Summary
No presente estudo, o dextrano marcado com fluoresceína-isotiocianato (FITC) é administrado a camundongos via gavagem oral para avaliar a permeabilidade intestinal tanto in vivo quanto em amostras plasmáticas e fecais. Como a função de barreira intestinal é afetada em muitos processos de doenças, este ensaio direto e quantitativo pode ser usado em diversas áreas de pesquisa.
Abstract
A integridade da barreira intestinal é uma característica da saúde intestinal. Embora a integridade da barreira intestinal possa ser avaliada usando marcadores indiretos, como a medição de marcadores inflamatórios plasmáticos e a translocação bacteriana para o baço e os gânglios linfáticos, o padrão-ouro quantifica diretamente a capacidade das moléculas selecionadas de atravessar a camada mucosa intestinal em direção à circulação sistêmica. Este artigo usa uma técnica não invasiva, econômica e de baixa carga para quantificar e acompanhar em tempo real a permeabilidade intestinal em camundongos usando dextrano marcado com fluoresceína-isotiocianato (FITC-dextrano). Antes da suplementação oral com FITC-dextrano, os ratos estão em jejum. Eles são então gavagados com FITC-dextran diluído em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Uma hora após a gavagem, os camundongos são submetidos à anestesia geral com isoflurano, e a fluorescência in vivo é visualizada em uma câmara de imagem. Esta técnica tem como objetivo avaliar a fluorescência residual na cavidade abdominal e a captação hepática, o que é sugestivo de migração portal da sonda fluorescente. Amostras de sangue e fezes são coletadas 4 h após a gavagem oral, e os ratos são sacrificados. Amostras de plasma e fezes diluídas em PBS são então chapeadas e a fluorescência é registrada. A concentração de FITC-dextran é então calculada usando uma curva padrão. Em pesquisas anteriores, imagens in vivo mostraram que a fluorescência se espalha rapidamente para o fígado em camundongos com uma barreira intestinal mais fraca induzida por uma dieta pobre em fibras, enquanto em camundongos suplementados com fibras para fortalecer a barreira intestinal, o sinal fluorescente é retido principalmente no trato gastrointestinal. Além disso, neste estudo, os ratos de controle tiveram fluorescência plasmática elevada e fluorescência reduzida nas fezes, enquanto inversamente, os ratos suplementados com inulina apresentaram níveis mais altos de sinais de fluorescência no intestino e baixos níveis no plasma. Em resumo, este protocolo fornece medidas qualitativas e quantitativas da permeabilidade intestinal como marcador para a saúde intestinal.
Introduction
A barreira intestinal desempenha um papel importante na saúde e na doença. Requer um equilíbrio complexo entre permitir que os nutrientes necessários permeiem a circulação a partir do lúmen intestinal e, ao mesmo tempo, impedir a penetração de moléculas pró-inflamatórias, como patógenos ou antígenos1. O aumento da permeabilidade pode ser causado por muitos distúrbios gastrointestinais, como doença hepática ou doenças inflamatórias intestinais (DIIs)2,3. Por exemplo, na colite ulcerativa (RCU), uma DII, a inflamação crônica leva à quebra de junções apertadas, à subsequente ruptura da barreira intestinal e à translocação de bactérias, potencialmente perpetuando a inflamação mucosa e sistêmica4.
A integridade da barreira intestinal é, portanto, um importante marcador da saúde intestinal. No entanto, os métodos atuais para a medição da permeabilidade intestinal têm muitas limitações. Por exemplo, métodos que medem marcadores inflamatórios plasmáticos ou translocação bacteriana para o baço e linfonodos são indiretos 5,6. Outros métodos podem ser invasivos e demorados. Este artigo descreve um ensaio não invasivo e custo-efetivo que mede direta e quantitativamente a permeabilidade intestinal. Este ensaio usa dextrano marcado com fluoresceína-isotiocianato (FITC-dextrano) para acompanhar a permeabilidade intestinal em tempo real, medindo a fluorescência in vivo. Além disso, a mensuração dos níveis de FITC-dextrano no plasma e nas fezes quantifica a permeabilidade intestinal (Figura 1).
O ensaio de permeabilidade FITC-dextran tem sido usado anteriormente em muitos contextos diferentes, inclusive em modelos animais da doença de Parkinson7, sepse8, acidente vascular cerebral isquêmico9 e lesão por queimadura10. Além disso, este ensaio tem sido usado recentemente para ajudar na compreensão de como o microbioma intestinal pode estar implicado em diferentes processos de doença e como ele pode ser direcionado ou manipulado como uma terapêutica potencial. Por exemplo, tem sido usado para estudar o microbioma e a terapêutica baseada no microbioma no envelhecimento 11, DIIs12, câncer colorretal 13 e transtorno do espectro do autismo11. Como a função de barreira intestinal está implicada em vários aspectos da saúde e da doença, este ensaio tem sido amplamente utilizado. Sua relativa simplicidade e baixa carga de tempo o tornam ideal para testar as condições in vivo suspeitas de alterar a integridade da barreira intestinal. Seus resultados quantitativos são úteis para determinar a eficácia de um tratamento potencial.
Neste estudo, o efeito da dieta sobre a função da barreira intestinal foi avaliado usando o ensaio FITC-dextran. A permeabilidade intestinal de camundongos que receberam uma dieta de controle e a permeabilidade intestinal de camundongos que receberam uma dieta suplementada com inulina foram comparadas. A inulina é um oligossacarídeo benéfico que demonstrou melhorar a função da barreira intestinal12,13. Para medições de fluorescência in vivo (fundo), um camundongo adicional não tratado foi usado como controle negativo e recebeu PBS em vez de FITC-dextrano. Este experimento demonstra que o ensaio FITC-dextran é uma ferramenta valiosa para avaliar a permeabilidade intestinal.
Protocol
Todos os procedimentos foram realizados seguindo as diretrizes do Canadian Council on Animal Care após aprovação pelo Comitê Institucional de Cuidados com Animais do CRCHUM. Camundongos fêmeas BALB/c de oito semanas de idade, obtidos de fonte comercial (ver Tabela de Materiais), foram utilizados para o presente estudo. Os animais receberam suplementação dietética com 10% de inulina em peso/peso por 2 semanas. Um grupo de controle recebeu uma dieta semelhante sem o suplemento de inulina. Os ratos tiveram acesso ad libitum à dieta. Uma visão geral do ensaio é mostrada na Figura 1.
Figura 1: Esquema do ensaio FITC-dextran. T−4- 4 h antes da gavagem, o acesso aos alimentos foi removido. T0- FITC-dextran foi administrado por gavagem oral. T1 - 1 h após a gavagem, a fluorescência in vivo foi avaliada. T4- 4 h após a gavagem, as amostras fecais e plasmáticas foram coletadas e a fluorescência foi medida. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
1. Administração de FITC-dextran
- Antes de administrar FITC-dextrano, jejue os ratos por 4 h, mantendo o acesso ad libitum à água.
NOTA: O jejum deve ser iniciado preferencialmente no início do ciclo de luz (de manhã). Os ratos podem ser transferidos para uma nova gaiola sem cama durante o jejum para limitar a coprofagia. - Preparar 200 μL de 80 mg·mL−1 4 kDa FITC-dextran (ver Tabela de Materiais) diluídos em solução salina estéril 1x tamponada com fosfato (PBS) (por rato). Prepare as amostras imediatamente antes da administração e mantenha-as protegidas da luz.
- Administrar 200 μL da suspensão FITC-dextran por gavagem oral a cada rato, utilizando uma agulha de gavagem curva esterilizada de 38 mm 22 G com uma ponta em forma de bola ou pera (ver Tabela de Materiais). Inicie um temporizador após a primeira gavagem e aguarde 5-10 min antes de gavagar o próximo rato para permitir medições in vivo (passo 2), mantendo sempre 1 h de gavagem pós-gavagem. Mantenha a suspensão FITC-dextran restante para a curva padrão.
NOTA: Imediatamente após a gavagem, os alimentos podem ser substituídos para garantir a formação de fezes.
2. Medição de fluorescência in vivo
- Anestesiar os camundongos 1 h após a gavagem usando isoflurano a 2,5% ou um anestésico alternativo. Confirme se o animal está devidamente anestesiado, beliscando o dedo do pé ou a cauda e garantindo que o animal não reage.
- Remova a pele da área abdominal usando um barbeador elétrico e aplique generosamente pomada lubrificante oftálmica nos olhos para evitar a secagem. Em seguida, coloque os ratos individualmente na câmara de imagem deitados dorsalmente.
NOTA: Deve ser incluído um rato de controlo que receba PBS ou solução salina em vez de FITC-dextran para ter em conta o fundo durante a imagiologia in vivo.
- Remova a pele da área abdominal usando um barbeador elétrico e aplique generosamente pomada lubrificante oftálmica nos olhos para evitar a secagem. Em seguida, coloque os ratos individualmente na câmara de imagem deitados dorsalmente.
- Fotografe os ratos usando uma câmara de imagem de fluorescência (consulte Tabela de materiais). Adquirir imagens da região abdominal, definindo o comprimento do laser em 470 nm e a resolução em 2,0 mm.
- Inicie a máquina e o software clicando e segurando o botão Iniciar . Deixe o sistema aquecer.
NOTA: O sistema pode precisar de 20 minutos ou mais para aquecer, por isso a máquina deve ser iniciada cedo para não interferir com a imagem dos ratos em 1 h após a gavagem. - Clique em Status do dispositivo e verifique se todos os dispositivos configurados mostram "OK" antes de prosseguir.
- Se necessário, aqueça o laser apropriado clicando em Controle de laser e, em seguida, clicando no botão Nome do laser do laser desejado.
- Inicie um novo estudo clicando em Novo estudo. Salve sob o arquivo apropriado com o nome desejado.
- Clique em Opções de estudo, insira o ID da amostra e escolha o laser e o experimento corretos.
- Abra a câmara de imagem e coloque o animal dorsalmente na placa de varredura. Prenda os membros e a cauda com fita adesiva e certifique-se de que o nariz e a boca se encaixem confortavelmente no tubo de anestesia, mantendo 2,5% de isoflurano.
- Ajuste a altura da placa de varredura para que a região de varredura fique ligeiramente ventral em relação à linha média do animal. Ajuste a placa girando o botão de ajuste dentro da câmara de imagem. Feche e tranque a porta da câmara de imagem.
- Selecione a área a ser digitalizada usando a ferramenta Desenhar . Inclua toda a largura do abdômen, desde logo acima do fígado até o reto. Clique na ferramenta Modificar para ajustar a área uma vez desenhada.
- Defina a resolução de digitalização para 2,0 mm e, em seguida, clique em Avançar. Quando a automação de energia estiver concluída, verifique se as configurações estão corretas e faça os ajustes necessários. Clique em Iniciar para iniciar a verificação.
- Quando a varredura estiver completa, remova o animal da câmara de imagem e coloque-o em uma incubadora para manter a temperatura corporal enquanto se recupera da anestesia.
- Clique em Continuar o estudo para manter as configurações e, em seguida, repita as etapas 2.2.5-2.2.10 até que todos os mouses tenham sido escaneados.
- Clique no botão liga/desliga e segure-o por 3 s para desligar a câmara de imagem.
- Inicie a máquina e o software clicando e segurando o botão Iniciar . Deixe o sistema aquecer.
- Avaliar a fluorescência comparando a fluorescência abdominal de cada animal e do rato controle em imagens uniformemente dimensionadas usando um software associado ao sistema de imagem utilizado (ver Tabela de Materiais).
- Abra os arquivos de imagem localizando-os sob o nome de arquivo escolhido. Abra todos os arquivos que sincronizaram as configurações ao mesmo tempo.
- Usando a barra de ferramentas de configurações de imagem, use os botões Sincronizar imagem e Sincronizar escala para sincronizar as configurações das imagens, permitindo uma comparação precisa.
- Salve as imagens com suas escalas ajustadas.
3. Medição de fluorescência em amostras fecais e plasma
- Recolher um pellet fecal de cada rato num tubo estéril 4 h após a gavagem. Mantenha os tubos no escuro no gelo.
- Anestesiar os ratinhos através de injeção intraperitoneal de 240 mg/ml de pentobarbital sódico (diluição, 1:100; ver Tabela de Materiais). Administrar na dose de 0,03 ml/g de peso corporal.
- Recolher amostras de sangue de, pelo menos, 700 μL num tubo concebido para recolha de plasma contendo heparina ou EDTA para evitar a coagulação (ver Tabela de Materiais), inserindo um tubo capilar de vidro no plexo retroorbital14.
NOTA: Métodos alternativos para a coleta de sangue incluem punção cardíaca ou retirada da veia da cauda. Como este é um procedimento terminal, os ratos precisam ser sacrificados por luxação cervical ou um método humano alternativo. Siga as recomendações do comitê de ética animal local para a eutanásia.
- Recolher amostras de sangue de, pelo menos, 700 μL num tubo concebido para recolha de plasma contendo heparina ou EDTA para evitar a coagulação (ver Tabela de Materiais), inserindo um tubo capilar de vidro no plexo retroorbital14.
- Centrifugar as amostras de sangue a 9.390 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente. Transfira o plasma para um novo tubo estéril e mantenha-o no escuro no gelo.
- Diluir 50 mg de amostras fecais em 200 μL de 1x PBS e diluir o plasma 1:2 com 1x PBS. A razão de diluição pode ser modificada com base na intensidade do sinal de fluorescência.
- Gere uma curva padrão usando diluições seriais de FITC-dextran em 1x PBS. Começando com a maior concentração de 20 mg·mL−1 de dextrana FITC, diluído por um fator de 1:1 em série 7-10 vezes.
NOTA: As concentrações, portanto, devem ser de 20 mg·mL−1, 10 mg·mL−1, 5 mg·mL−1, 2,5 mg·mL−1, 1,25 mg·mL−1, 0,625 mg·mL−1, 0,3125 mg·mL−1, etc. - Amostras de placa de 100 μL e padrões em uma placa preta opaca de 96 poços. Inclua um PBS em branco. Ler a fluorescência num leitor de placas fluorescentes (ver Tabela de Materiais) com a absorção a 530 nm e a excitação a 485 nm.
NOTA: As amostras e os padrões podem ser banhados em duplicado ou triplicado e, em seguida, seus valores de fluorescência são calculados em média. - Determinar a concentração de FITC-dextran por amostra comparando a fluorescência com as concentrações conhecidas da curva padrão. Nas amostras, multiplicar a concentração pelo factor de diluição (passo 3.5).
Representative Results
A análise da fluorescência in vivo mostrou que os camundongos que receberam apenas a dieta controle apresentaram maior ingestão hepática de FITC-dextran e maiores níveis de fluorescência residual na cavidade abdominal em comparação com os camundongos que receberam a dieta suplementada com inulina (Figura 2A). Alguma fluorescência foi visível no ceco dos ratos que receberam a dieta de inulina, mas houve pouca ou nenhuma ingestão hepática, indicando que essas dietas protegiam contra o aumento da permeabilidade intestinal.
Os níveis de fluorescência em amostras de plasma e fezes trabalham para reforçar e quantificar suas contrapartes in vivo. Os ratos que receberam a dieta suplementada com inulina apresentaram níveis significativamente mais baixos de FITC-dextran em seu plasma em comparação com os ratos que receberam apenas a dieta controle (Figura 2B). Isso indica que eles melhoraram a função da barreira intestinal porque menos FITC-dextran poderia permear a barreira intestinal na circulação. Concordantemente, os camundongos que receberam a dieta de inulina apresentaram níveis significativamente mais elevados de FITC-dextran em suas fezes do que os camundongos que receberam apenas a dieta controle (Figura 2C). Isso reforça que eles tinham função de barreira intestinal intacta, pois o FITC-dextran permaneceu no cólon até a excreção, como é considerado normal. Os níveis mais baixos de FITC-dextran nas fezes dos ratos controle indicam que ele permeou através da barreira intestinal para a circulação, em vez de ser excretado adequadamente. Os altos níveis de FITC-dextran no plasma reforçam esse achado.
Figura 2: A suplementação dietética com inulina diminui a translocação de FITC-dextran através da barreira intestinal . (A) A fluorescência residual e a captação hepática de FITC-dextrano. Vermelho = maior intensidade; roxo escuro = menor intensidade. Fluorescência máxima de 2,15 x 103, fluorescência mínima de 0,378. (B) A concentração plasmática de FITC-dextrano. P = 0,010. (C) A concentração fecal de FITC-dextrano. P = 0,00003. N = 4 por grupo. Os dados são representados como média ± EPM. Cada ponto representa um mouse. Teste t de Student não pareado. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
A função de barreira intestinal é parte integrante de muitos processos de doenças diferentes. Assim, avaliar a permeabilidade intestinal de forma não invasiva, custo-efetiva e quantificável é essencial para representar com precisão essas doenças em modelos animais. O ensaio FITC-dextran oferece a possibilidade para essa representação. No entanto, esse protocolo envolve várias etapas críticas que devem ser concluídas com precisão para obter resultados confiáveis. Em primeiro lugar, é essencial assegurar a utilização de FITC-dextran de dimensões adequadas. Para examinar a permeabilidade in vivo , 4 kDa FITC-dextran é o peso molecular ideal e, à medida que o peso molecular aumenta, a permeabilidade diminui15. Assim, o uso de FITC-dextran de um peso molecular diferente pode fornecer resultados confusos ou não confiáveis. Além disso, é importante observar o tempo de cada gavagem e ajustar os pontos de tempo para a coleta de dados in vivo e a coleta de plasma e fezes de acordo. Por exemplo, se dois ratos são gavagados a 10 minutos de distância, as leituras de fluorescência in vivo e a coleta de fezes e plasma também devem ocorrer com 10 minutos de intervalo. Comparar a fluorescência nos mesmos pontos de tempo permite uma representação mais precisa das diferenças de permeabilidade. Além disso, a ordem em que os animais de diferentes grupos são testados deve ser alternada para evitar um efeito de agrupamento devido ao tempo. Em vez de testar todos os animais do Grupo A primeiro, depois todos os animais do Grupo B segundo (AAABBB), recomenda-se que o grupo seja trocado após cada animal (ABABAB).
Este ensaio pode ser modificado para incluir apenas a avaliação de amostras de plasma e fezes se houver falta de acesso a uma máquina de imagem. Embora a imagem de fluorescência direta in vivo permita a visualização da ingestão hepática e da fluorescência abdominal residual, a avaliação da fluorescência nas amostras plasmáticas e fecais ainda fornece uma medida quantitativa da permeabilidade intestinal. Além disso, como demonstrado pelo experimento descrito, os níveis de fluorescência no plasma e nas fezes se correlacionam bem com a imagem in vivo. Além disso, este ensaio pode ser modificado para incluir apenas a imagem in vivo. Isso permite que os animais sejam mantidos vivos para continuar testando outros parâmetros ou monitorar como a permeabilidade intestinal muda ao longo do tempo. A capacidade de modificar esse ensaio, portanto, o torna acessível, mas ainda quantitativo. Finalmente, a dosagem de 200 μL de 80 mg·mL−1 FITC-dextran administrada a cada camundongo foi utilizada anteriormente e mostrou-se eficaz em camundongos com pequenas diferenças no peso corporal16. Além disso, é importante notar que todos os camundongos utilizados na seção de resultados representativos pesaram aproximadamente 20 g, permitindo que a mesma dosagem fosse usada para cada rato. Para explicar as diferenças no peso corporal, no entanto, o FITC-dextran pode ser administrado na dose de 0,6-0,8 mg / g de peso corporal, por exemplo,17. Crucialmente, independentemente da dosagem utilizada, é importante limitar a quantidade gavada para cada camundongo a menos de 10 mL·kg−1 para evitar complicações ou desconforto18.
Embora o ensaio FITC-dextran forneça um método eficaz para avaliar a função da barreira intestinal, ele ainda tem algumas limitações. Uma limitação deste modelo é que ele requer o jejum dos ratos por várias horas, o que significa que não é confiável comparar esses resultados com os de ratos que não foram jejuados. Além disso, o jejum pode afetar os resultados em certos modelos que exigem horários de alimentação rigorosos, como ao medir a glicose no sangue em modelos animais para diabetes.
Apesar dessas limitações, o ensaio FITC-dextran continua sendo um método eficaz para analisar a permeabilidade intestinal, pois é quantitativo, versátil, econômico e menos invasivo do que muitos métodos clássicos. Por exemplo, sondas comuns utilizadas para medir a permeabilidade intestinal são as pequenas sondas de sacarídeo ou Cr-EDTA, que apresentam algumas vantagens19. No entanto, algumas sondas de sacarídeo têm apenas permeabilidade específica da região. Como são hidrolisados na porção distal do intestino delgado, não fornecem informações sobre a permeabilidade colônica19. Por outro lado, o Cr-EDTA pode fornecer informações sobre a permeabilidade colônica, mas requer medições por 24 h, tornando a carga de tempo deste método muito maior do que a do ensaio FITC-dextran20. Além disso, nenhum desses métodos fornece a imagem in vivo direta deste ensaio. Portanto, o ensaio FITC-dextran fornece uma opção relativamente simples, direta e eficaz em comparação com métodos alternativos para medir a permeabilidade intestinal.
Finalmente, em processos patológicos como as DIIs4, a doença de Alzheimer21 e a doença hepática2, a permeabilidade intestinal é um parâmetro importante que pode ser medido usando o ensaio FITC-dextran para melhorar os estudos. Por exemplo, no desenvolvimento de novos tratamentos, como imunoterapias para DIIs, este ensaio pode ser usado para testar a eficácia da terapêutica para manter a integridade da barreira intestinal. Considerando que a função de barreira intestinal prejudicada pode estar implicada na perpetuação da inflamação crônica na RCU, por exemplo, examinar o quão bem uma terapêutica protege contra o aumento da permeabilidade é importante4. Este é apenas um exemplo, mas o ensaio FITC-dextran é uma maneira acessível e quantificável de medir a permeabilidade intestinal em muitas áreas e aspectos diferentes da pesquisa.
Disclosures
Os autores declaram que não têm divulgações.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por uma bolsa do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (concessão RGPIN-2018-06442 ao MMS). Agradecemos à instalação de animais no CRCHUM e ao Dr. Junzheng Peng da Plataforma de Fenotipagem Cardiovascular.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 ppm Fe Diet (10% Inulin) | Envigo Teklad | TD.190651 | Representative Results |
| 50 ppm Fe Diet (FeSO4) | Envigo Teklad | TD.190723 | Representative Results |
| BALB/c Mice 49-55 Days, Female | Charles River | 028BALB/C | Representative Results |
| BD 1 mL Syringe Tuberculin Slip Tip | Becton, Dickinson and Company | 309659 | For gavage |
| BD Microtainer Tubes - With LH (Lithium Heparin) | Becton, Dickinson and Company | 365965 | For plasma collection |
| Centrifuge 5420 | Eppendorf | S420KN605698 | |
| Curved Gavage Needle (Gavage Cannula) 7.7.0 38 mm x 22 G | Harvard Apparatus Canada | 34-024 | No longer available - A potential alternative is available at Instech Labs (FTP-22-38) |
| Euthanyl (Pentobarbital Sodium) 240 mg/mL | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 141704 | 1/100 dilution; Administered via intraperitoneal injection at 0.03 mL/g body weight |
| FITC-dextran 4 | TdB Labs | 20550 | |
| Heparinized Capillary Tubes | Kimble Chase Life Science and Research | 2501 | For retro-orbital blood collection |
| Microplate, PS, 96-well, Flat-bottom (Chimney Well), Black, Flutrac, Med. Binding | Greiner Bio-one | 655076 | |
| MiniARCO Clipper Kit | Kent Scientific | CL8787-KIT | For hair removal |
| Optix MX2 and Optix Optiview | Advanced Research Technologies | 2.02.00.6 | Fluorescence imaging machine and software |
| Phosphate Buffered Saline 1x (PBS) | Wisent Inc | 311-010-LL | |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | 12920060 | Ophthalmic ointement to prevent eye damage during anesthesia |
| Spark Multiplate Reader | Tecan | 30086376 |
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