Summary
Her beskriver vi en enkel metode til at implantere en kommerciel kontinuerlig glukosemonitor designet til patienter på mus og give scripts til at analysere resultaterne.
Abstract
Mus er en almindelig modelorganisme, der bruges til at studere metaboliske sygdomme som diabetes mellitus. Glukoseniveauer måles typisk ved haleblødning, hvilket kræver håndtering af musene, forårsager stress og ikke giver data om frit opførte mus under den mørke cyklus. State-of-the-art kontinuerlig glukosemåling hos mus kræver indsættelse af en sonde i musens aortabue samt et specialiseret telemetrisystem. Denne udfordrende og dyre metode er ikke blevet vedtaget af de fleste laboratorier. Her præsenterer vi en simpel protokol, der involverer brugen af kommercielt tilgængelige kontinuerlige glukosemonitorer, der bruges af millioner af patienter til at måle glukose kontinuerligt i mus som en del af grundforskningen. Den glukosefølende sonde indsættes i det subkutane rum bag på musen gennem et lille snit i huden og holdes tæt på plads ved hjælp af et par suturer. Enheden sutureres til musehuden for at sikre, at den forbliver på plads. Enheden kan måle glukoseniveauer i op til 2 uger og sender dataene til en modtager i nærheden uden behov for at håndtere musene. Scripts til den grundlæggende dataanalyse af registrerede glukoseniveauer leveres. Denne metode, fra kirurgi til beregningsanalyse, er omkostningseffektiv og potentielt meget nyttig i metabolisk forskning.
Introduction
Diabetes mellitus (DM) er en ødelæggende sygdom præget af høje blodsukkerniveauer. Type 1 DM kan være et resultat af et autoimmunt angreb på de insulinproducerende betaceller i bugspytkirtlen. Type 2 DM og svangerskabs-DM er derimod karakteriseret ved, at betacellerne ikke udskiller tilstrækkeligt insulin som reaktion på en stigning i glukoseniveauer1. Musen er en almindelig modelorganisme, der bruges til at studere DM, da den har lignende fysiologi, og dens normale glukoseniveauer er tæt på menneskers. Desuden kan specifikke musestammer udvikle DM på grund af mutationer i vigtige signalveje eller efter eksponering for specifikke kostvaner, hvilket muliggør sygdomsmodellering 2,3,4.
Blodsukker måles almindeligvis hos mus ved hjælp af glucometre designet til patienter ved at ekstrahere en lille dråbe blod (1-2 μL) fra spidsen af musens hale. Denne metode forårsager stress og kræver håndtering af musen, hvilket påvirker glukoseniveauerne og forbyder måling af blodsukkerniveauer i frit opførte mus, eller når forskeren ikke er tæt på5. Blødning af musene kan forårsage stress hos mus i nærheden, især hos mus i samme bur, hvis glykæmi endnu ikke er målt, hvilket påvirker resultaterne. Mus reagerer forskelligt afhængigt af håndtereren, og den person, der måler glukose, kan påvirke musenes glukoseniveauer. Disse faldgruber kræver omhyggeligt eksperimentelt design og ligger til grund for nogle uoverensstemmelser mellem eksperimenter.
Det er muligt at måle glukose i frit bevægelige mus uden blødning ved at implantere glukosesensorer i musenes aortabue ved hjælp af avanceret telemetri6. De resulterende målinger er meget gode og kan opretholdes over en lang periode, men det er udfordrende at implantere disse sensorer, og telemetrisystemet er dyrt, hvilket fører til en moderat vedtagelse af denne metode og ingen vedtagelse i ikke-specialiserede laboratorier. Subkutane eller andre glukosesensorer, der er skræddersyet til musenes dimensioner og deres fysiologi, er blevet udviklet i de senere år, men disse kræver igen højt kvalificerede eksperter og er i nogle tilfælde dyre 6,7,8,9,10.
Kommercielle kontinuerlige glukosemonitorer (CGM'er), der oprindeligt blev udviklet til at overvåge glukoseniveauerne hos DM-patienter, tilbyder en anden mulighed for at måle glukose i frit bevægelige mus med lavere omkostninger og tekniske ekspertisekrav end implanterede sonder. Sådanne sonder er blevet brugt i grundforskning af nogle få laboratorier 5,11,12,13,14,15 inklusive vores kolleger, der brugte denne protokol 16. Disse enheder omfatter typisk en sensor, en monteringsenhed, en modtager og et softwareprogram. Sensoren har en kanyle, der styrer den enzymatiske glucosensor, tape, en energikilde, korttidshukommelse og et trådløst kommunikationsmodul, der gemmer og sender dataene til modtageren. Modtageren kan vise de aktuelle glukoseniveauer og sender dataene til en server; Denne modtager kan være en mobiltelefon. Softwareapplikationen leverer data til patienten og det medicinske behandlingsteam om patientens glykæmi. Hos patienter fastgøres sensoren let ved hjælp af monteringsanordningen. Kanylen indsættes subkutant ved at trykke monteringsenheden mod huden, og sensoren forbliver på plads ved hjælp af tape.
Dette er en detaljeret protokol til tilpasning af en kommerciel CGM-enhed til måling af glukoseniveauer hos mus. Denne protokol beskriver, hvordan du kirurgisk indsætter glukosesensoren og fastgør den til musen. Scripts til grundlæggende dataanalyse og datavisualisering leveres. De potentielle faldgruber, fejlfinding og eksempler på standardresultater er angivet. Protokollen nedenfor er specifik for en bestemt CGM, men kan let tilpasses andre typer kommercielle CGM'er, efterhånden som de bliver tilgængelige.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forsøgene blev godkendt af Hebrew University's Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
BEMÆRK: Alt værktøj skal steriliseres, og håndtering af kanylen skal udføres ved hjælp af en steril teknik. Protokollen nedenfor er finjusteret til en bestemt CGM. Protokollen kan tilpasses andre CGM'er.
1. Analgetisk administration før proceduren
- Administrer 5% dextrose og 0,45% saltvand med meloxicam ved 5 mg/kg legemsvægt subkutant.
2. Administration af anæstesi
- Placer musen i induktionskammeret, luk låget tæt. Induktion af anæstesi i induktionskammeret indstilles til 3% isofluran med en strømningshastighed på 500 ml/min.
- Når musen ikke reagerer, skal du fjerne musen fra kammeret og tilpasse næsekeglen til musen. Bekræft anæstesiniveauet med en interdigital knivspids. Indstil koncentrationen til 1%-1,5% isofluran og flowhastigheden til 100 ml/min i en mus, der vejer 30 g.
- Påfør oftalmisk salve til øjnene for at forhindre tørhed under anæstesi.
3. Forberedelse af sensor
- Monter sensoren på sensorens monteringsenhed for at eksponere sensorens tape og kanyleside (figur 1A). Vær forsigtig, da nålen indsættes i kanylen og udsættes.
- Sutur to 5-0 koniske punkt suturer til båndet på begge sider af kanylen (figur 1A).
4. Hårfjerning og desinfektion
- Barber et område på ca. 4 cm x 4 cm på midterlinjen af bagsiden af musen.
- Administrer en hårfjerningscreme til det barberede område for at sikre fuldstændig hårfjerning.
- Tør huden af, og desinficer den med en antiseptisk opløsning indeholdende 2% chlorhexidingluconat og 70% isopropylalkohol.
5. Dorsal hudforberedelse
- Lav et 2 mm snit i midten af det barberede område over rygsøjlen ved hjælp af en skarp saks (figur 1B).
- Indsæt kort sagt små pincet med en stump kant under huden for at danne en lille subkutan lomme, så kanylen let kan indsættes i den subkutane lomme (figur 1B).
- Før en sutur fra trin 3.2 gennem huden på hver side af snittet (figur 1C).
6. Indsætning af sensor
- Fjern sensoren helt fra sensormonteringsenheden (kanylen er tom fra nålen), og hold sensoren med pincet for at forhindre, at den omgivende tape klæber til sig selv.
- Indsæt forsigtigt kanylen i den subkutane lomme.
- Træk suturerne på hver side, og stram og bind dem for at fastgøre sensoren fast på plads, hvilket forhindrer kanylen i at glide ud af den subkutane lomme, når klæbebåndet løsner sig over tid.
7. Sensorfastgørelse og suturering
- Fastgør sensoren fast på bagsiden ved at binde de indre suturer og bruge klæbebåndet omkring sensoren.
- Lav otte diskontinuerlige suturer omkring sensoren, og fastgør kanten af sensorens tape til huden (figur 1D).
8. Aktivering af læseren
- Når sensoren er indsat, skal du aktivere læseren ved at tænde læseren, trykke på Start ny sensor og stryge sensoren i henhold til producentens anvisninger.
- Den første læsning kan kun tages et par minutter efter installation af CGM. I tilfælde af denne CGM kan førstebehandlingen foretages efter 60 min.
9. Læsning af resultater
- Placer læseren tæt på musen (det er ikke nødvendigt at røre ved den). Alle data, der er gemt i sensoren, overføres til læseren.
BEMÆRK: Forskellige CGM-enheder kan variere i perioden med historisk databesparelseskapacitet. I tilfælde af denne CGM kan maksimalt 8 timer gemmes mellem to aflæsninger.
10. Fjernelse af sensoren
- Bedøv musen (se punkt 2).
- Klip suturerne, der forbinder sensoren med bagsiden af musen ved hjælp af en skarp saks.
- Fjern og skær suturerne ved snittet ved forsigtigt at fjerne sensoren.
- Brug om nødvendigt en enkelt sutur til at lukke snittet bag på musen.
11. Analyse af data
- Download af data: Download dataene i henhold til instruktionerne fra CGM-producenten.
BEMÆRK: Hver CGM har et andet format, som måske eller måske ikke er let tilgængeligt for brugeren. Dette er en vigtig overvejelse ved valg af CGM. - Til analyse med den medfølgende software skal du formatere dataene i henhold til instruktionerne i vigtigt-filen på Github (https://github.com/mika-littor/CGM-in-Mice-Analysis.git).
Figur 1: Fastgørelse af sensoren til musen . (A) To suturer markeret med røde pile føres gennem sensorbåndet på begge sider af kanylen på undersiden af CGM-sensoren, markeret med en hvid pil. (B) Et lille snit på 2 mm er lavet i midten af det barberede område langs rygsøjlen ved hjælp af en skarp saks. Små tang med en stump kant indsættes kort under huden for at danne en lille subkutan lomme, så kanylen kan indsættes subkutant. (C) De samme suturer fra A føres subkutant på hver side af snittet. De røde pile markerer suturerne, der er fastgjort til sensoren som i A, de blå pile markerer den placering, suturerne passerede igennem til huden bag på musen, og den sorte pil viser snittet. (D) Efter at kanylen er indsat, strammes de indre suturer og bindes tæt på snittet for at sikre CGM. Sensoren sutureres derefter til huden. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kirurgisk udfald
Resultater fra otte HSD:ICR-mus (i alderen 8 uger) fodret med en fedtfattig kost med højt saccharoseindhold (HFHS) i 18 uger og fem magre HSD:ICR-mus (i alderen 12 uger) vises. Den enhed, vi brugte, gemmer data i op til 8 timer. Adgang til det lokale dyreanlæg var begrænset til kl. 07.00-19.00, hvilket forbød dataindsamling i de sene kl. 07.00, hvor musene er aktive. Musene blev derfor placeret i et rum med omvendt belysning i 7 dage før det kirurgiske indgreb med mørke timer mellem 8:30 og 20:30. Dette er ikke nødvendigt for alle enheder eller dyrefaciliteter, og vi anbefaler at bruge enheder, der kan gemme oplysninger i over 12 timer.
Der var ingen dødelighed efter operationen. Operationen førte til et vægttab på ca. 10% i løbet af eksperimentet (figur 2A). Derfor bør målingerne taget i de første par dage efter operationen, under vægttab, fortolkes med omhu. Vægttab skyldtes ikke musenes manglende evne til at nå frem til mad og vand. Sammenligningen af CGM-målinger og blodglukosemålinger med halespids viste god overensstemmelse i fastende og ikke-fastende tilstande (figur 2B). CGM var aktiv i gennemsnit i 11 dage (figur 2C). Det maksimale antal dage for denne type enhed er 14 dage. Da enheden blev inaktiv tidligere, skyldtes det ikke, at CGM faldt af.
Figur 2: Generelle resultater af anvendelsen af CGM. (A) Gennemsnitlig vægtreduktion i den tid, CGM var aktiv. n = 8 mus. B) Den gennemsnitlige forskel mellem glukosemålingerne ved hjælp af det håndholdte glucometer og CGM-apparatet. Forskellen var ikke signifikant forskellig fra 0 mg/dl. n = 10 aflæsninger i seks mus. (C) Den gennemsnitlige tid, CGM var aktiv i n = 8 mus. Fejlbjælker repræsenterer standardfejlen i middelværdien. Klik her for at se en større version af denne figur.
Rå output
Glukoseniveauerne for en enkelt dag vises på en graf produceret af CGM-softwaren (figur 3A). Data fra nogle få dage kan ses ved hjælp af den angivne kode (figur 3B). Vi viser data fra 3 dage for klarhedens skyld.
Figur 3: Dataanalyse . (A) Kommerciel produktion. Data blev ikke indsamlet mellem kl. 18.00 og midnat. Det skraverede område viser normoglykæmi værdier hos patienter, som er mellem 70-100 mg / dl. (B) Rå outputdata på 3 dage fra en enkelt mus ved hjælp af den angivne kode. Bemærk forskellen i skala i y-aksen mellem A og B. Akseparametrene og alle de andre parametre kan moduleres i koden. Data for 3 dage vises for klarhed. Klik her for at se en større version af denne figur.
Analyse
Når dataene er ekstraheret, kan analysen udføres ved hjælp af den angivne kode eller enhver anden specialbygget software. Nedenfor er de gennemsnitlige (figur 4A, C) og median (figur 4B, D) glukoseniveauer på hvert tidspunkt for en enkelt mus. Et glidende vindue kan bruges til at udjævne plottet. Kun to mus vises for klarhedens skyld.
Figur 4: Dataanalyseoutput ved hjælp af de medfølgende scripts . (A) Gennemsnitlige og (B) mediane glukoseniveauer på hvert tidspunkt i en bestemt mus. Det skraverede område angiver standardafvigelsen i glukoseniveauer. (C) Gennemsnitlige og (D) mediane glukoseniveauer fra to mus. Kun to mus vises for klarhedens skyld. En stiplet linje angiver overgangen fra lys (20:30-08:30) til mørk (8:30-20:30). Et glidende vindue på 20 minutter blev brugt til at udjævne kurven. Vinduets størrelse og alle parametre kan ændres i koden. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol tilbyder en enkel, billig metode til at overvåge glukoseniveauer hos mus, der ikke kræver udfordrende mikrokirurgi og ikke involverer blødning eller håndtering af musene. Metoden er nem at implementere i alle faciliteter og forårsager ikke dødelighed, smerte eller overdreven ubehag for musene. Det mest kritiske trin i protokollen er at indsætte kanylen på glukosesensoren under musens hud. Tilføjelsen af et par suturer gør det muligt for kanylen at forblive på plads i længere tid. Sensorerne er små og kan blive blokeret eller forlagt, når musen bevæger sig. Sensoren skal sikres af de indre suturer og fastgøres til bagsiden af musen med et par suturer. Protokollen kan tilpasses mange kommercielle CGM-systemer.
Musene tabte sig efter operationen, hvilket forventes efter operationen og kan være forbundet med stress ved kirurgi og anæstesi, byrden ved at bære enheden og enkelthuset pålagt af den specifikke protokol, der blev brugt i denne undersøgelse. Efterhånden som CGM-enheder gradvist bliver lettere og mere præcise, forventes disse effekter at blive mindre. Vi observerede, at mus, der bar CGM, bevægede sig frit i buret og nåede madpiller, der krævede klatring. Metoden er begrænset af hver CGM's evne til at fungere over tid. Forskere bør overvåge for vægttab og overveje fordele og ulemper ved denne metode sammenlignet med standardalternativer, der kræver hyppig håndtering og blødning af musene, som antager, at blødning af en mus har ringe effekt på sine naboers glykæmi og involverer måling af glukoseniveauer i en stressende tilstand om dagen.
Protokollen beskrevet ovenfor er ret enkel, hurtig og skalerbar. Det kræver ikke en særlig indstilling i dyreanlægget eller dyrt udstyr, kan bruges parallelt med andre procedurer, der er en del af eksperimentet, og kan bruges på enhver genetisk baggrund eller med enhver ernæring. Dataanalysescripts leveres for at lette analyse af forskningsgrupper, der er mindre erfarne inden for dataanalyse. Forhåbentlig vil denne detaljerede protokol og dataanalysescripts gøre det muligt for andre laboratorier at måle glukose i deres eksperimenter inden for metaboliske og andre forskningsområder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Dvir Mintz DVM og veterinær- og husdyrpersonalet i dyreanlægget samt medlemmer af vores gruppe for frugtbare diskussioner. Denne undersøgelse blev støttet af et Israel Science Foundation-tilskud 1541/21 tildelt D.B.Z. D.B.Z. er et Zuckerman STEM-fakultet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2% Chlorhexidine Gluconate and 70% Isopropyl Alcohol | 3M | ID 7000136290 | |
| 5% Dextrose and 0.45% Sodium Chloride Injection, USP | Braun | L6120 | |
| Castroviejo needle holder | FST | 12061-02 | |
| Extra Fine Bonn scissors | FST | 14084-08 | |
| FreeStyle Libre 1 reader | Abbott | ART27543 | |
| FreeStyle Libre sensor | Abbott | ART36687 | |
| FreeStyle Libre sensor applicator | Abbott | ART36787 | |
| Gauze pads | Sion medical | PC912017 | |
| Graefe Forceps | FST | 11052-10 | |
| Hair Removal Cream | Veet | 3116523 | |
| High-fat high-sucrose diet | Envigo Teklad diets | TD.08811 | |
| Isoflurane, USP Terrell | Piramal | 26675-46-7 | |
| Meloxicam 5 mg/mL | Chanelle Pharma | 08749/5024 | |
| MiniARCO Clipper kit | Moser | CL8787-KIT | |
| PROLENE Polypropylene Suture 5-0 | Ethicon | 8725H | |
| Puralube Opthalmic Ointment | Perrigo | 574402511 | |
| Q-tips | B.H.W | 271676 | |
| SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System | Kent Scientific | SOMNO |
References
- Polonsky, K. S. The past 200 years in diabetes. New England Journal of Medicine. 367 (14), 1332-1340 (2012).
- Rees, D. A., Alcolado, J. C.
- Pearson, J. A., Wong, F. S., Wen, L. The importance of the non-obese diabetic (NOD) mouse model in autoimmune diabetes. Journal of Autoimmunity. 66, 76-88 (2016).
- Heydemann, A. An overview of murine high fat diet as a model for Type 2 diabetes mellitus. Journal of Diabetes Research. 2016, 2902351 (2016).
- Kennard, M. R., et al. The use of mice in diabetes research: The impact of experimental protocols. Diabetic Medicine. 38 (12), 14705 (2021).
- Klueh, U., et al. Continuous glucose monitoring in normal mice and mice with prediabetes and diabetes. Diabetes Technology and Therapeutics. 8 (3), 402-412 (2006).
- Wuyts, C., Simoens, C., Pinto, S., Philippaert, K., Vennekens, R. Continuous glucose monitoring during pregnancy in healthy mice. Scientific Reports. 11, 4450 (2021).
- Korstanje, R., et al. Continuous glucose monitoring in female NOD mice reveals daily rhythms and a negative correlation with body temperature. Endocrinology. 158 (9), 2707-2712 (2017).
- Han, B. G., et al. Markers of glycemic control in the mouse: Comparisons of 6-h-and overnight-fasted blood glucoses to Hb A1c. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 295 (4), 981-986 (2008).
- Xie, X., et al. Reduction of measurement noise in a continuous glucose monitor by coating the sensor with a zwitterionic polymer. Nature Biomedical Engineering. 2 (12), 894-906 (2018).
- Van Der Meulen, T., et al. Urocortin3 mediates somatostatin-dependent negative feedback control of insulin secretion. Nature Medicine. 21 (7), 769-776 (2015).
- Peterson, Q. P., et al. A method for the generation of human stem cell-derived alpha cells. Nature Communications. 11, 2241 (2020).
- Klueh, U., Liu, Z., Feldman, B., Kreutzer, D. Interstitial fluid physiology as it relates to glucose monitoring technologies: Importance of Interleukin-1 and Interleukin-1 receptor antagonist in short-term glucose sensor function in vivo. Journal of Diabetes Science and Technology. 4 (5), 1073 (2010).
- Klueh, U., Antar, O., Qiao, Y., Kreutzer, D. L. Role of interleukin-1/interleukin-1 receptor antagonist family of cytokines in long-term continuous glucose monitoring in vivo. Journal of Diabetes Science and Technology. 7 (6), 1538 (2013).
- Klueh, U., Kaur, M., Qiao, Y., Kreutzer, D. L. Critical role of tissue mast cells in controlling long-term glucose sensor function in vivo. Biomaterials. 31 (16), 4540-4551 (2010).
- Kogot-Levin, A., et al. Mapping the metabolic reprogramming induced by sodium-glucose cotransporter 2 inhibition. JCI Insight. , 164296 (2023).
