Summary
Vi udviklede en omkostningseffektiv metode til at følge ikke-enkelt nukleotidpolymorfisme-alleldynamik, der let kan tilpasses eksperimentelle evolutionsfrosne arkiver. En triplet PCR-teknik blev kombineret med automatiseret parallel kapillærelektroforese for at kvantificere den relative frekvens af en indsættelsesallel i løbet af eksperimentel evolution.
Abstract
Strukturelle varianter (SV'er) (dvs. deletioner, indsættelser, duplikationer og inversioner) er nu kendt for at spille en vigtig rolle i fænotypisk variation og følgelig i processer som sygdomsbestemmelse eller tilpasning til et nyt miljø. Imidlertid får enkeltnukleotidvarianter meget mere opmærksomhed end SV'er, sandsynligvis fordi de er lettere at opdage, og deres fænotypiske virkninger er lettere at forudsige. Udviklingen af kort- og langlæste dybsekventeringsteknologier har i høj grad forbedret detektionen af SV'er, men kvantificeringen af deres frekvens fra pooled sequencing (poolseq) data er stadig teknisk kompleks og dyr.
Her præsenterer vi en ret simpel og billig metode, som gør det muligt for forskere at følge dynamikken i SV-allelfrekvensen. Som et eksempel på anvendelse følger vi hyppigheden af en indsættelsessekvens (IS) indsættelse i eksperimentelle evolutionspopulationer af bakterier. Denne metode er baseret på design af tripletter af primere omkring de strukturelle variantgrænser, således at amplikonerne produceret ved forstærkning af vildtypen (WT) og afledte alleler varierer i størrelse med mindst 5%, og at deres forstærkningseffektivitet er ens. Mængden af hver amplicon bestemmes derefter ved parallel kapillærelektroforese og normaliseres til en kalibreringskurve. Denne metode kan let udvides til kvantificering af hyppigheden af andre strukturelle varianter (deletioner, duplikationer og inversioner) og til pool-seq-tilgange for naturlige populationer, herunder patogenpopulationer inden for patientindlæggelsen.
Introduction
Strukturelle varianter (SV'er) er ændringer af den genomiske sekvens, der generelt påvirker 50 bp eller mere. De fire kategorier af beskrevne SV'er er store indsættelser, store sletninger, inversioner og dubletter. Indtil for nylig har der været mere opmærksomhed på enkeltnukleotidvarianter (SNV'er) end på strukturelle varianter med hensyn til deres fænotypiske virkninger og deres rolle som genetiske determinanter for sygdom eller deres bidrag til tilpasning. Dette skyldes sandsynligvis, at det er lettere både at opdage SNV'er og forudsige deres fænotypiske virkninger. Imidlertid har kort- og langlæste dybe sekventeringsteknologier kraftigt forbedret påvisningen af SV'er, i det mindste i enkeltindivider eller klonale genomer1. Parallelt hermed er deres fænotypiske virkninger blevet bedre karakteriseret, og mange eksempler på deres implikation som genetiske determinanter for menneskelig sygdom 2,3 eller tilpasning til et nyt miljø4 er blevet dokumenteret.
Deletioner og indsættelser, ofte på grund af indsættelser af mobile genetiske elementer (MGE), er meget mere forstyrrende end enkeltnukleotidpolymorfier (SNP'er) og fører til frameshift-mutationer og proteinstrukturmodifikationer. Deletioner og MGE-indsættelser i gener resulterer næsten altid i geninaktivering, og indsættelser i ikke-kodende regioner kan føre til undertrykkelse eller konstitutiv ekspression af tilstødende gener, når insertionssekvenser (IS'er) indeholder promotor- eller termineringssekvenser5. Mens knockout af essentielle gener fører til klare skadelige virkninger på bakteriel fitness, er tabet af ikke-essentielle gener gavnligt i nogle tilfælde. På trods af deres iboende omkostninger kan duplikationer også være fordelagtige og deltage i tilpasning, da de fører til en ændring i gendosering; En stigning i aktiviteten af et specifikt protein kan være fordelagtigt afhængigt af betingelserne6.
Mikrobielle eksperimentelle evolutionspopulationer startes normalt med kloner. Dette oprindelige fravær af genetisk diversitet kombineret med reagensglassenes "lukkede miljø", der er karakteristisk for reagensglas, fører til et meget begrænset udviklingspotentiale ved gengevinst gennem horisontal genoverførsel og rekombination. Under disse særlige omstændigheder er bidraget til tilpasning af deletioner, duplikationer og intragenomisk MGE-indsættelse særlig vigtigt; bakterier tilpasser sig ofte gennem tab af funktionsmutationer (hovedsageligt på grund af deletioner eller MGE-indsættelser), der påvirker gener, der ikke er nyttige i stabile, ofte næringsrige, monokultur kunstige miljøer7. I det længst kørende E . coli-evolutionseksperiment er IS150-indsættelser særligt hyppige blandt populationer udviklet efter 50.000 generationer, hvor IS-elementer repræsenterer 35% af mutationerne, der når høj frekvens i populationer, der bevarer deres forfædres punktmutationshastighed8.
Udvikle og resequence undersøgelser par eksperimentel evolution og næste generations sekventering (NGS) teknologier for at undersøge, hvordan bakterier tilpasser sig på fænotypiske og genomiske niveauer til forskellige miljøforhold og belastninger, såsom forskellige kulstof- og energikilder, antibiotika og osmotisk stress 9,10,11 . Disse undersøgelser indhenter typisk genomisk information om de udviklede populationer eller kloner udelukkende ved det eksperimentelle endepunkt og i nogle tilfælde ved et antal mellemliggende tidspunkter12,13,14. Disse data giver indsigt i gener og veje, der er involveret i tilpasningen til et givet miljø, men giver sjældent forskere mulighed for at følge dynamikken i de novo nye og fejende alleler over tid.
En tilgang til at følge disse dynamikker er at vælge et begrænset antal segregerende alleler af interesse (på grund af funktionen af de gener, de påvirker, fordi de fejer parallelt i uafhængige populationer osv.) og bruge amplicon sekventering til at kvantificere allelandelen og samle mange tidspunkter i samme sekventeringskørsel15. Denne metode er med succes blevet brugt til at følge dynamikken i små størrelsesvarianter (SNP'er eller 1 bp indels) i eksperimentelle16 og naturlige17 populationer af mikrober. I tilfælde af større indel- eller MGE-indsættelser inducerer ampliconernes størrelsesforskel imidlertid PCR-effektivitetsforskelle, hvilket forvrænger forholdet mellem læse- og allelproportioner. I visse tilfælde er størrelsesforskellen mellem de to alleler bedre end ampliconens klassiske længde. Her koblede vi en triplet PCR-teknik med automatiseret parallel kapillærelektroforese for at kvantificere den relative frekvens af en indsættelsesallel baseret på størrelsesdiskrimination. Denne tilgang gør det muligt at udnytte underudnyttede eksperimentelle tidspunkter til at bestemme dynamikken i en ny mutant allel og følge dens hyppighed til fiksering eller tab på en omkostningseffektiv måde. Vi anvendte denne metode til at spore nye mutS-alleler, muteret gennem en IS10-indsættelse, hvilket gav den muterede genotype en hypermutatorfænotype.
Denne metode kræver to målalleler med en forskel på ≥5% i størrelse. For det første er primertrillinger designet til at producere fragmenter af samme størrelse, som deler en fælles primer. For det andet optimeres PCR-forholdene, og der fremstilles en kalibreringskurve ved hjælp af blandinger af vildtype (WT) og mutant gDNA. Endelig forstærkes prøver ved PCR, og den relative frekvens af hver allel kvantificeres ved parallel kvantitativ kapillærelektroforese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opsætning af denne protokol kræver præcis viden om indsættelses-, sletnings-, inversions- eller duplikeringspunktet inden for forfædresekvensen. Disse oplysninger opnås normalt ved helgenomsekventering (WGS) af slut- eller mellempunktprøverne. I den følgende protokol er det generelle princip for tilfælde af en insertionsmutation angivet for hvert trin sammen med et repræsentativt tilfælde, hvor hyppigheden af en IS10-indsættelse i mutS-genet i en eksperimentel evolutionspopulation af E. coli følges. I denne population identificerede WGS af endepunktspopulationen indsættelsen af en IS10 på 1.329 bp mellem positionerne 2.463 og 2.471, hvilket resulterede i duplikering af dette indsættelsessted. Denne metode kan anvendes på de tre andre SV-typer, og de særlige forhold i hvert enkelt tilfælde er angivet i diskussionen.
1. Design af tripletprimere
- Brug klassisk primerdesignpraksis (18-24 bp, 40% -60% GC-indhold, start / slut med G / C-par, hvor det er muligt,Tm-forskel < 5 ° C) til fremstilling af primere FW1 og RV1. Design primere til at forstærke en kort amplicon på WT-allelen omkring det mutante allelindsættelsessted (figur 1).
BEMÆRK: Amplicon størrelsen kan variere fra 100 bp til op til 3.000 bp, i overensstemmelse med DNA-størrelsesstigen, der anvendes i kapillærelektroforesen. I dette eksempel blev en 155 bp amplicon forstærket. Den lille fragmentstørrelse, der er valgt her, forhindrer forstærkning uden for målet af hele IS10-indsættelsessekvensen (se afsnit 2). - Design en anden fremadgående primer FW2 inden for indsættelsessekvensen for at producere en anden amplicon, der er ca. 5% større eller mindre end WT-amplikon (figur 1). Denne størrelsesforskel på 5% er den mindste størrelsesforskel, som den parallelle kapillærelektroforeseanordning pålideligt kunne skelne. Design derfor primerne således, at de to amplicons har en forskel i størrelse, som er over, men så tæt som muligt på den relative tærskel.
BEMÆRK: Sørg for atminimere Tm-forskellen og dannelsen af primerdimer. I dette eksempel blev en anden fremadgående primer designet til at producere en 226 bp amplicon, 71 bp større end WT amplicon. I dette repræsentative eksempel er primersekvenserne som følger:
FW1:AAAGCATTTCGCCGAACGCC
RV1: GCGATAAATCCACTCCAGCGCC
FW2: AGTTCGCTTAGGCATGGAAG
Figur 1: Skema over tripletprimerdesign på mutS WT-gen og mutant mutS IS10-indsættelse. Den sorte trekant repræsenterer IS10-indsættelsesstedet i mutS-genet. WT-genet er i blåt, og IS10 er i orange. Primere FW1 og RV1 markerer IS10-indsættelsesstedet og producerer en 155 bp WT-amplicon. RV1-primeren og intra-IS10-primeren FW2 producerer en anden 226 bp amplicon. Klik her for at se en større version af denne figur.
2. Optimering af PCR-forhold
- Dyrk en natlig kultur af faste WT- og mutante allelkloner.
- Uddrag DNA'et ved hjælp af et hvilket som helst sæt.
- Kvantificer DNA'et.
- Forbered DNA-prøven ved at fortynde ekstraktionen af WT og mutant DNA til 5 ng/μL. De to DNA-prøver blandes i forholdet 50/50.
- 10 ng af de tre DNA-prøver (WT, mutant, 50/50 mix) amplificeres ved hjælp af en 2x brugsklar PCR-masterblanding, 0,5 μM FW1-primer, 1 μM RV1-primer og 0,5 μM FW2-primer i et 20 μL reaktionsvolumen. Brug en 2% agarosegel til at migrere PCR-produktet ved klassisk elektroforese og bestemme de optimale PCR-betingelser.
BEMÆRK: Forlængelsestider bør minimeres for at forhindre dannelse af FW1 og RV1 amplicon på den mutante allel. Udglødningstemperaturen bør justeres for at minimere forspændt forstærkning af allelerne og ikke-specifik forstærkning.- For at følge programmet i dette eksempel skal du bruge følgende indstillinger: 98 °C i 10 sekunder efterfulgt af 25 cyklusser med 98 °C i 1 s, 58 °C i 15 sekunder, 72 °C i 8 sekunder og et sidste forlængelsestrin ved 72 °C i 1 min.
BEMÆRK: Forlængelsestiden blev reduceret til 8 s for at forhindre forstærkning af >1.000 bp-produktet fra den fremadgående primer og RV1-primeren på den mutante allel (mutS med IS10-indsættelse).
- For at følge programmet i dette eksempel skal du bruge følgende indstillinger: 98 °C i 10 sekunder efterfulgt af 25 cyklusser med 98 °C i 1 s, 58 °C i 15 sekunder, 72 °C i 8 sekunder og et sidste forlængelsestrin ved 72 °C i 1 min.
3. Kalibreringskurve
- Bland de to DNA-prøver, WT og mutant, i forholdet 10/90, 25/75, 40/60, 50/50, 60/40, 75/25 og 90/10.
BEMÆRK: Biologiske replikater fremstilles fra uafhængige bakteriekulturer natten over. - Forstærk ved hjælp af optimerede PCR-forhold (se afsnit 2).
- Kvantificer amplicon produktet.
- PCR-produkterne fortyndes til 0,1 ng/μL.
- Forbered det parallelle kapillærelektroforeseinstrument.
- Bland frisk gel og farvestof (NGS kvantitativt analysesæt (22, 33 eller 55); HS NGS-fragment 1-6.000 bp i dette eksempel).
BEMÆRK: Se den parallelle kapillærelektroforese HS NGS-fragmentvejledning for detaljerede instruktioner (se materialetabellen).
- Bland frisk gel og farvestof (NGS kvantitativt analysesæt (22, 33 eller 55); HS NGS-fragment 1-6.000 bp i dette eksempel).
- Udskift kapillæropbevaringsopløsningen og indløbsbufferen, og anbring skyllebufferpladen på de korrekte skuffeplaceringer af det parallelle kapillærelektroforeseinstrument.
- Der tilsættes 2 μL HS-fortyndingsmarkør til 22 μL af hver fortyndet prøve i en plade med 96 huller.
- Tilføj en størrelsesstige (DNA-størrelsesstige; rækkevidde 1-6.000 bp) fra et HS NGS kvantitativt analysesæt til en brønd på 96-brøndpladen.
- Placer 96-brøndspladen i den korrekte skuffe på instrumentet til parallel kapillærelektroforese, og vælg Kør på instrumentsoftwaren til parallel kapillærelektroforese.
- Analyser resultaterne ved hjælp af dataanalysesoftwaren, som registrerer og identificerer hver top på størrelsesstigen og tildeler hver top af prøverne til deres kendte faktiske størrelse.
- Når du bruger et kvantitativt sæt, skal du bruge softwaren til at bestemme DNA-mængden af hvert fragment ved at integrere området under toppen, som i kromatografidataanalyse. Igen skal du sammenligne prøver med kendte mængder i standarder for at kvantificere hver top fra en prøve og beregne forholdet mellem de forskellige toppe, der er påvist i prøverne.
- Der konstrueres en kalibreringskurve (figur 2), der forbinder den kendte andel af den mutante allel (DNA-blanding) med den, der måles ved hjælp af instrumentet til parallel kapillærelektroforese. Denne kalibreringskurve gør det muligt at evaluere og korrigere metodens pålidelighed for mindre amplifikationsbias.
4. Forberedelse af prøver
- Dyrk tidspunktprøver natten over under standardforhold.
- Uddrag DNA'et.
- Kvantificer DNA'et.
- Forstærk prøverne ved hjælp af optimerede PCR-betingelser (se afsnit 2).
- Prøverne køres i instrumentet til parallel kapillærelektroforese (se trin 3.5-3.10).
5. Kvantificering af allel
- Udtræk mutante allelmængder fra instrumentdataene for parallel kapillær elektroforese med softwaren, og beregn de faktiske proportioner ved at plotte disse værdier på kalibreringskurven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af DNA ekstraheret fra en forfædres klon og en hypermutatorklon isoleret fra S2.11-populationen ved generation 1.000 etablerede vi kalibreringskurven vist i figur 2. De faktiske mutantproportioner fra laboratoriefremstillede DNA-blandinger og målt med det parallelle kapillærelektroforeseinstrument var forbundet med et lineært forhold med hældning 1,0706 med enR2 på 0,9705. Derudover var der en god overensstemmelse mellem biologiske replikater; Standardafvigelsen var mellem 0,61 og 17,74 på tværs af standardkurvens ni punkter.
Figur 2: Standardkurve for kalibrering. Observeret versus forventet andel af WT/mutant DNA-blanding. Fejlbjælker repræsenterer standardfejlen mellem biologiske replikater. Klik her for at se en større version af denne figur.
DNA blev ekstraheret fra 19 tidspunkter fra generation 356 til generation 990, amplificeret og kvantificeret ved parallel kapillærelektroforese. Prosize-software blev brugt til at identificere og kvantificere hver amplicon i hver prøve. Disse resultater blev konverteret til allelandel ved hjælp af kalibreringskurven.
Resultaterne vist i figur 3 afslører en ikke-monoton bane af den hypermutatorinducerende mutS-allel . Generation 680 (dag 102) var det første tidspunkt, hvor den mutante allel var i tilstrækkelig mængde til at blive detekteret ved parallel kapillærelektroforese. Den mutante allel steg derefter hurtigt i frekvens og nåede 66,7% ved generation 713 (33 generationer senere). Den mutante allelfrekvens stagnerede derefter og var 76% ved generation 766, på trods af at den tidligere var steget hurtigt i frekvens. Uventet reducerede den mutante allelfrekvens derefter fra 76% til 49% i løbet af 13 generationer (2 dage), hvorefter den steg til fiksering.
Figur 3: Dynamik af forfædres (WT) og afledte (mutS::IS10) alleler i løbet af en 1.000-generations eksperimentel evolution. Den forfædre allelfrekvens er i grå, og den afledte allelfrekvens er i blå. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Primerdesign og amplikon position til kvantificering af de fire typer strukturelle varianter. Forstærkede fragmenter er afbildet i sort / hvid. Pile repræsenterer primere på deres hybridiseringssted; Stiplede pile repræsenterer primere, der hybridiserer, men ikke deltager i nogen fragmentforstærkning, enten fordi der ikke er nogen parret primer (duplikering og inversion), eller forlængelsestiden er blevet reduceret for at undgå forstærkning af store amplicons (indsættelse og sletning). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her har vi foreslået en omkostningseffektiv metode, der gør det muligt at følge dynamikken i nye adaptive SV-alleler i eksperimentelle evolutionspopulationer. Denne metode kombinerer klassiske PCR-teknikker og automatiseret parallel kapillærelektroforese, hvilket gør det muligt at bestemme de relative mængder af to alleler. Når den er oprettet, tillader den kvantificering af allelproportioner i mange prøver parallelt og er meget billigere end WGS. Denne metode kan ses som en ækvivalent til amplicon sekventering for ikke-SNP mutationer og som en løsning på de tekniske begrænsninger af amplicon sekventering af store SV'er. Vi har vist, at metoden nøjagtigt kvantificerer andelen af ikke-SNP-mutanter ved hjælp af en kalibreringskurve, der overvinder PCR-bias (figur 2).
Karakterisering af SV-alleldynamik kan være nyttig til at identificere sammenkædede mutationer gennem deres parallelle tidsmæssige dynamik eller til at beregne selektionskoefficienter og identificere deres variationer over tid. I eksemplet på anvendelse, vi har præsenteret her, identificerede vi ved endepunkt WGS, at hypermutatorer adskilte eller fikserede i forskellige eksperimentelle evolution E. coli-populationer18. Disse populationer blev betragtet som hypermutatorer, da de havde forstyrrende mutationer (IS-indsættelse) i et af methylmismatchreparationsgenerne (MMR) og havde akkumuleret mange flere mutationer i løbet af de 1.000 generationer af eksperimentel evolution end dem, der ikke bærer mutationer i MFR-generne (24,38 ± 1,75 vs. 126,7 ± 19,57). Mutationer i MFR-gener er kendt for at føre til en øget mutationshastighed, hvilket gør det muligt for bakterier at prøve mange flere mutationer, end deres baseline-mutationshastigheder tillader12,13. Imidlertid betyder en stor stigning i mutationshastigheden også en hurtigere akkumulering af skadelige mutationer og en større mutationsbelastning14,15. Mutorer er blevet forudsagt at være forbigående fordelagtige i populationer, der tilpasser sig nye miljøer, da andelen af gavnlige mutationer er større i denne situation. De gavnlige genetiske baggrunde, der genereres under høj mutationshastighed, gør det muligt for mutatorer at formere sig gennem en befolkning ved at blaffe på de gavnlige mutationer, de genererer19. Temporal dynamik af hypermutatorudbredelse er blevet undersøgt ved simuleringer, og med den metode, vi foreslår her, er det muligt at følge dynamikken i IS-medierede mutatoralleler i eksperimentelle populationer19.
I vores repræsentative resultater er SV en IS-indsættelse, men metoden beskrevet her kan let udvides til de andre typer SV (se figur 4). Trillingeprimerdesignet følger nøjagtig den samme logik for deletionskvantificering som for indsættelseskvantificering: to primere sidder omkring deletionspunktet, og den tredje primer sidder inden for den slettede sekvens. For inversioner og duplikationer sidder to af primerne omkring et af brudpunkterne, og det tredje sidder inde i det omvendte / duplikerede fragment, tæt på det andet brudpunkt og rettet mod ydersiden af fragmentet. For indsættelser, sletninger og inversioner er hver amplicon specifik for en af allelerne, forfædre eller afledte. For duplikationer er en af amplicons fælles for de to alleler, og den anden er specifik for den afledte allel. Dette skal tages i betragtning ved beregning af andelen af alleler fra kalibreringskurven.
Endelig har vi udviklet denne metode til at følge en SV i eksperimentelle evolutionspopulationer af bakterier, hvor "metagenomisk" sekventering på populationsniveau er almindelig praksis. Denne metode kan imidlertid også anvendes på eksperimentelle evolutionspopulationer af flercellede organismer i en pool-seq-tilgang eller til intra-host viral eller mikrobiel patogenprøveudtagning17.
Denne metode har nogle begrænsninger. For det første skal allelerne, der sammenlignes, variere i størrelse med mindst 5%. Dette forhindrer os i at følge dynamikken i alleler produceret af meget små indsættelser eller sletninger. Heldigvis kan disse alleldynamikker efterfølges af amplicon sekventering. For det andet skal sekvensen af den afledte allel være kendt for at muliggøre udformningen af primerne omkring indsættelsen eller deletion eller brudpunkterne. For det tredje er primerdesign og optimering nødvendig for hvert websted. Denne metode er således egnet til at følge et begrænset antal målallelpar af interesse. Hvis mange alleler skal følges i samme population, foreslår vi NGS med flere tidspunkter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af ERC HGTCODONUSE (ERC-2015-CoG-682819) til S.B. Data, der blev brugt i dette arbejde, blev (delvist) produceret gennem GenSeq-tekniske faciliteter ved Institut des Sciences de l'Evolution de Montpellier med støtte fra LabEx CeMEB, et ANR "Investissements d'avenir" -program (ANR-10-LABX-04-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well Skirted PCR Plate | 4titude | 4Ti - 0740 | PCR |
| Agarose molecular biology grade | Eurogentec | EP-0010-05 | Agarose gel electrophoresis |
| Agilent DNF-474 HS NGS Fragment Kit Quick Guide for the Fragment Analyzer Systems | Agilent | PDF instruction guide | |
| Buffer TBE | Panreac appliChem | A4228,5000Pc | Agarose gel electrophoresis |
| Calibrated Disposable Inoculating Loops and Needles | LABELIANS | 8175CSR40H | Bacterial culture |
| Dneasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69506 | DNA extraction |
| Electrophoresis power supply | Amilabo | ST606T | Agarose gel electrophoresis |
| Fragment Analyzer Automated CE System | Agilent | Parallel capillary electrophoresis | |
| Fragment DNA Ladder | Agilent | DNF-396, range 1-6000bp | Parallel capillary electrophoresis |
| GENTAMICIN SULFATE SALT BIOREAGENT | Sigma-Aldrich | G1264-1G | Bacterial culture |
| High Sensitivity diluent marker | Agilent | DNF-373 | Parallel capillary electrophoresis |
| High Sensitivity NGS quantitative analysis kit | Agilent | DNF-474 | Parallel capillary electrophoresis |
| Ladder quick load 1 kb plus DNA ladder | NEB | N0469S | Agarose gel electrophoresis |
| LB Broth, VegitoneNutriSelect Plus | Millipore | 28713 | Bacterial culture |
| Master Mix PCR High Fidelity Phusion Flash | Thermo Fisher Scientific | F548L | PCR |
| Primers | Eurogentec | PCR | |
| Prosize data analysis software v.4 | Agilent | V.4 | Parallel capillary electrophoresis |
| Qubit assays | Invitrogen | MAN0010876 | DNA quantification |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | LIFE TECHNOLOGIES SAS | Q32854 | DNA quantification |
| Thermocycler | Eppendorf | Ep gradients | PCR |
| UVbox, eBOX VX5 | Vilber Lourmat | Agarose gel electrophoresis visualisation | |
| Water for injectable preparation | Aguettant | PROAMP | PCR |
References
- Mahmoud, M., et al. Structural variant calling: the long and the short of it. Genome Biology. 20 (1), 246 (2019).
- Bragg, D. C., et al. Disease onset in X-linked dystonia-parkinsonism correlates with expansion of a hexameric repeat within an SVA retrotransposon in TAF1. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (51), 11020-11028 (2017).
- Stransky, N., Cerami, E., Schalm, S., Kim, J. L., Lengauer, C. The landscape of kinase fusions in cancer. Nature Communications. 5, 4846 (2014).
- Tenaillon, O., et al. The molecular diversity of adaptive convergence. Science. 335 (6067), 457-461 (2012).
- Vandecraen, J., Chandler, M., Aertsen, A., Van Houdt, R. The impact of insertion sequences on bacterial genome plasticity and adaptability. Critical Reviews in Microbiology. 43 (6), 709-730 (2017).
- Andersson, D. I., Gene Hughes, D. amplification and adaptive evolution in bacteria. Annual Review of Genetics. 43, 167-195 (2009).
- Bailey, S. F., Bataillon, T. Can the experimental evolution programme help us elucidate the genetic basis of adaptation in nature. Molecular Ecology. 25 (1), 203-218 (2016).
- Consuegra, J., et al. Insertion-sequence-mediated mutations both promote and constrain evolvability during a long-term experiment with bacteria. Nature Communications. 12 (1), 980 (2021).
- Burch, C. L., Romanchuk, A., Kelly, M., Wu, Y., Jones, C. D. Genome-wide determination of barriers to horizontal gene transfer. bioRxiv. , (2022).
- Slomka, S., et al. Experimental evolution of Bacillus subtilis reveals the evolutionary dynamics of horizontal gene transfer and suggests adaptive and neutral effects. Genetics. 216 (2), 543-558 (2020).
- Choudhury, D., Saini, S. Evolution of Escherichia coli in different carbon environments for 2,000 generations. Journal of Evolutionary Biology. 32 (12), 1331-1341 (2019).
- Tenaillon, O., et al. Tempo and mode of genome evolution in a 50,000-generation experiment. Nature. 536 (7615), 165-170 (2016).
- Behringer, M. G., et al. Escherichiacoli cultures maintain stable subpopulation structure during long-term evolution. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (20), 4642-4650 (2018).
- Voordeckers, K., et al. Adaptation to high ethanol reveals complex evolutionary pathways. PLoS Genetics. 11 (11), 1005635 (2015).
- Levy, S. F., et al. Quantitative evolutionary dynamics using high-resolution lineage tracking. Nature. 519 (7542), 181-186 (2015).
- Bruger, E. L., Marx, C. J. A decade of genome sequencing has revolutionized studies of experimental evolution. Current Opinion in Microbiology. 45, 149-155 (2018).
- Grubaugh, N. D., et al. An amplicon-based sequencing framework for accurately measuring intrahost virus diversity using PrimalSeq and iVar. Genome Biology. 20 (1), 8 (2019).
- Bedhomme, S., et al. Evolutionary changes after translational challenges imposed by horizontal gene transfer. Genome Biology and Evolution. 11 (3), 814-831 (2019).
- Tenaillon, O., Toupance, B., Le Nagard, H., Taddei, F., Godelle, B. Mutators, population size, adaptive landscape and the adaptation of asexual populations of bacteria. Genetics. 152 (2), 485-493 (1999).
