Summary
O trabalho abaixo apresenta um protocolo para medir a germinação de sementes, o crescimento de plântulas e os índices fisiológicos de duas variedades de pimenta com diferenças de tolerância à salinidade em resposta a seis concentrações mistas de sal. Este protocolo pode ser usado para avaliar a tolerância ao sal de variedades de pimenta.
Abstract
Para determinar a tolerância ao sal e o mecanismo fisiológico da pimenta (Capsicum annuum L.) na fase de germinação, as variedades Hongtianhu 101 e Xinxiang 8, que apresentam grandes diferenças na tolerância ao sal, são empregadas como materiais de estudo. São utilizadas seis concentrações mistas de sal de 0, 3, 5, 10, 15 e 20 g/L derivadas usando proporções molares iguais de Na 2 CO3, NaHCO3, NaCl, CaCl2, MgCl 2, MgSO 4 e Na2 SO4. Para determinar seus efeitos, os índices relacionados de germinação, crescimento de plântulas e fisiologia são medidos, e a tolerância ao sal é avaliada de forma abrangente usando a análise da função de associação. Os resultados mostram que, à medida que a concentração de sal misto aumenta, o potencial de germinação, o índice de germinação, a taxa de germinação, o índice de vigor germinativo das sementes, o comprimento da raiz e o peso fresco das duas cultivares diminuem significativamente, enquanto a taxa relativa de sal aumenta gradualmente. O comprimento do hipocótilo e o peso fresco acima do solo aumentam primeiro e depois diminuem, enquanto a atividade da malondialdeído (MDA), prolina (Pro), catalase (CAT), peroxidase (POD) e superóxido dismutase (SOD) diminuem e depois aumentam. O potencial de germinação, o índice de germinação, a taxa de germinação, o índice de vigor germinativo das sementes, o comprimento da raiz, o peso fresco da raiz, o teor de MDA e Pro e a atividade CAT das sementes de Hongtianhu 101 são superiores aos de Xinxiang 8 para todas as concentrações de sal aqui empregadas. No entanto, o comprimento do hipocótilo, o peso fresco acima do solo e a taxa relativa de sal são menores em Hongtianhu 101 do que em Xinxiang 8. A avaliação abrangente da tolerância ao sal revela que os valores ponderados totais dos dois índices de função de associação aumentam primeiro e depois diminuem à medida que a concentração mista de sal aumenta. Em comparação com 5 g/L, que tem o maior valor de função de associação, o índice sob concentrações de sal de 3 g/L, 10 g/L e 15 g/L diminui 4,7%-11,1%, 25,3%-28,3% e 41,4%-45,1%, respectivamente. Este estudo fornece orientação teórica para o melhoramento de variedades de pimenta tolerantes ao sal e uma análise dos mecanismos fisiológicos envolvidos na tolerância ao sal e no cultivo tolerante ao sal.
Introduction
A salinidade é um importante fator limitante para a produtividade das culturas em todo o mundo1. Atualmente, quase 19,5% das terras irrigadas do mundo e 2,1% da terra seca são afetadas pela salinidade, e aproximadamente 1% das terras agrícolas degeneram em terras salinas-alcalinas a cada ano. Até 2050, espera-se que 50% das terras aráveis sejam afetadas pela salinização 2,3. Além de fatores naturais, como o intemperismo natural das rochas e a água salgada da chuva perto ou ao redor da costa, a rápida evaporação da superfície, a baixa precipitação e os métodos de manejo agrícola irracionais exacerbaram o processo de salinização do solo. A salinização do solo inibe o crescimento das raízes das plantas e reduz a absorção e o transporte de água e nutrientes das raízes das plantas para as folhas. Essa inibição resulta em escassez fisiológica de água, desequilíbrios nutricionais e toxicidade de íons, o que leva à redução da produtividade das culturas e a uma perda completa do rendimento das culturas. A salinização das terras cultivadas está gradualmente se tornando um dos fatores de estresse abiótico mais críticos que afetam a produção global de alimentos agrícolas4. O estresse salino reduz as terras aráveis disponíveis para a agricultura, o que pode resultar em um desequilíbrio significativo entre a oferta e a demanda de futuros produtos agrícolas. Portanto, explorar os efeitos da salinização do solo no crescimento das culturas e nos mecanismos fisiológicos e bioquímicos é propício para a criação de variedades tolerantes ao sal, a utilização sustentável do solo salino e a segurança dos produtos agrícolas.
A pimenta (Capsicum annuum L.) é plantada em todo o mundo devido ao seu alto valor nutricional e medicinal. Por exemplo, a capsaicina é um alcaloide responsável pelo sabor picante da pimenta. A capsaicina pode ser usada para alívio da dor, perda de peso, melhora dos sistemas cardiovascular, gastrointestinal e respiratório, e em várias outras aplicações5. A pimenta também é rica em substâncias bioativas, especialmente diferentes compostos antioxidantes (carotenoides, fenólicos e flavonoides) e vitamina C6. Atualmente, a pimenta é relatada como a cultura vegetal com a maior área de cultivo na China, com uma área de plantio anual de mais de 1,5 x 106 ha, representando assim 8% a 10% da área total de plantio de vegetais na China. A indústria da pimenta tornou-se uma das maiores indústrias vegetais da China e tem o maior valor de produção7. No entanto, o cultivo de pimenta é frequentemente submetido a uma variedade de estresses biológicos (pragas e fungos) e abióticos, especialmente o estresse salino, que tem um impacto negativo direto na germinação, crescimento e desenvolvimento das sementes, resultando na redução da produtividade e qualidade dos frutos de pimenta8.
A germinação de sementes é o primeiro estágio de interação entre as plantas e o meio ambiente. A germinação de sementes é altamente sensível a flutuações no meio circundante, especialmente ao estresse salino do solo, que pode exercer efeitos reversos sobre a fisiologia e o metabolismo e, eventualmente, perturbar o crescimento, o desenvolvimento e a morfogênese normais das culturas9. Em estudos anteriores, a germinação de sementes de pimenta e o crescimento de plântulas sob estresse salino foram extensivamente investigados; no entanto, a maioria dos estudos utilizou o NaCl como único sal para indução de estresse10,11,12. No entanto, os danos ao sal no solo são devidos principalmente à toxicidade de íons Na+, Ca 2+, Mg2+, Cl-, CO3 2-, e SO42- gerada pela dissociação de sais de sódio, cálcio e magnésio. Devido à sinergia e antagonismo entre íons, os efeitos do sal misto e do sal único no crescimento e desenvolvimento das culturas podem ser bastante diferentes. No entanto, as características correspondentes da germinação e crescimento de sementes de pimenta em sal misto ainda não estão claras. Portanto, duas variedades de pimenta com diferenças notáveis na tolerância ao sal são utilizadas como materiais neste estudo. A análise dos efeitos de diferentes concentrações de sal na germinação, crescimento e índices fisiológicos e bioquímicos de sementes de pimenta após a mistura equimolar de sete sais pode revelar o mecanismo de resposta da germinação de sementes de pimenta ao estresse salino. Também pode fornecer uma base teórica para o cultivo de mudas de pimenta fortes, bem como o cultivo de alto rendimento e alta qualidade em terras cultivadas com solução salina.
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Protocol
NOTA: Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar as características de resposta e os mecanismos internos de germinação de sementes de pimenta e crescimento de plântulas sob diferentes tensões mistas de sal, que pode servir como método de referência para avaliação da tolerância ao sal de sementes.
1. Preparação experimental
- Preparar sementes de culturas para cultivares-Hongtianhu 101 com forte tolerância ao sal e Xinxiang 8 com baixa tolerância.
- Preparar a solução de KMnO4 a 0,2% como reagente de desinfecção de sementes. Primeiro, pese 4,0 g de KMnO4 e, em seguida, adicione 2.000 mL de água destilada.
NOTA: O permanganato de potássio é geralmente instável devido à sua forte oxidação; por conseguinte, é preparado imediatamente antes da utilização. - Preparar os sais mistos usando sete sais, incluindo carbonato de sódio, bicarbonato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de cálcio, cloreto de magnésio, sulfato de magnésio e sulfato de sódio13. Adicione a mesma quantidade molar de cada um, que sucessivamente representam 14,8%, 11,7%, 8,2%, 15,5%, 13,3%, 16,7% e 19,8% da razão de massa total dos sais mistos, respectivamente.
- Preparar placas de Petri (uso único) e papel filtro (papel filtro qualitativo de velocidade média), ambos com diâmetro de 9 cm.
NOTA: O material da placa de Petri pode ser alterado; no entanto, o diâmetro da placa de Petri e do papel de filtro deve ser o mesmo.
2. Embebição de sementes e preparação para germinação
- Para otimização de sementes, selecione sementes de pimenta com tamanho consistente e partículas cheias de cada variedade, com diâmetro médio de 4,2 mm e 3,7 mm para as sementes Hongtianhu 101 e Xinxiang 8, respectivamente. Calcule o número total de sementes selecionadas de acordo com a carga de trabalho de teste.
- Para a desinfecção das sementes, mergulhe as sementes de pimenta selecionadas em solução de KMnO4 a 0,2% por 15 min e depois enxágue cinco vezes com água destilada.
- Para a imersão das sementes, transfira as sementes esterilizadas para água destilada e deixe-as de molho por 24 h. Lave as sementes várias vezes com água destilada e seque para uso posterior.
NOTA: O tempo de imersão das sementes para diferentes culturas pode variar.
3. Germinação de sementes e crescimento de plântulas
- Preparar seis concentrações dos sais mistos: 0 (controle), 3, 5, 10, 15 e 20 g/L. Medir a condutividade da solução salina usando um medidor de condutividade; os valores de condutividade EC da solução são 0,092, 3,05, 4,73, 8,33, 11,53 e 15,22 ms/cm, respectivamente.
- Para a preparação de sementes, coloque uniformemente 40 sementes de pimenta em uma placa de Petri com duas camadas de papel de filtro. Preparar as sementes para seis tratamentos experimentais e repetir cada tratamento cinco vezes.
- Para a germinação das sementes, adicione uma quantidade adequada das seis concentrações mistas de sal à placa de Petri para garantir que o papel de filtro seja mantido úmido. Colocar as sementes numa incubadora de ar a 28 °C e a 80% de humidade do ar para germinação no escuro.
- Após a germinação das sementes, deixe que as plântulas continuem a crescer em luz (intensidade de luz de aproximadamente 450 Lux; ciclo de luz de 12/12h) na incubadora por 14 dias após a semeadura. A temperatura e a humidade na fase de crescimento das plântulas devem ser as mesmas que as utilizadas na fase de germinação.
- Reabasteça a solução na placa de cultura a cada 12 h para reter um papel de filtro úmido e lave completamente o papel de filtro a cada 24 h com a concentração correspondente da solução salina mista para manter uma concentração constante de sal misto na placa de Petri.
NOTA: A quantidade de solução salina adicionada às sementes úmidas pode ser ajustada de acordo com os estágios de germinação e crescimento das sementes. Muitos métodos estão disponíveis para manter uma concentração constante de soluções salinas em pratos de cultura. Além dos métodos descritos neste experimento, pode-se utilizar a estratégia de adição de água destilada por peso.
4. Medição e cálculo de indicadores
- Determinação dos índices de germinação das sementes
- Determinar a taxa de germinação diariamente após a semeadura, com a radícula quebrando o revestimento da semente atingindo metade do comprimento do diâmetro da semente como marcador de germinação.
- Calcule a taxa de germinação, o potencial de germinação, a taxa relativa de sal, o índice de germinação e o índice de vigor de germinação das sementes usando as seguintes fórmulas:
Taxa de germinação (%) = (número de sementes germinadas normais no 7º dia após a semeadura/número de sementes testadas) × 100
Potencial germinativo (%) = (número de sementes germinadas normais no 3º dia após a semeadura/número de sementes testadas) × 100
Taxa relativa de sal (%) = (taxa de germinação de controle - taxa de germinação de tratamento)/taxa de germinação de controle × 100
calculado utilizando a taxa de germinação das sementes no dia 7 após a semeadura
Índice de germinação (IG) = ∑ [Gt/Dt]
em que Gt refere-se ao número de germinação das sementes num período de tempo (t) após a sementeira e Dt refere-se aos dias de germinação correspondentes
Índice de vigor germinativo de sementes (VI) = GI x S
onde S é o comprimento da raiz
- Determinação do índice de crescimento das plântulas
- No dia 14 após a semeadura, selecione aleatoriamente 10 mudas representativas de cada placa de Petri e meça o comprimento da raiz e o comprimento do hipocótilo.
- Use uma faca para dividir as mudas de pimenta em duas partes: radícula e partes acima do solo. Retire a água das mudas limpando e pese as mudas separadamente para determinar o peso fresco.
- Determine a atividade da enzima antioxidante, o nível de malondialdeído (MDA) e o teor de prolina (Pro) na pimenta da seguinte forma.
- Para preservar as mudas de pimenta, selecione mudas de pimenta inteiras representativas (aproximadamente 24,0 g) de cada tratamento no dia 14 após a semeadura. Depois de remover a água superficial, congele imediatamente as mudas em nitrogênio líquido por 1 min e guarde-as em uma geladeira a uma temperatura ultrabaixa (-80 °C).
NOTA: O número de amostras de mudas de pimenta armazenadas no refrigerador de temperatura ultrabaixa deve ser suficiente, caso alguns indicadores precisem ser testados novamente. - Recuperar aproximadamente 1,0 g de amostra de plântulas de cada tratamento coletado em triplicado. Coloque a amostra de plântula em um tubo de centrífuga, adicione nitrogênio líquido e triture a amostra usando uma haste de moagem para determinar os índices fisiológicos das plântulas. Os índices determinados e o esquema de medição são mostrados abaixo.
- Determinar a atividade enzimática protetora das plântulas (peroxidase [POD], catalase [CAT], superóxido dismutase [SOD]), malondialdeído (MDA) e prolina (Pro) usando um kit comercialmente disponível (baseado em espectrofotometria) para cada fator14.
NOTA: Observações anteriores não revelaram diferença no estresse salino entre as concentrações de sal misto de 15 e 20 g/L. Como resultado, apenas cinco concentrações de sal (0, 3, 5, 10 e 15 g / L) são medidas.
- Para preservar as mudas de pimenta, selecione mudas de pimenta inteiras representativas (aproximadamente 24,0 g) de cada tratamento no dia 14 após a semeadura. Depois de remover a água superficial, congele imediatamente as mudas em nitrogênio líquido por 1 min e guarde-as em uma geladeira a uma temperatura ultrabaixa (-80 °C).
- Avaliação abrangente da tolerância ao sal usando o método da função de associação
NOTA: A função de associação utiliza um método matemático difuso, que converte a avaliação qualitativa em avaliação quantitativa15, para avaliar uma variedade de índices fisiológicos afetados pelo dano do sal.- Calcule o valor da função de associação usando a seguinte fórmula de Zhoubin Liu et al.15:
Ri = (Xi - Xmin)/(Xmax - Xmin)
Se uma característica estiver negativamente correlacionada com a tolerância ao sal, calcule a função de associação inversa usando:
Ri = 1 - (Xi - Xmin)/(Xmax - Xmin)
Acumule os valores de associação de cada índice fisiológico, onde Xi é o valor medido de uma determinada característica, Xmax e Xmin são os valores máximo e mínimo para Xi, respectivamente, e Ri é o valor de associação dessa característica. - Incluir os seguintes indicadores relevantes: características de germinação das sementes (potencial de germinação, taxa de germinação, índice de germinação e índice de vigor de germinação das sementes), características de crescimento das plântulas no estágio de germinação (comprimento da raiz, comprimento do hipocótilo, massa fresca da raiz e massa fresca acima do solo), MDA, Pro e atividade enzimática protetora (CAT, POD, SOD) para o cálculo do valor da função de associação. Os valores da função de associação são obtidos a partir de cada indicador.
- Calcule o valor da função de associação usando a seguinte fórmula de Zhoubin Liu et al.15:
- Use planilha eletrônica e software SPSS (versão 22.0) para analisar e processar os dados de teste e aplicar o método de diferença menos significativa (LSD) para comparações múltiplas para identificar diferenças significativas. Use a análise de correlação de Pearson para investigar a correlação entre a germinação de sementes e os índices fisiológicos de plântulas de pimenta sob estresse salino composto.
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Representative Results
Características de germinação de sementes
À medida que a concentração de sal misto aumenta, o potencial de germinação e o índice de germinação de Hongtianhu 101 e Xinxiang 8 diminuem significativamente. Ambas as cultivares têm um declínio acentuado nas concentrações de sal de 0-3 g/L, e um declínio lento e constante para as concentrações de sal de 3-20 g/L (Figura 1A,B). A taxa de germinação das duas variedades diminui gradualmente à medida que as concentrações de sal misto aumentam, e a taxa relativa de sal para as variedades aumenta gradualmente. Não há diferença significativa na taxa de germinação e na taxa relativa de sal em concentrações salinas de 3-15 g/L. No entanto, a diferença é significativa em todas as outras concentrações de sal (Figura 1C,D). Em relação à tolerância ao sal entre as duas variedades, o potencial germinativo, o índice de germinação e a taxa de germinação das sementes de Hongtianhu 101 com concentrações crescentes de sal misto são maiores que as de Xinxiang 8, enquanto a taxa relativa de sal é menor que a de Xinxiang 8.
À medida que a concentração de sal misto aumenta (0-15 g/L), o índice de vigor germinativo das sementes das duas variedades diminui significativamente. Quando a concentração de sal misto é de 15 g/L, o índice de vigor germinativo das sementes de Hongtianhu 101 e Xinxiang 8 diminui em 91,0% e 94,6%, respectivamente, em comparação com o do controle. De notar, a diminuição não é significativa quando a concentração de sal misto aumenta ainda mais de 15 para 20 g / L. O índice de vigor germinativo de sementes de Hongtianhu 101 é maior que o de Xinxiang 8 em cada nível de concentração de sal misto (Figura 1E).
Características de crescimento das plântulas
À medida que a concentração de sal misto aumenta (0-15 g / L), o comprimento da raiz e o peso fresco da raiz de Hongtianhu 101 e Xinxiang 8 diminuem significativamente. Quando a concentração de sal misto é de 15 g/L, o comprimento da raiz de Hongtianhu 101 e Xinxiang 8 diminui em 89,4% e 91,1%, respectivamente, e o peso fresco da raiz diminui em 81,7% e 71,2%, respectivamente, em comparação com os do controle. No entanto, quando a concentração de sal é de 15-20 g/L, o comprimento da raiz e o peso fresco da raiz das duas variedades não se alteram significativamente (Figura 2A,C). O comprimento da raiz e o peso fresco da raiz de Hongtianhu 101 são geralmente maiores do que os de Xinxiang 8 com níveis crescentes de sal misto, com diferenças óbvias em concentrações que variam de 0 a 10 g / L.
O comprimento do hipocótilo e o peso fresco acima do solo das duas variedades aumentam e depois diminuem com o aumento da concentração de sal misto. Ambos os índices atingem seus maiores valores a uma concentração de sal de 5 g/L. Da mesma forma, quando a concentração de sal é de 15-20 g / L, o comprimento do hipocótilo e o peso fresco acima do solo das duas variedades diminuem ligeiramente. Com base nas diferenças varietais, o comprimento do hipocótilo e o peso fresco acima do solo de Xinxiang 8 são maiores do que os de Hongtianhu 101 em cada concentração de sal (Figura 2B,D).
Peroxidação lipídica da membrana e conteúdo de substância de ajuste osmótico
À medida que a concentração de sal misto aumenta, os teores de MDA e Pro das duas variedades diminuem e depois aumentam. Os teores de MDA e Pro atingem seus menores valores nas concentrações de 5 g/L e 3 g/L, respectivamente (Figura 3A,B). O teor de MDA diminui ligeiramente em concentrações de sal de 0-5 g/L e aumenta rapidamente a 10 g/L. Em comparação com o tratamento de 5 g/L, o teor de MDA após o tratamento de 10 g/L aumenta em 59,9%-64,8%, e depois permanece inalterado. O teor de MDA de Hongtianhu 101 é maior do que o de Xinxiang 8 em diferentes concentrações de sal (Figura 3A). A diminuição do teor de Pro em 0-3 g / L não é significativa e pouca diferença é encontrada entre as duas variedades. Quando a concentração de sal é de 3-15 g / L, o teor de Pro de Xinxiang 8 aumenta lentamente e permanece relativamente estável, enquanto o conteúdo Pro de Hongtianhu 101 aumenta rapidamente. Em comparação com 3 g/L, o teor de Pro de Hongtianhu 101 aumenta significativamente em 440,2% a 15 g/L (Figura 3B).
Atividade enzimática protetora
À medida que a concentração mista de sal aumenta, as atividades de CAT, POD e SOD das plântulas de Hongtianhu 101 e Xinxiang 8 diminuem e depois aumentam, com os menores valores obtidos na concentração de 3 g/L (Figura 4A-C). As atividades CAT e POD das duas variedades variam ligeiramente em concentrações de sal de 0-5 g/L, e a diferença entre elas é pequena. Posteriormente, as atividades de CAT e POD das duas variedades aumentam significativamente com o aumento da concentração de sal. Além disso, as atividades CAT e POD de Hongtianhu 101 são maiores do que as de Xinxiang 8, e a diferença entre elas aumenta gradualmente (Figura 4A,B). A atividade SOD das duas variedades varia ligeiramente em concentrações de sal de 0-10 g / L e, em seguida, aumenta rapidamente. A atividade SOD de Xinxiang 8 é maior que a de Hongtianhu 101 em concentrações de sal de 0-10 g/L; para as demais concentrações, sua atividade é inferior à de Hongtianhu 101 (Figura 4C).
Análise de correlação dos índices de germinação de sementes de pimenta e avaliação abrangente do estresse salino
A análise de correlação (Tabela 1) revela que o comprimento radicular e o peso fresco da raiz para os índices característicos de crescimento de plântulas estão significativamente correlacionados positivamente com os índices de germinação (potencial germinativo, taxa de germinação, índice de germinação, etc.); no entanto, nenhuma relevância explícita é encontrada entre o comprimento do hipocótilo, o peso fresco acima do solo e os índices de germinação. Uma correlação negativa significativa é encontrada entre os índices de características de crescimento de plântulas e a atividade de enzimas protetoras (CAT, POD e SOD). Uma correlação negativa significativa também é encontrada entre o comprimento do hipocótilo e o conteúdo de MDA e Pro, e entre o peso fresco da parte aérea e o conteúdo de MDA. Com exceção da correlação significativa entre o índice de vigor germinativo das sementes e a atividade enzimática protetora, não foi encontrada correlação significativa entre os índices característicos de germinação e os índices fisiológicos das plântulas (atividade enzimática protetora e teor de MDA e Pro).
A tolerância ao sal das duas variedades de pimenta sob estresse de sal composto é avaliada usando o método de função de associação para múltiplas características. Como as mudas de pimenta não são submetidas ao estresse salino quando a concentração de sal misto é de 0 g/L, seu valor de função de associação não é calculado. Como resultado, apenas o tratamento com estresse salino é avaliado usando a análise da função de associação. Verificou-se que o MDA está negativamente correlacionado com a tolerância ao sal de mudas de pimenta e é calculado usando o método da função de associação inversa; outros índices são calculados usando o método de função de associação. A Tabela 2 mostra que, à medida que a concentração de sal misto aumenta, os valores ponderados totais de cada função de índice das duas variedades aumentam e depois diminuem, atingindo finalmente um máximo a uma concentração de sal de 5 g/L. Em comparação com o tratamento de 5 g/L, os valores obtidos com os 3 g/L, 10 g/L, e os tratamentos com concentração de sal de 15 g/L diminuem 4,7%-11,1%, 25,3%-28,3% e 41,4%-45,1%, respectivamente. Portanto, a tolerância ao sal da pimenta submetida aos tratamentos de concentração de sal de 5 g/L, 3 g/L, 10 g/L e 15 g/L pode ser categorizada em melhor, segunda melhor, ruim e pior, respectivamente.
Figura 1: Os efeitos do aumento das concentrações mistas de sal na germinação de pimenta nas sementes. (A), (B), (C), (D) e (E) representam as características de resposta do potencial germinativo de sementes de pimenta, índice de germinação, taxa de germinação, taxa relativa de sal e índice de vigor germinativo de sementes ao estresse salino composto, respectivamente. Diferentes letras minúsculas na figura indicam diferenças significativas entre os tratamentos, que são analisadas pelo teste de múltiplos alcances de Tukey (p < 0,05). As barras de erro indicam desvios padrão (n = 5). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Os efeitos do aumento das concentrações mistas de sal sobre a germinação das sementes e os índices morfológicos da pimenta. (A), (B), (C) e (D) representam as características de resposta do comprimento da raiz da plântula de pimenta, comprimento do hipocótilo, peso fresco da raiz e peso fresco acima do solo ao estresse de sal composto, respectivamente. Diferentes letras minúsculas na figura indicam diferenças significativas entre os tratamentos, que são analisadas pelo teste de múltiplos alcances de Tukey (p < 0,05). As barras de erro indicam desvio padrão (n = 5). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Efeitos do aumento das concentrações mistas de sal sobre o teor de MDA e Pro de plântulas de pimenta. (A) e (B) representam as características de resposta do teor de MDA e Pro de plântulas de pimenta ao estresse salino composto, respectivamente. Diferentes letras minúsculas na figura indicam diferenças significativas entre os tratamentos, que são analisadas pelo teste de múltiplos alcances de Tukey (p < 0,05). As barras de erro indicam desvio padrão (n = 3). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Efeitos do aumento das concentrações mistas de sal nas atividades de CAT, POD e SOD de plântulas de pimenta. (A), (B) e (C) representam as características de resposta das atividades de CAT, POD e SOD de plântulas de pimenta ao estresse salino composto, respectivamente. Diferentes letras minúsculas na figura indicam diferenças significativas entre os tratamentos, que são analisadas pelo teste de múltiplos alcances de Tukey (p < 0,05). As barras de erro indicam desvio padrão (n = 3). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Análise de correlação entre a germinação de pimenta e os indicadores fisiológicos sob estresse salino composto (n = 30). A análise de correlação de Pearson é utilizada para investigar a correlação entre a germinação de sementes e os índices fisiológicos de plântulas de pimenta sob estresse salino composto. * p < 0,05; ** p < 0,01. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
Tabela 2: O valor ponderado da função de associação da germinação de pimenta e os indicadores fisiológicos de plântulas sob estresse de sal misto. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
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Discussion
Este método de pesquisa compreende quatro etapas-chave que afetam a precisão dos resultados experimentais. Primeiro, devido à má dissolução de sais mistos causada pelo aumento do teor de soluto em soluções de alta concentração de sal e à baixa solubilidade de reagentes como o cloreto de cálcio, que são mais difíceis de solubilizar em água, os reagentes pesados devem ser totalmente moídos em uma argamassa. Além disso, os reagentes devem ser dissolvidos através de ondas ultra-sônicas antes de determinar a capacidade. Em segundo lugar, a solução salina configurada deve ser completamente agitada de cada vez e adicionada à placa de Petri para uso. Em terceiro lugar, as placas de Petri devem reter uma camada de água adequada após a adição da solução salina, e o estado da água de cada placa de Petri deve ser relativamente consistente. Finalmente, as condições de luz devem ser consistentes após a germinação das sementes.
Neste estudo, o número de sementes de teste em uma única placa de Petri pode ser ajustado variando o diâmetro da placa de Petri selecionada. De acordo com a situação específica do estresse salino no solo em diferentes áreas de plantio, a proporção de cada adição única de sal poderia ser ajustada para permitir a consistência com a situação real de estresse salino no solo local. Embora esse método seja prático, para sementes menores (como colza, planta gelada e amaranto) ou sementes maiores (como favas e favas), problemas como dificuldades operacionais na determinação do comprimento das plântulas e do peso fresco, ou a disponibilidade de muito poucas sementes em um único prato de cultura para repetir os dados, levam a dificuldades no estudo da tolerância ao sal usando esse método.
O método aqui descrito é utilizado para determinar as características de germinação das sementes e o crescimento das plântulas sob diferentes concentrações mistas de sal e revelar o mecanismo de mudança através da atividade enzimática fisiológica interna, o que é de grande importância para avaliar objetivamente as características de tolerância ao sal das sementes. Esta tecnologia pode fornecer uma referência técnica para a avaliação da tolerância ao sal de outras culturas. A germinação das sementes e o crescimento das plântulas são os estágios em que as culturas são mais sensíveis ao estresse salino. Assim, este método pode efetivamente fornecer uma referência para o cultivo tolerante ao sal e melhoramento de culturas.
Na maioria das culturas, o estresse salino pode inibir a germinação das sementes e o crescimento de plântulas sob estresse biótico. Tal inibição pode ser devida a uma redução na absorção de água das sementes, reduzindo o potencial osmótico da solução salina em condições salinas. O estresse e a toxicidade dos íons sal podem alterar a atividade de enzimas protetoras (POD, CAT, SOD, etc.) e o metabolismo proteico durante a germinação das sementes, além de destruir o equilíbrio hormonal endógeno11,16. Zhani et al. relataram que o processo de germinação foi alterado principalmente por uma taxa de germinação reduzida e germinação prolongada sob estresse salino (NaCl). Além disso, uma diferença significativa foi encontrada na taxa de germinação entre as diferentes variedades (10%-50%) em uma concentração de sal de 8 g/L17. O presente estudo também revela que, à medida que a concentração mista de sal aumenta, o potencial de germinação, o índice de germinação, a taxa de germinação e o índice de vigor germinativo das sementes de Hongtianhu 101 e Xinxiang 8 diminuem significativamente, e a taxa relativa de sal aumenta gradualmente. De acordo com Patanè et al., embora o estresse salino tenha prolongado o tempo de germinação das sementes de sorgo doce, o aumento do estresse salino teve um efeito adverso na germinação final das sementes18. No entanto, estudos relacionados sugerem que o tratamento com NaCl pode promover a germinação e o crescimento de sementes de pimenta19, o que pode estar relacionado a diferenças nos níveis de concentração de sal.
O aumento do nível de estresse salino tem um efeito significativo no crescimento de mudas de pimenta e, com base neste estudo, o comprimento da raiz e o peso fresco da raiz das duas variedades diminuíram significativamente com o aumento das concentrações mistas de sal. Esse achado é semelhante ao de Mirosavljević et al., que sugeriram que o comprimento e o peso radicular diminuíram à medida que o estresse salino aumentou, e as diferenças entre os tratamentos foram significativas20. Esse resultado indica que o sistema radicular foi colocado no meio do solo em contato direto com a solução do solo, e o comprimento e o peso radicular foram mais sensíveis ao estresse osmótico de NaCl. O comprimento e o peso radicular são indicadores-chave da resposta da planta ao estresse salino. De acordo com este estudo, à medida que a concentração de sal aumenta, o comprimento do hipocótilo e o peso fresco das partes acima do solo aumentam e depois diminuem, com valores máximos alcançados em 5 g/L. Khan et al. também sugeriram que, à medida que a salinidade (NaCl) aumenta (0-9 ms/cm), o comprimento da parte aérea da pimenta aumenta primeiro e depois diminui, com o melhor desempenho obtido a 3 ms/cm12, 21. A condutividade da concentração de sal neste estudo foi de 4,73 ms/cm quando o valor do comprimento do hipocótilo das plântulas e o peso fresco acima do solo foram os mais elevados, o que é superior ao valor relatado por Khan et al.21. Este resultado pode ser devido à alta tolerância da pimenta acima do solo ao estresse de sal composto em comparação com o estresse de sal único.
O estresse salino não só dificulta o crescimento das culturas, mas também causa mudanças fisiológicas significativas nas plantas. O estresse salino pode aumentar os níveis de espécies reativas de oxigênio (ROS). Se as ERO não forem eliminadas a tempo, a peroxidação lipídica da membrana e o estresse oxidativo, que podem causar sérios danos à membrana celular da planta, podem ocorrer. O MDA é o metabólito final da peroxidação lipídica da membrana, e a concentração intracelular de MDA é frequentemente utilizada como indicador para avaliar o grau de dano às plantas sob estresse22. No presente estudo, à medida que a concentração de sal misto aumenta, o teor de MDA das plântulas das duas variedades diminui primeiro e depois aumenta. De notar, a diminuição não é significativa em concentrações de sal que variam de 0-5 g / L. No entanto, um rápido aumento é observado de 5-10 g / L. Posteriormente, os valores permanecem inalterados, indicando que o grau de peróxido lipídico de membrana das sementes de pimenta muda de geral, para rapidamente crescente, para estável. Especula-se que o estresse salino tenha um sério impacto na permeabilidade da membrana celular quando a concentração mista de sal é maior que 10 g / L. Guzmán-Murillo et al. relataram uma conclusão semelhante de uma diminuição e, em seguida, um aumento no nível de peróxido lipídico da membrana em mudas de pimentão doce à medida que a concentração de NaCl aumentou (0-50 nmol / L). Além disso, o nível de peroxidação lipídica foi menor em 25 nmol/L NaCl23.
As plantas desenvolveram várias estratégias para lidar com o estresse salino. Por um lado, as culturas aumentam a estabilidade proteica e a integridade da membrana, aumentando as substâncias de ajuste osmótico, como a prolina, e reduzem a perda de água intracelular, melhorando assim a tolerância ao sal24. No presente estudo, à medida que a concentração de sal misto aumenta, o teor de Pro das plântulas de Xinxiang 8 e Hongtianhu 101 diminui primeiro e depois aumenta. Notavelmente, a diminuição não é significativa nas concentrações de 0-3 g/L e a diferença entre as duas variedades não é significativa, alinhando-se com os resultados experimentais de Muchate ecols.25. O teor de Pro da variedade de pimenta Hongtianhu 101 com boa tolerância ao sal também aumenta rapidamente em concentrações de sal de 3-15 g / L. Em comparação com 3 g / L, o teor de Pro de 15 g / L aumenta significativamente em 440,2%, enquanto o teor de Pro de Xinxiang 8 com tolerância geral ao sal aumenta lentamente e mantém um nível relativamente estável em concentrações de sal de 3-15 g / L. O efeito de eliminação das enzimas antioxidantes sobre as EROs induzidas pelo estresse salino provou ser o principal componente dos mecanismos de defesa das culturas. As atividades de CAT, POD e SOD têm aumentado sob diferentes ambientes de estresse salino, melhorando assim sua tolerância ao sal25,26. Chen et al. mostraram que, à medida que a concentração de NaCl aumenta, as atividades de SOD, POD e CAT na germinação de sementes de tomateiro aumentam gradualmente, sem diferença significativa em cada índice após o tratamento com NaCl 0-50 nmol/L27. Este estudo também mostra que, à medida que a concentração mista de sal aumenta, as atividades de CAT, POD e SOD nas plântulas de Hongtianhu 101 e Xinxiang 8 diminuem e depois aumentam. Em baixas concentrações de sal (0-3 g / L), a atividade das enzimas antioxidantes não muda significativamente, e um aumento adicional na concentração de sal melhora a tolerância ao sal.
As características de adaptabilidade e resposta das culturas ao estresse salino se refletem principalmente na morfologia, estrutura, ecologia fisiológica, etc. Uma avaliação abrangente da tensão de sal composto é realizada usando o método de valor da função de associação para múltiplas características. Este estudo mostra que, à medida que a concentração de sal misto aumenta, o valor total ponderado do valor da função aumenta primeiro e depois diminui. As duas variedades atingem um máximo de 5 g/L, levando ao melhor efeito de tolerância ao sal. Em comparação com o tratamento de 5 g/L, os valores ponderados após o tratamento com as concentrações de sal de 3 g/L, 10 g/L e 15 g/L diminuem 4,7%, 25,3% e 41,4%, respectivamente, para Hongtianhu 101 e 11,1%, 28,3% e 45,1%, respectivamente, para Xinxiang 8. Tais achados indicam que a tolerância ao sal de Hongtianhu 101 é maior que a de Xinxiang 8.
Este estudo fornece uma descrição abrangente dos efeitos de diferentes concentrações de estresse salino composto sobre a germinação de sementes de pimenta e suas atividades enzimáticas fisiológicas, e uma referência técnica para pesquisas sobre tolerância ao sal em outras culturas. As mudas de pimenta são menos afetadas pelo estresse salino sob concentrações simuladas de sal misto (0-5 g/L). A germinação das sementes, o alongamento radicular e a morfogênese das plântulas da pimenta são significativamente inibidos sob alto estresse salino (>5 g/L), causando grave peroxidação lipídica da membrana em plântulas de pimenta. As culturas reduzem os efeitos adversos do estresse salino, aumentando seu teor de Pro e aumentando a atividade de enzimas protetoras (CAT, POD e SOD). Sob estresse salino, o teor de prolina e a atividade enzimática protetora das plântulas de Hongtianhu 101 são maiores, o grau de peroxidação lipídica da membrana é menor e a germinação das sementes e o crescimento das plântulas são mais óbvios do que os de Xinxiang 8.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Departamento de Ciência e Tecnologia da Província de Jiangxi (20203BBFL63065) e pelo Projeto Geral de Pesquisa em Ciência e Tecnologia do Departamento de Educação de Jiangxi (GJJ211430). Gostaríamos de agradecer à Editage (www.editage.cn) pela edição em inglês.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium chloride | Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd.,China | Analytical reagent | |
| Centrifugal machine | Shanghai Luxianyi Centrifuge Instrument Co., Ltd., China | TGL-16M | |
| Centrifuge tube | None | None | |
| Conductivity meter | Shanghai Instrument&Electronics Science Instrument Co., Ltd., China | DDSJ-308F | |
| Constant temperature and humidity box | Ningbo Laifu Technology Co., Ltd.,China | PSX-280H | |
| Digital display vernier caliper | Deli Group Co., Ltd.,China | DL90150 | |
| Electronic balance | Mettler Toledo Instruments (Shanghai) Co., Ltd.,China | ME802E/02 | |
| Filter paper | Hangzhou Fuyang North Wood Pulp and Paper Co., Ltd.,China | GB/T1914-2017 | |
| Grinding rod | None | None | |
| Hongtianhu 101 | Seminis Seed (Beijing) Co., Ltd.,China | 11933955/100147K1-137 | |
| Ice machine | Shanghai Kehuai Instrument Co., Ltd., China | IM150G | |
| Liquid nitrogen | None | None | |
| Magnesium chloride | Tianjin Kermel Chemical Reagent Co., Ltd.,China | Analytical reagent | |
| Magnesium sulfate | Tianjin Kermel Chemical Reagent Co., Ltd.,China | Analytical reagent | |
| Petri dish | Jiangsu Yizhe Teaching Instrument Co., Ltd.,China | I-000163 | |
| Pocket knife | None | None | |
| Potassium permanganate (KMnO4 | Xilong Scientific Co.,Ltd.,China | Analytical reagent | |
| Pure water equipment | Sichuan Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd.,China | UPT-I-20T | |
| Sodium bicarbonate | Xilong Scientific Co.,Ltd.,China | Analytical reagent | |
| Sodium carbonate | Xilong Scientific Co.,Ltd.,China | Analytical reagent | |
| Sodium chloride | Xilong Scientific Co.,Ltd.,China | Analytical reagent | |
| Sodium sulfate | Xilong Scientific Co.,Ltd.,China | Analytical reagent | |
| Test kit | Suzhou Keming, Biotechnology Co., Ltd, Suzhou.,China | Spectrophotometer method | |
| Ultra-low temperature freezer | SANYO Techno Solution TottoriCo.,Ltd. | MDF-382 | |
| Ultraviolet visible spectrophotometer | Shanghai Precision Scientific Instrument Co., Ltd., China | 760CRT | |
| Xinxiang 8 | Jiangxi Nongwang High Tech Co., Ltd.,China | GPD Pepper 2017(360013) |
References
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