøplantefysiologiske indekser av pepper under sammensatt saltstress.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Frø spiring egenskaper
Etter hvert som den blandede saltkonsentrasjonen øker, reduseres spiringspotensialet og spiringsindeksen til Hongtianhu 101 og Xinxiang 8 betydelig. Begge sortene har en kraftig nedgang i saltkonsentrasjoner fra 0-3 g/L, og en langsom og jevn nedgang for saltkonsentrasjoner fra 3-20 g/L (figur 1A,B). Spiringshastigheten til de to varianter reduseres gradvis etter hvert som de blandede saltkonsentrasjonene øker, og den relative salthastigheten for varianter øker gradvis. Det er ingen signifikant forskjell i spiringshastighet og relativ salthastighet ved saltkonsentrasjoner på 3-15 g / L. Forskjellen er imidlertid signifikant ved alle andre saltkonsentrasjoner (figur 1C,D). Når det gjelder salttoleranse mellom de to varianter, er spiringspotensialet, spiringsindeksen og spiringshastigheten til Hongtianhu 101 frø med økende blandede saltkonsentrasjoner høyere enn for Xinxiang 8, mens den relative salthastigheten er lavere enn Xinxiang 8.
Når den blandede saltkonsentrasjonen øker (0-15 g / L), reduseres frøspredningskraftindeksen for de to variantene betydelig. Når den blandede saltkonsentrasjonen er 15 g / L, reduseres frøspredningskraftindeksen for Hongtianhu 101 og Xinxiang 8 med henholdsvis 91,0% og 94,6%, sammenlignet med kontrollen. Merk at reduksjonen ikke er signifikant når den blandede saltkonsentrasjonen ytterligere øker fra 15 til 20 g / L. Frøspredningskraftindeksen for Hongtianhu 101 er høyere enn Xinxiang 8 ved hvert blandet saltkonsentrasjonsnivå (figur 1E).
Frøplante vekstegenskaper
Når den blandede saltkonsentrasjonen øker (0-15 g / L), reduseres rotlengden og rotens friske vekt av Hongtianhu 101 og Xinxiang 8 betydelig. Når den blandede saltkonsentrasjonen er 15 g / L, reduseres rotlengden til Hongtianhu 101 og Xinxiang 8 med henholdsvis 89,4% og 91,1%, og rotens ferske vekt reduseres med henholdsvis 81,7% og 71,2% sammenlignet med kontrollen. Men når saltkonsentrasjonen er 15-20 g / L, endres ikke rotlengden og rotvekten til de to variantene signifikant (figur 2A, C). Rotlengden og rotvekten til Hongtianhu 101 er generelt høyere enn for Xinxiang 8 med økende blandede saltnivåer, med åpenbare forskjeller ved konsentrasjoner fra 0 til 10 g / L.
Hypokotyllengden og ferskvekten over bakken av de to variantene øker og reduseres deretter med økende blandet saltkonsentrasjon. Begge indeksene når sine høyeste verdier ved en saltkonsentrasjon på 5 g/l. Tilsvarende, når saltkonsentrasjonen er 15-20 g / L, reduseres hypokotyllengden og friskvekten over bakken av de to variantene noe. Basert på variasjonsforskjellene er hypokotyllengden og ferskvekten over bakken til Xinxiang 8 høyere enn for Hongtianhu 101 ved hver saltkonsentrasjon (figur 2B,D).
Membranlipidperoksidasjon og osmotisk justeringssubstansinnhold
Når den blandede saltkonsentrasjonen øker, reduseres MDA- og Pro-innholdet i de to varianter og øker deretter. MDA- og Pro-innholdet når sine laveste verdier ved konsentrasjoner på henholdsvis 5 g/l og 3 g/l (figur 3A,B). MDA-innholdet reduseres noe ved saltkonsentrasjoner på 0-5 g/l og øker raskt ved 10 g/l. Sammenlignet med 5 g/l-behandlingen øker MDA-innholdet etter 10 g/l-behandlingen med 59,9 %-64,8 %, og forblir deretter uendret. MDA-innholdet i Hongtianhu 101 er høyere enn i Xinxiang 8 ved forskjellige saltkonsentrasjoner (figur 3A). Nedgangen i Pro-innhold ved 0-3 g/L er ikke signifikant, og det er liten forskjell mellom de to variantene. Når saltkonsentrasjonen er 3-15 g / L, øker Pro-innholdet i Xinxiang 8 sakte og forblir relativt stabilt, mens Pro-innholdet i Hongtianhu 101 øker raskt. Sammenlignet med 3 g / l øker Pro-innholdet i Hongtianhu 101 betydelig med 440,2% ved 15 g / l (figur 3B).
Beskyttende enzymaktivitet
Etter hvert som den blandede saltkonsentrasjonen øker, reduseres og øker CAT-, POD- og SOD-aktivitetene til plantene til Hongtianhu 101 og Xinxiang 8, med de laveste verdiene oppnådd ved en konsentrasjon på 3 g / l (figur 4A-C). CAT- og POD-aktivitetene til de to variantene varierer litt ved saltkonsentrasjoner på 0-5 g / L, og forskjellen mellom dem er liten. Deretter øker CAT- og POD-aktivitetene til de to variantene betydelig med økende saltkonsentrasjon. Videre er CAT- og POD-aktivitetene til Hongtianhu 101 høyere enn Xinxiang 8, og forskjellen mellom dem øker gradvis (figur 4A, B). SOD-aktiviteten til de to variantene varierer litt ved saltkonsentrasjoner fra 0-10 g/L, og øker deretter raskt. SOD-aktiviteten til Xinxiang 8 er høyere enn Hongtianhu 101 ved saltkonsentrasjoner fra 0-10 g / L; for de resterende konsentrasjonene er aktiviteten lavere enn Hongtianhu 101 (figur 4C).
Korrelasjonsanalyse av frøspiringsindeksene for pepper og omfattende evaluering av saltspenning
Korrelasjonsanalyse (tabell 1) viser at rotlengden og rotens friske vekt for frøplantevekstkarakteristikkindeksene er signifikant positivt korrelert med spiringsindeksene (spiringspotensial, spiringshastighet, spiringsindeks, frøspredningskraftindeks, etc.); Imidlertid er det ikke funnet noen eksplisitt relevans mellom hypokotyllengden, ferskvekten over bakken og spiringsindeksene. En signifikant negativ korrelasjon er funnet mellom indeksene for frøplantevekstegenskaper og aktiviteten til beskyttende enzymer (CAT, POD og SOD). Det er også funnet en signifikant negativ korrelasjon mellom hypokotyllengden og innholdet i MDA og Pro, og mellom den ferske vekten av skuddet og MDA-innholdet. Med unntak av den signifikante korrelasjonen mellom frøspiringskraftindeks og beskyttende enzymaktivitet, er det ikke funnet noen signifikant korrelasjon mellom spirekarakteristikkindeksene og frøplantefysiologiske indekser (beskyttende enzymaktivitet og MDA- og Pro-innhold).
Salttoleransen til de to peppersortene under sammensatt saltspenning evalueres ved hjelp av medlemskapsfunksjonsmetoden for flere egenskaper. Siden pepperplantene ikke utsettes for saltbelastning når den blandede saltkonsentrasjonen er 0 g / L, beregnes ikke deres medlemsfunksjonsverdi. Som et resultat vurderes bare behandlingen med saltstress ved hjelp av medlemsfunksjonsanalyse. MDA er funnet å være negativt korrelert med salttoleransen til pepperplanter og beregnes ved hjelp av den inverse medlemsfunksjonsmetoden; Andre indekser beregnes ved hjelp av metoden Medlemskapsfunksjon. Tabell 2 viser at når den blandede saltkonsentrasjonen øker, øker og reduseres de totale vektede verdiene for hver indeksfunksjon av de to varianter, og til slutt når de maksimalt ved en saltkonsentrasjon på 5 g / L. Sammenlignet med 5 g / L-behandlingen, ble verdiene oppnådd med 3 g / L, 10 g / L, og 15 g / l saltkonsentrasjonsbehandlinger reduseres med henholdsvis 4,7% -11,1%, 25,3% -28,3% og 41,4% -45,1%. Derfor kan salttoleransen til pepper utsatt for 5 g / L, 3 g / L, 10 g / L og 15 g / L saltkonsentrasjonsbehandlinger kategoriseres som henholdsvis best, nest best, dårlig og verste.
Figur 1: Effekter av økende blandede saltkonsentrasjoner på frøspredning av pepper . (A), (B), (C), (D) og (E) representerer responsegenskapene til henholdsvis spiringspotensial for pepperfrø, spiringsindeks, spiringshastighet, relativ salthastighet og frøspiringskraftindeks til sammensatt saltspenning. Ulike små bokstaver i figuren indikerer signifikante forskjeller mellom behandlingene, som analyseres ved Tukeys test med flere rekkevidder (p < 0,05). Feilfelt angir standardavvik (n = 5). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Effekter av økende blandede saltkonsentrasjoner på frøspredning og morfologiske indekser av pepper . (A), (B), (C) og (D) representerer responsegenskapene til henholdsvis pepperfrøplanterotlengde, hypokotyllengde, rotferskvekt og ferskvekt over bakken til sammensatt saltspenning. Ulike små bokstaver i figuren indikerer signifikante forskjeller mellom behandlinger, som analyseres ved Tukeys multippel rekkeviddetest (p < 0,05). Feilfelt angir standardavvik (n = 5). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Effekter av økende blandede saltkonsentrasjoner på MDA- og Pro-innhold i pepperplanter. (A) og (B) representerer responsegenskapene til henholdsvis MDA- og Pro-innhold for sammensatt saltspenning. Ulike små bokstaver i figuren indikerer signifikante forskjeller mellom behandlingene, som analyseres ved Tukeys flerområdetest (p < 0,05). Feilfelt angir standardavvik (n = 3). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Effekter av økende blandede saltkonsentrasjoner på CAT- , POD- og SOD-aktiviteter hos pepperplanter. (A), (B) og (C) representerer responsegenskapene til henholdsvis CAT-, POD- og SOD-aktiviteter for å sammensette saltspenning. Ulike små bokstaver i figuren indikerer signifikante forskjeller mellom behandlinger, som analyseres ved Tukeys multippel rekkeviddetest (p < 0,05). Feilfelt angir standardavvik (n = 3). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Korrelasjonsanalyse mellom pepperspiring og fysiologiske indikatorer under sammensatt saltstress (n = 30). Pearsons korrelasjonsanalyse brukes til å undersøke sammenhengen mellom frøspredning og frøplantefysiologiske indekser av pepper under sammensatt saltstress. * p < 0,05; ** p < 0,01. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 2: Den vektede medlemsfunksjonsverdien av pepperspiring og frøplanters fysiologiske indikatorer under blandet saltstress. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne forskningsmetoden består av fire viktige trinn som påvirker nøyaktigheten av de eksperimentelle resultatene. For det første, på grunn av den dårlige oppløsningen av blandede salter forårsaket av det økte oppløsningsinnholdet i løsninger med høy saltkonsentrasjon, og den lave oppløseligheten av reagenser som kalsiumklorid, som er vanskeligere å oppløse i vann, må de veide reagensene være fullstendig malt i en mørtel. Videre må reagensene oppløses via ultralydbølger før kapasiteten bestemmes. For det andre må den konfigurerte saltløsningen ristes helt hver gang og legges til petriskålen for bruk. For det tredje må petriskålene beholde et passende vannlag etter tilsetning av saltløsningen, og vannstatusen til hver petriskål må være relativt konsistent. Til slutt må lysforholdene være konsistente etter frøspiring.
I denne studien kan antall testfrø i en enkelt petriskål justeres ved å variere diameteren på den valgte petriskålen. I henhold til den spesifikke situasjonen med jordsaltstress i forskjellige planteområder, kan andelen av hver enkelt salttilsetning justeres for å muliggjøre konsistens med den faktiske situasjonen for saltstress i den lokale jorda. Selv om denne metoden er praktisk, for mindre frø (som raps, isplante og amarant) eller større frø (som sverdbønner og bondebønner), fører problemer som operasjonelle vanskeligheter ved bestemmelse av frøplantelengde og friskvekt, eller tilgjengeligheten av svært få frø i en enkelt kulturrett for å gjenta dataene, til vanskeligheter med å studere salttoleranse ved hjelp av denne metoden.
Metoden beskrevet her brukes til å bestemme frøspredningsegenskapene og frøplanteveksten under forskjellige blandede saltkonsentrasjoner og avsløre forandringsmekanismen gjennom intern fysiologisk enzymaktivitet, noe som er av stor betydning for objektiv evaluering av salttoleranseegenskapene til frø. Denne teknologien kan gi en teknisk referanse for salttoleranseevaluering av andre avlinger. Frøspredning og frøplantevekst er stadiene der avlinger er mest følsomme for saltstress. Dermed kan denne metoden effektivt gi en referanse for salttolerant dyrking og avl.
I de fleste avlinger kan saltstress hemme frøspredning og frøplantevekst under biotisk stress. Slik hemming kan skyldes en reduksjon i frøvannopptaket ved å redusere saltløsningens osmotiske potensial under saltvannsbetingelser. Saltionstress og toksisitet kan endre aktiviteten til beskyttende enzymer (POD, CAT, SOD, etc.) og proteinmetabolisme under frøspiring, og ødelegge endogen hormonbalanse11,16. Zhani et al. rapporterte at spiringsprosessen hovedsakelig ble endret av redusert spiringshastighet og langvarig spiring under salt (NaCl) stress. Videre ble det funnet en signifikant forskjell i spiringshastigheten mellom forskjellige varianter (10% -50%) ved en saltkonsentrasjon på 8 g / L17. Den nåværende studien viser også at når den blandede saltkonsentrasjonen øker, reduseres spiringspotensialet, spiringsindeksen, spiringshastigheten og frøspredningskraftindeksen for Hongtianhu 101 og Xinxiang 8 betydelig, og den relative salthastigheten øker gradvis. Ifølge Patanè et al., selv om saltstress forlenget spiringstiden til søte durrafrø, hadde økende saltstress en negativ effekt på den endelige spiringen av frø18. Relaterte studier tyder imidlertid på at NaCl-behandling kan fremme spiring av pepperfrø og vekst19, noe som kan være relatert til forskjeller i saltkonsentrasjonsnivåer.
Å øke nivået av saltspenning har en signifikant effekt på veksten av pepperplanter, og basert på denne studien reduserte rotlengden og rotens friske vekt av de to varianter betydelig med økende blandede saltkonsentrasjoner. Dette funnet ligner på Mirosavljević et al., som foreslo at rotlengde og rotvekt ble redusert etter hvert som saltspenningen økte, og forskjellene mellom behandlingene var signifikante20. Dette resultatet indikerer at rotsystemet ble plassert i jordmediet i direkte kontakt med jordløsningen, og rotlengden og rotvekten var mer følsom for NaCl osmotisk stress. Rotlengde og rotvekt er nøkkelindikatorer for planterespons på saltstress. Ifølge denne studien, når saltkonsentrasjonen øker, øker hypokotyllengden og friskvekten til de ovennevnte delene og reduseres deretter, med maksimale verdier oppnådd ved 5 g / L. Khan et al. foreslo også at når saltholdigheten (NaCl) øker (0-9 ms / cm), øker skuddlengden av pepper først og reduseres deretter, med den beste ytelsen oppnådd ved 3 ms / cm12, 21. Konduktiviteten til saltkonsentrasjonen i denne studien var 4,73 ms / cm når verdien av frøplantehypokotyllengde og ferskvekt over bakken var høyest, noe som er høyere enn verdien rapportert av Khan et al.21. Dette resultatet kan skyldes den høye toleransen av pepper over bakken til sammensatt saltspenning sammenlignet med enkelt saltstress.
Saltspenning hindrer ikke bare vekstvekst, men forårsaker også betydelige fysiologiske endringer i planter. Saltstress kan øke nivåene av reaktive oksygenarter (ROS). Hvis ROS ikke fjernes i tide, kan membranlipidperoksidasjon og oksidativt stress, som kan forårsake alvorlig skade på plantecellemembranen, forekomme. MDA er den endelige metabolitten av membranlipidperoksydasjon, og intracellulær MDA-konsentrasjon brukes ofte som en indikator for å vurdere graden av skade på planter under stress22. I denne studien, når den blandede saltkonsentrasjonen øker, reduseres MDA-innholdet i plantene i de to varianter først og øker deretter. Merk at reduksjonen ikke er signifikant ved saltkonsentrasjoner fra 0-5 g / L. Imidlertid observeres en rask økning fra 5-10 g / L. Deretter forblir verdiene uendret, noe som indikerer at graden av membranlipidperoksid av pepperfrø endres fra generell, til raskt økende, til stabil. Saltspenning spekuleres i å ha en alvorlig innvirkning på cellemembranpermeabiliteten når den blandede saltkonsentrasjonen er større enn 10 g / L. Guzmán-Murillo et al. rapporterte en lignende konklusjon av en reduksjon og deretter en økning i membranlipidperoksidnivået i søte pepperplanter da NaCl-konsentrasjonen økte (0-50 nmol / L). Videre var nivået av lipidperoksidasjon lavest ved 25 nmol / L NaCl23.
Planter har utviklet flere strategier for å takle saltstress. På den ene siden øker avlinger proteinstabiliteten og membranintegriteten ved å øke osmotiske justeringsstoffer, som prolin, og reduserer tapet av intracellulært vann, og forbedrer dermed salttoleransen24. I denne studien, etter hvert som den blandede saltkonsentrasjonen øker, reduseres Pro-innholdet i Xinxiang 8 og Hongtianhu 101-plantene først og øker deretter. Spesielt er reduksjonen ikke signifikant ved konsentrasjoner på 0-3 g / L, og forskjellen mellom de to varianter er ikke signifikant, i tråd med de eksperimentelle resultatene fra Muchate et al25. Pro-innholdet i Hongtianhu 101 peppersort med god salttoleranse øker også raskt ved saltkonsentrasjoner på 3-15 g / L. Sammenlignet med 3 g / l øker Pro-innholdet på 15 g / l betydelig med 440,2%, mens Pro-innholdet i Xinxiang 8 med generell salttoleranse øker sakte og opprettholder et relativt stabilt nivå ved saltkonsentrasjoner på 3-15 g / L. Den rensende effekten av antioksidantenzymer på ROS indusert av saltstress har vist seg å være hovedkomponenten i avlingsforsvarsmekanismer. Aktivitetene til CAT, POD og SOD har blitt rapportert å øke under forskjellige saltspenningsmiljøer, og dermed forbedre salttoleransen25,26. Chen et al. viste at når NaCl-konsentrasjonen øker, øker aktivitetene til SOD, POD og CAT i spiring av tomatfrø gradvis, uten signifikant forskjell i hver indeks etter behandling med 0-50 nmol / L NaCl27. Denne studien viser også at når den blandede saltkonsentrasjonen øker, reduseres og øker aktivitetene til CAT, POD og SOD i plantene til Hongtianhu 101 og Xinxiang 8. Ved lave saltkonsentrasjoner (0-3 g / l) endres aktiviteten til antioksidantenzymer ikke vesentlig, og en ytterligere økning i saltkonsentrasjonen forbedrer salttoleransen.
Tilpasningsevnen og responsegenskapene til avlinger til saltspenning gjenspeiles hovedsakelig i morfologi, struktur, fysiologisk økologi, etc. En omfattende evaluering av sammensatt saltspenning utføres ved hjelp av medlemsfunksjonsverdimetoden for flere egenskaper. Denne studien viser at når den blandede saltkonsentrasjonen øker, øker den totale vektede verdien av funksjonsverdien først og reduseres deretter. De to variantene når maksimalt 5 g / l, noe som fører til den beste salttoleranseeffekten. Sammenlignet med 5 g/l-behandlingen reduseres vektede verdier etter behandling med saltkonsentrasjoner på 3 g/l, 10 g/l og 15 g/l med henholdsvis 4,7 %, 25,3 % og 41,4 % for Hongtianhu 101 og henholdsvis 11,1 %, 28,3 % og 45,1 % for Xinxiang 8. Slike funn indikerer at salttoleransen til Hongtianhu 101 er høyere enn for Xinxiang 8.
Denne studien gir en omfattende beskrivelse av effekten av forskjellige konsentrasjoner av sammensatt saltstress på spiring av pepperfrø og dets fysiologiske enzymaktiviteter, og en teknisk referanse for forskning på salttoleranse i andre avlinger. Pepperplanter påvirkes mindre av saltstress under simulerte blandede saltkonsentrasjoner (0-5 g/L). Frøspredning, radikelforlengelse og frøplantemorfogenese av pepper hemmes betydelig under høy saltspenning (>5 g / L), noe som forårsaker alvorlig membranlipidperoksydasjon i pepperplanter. Avlinger reduserer de negative effektene av saltstress ved å øke Pro-innholdet og øke aktiviteten til beskyttende enzymer (CAT, POD og SOD). Under saltstress er prolininnholdet og beskyttende enzymaktiviteten til Hongtianhu 101-plantene høyere, graden av membranlipidperoksydasjon er lavere, og frøspredning og frøplantevekst er tydeligere enn Xinxiang 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Science and Technology Department of Jiangxi Province (20203BBFL63065) og General Project of Science and Technology Research Project of Jiangxi Education Department (GJJ211430). Vi takker Editage (www.editage.cn) for engelskspråklig redigering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium chloride | Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd.,China | Analytical reagent | |
| Centrifugal machine | Shanghai Luxianyi Centrifuge Instrument Co., Ltd., China | TGL-16M | |
| Centrifuge tube | None | None | |
| Conductivity meter | Shanghai Instrument&Electronics Science Instrument Co., Ltd., China | DDSJ-308F | |
| Constant temperature and humidity box | Ningbo Laifu Technology Co., Ltd.,China | PSX-280H | |
| Digital display vernier caliper | Deli Group Co., Ltd.,China | DL90150 | |
| Electronic balance | Mettler Toledo Instruments (Shanghai) Co., Ltd.,China | ME802E/02 | |
| Filter paper | Hangzhou Fuyang North Wood Pulp and Paper Co., Ltd.,China | GB/T1914-2017 | |
| Grinding rod | None | None | |
| Hongtianhu 101 | Seminis Seed (Beijing) Co., Ltd.,China | 11933955/100147K1-137 | |
| Ice machine | Shanghai Kehuai Instrument Co., Ltd., China | IM150G | |
| Liquid nitrogen | None | None | |
| Magnesium chloride | Tianjin Kermel Chemical Reagent Co., Ltd.,China | Analytical reagent | |
| Magnesium sulfate | Tianjin Kermel Chemical Reagent Co., Ltd.,China | Analytical reagent | |
| Petri dish | Jiangsu Yizhe Teaching Instrument Co., Ltd.,China | I-000163 | |
| Pocket knife | None | None | |
| Potassium permanganate (KMnO4 | Xilong Scientific Co.,Ltd.,China | Analytical reagent | |
| Pure water equipment | Sichuan Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd.,China | UPT-I-20T | |
| Sodium bicarbonate | Xilong Scientific Co.,Ltd.,China | Analytical reagent | |
| Sodium carbonate | Xilong Scientific Co.,Ltd.,China | Analytical reagent | |
| Sodium chloride | Xilong Scientific Co.,Ltd.,China | Analytical reagent | |
| Sodium sulfate | Xilong Scientific Co.,Ltd.,China | Analytical reagent | |
| Test kit | Suzhou Keming, Biotechnology Co., Ltd, Suzhou.,China | Spectrophotometer method | |
| Ultra-low temperature freezer | SANYO Techno Solution TottoriCo.,Ltd. | MDF-382 | |
| Ultraviolet visible spectrophotometer | Shanghai Precision Scientific Instrument Co., Ltd., China | 760CRT | |
| Xinxiang 8 | Jiangxi Nongwang High Tech Co., Ltd.,China | GPD Pepper 2017(360013) |
References
- Szabolcs, I. Soils sand salinisation. Handbook of Plant and Crop Stress. , Marcel Dekker. New York. 3-11 (1994).
- Global network on integrated soil management for sustainable use of salt effected soils. FAO. , Available from: http://www.fao.org/ag/AGL/agll/spush/intro.htm (2005).
- Lakhdar, A., et al. Effectiveness of compost use in salt-affected soil. Journal of Hazardous Materials. 171 (1-3), 29-37 (2009).
- Cheng, Z., Chen, Y., Zhang, F. Effect of cropping systems after abandoned salinized farmland reclamation on soil bacterial communities in arid northwest China. Soil and Tillage Research. 187, 204-213 (2019).
- Shrivastava, P., Kumar, R. Soil salinity: A serious environmental issue and plant growth promoting bacteria as one of the tools for its alleviation. Saudi Journal of Biological Sciences. 22 (2), 123-131 (2015).
- Fattori, V., Hohmann, M. S., Rossaneis, A. C., Pinho-Ribeiro, F. A., Verri, W. A. Capsaicin: Current understanding of its mechanisms and therapy of pain and other pre-clinical and clinical uses. Molecules. 21 (7), 844-878 (2016).
- Zhao, Z., et al. Investigation, collection and identification of pepper germplasm resources in Guangxi. Journal of Plant Genetic .Resources. 21 (4), 908-913 (2020).
- Zhang, J., et al. Biochar alleviated the salt stress of induced saline paddy soil and improved the biochemical characteristics of rice seedlings differing in salt tolerance. Soil and Tillage Research. 195, 104372-104381 (2019).
- Ashraf, M., Foolad, M. R. Pre-sowing seed treatment-A shotgun approach to improve germination, plant growth, and crop yield under saline and non-saline conditions. Advances in Agronomy. 88, 223-271 (2005).
- Esra, K. O. Ç, Üstün, A. S., İşlek, C., Arici, Y. K. Effect of exogenously applied spermine and putrescine on germination and in vitro growth of pepper (Capsicum annuum l.) seeds under salt stress. Anadolu University Journal of Science and Technology C-Life Sciences and Biotechnology. 3 (2), 63-71 (2014).
- Demir, I., Mavi, K. Effect of salt and osmotic stresses on the germination of pepper seeds of different maturation stages. Brazilian Archives of Biology and Technology. 51 (5), 897-902 (2008).
- Khan, H. A., et al. Effect of seed priming with NaCl on salinity tolerance of hot pepper (Capsicum annuum L.) at seedling stage. Soil and Environment. 28 (1), 81-87 (2009).
- Zhou, L. L. Effects of salinity stress on cotton (Gossypium hirsutum L.) root growth and cotton field soil micro-ecology. Nanjing Agricultural University. , (2010).
- Ding, D. X., et al. Exogenous zeaxanthin alleviates low temperature combined with low light induced photosynthesis inhibition and oxidative stress in pepper (Capsicum annuum L.) plants. Current Issues in Molecular Biology. 44 (6), 2453-2471 (2022).
- Liu, Z. B., Yang, B. Z., Ou, L. J., Zou, X. X. The impact of different Ca2+ spraying period on alleviating pepper injury under the waterlogging stress. Acta Horticulturae Sinica. 42 (8), 1487-1494 (2015).
- Aloui, H., Souguir, M., Latique, S., Hannachi, C. Germination and growth in control and primed seeds of pepper as affected by salt stress. Cercetări agronomice în Moldova. 47 (3), 83-95 (2014).
- Zhani, K., Elouer, M. A., Aloui, H., Hannachi, C. Selection of a salt tolerant Tunisian cultivar of chili pepper (Capsicum frutescens). EurAsian Journal of Biosciences. 6, 47-59 (2012).
- Patanè, C., Saita, A., Sortino, O. Comparative effects of salt and water stress on seed germination and early embryo growth in two cultivars of sweet sorghum. Journal of Agronomy and Crop Science. 199 (1), 30-37 (2013).
- Smith, P. T., Cobb, B. G. Accelerated germination of pepper seed by priming with salt solutions and water. Hortscience. 26 (4), 417-419 (2019).
- Mirosavljević, M., et al. Maize germination parameters and early seedlings growth under different levels of salt stress. Ratarstvo i Povrtarstvo. 50 (1), 49-53 (2013).
- Khan, H. A., et al. Hormonal priming alleviates salt stress in hot pepper (Capsicum annuum L.). Soil and Environment. 28 (2), 130-135 (2009).
- Zhang, B. B., et al. Effects of simulated salinization on seed germination and physiological characteristics of muskmelon seedlings. Chinese Journal of Tropical Crops. 41 (5), 912-920 (2020).
- Guzmán-Murillo, M. A., Ascencio, F., Larrinaga-Mayoral, J. A. Germination and ROS detoxification in bell pepper (Capsicum annuum L.) under NaCl stress and treatment with microalgae extracts. Protoplasma. 250 (1), 33-42 (2013).
- Slama, I., Abdelly, C., Bouchereau, A., Flowers, T., Savoure, A. Diversity, distribution and roles of osmoprotective compounds accumulated in halophytes under abiotic stress. Annals of Botany. 115 (3), 433-447 (2015).
- Muchate, N. S., Nikalje, G. C., Rajurkar, N. S., Suprasanna, P., Nikamd, T. D. Physiological responses of the halophyte Sesuvium portulacastrum to salt stress and their relevance for saline soil bio-reclamation. Flora. 224, 96-105 (2016).
- Javed, S. A., et al. Can different salt formulations revert the depressing effect of salinity on maize by modulating plant biochemical attributes and activating stress regulators through improved N supply. Sustainability. 13 (14), 8022-8037 (2021).
- Chen, J., et al. Effects of salt stress on form of polyamine and antioxidation in germinating tomato seed. Acta Pedologica Sinica. 58 (6), 1598-1609 (2021).
