Summary
El siguiente documento presenta un protocolo para medir la germinación de semillas, el crecimiento de las plántulas y los índices fisiológicos de dos variedades de pimiento con diferencias de tolerancia a la salinidad en respuesta a seis concentraciones mixtas de sal. Este protocolo se puede utilizar para evaluar la tolerancia a la sal de las variedades de pimienta.
Abstract
Para determinar la tolerancia a la sal y el mecanismo fisiológico de la pimienta (Capsicum annuum L.) en la etapa de germinación, se emplean como materiales de estudio las variedades Hongtianhu 101 y Xinxiang 8, que tienen grandes diferencias en la tolerancia a la sal. Se utilizan seis concentraciones mixtas de sal de 0, 3, 5, 10, 15 y 20 g/L derivadas utilizando proporciones molares iguales de Na2 CO 3, NaHCO3, NaCl, CaCl 2, MgCl2, MgSO 4 yNa2SO4. Para determinar sus efectos, se miden los índices relacionados de germinación de semillas, crecimiento de plántulas y fisiología, y la tolerancia a la sal se evalúa exhaustivamente utilizando el análisis de la función de membresía. Los resultados muestran que a medida que aumenta la concentración de sal mixta, el potencial de germinación, el índice de germinación, la tasa de germinación, el índice de vigor de germinación de la semilla, la longitud de la raíz y el peso fresco de la raíz de los dos cultivares disminuyen significativamente, mientras que la tasa relativa de sal aumenta gradualmente. La longitud del hipocótilo y el peso fresco sobre el suelo aumentan primero y luego disminuyen, mientras que la actividad de malondialdehído (MDA), prolina (Pro), catalasa (CAT), peroxidasa (POD) y superóxido dismutasa (SOD) disminuyen y luego aumentan. El potencial de germinación, el índice de germinación, la tasa de germinación, el índice de vigor de germinación de la semilla, la longitud de la raíz, el peso fresco de la raíz, el contenido de MDA y Pro, y la actividad CAT de las semillas Hongtianhu 101 son más altos que los de Xinxiang 8 para todas las concentraciones de sal empleadas aquí. Sin embargo, la longitud del hipocótilo, el peso fresco sobre el suelo y la tasa relativa de sal son más bajos en Hongtianhu 101 que en Xinxiang 8. La evaluación exhaustiva de la tolerancia a la sal revela que los valores ponderados totales de los dos índices de función de membresía aumentan primero y luego disminuyen a medida que aumenta la concentración de sal mixta. En comparación con 5 g / L, que tiene el valor de función de membresía más alto, el índice bajo concentraciones de sal de 3 g / L, 10 g / L y 15 g / L disminuye en 4.7% -11.1%, 25.3% -28.3% y 41.4% -45.1%, respectivamente. Este estudio proporciona orientación teórica para el mejoramiento de variedades de pimiento tolerantes a la sal y un análisis de los mecanismos fisiológicos involucrados en la tolerancia a la sal y el cultivo tolerante a la sal.
Introduction
La salinidad es un factor limitante importante para la productividad de los cultivos en todo el mundo1. En la actualidad, casi el 19,5% de las tierras de regadío del mundo y el 2,1% de las tierras secas están afectadas por la salinidad, y aproximadamente el 1% de las tierras agrícolas degeneran en tierras salinas-alcalinas cada año. Para 2050, se espera que el 50% de la tierra cultivable se vea afectada por la salinización 2,3. Además de los factores naturales, como la erosión natural de las rocas y el agua de lluvia salada cerca o alrededor de la costa, la rápida evaporación de la superficie, las bajas precipitaciones y los métodos de gestión agrícola irrazonables han exacerbado el proceso de salinización del suelo. La salinización del suelo inhibe el crecimiento de las raíces de las plantas y reduce la absorción y el transporte de agua y nutrientes desde las raíces de las plantas hasta las hojas. Esta inhibición resulta en escasez fisiológica de agua, desequilibrios nutricionales y toxicidad iónica, lo que conduce a una reducción de la productividad de los cultivos y una pérdida completa del rendimiento de los cultivos. La salinización de las tierras cultivadas se está convirtiendo gradualmente en uno de los factores de estrés abiótico más críticos que afectan la producción mundial de alimentos agrícolas4. El estrés salino reduce la tierra cultivable disponible para la agricultura, lo que puede dar lugar a un desequilibrio significativo entre la oferta y la demanda de futuros productos agrícolas. Por lo tanto, explorar los efectos de la salinización del suelo en el crecimiento de los cultivos y los mecanismos fisiológicos y bioquímicos es propicio para el mejoramiento de variedades tolerantes a la sal, la utilización sostenible del suelo salino y la inocuidad de los productos agrícolas.
La pimienta (Capsicum annuum L.) se siembra en todo el mundo debido a su alto valor nutricional y medicinal. Por ejemplo, la capsaicina es un alcaloide responsable del sabor picante de la pimienta. La capsaicina se puede utilizar para aliviar el dolor, pérdida de peso, mejorar los sistemas cardiovascular, gastrointestinal y respiratorio, y en varias otras aplicaciones5. La pimienta también es rica en sustancias bioactivas, especialmente diferentes compuestos antioxidantes (carotenoides, fenólicos y flavonoides) y vitamina C6. Actualmente, se informa que la pimienta es el cultivo de hortalizas con el área de cultivo más grande en China, con un área de siembra anual de más de 1.5 x 106 ha, lo que representa el 8% -10% del área total de siembra de hortalizas en China. La industria de la pimienta se ha convertido en una de las industrias vegetales más grandes de China y tiene el valor de producción más alto7. Sin embargo, el cultivo de pimiento a menudo está sujeto a una variedad de tensiones biológicas (plagas y hongos) y abióticas, especialmente estrés salino, que tiene un impacto negativo directo en la germinación, el crecimiento y el desarrollo de las semillas, lo que resulta en la reducción del rendimiento y la calidad de la fruta de pimienta8.
La germinación de las semillas es la primera etapa de interacción entre las plantas y el medio ambiente. La germinación de las semillas es altamente sensible a las fluctuaciones en los medios circundantes, especialmente al estrés salino del suelo, que puede ejercer efectos invertidos sobre la fisiología y el metabolismo, y eventualmente alterar el crecimiento, desarrollo y morfogénesis normales de los cultivos9. En estudios anteriores, la germinación de las semillas de pimiento y el crecimiento de las plántulas bajo estrés salino se investigaron ampliamente; sin embargo, la mayoría de los estudios utilizaron NaCl como la única sal para la inducción de estrés10,11,12. Sin embargo, el daño de la sal del suelo se debe principalmente a la toxicidad de Na+, Ca2+,Mg2+, Cl-, CO3 2-, y SO42- ion generada por la disociación de sales de sodio, calcio y magnesio. Debido a la sinergia y el antagonismo entre los iones, los efectos de la mezcla de sal y sal simple en el crecimiento y desarrollo de los cultivos pueden ser muy diferentes. Sin embargo, las características correspondientes de la germinación de la semilla de pimienta y el crecimiento en sal mixta aún no están claras. Por lo tanto, dos variedades de pimiento con diferencias notables en la tolerancia a la sal se utilizan como materiales en este estudio. El análisis de los efectos de diferentes concentraciones de sal en la germinación de semillas de pimienta, el crecimiento y los índices fisiológicos y bioquímicos después de la mezcla equimolar de siete sales puede revelar el mecanismo de respuesta de la germinación de semillas de pimienta al estrés por salinidad. También puede proporcionar una base teórica para cultivar plántulas de pimiento fuertes, así como un cultivo de alto rendimiento y alta calidad en tierras cultivadas con solución salina.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: Aquí, presentamos un protocolo para evaluar las características de respuesta y los mecanismos internos de la germinación de semillas de pimiento y el crecimiento de plántulas bajo diferentes estreses de sal mixta, que puede servir como método de referencia para la evaluación de la tolerancia a la sal de semillas.
1. Preparación experimental
- Prepare semillas de cultivo para cultivares: Hongtianhu 101 con fuerte tolerancia a la sal y Xinxiang 8 con baja tolerancia.
- Preparar una solución de KMnO4 al 0,2% como reactivo de desinfección de semillas. Primero, pesar 4.0 g de KMnO4, y luego agregar 2,000 mL de agua destilada.
NOTA: El permanganato de potasio suele ser inestable debido a su fuerte oxidación; En consecuencia, se prepara inmediatamente antes de su uso. - Prepare las sales mezcladas usando siete sales, incluyendo carbonato de sodio, bicarbonato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de calcio, cloruro de magnesio, sulfato de magnesio y sulfato de sodio13. Agregue la misma cantidad molar de cada uno, que sucesivamente representan 14.8%, 11.7%, 8.2%, 15.5%, 13.3%, 16.7% y 19.8% de la relación de masa total de las sales mixtas, respectivamente.
- Preparar placas de Petri (de un solo uso) y papel de filtro (papel de filtro cualitativo de velocidad media), ambos con un diámetro de 9 cm.
NOTA: El material de la placa de Petri se puede cambiar; sin embargo, el diámetro de la placa de Petri y el papel de filtro debe ser el mismo.
2. Remojo de semillas y preparación para la germinación
- Para la optimización de semillas, seleccione semillas de pimiento con tamaño consistente y partículas completas de cada variedad, con un diámetro promedio de 4.2 mm y 3.7 mm para semillas Hongtianhu 101 y Xinxiang 8, respectivamente. Calcule el número total de semillas seleccionadas de acuerdo con la carga de trabajo de prueba.
- Para la desinfección de semillas, remoje las semillas de pimiento seleccionadas en una solución KMnO4 al 0,2% durante 15 minutos y luego enjuague cinco veces con agua destilada.
- Para remojar las semillas, transfiera las semillas esterilizadas a agua destilada y déjelas en remojo durante 24 h. Enjuague las semillas varias veces con agua destilada y séquelas para su uso posterior.
NOTA: El tiempo de remojo de las semillas para diferentes cultivos puede variar.
3. Germinación de semillas y crecimiento de plántulas
- Prepare seis concentraciones de las sales mezcladas: 0 (control), 3, 5, 10, 15 y 20 g / L. Mida la conductividad de la solución salina usando un medidor de conductividad; los valores de EC de conductividad de la solución son 0.092, 3.05, 4.73, 8.33, 11.53 y 15.22 ms/cm, respectivamente.
- Para la preparación de semillas, coloque uniformemente 40 semillas de pimiento en una placa de Petri con dos capas de papel de filtro. Prepare las semillas para seis tratamientos experimentales y repita cada tratamiento cinco veces.
- Para la germinación de la semilla, agregue una cantidad adecuada de las seis concentraciones de sal mezcladas a la placa de Petri para asegurarse de que el papel de filtro se mantenga húmedo. Coloque las semillas en una incubadora de aire a 28 ° C y 80% de humedad del aire para la germinación en la oscuridad.
- Después de la germinación de la semilla, permita que las plántulas continúen creciendo en luz (intensidad de luz de aproximadamente 450 Lux; ciclo de luz de 12/12h) en la incubadora durante 14 días después de la siembra. La temperatura y la humedad en la etapa de crecimiento de la plántula deben ser las mismas que las utilizadas en la etapa de germinación.
- Reponga la solución en la placa de cultivo cada 12 h para retener un papel de filtro húmedo, y lave completamente el papel de filtro cada 24 h con la concentración correspondiente de la solución salina mezclada para mantener una concentración constante de sal mezclada en la placa de Petri.
NOTA: La cantidad de solución salina añadida a las semillas húmedas se puede ajustar de acuerdo con las etapas de germinación y crecimiento de la semilla. Hay muchos métodos disponibles para mantener una concentración constante de soluciones salinas en platos de cultivo. Además de los métodos descritos en este experimento, se puede utilizar la estrategia de agregar agua destilada por peso.
4. Medición y cálculo de indicadores
- Determinación de los índices de germinación de las semillas
- Determine la tasa de germinación diaria después de la siembra, con la capa de semilla que rompe la radícula alcanzando la mitad de la longitud del diámetro de la semilla como marcador de germinación.
- Calcule la tasa de germinación, el potencial de germinación, la tasa relativa de sal, el índice de germinación y el índice de vigor de germinación de la semilla utilizando las siguientes fórmulas:
Tasa de germinación (%) = (número de semillas germinadas normales el día 7 después de la siembra / número de semillas analizadas) × 100
Potencial de germinación (%) = (número de semillas germinadas normales el día 3 después de la siembra/número de semillas analizadas) × 100
Tasa relativa de sal (%) = (tasa de germinación de control - tasa de germinación del tratamiento)/tasa de germinación de control × 100
calculado utilizando la tasa de germinación de la semilla en el día 7 después de la siembra
Índice de germinación (IG) = ∑ [Gt/Dt]
donde Gt se refiere al número de germinación de la semilla en un período de tiempo (t) después de la siembra y Dt se refiere a los días de germinación correspondientes
Índice de vigor de germinación de semillas (VI) = GI x S
donde S es la longitud de la raíz
- Determinación del índice de crecimiento de plántulas.
- El día 14 después de la siembra, seleccione al azar 10 plántulas representativas de cada placa de Petri y mida la longitud de la raíz y la longitud del hipocótilo.
- Use un cuchillo para dividir las plántulas de pimiento en dos partes: radícula y partes sobre el suelo. Retire el agua de las plántulas limpiando y pese las plántulas por separado para determinar el peso fresco.
- Determine la actividad de la enzima antioxidante, el nivel de malondialdehído (MDA) y el contenido de prolina (Pro) en la pimienta de la siguiente manera.
- Para preservar las plántulas de pimiento, seleccione plántulas de pimiento enteras representativas (aproximadamente 24.0 g) de cada tratamiento el día 14 después de la siembra. Después de eliminar el agua superficial, congele inmediatamente las plántulas en nitrógeno líquido durante 1 minuto y guárdelas en un refrigerador a una temperatura ultra baja (-80 ° C).
NOTA: El número de muestras de plántulas de pimiento almacenadas en el refrigerador de temperatura ultra baja debería ser suficiente, en caso de que sea necesario volver a analizar algunos indicadores. - Recuperar aproximadamente 1,0 g de muestra de plántula de cada tratamiento recogido por triplicado. Coloque la muestra de plántula en un tubo de centrífuga, agregue nitrógeno líquido y muele la muestra con una varilla de molienda para determinar los índices fisiológicos de las plántulas. Los índices determinados y el esquema de medición se muestran a continuación.
- Determine la actividad enzimática protectora de las plántulas (peroxidasa [POD], catalasa [CAT], superóxido dismutasa [SOD]), malondialdehído (MDA) y prolina (Pro) utilizando un kit disponible comercialmente (basado en espectrofotometría) para cada factor14.
NOTA: Observaciones anteriores no revelaron diferencias en el estrés salino entre las concentraciones de sal mixta de 15 y 20 g/L. Como resultado, solo se miden cinco concentraciones de sal (0, 3, 5, 10 y 15 g / L).
- Para preservar las plántulas de pimiento, seleccione plántulas de pimiento enteras representativas (aproximadamente 24.0 g) de cada tratamiento el día 14 después de la siembra. Después de eliminar el agua superficial, congele inmediatamente las plántulas en nitrógeno líquido durante 1 minuto y guárdelas en un refrigerador a una temperatura ultra baja (-80 ° C).
- Evaluación exhaustiva de la tolerancia a la sal utilizando el método de función de membresía
NOTA: La función de membresía utiliza un método matemático difuso, que convierte la evaluación cualitativa en evaluación cuantitativa15, para evaluar una variedad de índices fisiológicos afectados por el daño de la sal.- Calcule el valor de la función de pertenencia utilizando la siguiente fórmula de Zhoubin Liu et al.15:
Ri = (Xi - Xmin)/(Xmax - Xmin)
Si un rasgo se correlaciona negativamente con la tolerancia a la sal, calcule la función de pertenencia inversa usando:
Ri = 1 - (Xi - Xmin)/(Xmax - Xmin)
Acumule los valores de membresía de cada índice fisiológico, donde Xi es el valor medido de un determinado rasgo, Xmax y Xmin son los valores máximo y mínimo para Xi, respectivamente, y Ri es el valor de membresía de ese rasgo. - Incluya los siguientes indicadores relevantes: características de germinación de la semilla (potencial de germinación, tasa de germinación, índice de germinación e índice de vigor de germinación de la semilla), características de crecimiento de las plántulas en la etapa de germinación (longitud de la raíz, longitud del hipocótilo, peso fresco de la raíz y peso fresco sobre el suelo), MDA, Pro y actividad enzimática protectora (CAT, POD, SOD) para el cálculo del valor de la función de membresía. Los valores de la función de pertenencia se obtienen de cada indicador.
- Calcule el valor de la función de pertenencia utilizando la siguiente fórmula de Zhoubin Liu et al.15:
- Utilice hojas de cálculo y software SPSS (versión 22.0) para analizar y procesar los datos de prueba y aplicar el método de diferencia menos significativa (LSD) para comparaciones múltiples para identificar diferencias significativas. Utilice el análisis de correlación de Pearson para investigar la correlación entre la germinación de semillas y los índices fisiológicos de plántulas de pimienta bajo estrés salino compuesto.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Características de germinación de las semillas
A medida que aumenta la concentración de sal mixta, el potencial de germinación y el índice de germinación de Hongtianhu 101 y Xinxiang 8 disminuyen significativamente. Ambos cultivares tienen una fuerte disminución en las concentraciones de sal de 0-3 g / L, y una disminución lenta y constante para las concentraciones de sal de 3-20 g / L (Figura 1A, B). La tasa de germinación de las dos variedades disminuye gradualmente a medida que aumentan las concentraciones de sal mixta, y la tasa relativa de sal para las variedades aumenta gradualmente. No hay diferencia significativa en la tasa de germinación y la tasa relativa de sal a concentraciones de sal de 3-15 g / L. Sin embargo, la diferencia es significativa en todas las demás concentraciones de sal (Figura 1C, D). Con respecto a la tolerancia a la sal entre las dos variedades, el potencial de germinación, el índice de germinación y la tasa de germinación de las semillas Hongtianhu 101 con concentraciones crecientes de sal mixta son más altas que las de Xinxiang 8, mientras que la tasa relativa de sal es menor que la de Xinxiang 8.
A medida que aumenta la concentración de sal mixta (0-15 g / L), el índice de vigor de germinación de semillas de las dos variedades disminuye significativamente. Cuando la concentración de sal mixta es de 15 g / L, el índice de vigor de germinación de semillas de Hongtianhu 101 y Xinxiang 8 disminuye en un 91,0% y 94,6%, respectivamente, en comparación con el del control. Cabe destacar que la disminución no es significativa cuando la concentración de sal mixta aumenta aún más de 15 a 20 g / L. El índice de vigor de germinación de semillas de Hongtianhu 101 es mayor que el de Xinxiang 8 en cada nivel de concentración de sal mixta (Figura 1E).
Características de crecimiento de las plántulas.
A medida que aumenta la concentración de sal mixta (0-15 g / L), la longitud de la raíz y el peso fresco de la raíz de Hongtianhu 101 y Xinxiang 8 disminuyen significativamente. Cuando la concentración de sal mixta es de 15 g / L, la longitud de la raíz de Hongtianhu 101 y Xinxiang 8 disminuye en un 89,4% y 91,1%, respectivamente, y el peso fresco de la raíz disminuye en un 81,7% y 71,2%, respectivamente, en comparación con los del control. Sin embargo, cuando la concentración de sal es de 15-20 g/L, la longitud de la raíz y el peso fresco de las dos variedades no cambian significativamente (Figura 2A, C). La longitud de la raíz y el peso fresco de la raíz de Hongtianhu 101 son generalmente más altos que los de Xinxiang 8 con niveles crecientes de sal mixta, con diferencias obvias en concentraciones que van de 0 a 10 g / L.
La longitud del hipocótilo y el peso fresco sobre el suelo de las dos variedades aumentan y luego disminuyen con el aumento de la concentración de sal mixta. Ambos índices alcanzan sus valores más altos a una concentración salina de 5 g/L. Del mismo modo, cuando la concentración de sal es de 15-20 g / L, la longitud del hipocótilo y el peso fresco sobre el suelo de las dos variedades disminuyen ligeramente. Según las diferencias varietales, la longitud del hipocótilo y el peso fresco sobre el suelo de Xinxiang 8 son más altos que los de Hongtianhu 101 en cada concentración de sal (Figura 2B, D).
Peroxidación lipídica de membrana y contenido de sustancia de ajuste osmótico
A medida que aumenta la concentración de sal mixta, los contenidos de MDA y Pro de las dos variedades disminuyen y luego aumentan. Los contenidos de MDA y Pro alcanzan sus valores más bajos en concentraciones de 5 g/L y 3 g/L, respectivamente (Figura 3A,B). El contenido de MDA disminuye ligeramente a concentraciones de sal de 0-5 g / L y aumenta rápidamente a 10 g / L. En comparación con el tratamiento de 5 g / L, el contenido de MDA después del tratamiento de 10 g / L aumenta en un 59.9% -64.8%, y luego permanece sin cambios. El contenido de MDA de Hongtianhu 101 es mayor que el de Xinxiang 8 a diferentes concentraciones de sal (Figura 3A). La disminución del contenido de Pro a 0-3 g/L no es significativa y se encuentra poca diferencia entre las dos variedades. Cuando la concentración de sal es de 3-15 g / L, el contenido Pro de Xinxiang 8 aumenta lentamente y permanece relativamente estable, mientras que el contenido Pro de Hongtianhu 101 aumenta rápidamente. En comparación con 3 g / L, el contenido Pro de Hongtianhu 101 aumenta significativamente en un 440.2% a 15 g / L (Figura 3B).
Actividad enzimática protectora
A medida que aumenta la concentración de sal mixta, las actividades de CAT, POD y SOD de las plántulas de Hongtianhu 101 y Xinxiang 8 disminuyen y luego aumentan, con los valores más bajos obtenidos a una concentración de 3 g / L (Figura 4A-C). Las actividades CAT y POD de las dos variedades varían ligeramente a concentraciones de sal de 0-5 g / L, y la diferencia entre ellas es pequeña. A partir de entonces, las actividades CAT y POD de las dos variedades aumentan significativamente con el aumento de la concentración de sal. Además, las actividades CAT y POD de Hongtianhu 101 son más altas que las de Xinxiang 8, y la diferencia entre ellas aumenta gradualmente (Figura 4A, B). La actividad SOD de las dos variedades varía ligeramente a concentraciones de sal de 0-10 g / L, y luego aumenta rápidamente. La actividad SOD de Xinxiang 8 es mayor que la de Hongtianhu 101 a concentraciones de sal de 0-10 g / L; para las concentraciones restantes, su actividad es menor que la de Hongtianhu 101 (Figura 4C).
Análisis de correlación de los índices de germinación de semillas de pimiento y evaluación integral del estrés salino
El análisis de correlación (Tabla 1) revela que la longitud de la raíz y el peso fresco de la raíz para los índices característicos de crecimiento de las plántulas están significativamente correlacionados positivamente con los índices de germinación (potencial de germinación, tasa de germinación, índice de germinación, índice de vigor de germinación de la semilla, etc.); Sin embargo, no se encuentra relevancia explícita entre la longitud del hipocótilo, el peso fresco sobre el suelo y los índices de germinación. Se encuentra una correlación negativa significativa entre los índices de características de crecimiento de las plántulas y la actividad de las enzimas protectoras (CAT, POD y SOD). También se encuentra una correlación negativa significativa entre la longitud del hipocótilo y el contenido de MDA y Pro, y entre el peso fresco del brote y el contenido de MDA. Con excepción de la correlación significativa entre el índice de vigor de germinación de la semilla y la actividad enzimática protectora, no se encuentra una correlación significativa entre los índices característicos de germinación y los índices fisiológicos de las plántulas (actividad enzimática protectora y contenido de MDA y Pro).
La tolerancia a la sal de las dos variedades de pimiento bajo estrés salino compuesto se evalúa utilizando el método de función de membresía para múltiples rasgos. Como las plántulas de pimiento no están sometidas a estrés salino cuando la concentración de sal mezclada es de 0 g / L, no se calcula su valor de función de membresía. Como resultado, solo el tratamiento con estrés salino se evalúa mediante el análisis de la función de membresía. Se encuentra que la MDA se correlaciona negativamente con la tolerancia a la sal de las plántulas de pimiento y se calcula utilizando el método de la función de membresía inversa; Otros índices se calculan utilizando el método de función de pertenencia. La Tabla 2 muestra que a medida que aumenta la concentración de sal mixta, los valores ponderados totales de cada función de índice de las dos variedades aumentan y luego disminuyen, alcanzando finalmente un máximo a una concentración de sal de 5 g/L. En comparación con el tratamiento de 5 g/L, los valores obtenidos con los 3 g/L, 10 g/L, y los tratamientos con concentración de sal de 15 g/L disminuyen en un 4,7%-11,1%, 25,3%-28,3% y 41,4%-45,1%, respectivamente. Por lo tanto, la tolerancia a la sal de la pimienta sometida a tratamientos de concentración de sal de 5 g / L, 3 g / L, 10 g / L y 15 g / L se puede clasificar como mejor, segundo mejor, malo y peor, respectivamente.
Figura 1: Efectos del aumento de las concentraciones mixtas de sal en la germinación de la semilla de pimienta. (A), (B), (C), (D) y (E) representan las características de respuesta del potencial de germinación de la semilla de pimienta, el índice de germinación, la tasa de germinación, la tasa relativa de sal y el índice de vigor de germinación de la semilla al estrés salino compuesto, respectivamente. Diferentes letras minúsculas en la figura indican diferencias significativas entre los tratamientos, que son analizadas por la prueba de rango múltiple de Tukey (p < 0,05). Las barras de error indican desviaciones estándar (n = 5). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Efectos del aumento de las concentraciones de sal mixta sobre la germinación de las semillas y los índices morfológicos de la pimienta . (A), (B), (C) y (D) representan las características de respuesta de la longitud de la raíz de plántula de pimiento, la longitud del hipocótilo, el peso fresco de la raíz y el peso fresco sobre el suelo al estrés salino compuesto, respectivamente. Diferentes letras minúsculas en la figura indican diferencias significativas entre los tratamientos, que son analizadas por la prueba de rango múltiple de Tukey (p < 0,05). Las barras de error indican la desviación estándar (n = 5). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Efectos del aumento de las concentraciones de sal mixta sobre el contenido de MDA y Pro de las plántulas de pimiento. (A) y (B) representan las características de respuesta del contenido de MDA y Pro de plántulas de pimiento al estrés salino compuesto, respectivamente. Diferentes letras minúsculas en la figura indican diferencias significativas entre los tratamientos, que son analizadas por la prueba de rango múltiple de Tukey (p < 0,05). Las barras de error indican la desviación estándar (n = 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Efectos del aumento de las concentraciones mixtas de sal en las actividades de CAT, POD y SOD de las plántulas de pimiento. (A), (B) y (C) representan las características de respuesta de las actividades CAT, POD y SOD de las plántulas de pimiento a la tensión salina compuesta, respectivamente. Diferentes letras minúsculas en la figura indican diferencias significativas entre los tratamientos, que son analizadas por la prueba de rango múltiple de Tukey (p < 0,05). Las barras de error indican la desviación estándar (n = 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Análisis de correlación entre la germinación del pimiento y los indicadores fisiológicos bajo estrés salino compuesto (n = 30). El análisis de correlación de Pearson se utiliza para investigar la correlación entre la germinación de semillas y los índices fisiológicos de plántulas de pimienta bajo estrés salino compuesto. * p < 0,05; ** p < 0,01. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 2: El valor ponderado de la función de membresía de la germinación de pimiento y los indicadores fisiológicos de las plántulas bajo estrés salino mixto. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este método de investigación comprende cuatro pasos clave que afectan la precisión de los resultados experimentales. En primer lugar, debido a la mala disolución de sales mixtas causada por el aumento del contenido de solutos en soluciones de alta concentración de sal, y la baja solubilidad de reactivos como el cloruro de calcio, que son más difíciles de solubilizar en agua, los reactivos pesados deben ser completamente molidos en un mortero. Además, los reactivos deben disolverse a través de ondas ultrasónicas antes de determinar la capacidad. En segundo lugar, la solución salina configurada debe agitarse completamente cada vez y agregarse a la placa de Petri para su uso. En tercer lugar, las placas de Petri deben retener una capa de agua adecuada después de la adición de la solución salina, y el estado del agua de cada placa de Petri debe ser relativamente consistente. Finalmente, las condiciones de luz deben ser consistentes después de la germinación de la semilla.
En este estudio, el número de semillas de prueba en una sola placa de Petri se puede ajustar variando el diámetro de la placa de Petri seleccionada. De acuerdo con la situación específica del estrés salino del suelo en diferentes áreas de plantación, la proporción de cada adición de sal individual podría ajustarse para permitir la coherencia con la situación real de estrés salino en el suelo local. Si bien este método es práctico, para semillas más pequeñas (como colza, planta de hielo y amaranto) o semillas más grandes (como frijoles espada y habas), problemas como dificultades operativas en la determinación de la longitud de la plántula y el peso fresco, o la disponibilidad de muy pocas semillas en un solo plato de cultivo para repetir los datos, conducen a dificultades para estudiar la tolerancia a la sal utilizando este método.
El método descrito aquí se utiliza para determinar las características de germinación de las semillas y el crecimiento de las plántulas bajo diferentes concentraciones de sal mixta y revelar el mecanismo de cambio a través de la actividad enzimática fisiológica interna, que es de gran importancia para evaluar objetivamente las características de tolerancia a la sal de las semillas. Esta tecnología puede proporcionar una referencia técnica para la evaluación de la tolerancia a la sal de otros cultivos. La germinación de las semillas y el crecimiento de las plántulas son las etapas en las que los cultivos son más sensibles al estrés salino. Por lo tanto, este método puede proporcionar efectivamente una referencia para el cultivo tolerante a la sal y el mejoramiento de cultivos.
En la mayoría de los cultivos, el estrés salino puede inhibir la germinación de las semillas y el crecimiento de las plántulas bajo estrés biótico. Tal inhibición puede deberse a una reducción en la absorción de agua de semilla al reducir el potencial osmótico de la solución salina en condiciones salinas. El estrés y la toxicidad de los iones de sal pueden cambiar la actividad de las enzimas protectoras (POD, CAT, SOD, etc.) y el metabolismo de las proteínas durante la germinación de las semillas, y destruir el equilibrio hormonal endógeno11,16. Zhani et al. informaron que el proceso de germinación fue cambiado principalmente por una tasa de germinación reducida y una germinación prolongada bajo estrés salino (NaCl). Además, se encontró una diferencia significativa en la tasa de germinación entre diferentes variedades (10%-50%) a una concentración de sal de 8 g/L17. El presente estudio también revela que a medida que aumenta la concentración de sal mixta, el potencial de germinación, el índice de germinación, la tasa de germinación y el índice de vigor de germinación de semillas de Hongtianhu 101 y Xinxiang 8 disminuyen significativamente, y la tasa relativa de sal aumenta gradualmente. Según Patanè et al., aunque el estrés salino prolongó el tiempo de germinación de las semillas de sorgo dulce, el aumento del estrés salino tuvo un efecto adverso en la germinación final de las semillas18. Sin embargo, estudios relacionados sugieren que el tratamiento con NaCl puede promover la germinación y el crecimiento de las semillas de pimiento19, lo que puede estar relacionado con las diferencias en los niveles de concentración de sal.
El aumento del nivel de estrés salino tiene un efecto significativo en el crecimiento de las plántulas de pimiento, y según este estudio, la longitud de la raíz y el peso fresco de la raíz de las dos variedades disminuyeron significativamente con el aumento de las concentraciones mixtas de sal. Este hallazgo es similar al de Mirosavljević et al., quienes sugirieron que la longitud de la raíz y el peso de la raíz disminuyeron a medida que aumentaba el estrés salino, y las diferencias entre los tratamientos fueron significativas20. Este resultado indica que el sistema radicular se colocó en el medio del suelo en contacto directo con la solución del suelo, y la longitud de la raíz y el peso de la raíz fueron más sensibles al estrés osmótico de NaCl. La longitud de la raíz y el peso de la raíz son indicadores clave de la respuesta de la planta al estrés salino. Según este estudio, a medida que aumenta la concentración de sal, la longitud del hipocótilo y el peso fresco de las partes aéreas aumentan y luego disminuyen, con valores máximos alcanzados a 5 g / L. Khan et al. también sugirieron que a medida que aumenta la salinidad (NaCl) (0-9 ms / cm), la longitud del brote de la pimienta aumenta primero y luego disminuye, con el mejor rendimiento obtenido a 3 ms / cm12, 21. La conductividad de la concentración de sal en este estudio fue de 4,73 ms/cm, cuando el valor de la longitud del hipocótilo de las plántulas y el peso fresco sobre el suelo fueron los más altos, que es mayor que el valor reportado por Khan et al.21. Este resultado podría deberse a la alta tolerancia de la pimienta sobre el suelo al estrés salino compuesto en comparación con el estrés salino simple.
El estrés salino no solo dificulta el crecimiento de los cultivos, sino que también causa cambios fisiológicos significativos en las plantas. El estrés salino puede aumentar los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS). Si las ROS no se eliminan a tiempo, puede producirse peroxidación lipídica de la membrana y estrés oxidativo, que pueden causar daños graves a la membrana celular de la planta. La MDA es el metabolito final de la peroxidación lipídica de la membrana, y la concentración intracelular de MDA se utiliza a menudo como indicador para evaluar el grado de daño a las plantas bajo estrés22. En el presente estudio, a medida que aumenta la concentración de sal mixta, el contenido de MDA de las plántulas de las dos variedades disminuye primero y luego aumenta. Cabe destacar que la disminución no es significativa a concentraciones de sal que oscilan entre 0 y 5 g / L. Sin embargo, se observa un rápido aumento de 5-10 g / L. A partir de entonces, los valores permanecen sin cambios, lo que indica que el grado de peróxido lipídico de membrana de las semillas de pimiento cambia de general, a rápidamente creciente, a estable. Se especula que el estrés salino tiene un impacto grave en la permeabilidad de la membrana celular cuando la concentración de sal mixta es superior a 10 g / L. Guzmán-Murillo et al. informaron una conclusión similar de una disminución y luego un aumento en el nivel de peróxido lipídico de membrana en plántulas de pimiento dulce a medida que aumentaba la concentración de NaCl (0-50 nmol / L). Además, el nivel de peroxidación lipídica fue más bajo a 25 nmol/L NaCl23.
Las plantas han desarrollado varias estrategias para hacer frente al estrés por sal. Por un lado, los cultivos mejoran la estabilidad proteica y la integridad de la membrana al aumentar las sustancias de ajuste osmótico, como la prolina, y reducen la pérdida de agua intracelular, mejorando así la tolerancia a la sal24. En el presente estudio, a medida que aumenta la concentración de sal mixta, el contenido Pro de las plántulas Xinxiang 8 y Hongtianhu 101 disminuye primero y luego aumenta. Cabe destacar que la disminución no es significativa a concentraciones de 0-3 g/L y la diferencia entre las dos variedades no es significativa, alineándose con los resultados experimentales de Muchate et al25. El contenido Pro de la variedad de pimienta Hongtianhu 101 con buena tolerancia a la sal también aumenta rápidamente a concentraciones de sal de 3-15 g / L. En comparación con 3 g / L, el contenido de Pro de 15 g / L aumenta significativamente en un 440.2%, mientras que el contenido Pro de Xinxiang 8 con tolerancia general a la sal aumenta lentamente y mantiene un nivel relativamente estable a concentraciones de sal de 3-15 g / L. El efecto eliminador de las enzimas antioxidantes sobre las ROS inducido por el estrés salino ha demostrado ser el componente principal de los mecanismos de defensa de los cultivos. Se ha informado que las actividades de CAT, POD y SOD aumentan en diferentes ambientes de estrés salino, mejorando así su tolerancia a la sal25,26. Chen et al. demostraron que a medida que aumenta la concentración de NaCl, las actividades de SOD, POD y CAT en la germinación de semillas de tomate aumentan gradualmente, sin diferencias significativas en cada índice después del tratamiento con 0-50 nmol / L NaCl27. Este estudio también muestra que a medida que aumenta la concentración de sal mixta, las actividades de CAT, POD y SOD en las plántulas de Hongtianhu 101 y Xinxiang 8 disminuyen y luego aumentan. A bajas concentraciones de sal (0-3 g / L), la actividad de las enzimas antioxidantes no cambia significativamente, y un aumento adicional en la concentración de sal mejora la tolerancia a la sal.
Las características de adaptabilidad y respuesta de los cultivos al estrés salino se reflejan principalmente en la morfología, estructura, ecología fisiológica, etc. Se lleva a cabo una evaluación exhaustiva del estrés salino compuesto utilizando el método de valor de función de membresía para múltiples rasgos. Este estudio muestra que a medida que aumenta la concentración de sal mixta, el valor ponderado total del valor de la función aumenta primero y luego disminuye. Las dos variedades alcanzan un máximo de 5 g / L, lo que lleva al mejor efecto de tolerancia a la sal. En comparación con el tratamiento de 5 g/L, los valores ponderados después del tratamiento con las concentraciones de sal de 3 g/L, 10 g/L y 15 g/L disminuyen en un 4,7%, 25,3% y 41,4%, respectivamente, para Hongtianhu 101, y 11,1%, 28,3% y 45,1%, respectivamente, para Xinxiang 8. Tales hallazgos indican que la tolerancia a la sal de Hongtianhu 101 es mayor que la de Xinxiang 8.
Este estudio proporciona una descripción completa de los efectos de diferentes concentraciones de estrés salino compuesto en la germinación de semillas de pimienta y sus actividades enzimáticas fisiológicas, y una referencia técnica para la investigación sobre la tolerancia a la sal en otros cultivos. Las plántulas de pimiento se ven menos afectadas por el estrés salino bajo concentraciones de sal mixtas simuladas (0-5 g / L). La germinación de las semillas, el alargamiento de la radícula y la morfogénesis de la plántula de la pimienta se inhiben significativamente bajo un alto estrés salino (>5 g / L), causando una grave peroxidación lipídica de la membrana en las plántulas de pimiento. Los cultivos reducen los efectos adversos del estrés salino al aumentar su contenido de Pro y mejorar la actividad de las enzimas protectoras (CAT, POD y SOD). Bajo estrés salino, el contenido de prolina y la actividad enzimática protectora de las plántulas de Hongtianhu 101 son mayores, el grado de peroxidación lipídica de la membrana es menor y la germinación de las semillas y el crecimiento de las plántulas son más obvias que las de Xinxiang 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Departamento de Ciencia y Tecnología de la provincia de Jiangxi (20203BBFL63065) y el Proyecto General de Proyecto de Investigación de Ciencia y Tecnología del Departamento de Educación de Jiangxi (GJJ211430). Nos gustaría agradecer a Editage (www.editage.cn) por la edición en inglés.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium chloride | Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd.,China | Analytical reagent | |
| Centrifugal machine | Shanghai Luxianyi Centrifuge Instrument Co., Ltd., China | TGL-16M | |
| Centrifuge tube | None | None | |
| Conductivity meter | Shanghai Instrument&Electronics Science Instrument Co., Ltd., China | DDSJ-308F | |
| Constant temperature and humidity box | Ningbo Laifu Technology Co., Ltd.,China | PSX-280H | |
| Digital display vernier caliper | Deli Group Co., Ltd.,China | DL90150 | |
| Electronic balance | Mettler Toledo Instruments (Shanghai) Co., Ltd.,China | ME802E/02 | |
| Filter paper | Hangzhou Fuyang North Wood Pulp and Paper Co., Ltd.,China | GB/T1914-2017 | |
| Grinding rod | None | None | |
| Hongtianhu 101 | Seminis Seed (Beijing) Co., Ltd.,China | 11933955/100147K1-137 | |
| Ice machine | Shanghai Kehuai Instrument Co., Ltd., China | IM150G | |
| Liquid nitrogen | None | None | |
| Magnesium chloride | Tianjin Kermel Chemical Reagent Co., Ltd.,China | Analytical reagent | |
| Magnesium sulfate | Tianjin Kermel Chemical Reagent Co., Ltd.,China | Analytical reagent | |
| Petri dish | Jiangsu Yizhe Teaching Instrument Co., Ltd.,China | I-000163 | |
| Pocket knife | None | None | |
| Potassium permanganate (KMnO4 | Xilong Scientific Co.,Ltd.,China | Analytical reagent | |
| Pure water equipment | Sichuan Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd.,China | UPT-I-20T | |
| Sodium bicarbonate | Xilong Scientific Co.,Ltd.,China | Analytical reagent | |
| Sodium carbonate | Xilong Scientific Co.,Ltd.,China | Analytical reagent | |
| Sodium chloride | Xilong Scientific Co.,Ltd.,China | Analytical reagent | |
| Sodium sulfate | Xilong Scientific Co.,Ltd.,China | Analytical reagent | |
| Test kit | Suzhou Keming, Biotechnology Co., Ltd, Suzhou.,China | Spectrophotometer method | |
| Ultra-low temperature freezer | SANYO Techno Solution TottoriCo.,Ltd. | MDF-382 | |
| Ultraviolet visible spectrophotometer | Shanghai Precision Scientific Instrument Co., Ltd., China | 760CRT | |
| Xinxiang 8 | Jiangxi Nongwang High Tech Co., Ltd.,China | GPD Pepper 2017(360013) |
References
- Szabolcs, I. Soils sand salinisation. Handbook of Plant and Crop Stress. , Marcel Dekker. New York. 3-11 (1994).
- Global network on integrated soil management for sustainable use of salt effected soils. FAO. , Available from: http://www.fao.org/ag/AGL/agll/spush/intro.htm (2005).
- Lakhdar, A., et al. Effectiveness of compost use in salt-affected soil. Journal of Hazardous Materials. 171 (1-3), 29-37 (2009).
- Cheng, Z., Chen, Y., Zhang, F. Effect of cropping systems after abandoned salinized farmland reclamation on soil bacterial communities in arid northwest China. Soil and Tillage Research. 187, 204-213 (2019).
- Shrivastava, P., Kumar, R. Soil salinity: A serious environmental issue and plant growth promoting bacteria as one of the tools for its alleviation. Saudi Journal of Biological Sciences. 22 (2), 123-131 (2015).
- Fattori, V., Hohmann, M. S., Rossaneis, A. C., Pinho-Ribeiro, F. A., Verri, W. A. Capsaicin: Current understanding of its mechanisms and therapy of pain and other pre-clinical and clinical uses. Molecules. 21 (7), 844-878 (2016).
- Zhao, Z., et al. Investigation, collection and identification of pepper germplasm resources in Guangxi. Journal of Plant Genetic .Resources. 21 (4), 908-913 (2020).
- Zhang, J., et al. Biochar alleviated the salt stress of induced saline paddy soil and improved the biochemical characteristics of rice seedlings differing in salt tolerance. Soil and Tillage Research. 195, 104372-104381 (2019).
- Ashraf, M., Foolad, M. R. Pre-sowing seed treatment-A shotgun approach to improve germination, plant growth, and crop yield under saline and non-saline conditions. Advances in Agronomy. 88, 223-271 (2005).
- Esra, K. O. Ç, Üstün, A. S., İşlek, C., Arici, Y. K. Effect of exogenously applied spermine and putrescine on germination and in vitro growth of pepper (Capsicum annuum l.) seeds under salt stress. Anadolu University Journal of Science and Technology C-Life Sciences and Biotechnology. 3 (2), 63-71 (2014).
- Demir, I., Mavi, K. Effect of salt and osmotic stresses on the germination of pepper seeds of different maturation stages. Brazilian Archives of Biology and Technology. 51 (5), 897-902 (2008).
- Khan, H. A., et al. Effect of seed priming with NaCl on salinity tolerance of hot pepper (Capsicum annuum L.) at seedling stage. Soil and Environment. 28 (1), 81-87 (2009).
- Zhou, L. L. Effects of salinity stress on cotton (Gossypium hirsutum L.) root growth and cotton field soil micro-ecology. Nanjing Agricultural University. , (2010).
- Ding, D. X., et al. Exogenous zeaxanthin alleviates low temperature combined with low light induced photosynthesis inhibition and oxidative stress in pepper (Capsicum annuum L.) plants. Current Issues in Molecular Biology. 44 (6), 2453-2471 (2022).
- Liu, Z. B., Yang, B. Z., Ou, L. J., Zou, X. X. The impact of different Ca2+ spraying period on alleviating pepper injury under the waterlogging stress. Acta Horticulturae Sinica. 42 (8), 1487-1494 (2015).
- Aloui, H., Souguir, M., Latique, S., Hannachi, C. Germination and growth in control and primed seeds of pepper as affected by salt stress. Cercetări agronomice în Moldova. 47 (3), 83-95 (2014).
- Zhani, K., Elouer, M. A., Aloui, H., Hannachi, C. Selection of a salt tolerant Tunisian cultivar of chili pepper (Capsicum frutescens). EurAsian Journal of Biosciences. 6, 47-59 (2012).
- Patanè, C., Saita, A., Sortino, O. Comparative effects of salt and water stress on seed germination and early embryo growth in two cultivars of sweet sorghum. Journal of Agronomy and Crop Science. 199 (1), 30-37 (2013).
- Smith, P. T., Cobb, B. G. Accelerated germination of pepper seed by priming with salt solutions and water. Hortscience. 26 (4), 417-419 (2019).
- Mirosavljević, M., et al. Maize germination parameters and early seedlings growth under different levels of salt stress. Ratarstvo i Povrtarstvo. 50 (1), 49-53 (2013).
- Khan, H. A., et al. Hormonal priming alleviates salt stress in hot pepper (Capsicum annuum L.). Soil and Environment. 28 (2), 130-135 (2009).
- Zhang, B. B., et al. Effects of simulated salinization on seed germination and physiological characteristics of muskmelon seedlings. Chinese Journal of Tropical Crops. 41 (5), 912-920 (2020).
- Guzmán-Murillo, M. A., Ascencio, F., Larrinaga-Mayoral, J. A. Germination and ROS detoxification in bell pepper (Capsicum annuum L.) under NaCl stress and treatment with microalgae extracts. Protoplasma. 250 (1), 33-42 (2013).
- Slama, I., Abdelly, C., Bouchereau, A., Flowers, T., Savoure, A. Diversity, distribution and roles of osmoprotective compounds accumulated in halophytes under abiotic stress. Annals of Botany. 115 (3), 433-447 (2015).
- Muchate, N. S., Nikalje, G. C., Rajurkar, N. S., Suprasanna, P., Nikamd, T. D. Physiological responses of the halophyte Sesuvium portulacastrum to salt stress and their relevance for saline soil bio-reclamation. Flora. 224, 96-105 (2016).
- Javed, S. A., et al. Can different salt formulations revert the depressing effect of salinity on maize by modulating plant biochemical attributes and activating stress regulators through improved N supply. Sustainability. 13 (14), 8022-8037 (2021).
- Chen, J., et al. Effects of salt stress on form of polyamine and antioxidation in germinating tomato seed. Acta Pedologica Sinica. 58 (6), 1598-1609 (2021).
