Summary
Aquí, describimos un método simple para implantar un monitor comercial continuo de glucosa diseñado para pacientes en ratones y proporcionamos los guiones para analizar los resultados.
Abstract
Los ratones son un organismo modelo común utilizado para estudiar enfermedades metabólicas como la diabetes mellitus. Los niveles de glucosa se miden típicamente por sangrado de cola, que requiere manipular a los ratones, causa estrés y no proporciona datos sobre el comportamiento libre de los ratones durante el ciclo oscuro. La medición continua de glucosa de última generación en ratones requiere la inserción de una sonda en el arco aórtico del ratón, así como un sistema de telemetría especializado. Este método desafiante y costoso no ha sido adoptado por la mayoría de los laboratorios. Aquí, presentamos un protocolo simple que implica la utilización de monitores continuos de glucosa disponibles comercialmente utilizados por millones de pacientes para medir la glucosa continuamente en ratones como parte de la investigación básica. La sonda sensible a la glucosa se inserta en el espacio subcutáneo en la parte posterior del ratón a través de una pequeña incisión en la piel y se mantiene en su lugar firmemente con un par de suturas. El dispositivo se sutura a la piel del ratón para garantizar que permanezca en su lugar. El dispositivo puede medir los niveles de glucosa durante un máximo de 2 semanas y envía los datos a un receptor cercano sin necesidad de manipular los ratones. Se proporcionan scripts para el análisis de datos básicos de los niveles de glucosa registrados. Este método, desde la cirugía hasta el análisis computacional, es rentable y potencialmente muy útil en la investigación metabólica.
Introduction
La diabetes mellitus (DM) es una enfermedad devastadora caracterizada por niveles altos de glucosa en sangre. La DM tipo 1 puede ser el resultado de un ataque autoinmune a las células beta productoras de insulina en el páncreas. La DM tipo 2 y la DM gestacional, por otro lado, se caracterizan por una falla de las células beta para secretar suficiente insulina en respuesta a un aumento en los niveles de glucosa1. El ratón es un organismo modelo común utilizado para estudiar la DM, ya que tiene una fisiología similar y sus niveles normales de glucosa son cercanos a los de los humanos. Además, cepas específicas de ratón pueden desarrollar DM debido a mutaciones en vías de señalización clave o después de la exposición a dietas específicas, lo que permite modelar la enfermedad 2,3,4.
La glucosa en sangre se mide comúnmente en ratones usando glucómetros diseñados para pacientes extrayendo una pequeña gota de sangre (1-2 μL) de la punta de la cola del ratón. Este método causa estrés y requiere el manejo del ratón, lo que afecta los niveles de glucosa y prohíbe la medición de los niveles de glucosa en sangre en ratones que se comportan libremente o cuando el investigador no está cerca de5. El sangrado de los ratones puede causar estrés a los ratones cercanos, particularmente a los ratones de la misma jaula cuya glucemia aún no se ha medido, lo que afecta los resultados. Los ratones responden de manera diferente dependiendo del manejador, y la persona que mide la glucosa puede afectar los niveles de glucosa de los ratones. Estos escollos requieren un diseño experimental cuidadoso y subyacen a algunas inconsistencias entre los experimentos.
Es posible medir la glucosa en ratones que se mueven libremente sin sangrado mediante la implantación de sensores de glucosa en el arco aórtico de los ratones utilizando la telemetría de última generación6. Las mediciones resultantes son muy buenas y pueden mantenerse durante un largo período, pero es difícil implantar estos sensores, y el sistema de telemetría es costoso, lo que lleva a una adopción moderada de esta metodología y a ninguna adopción en laboratorios no especializados. En los últimos años se han desarrollado sensores subcutáneos u otros sensores de glucosa adaptados a las dimensiones de los ratones y su fisiología, pero también requieren expertos altamente calificados y, en algunos casos, son costosos 6,7,8,9,10.
Los monitores continuos de glucosa (MCG) comerciales que se desarrollaron originalmente para monitorear los niveles de glucosa de los pacientes con DM ofrecen otra opción para medir la glucosa en ratones que se mueven libremente, con requisitos de menor costo y experiencia técnica que las sondas implantadas. Tales sondas han sido utilizadas en investigación básica por unos pocos laboratorios 5,11,12,13,14,15 incluyendo nuestros colegas que utilizaron este protocolo 16. Estos dispositivos suelen incluir un sensor, un dispositivo de montaje, un receptor y una aplicación de software. El sensor tiene una cánula que guía el glucosensor enzimático, cinta adhesiva, una fuente de energía, memoria a corto plazo y un módulo de comunicación inalámbrica que almacena y envía los datos al receptor. El receptor puede mostrar los niveles actuales de glucosa y envía los datos a un servidor; Este receptor puede ser un teléfono celular. La aplicación de software proporciona datos para el paciente y el equipo de atención médica sobre la glucemia del paciente. En los pacientes, el sensor se conecta fácilmente utilizando el dispositivo de montaje. La cánula se inserta por vía subcutánea presionando el dispositivo de montaje contra la piel, y el sensor permanece en su lugar con la ayuda de cinta adhesiva.
Este es un protocolo detallado para adaptar un dispositivo comercial de MCG para medir los niveles de glucosa en ratones. Este protocolo describe cómo insertar quirúrgicamente el sensor de glucosa y conectarlo al ratón. Se proporcionan scripts para el análisis básico de datos y la visualización de datos. Se proporcionan los posibles escollos, la solución de problemas y ejemplos de resultados estándar. El siguiente protocolo es específico para un determinado MCG, pero se puede adaptar fácilmente a otros tipos de MCG comerciales a medida que estén disponibles.
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Protocol
Los experimentos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Hebrea.
NOTA: Todas las herramientas deben ser esterilizadas, y el manejo de la cánula debe realizarse utilizando una técnica estéril. El siguiente protocolo está ajustado a un CGM específico. El protocolo se puede adaptar a otros MCG.
1. Administración de analgésicos antes del procedimiento
- Administrar dextrosa al 5% y solución salina al 0,45% con meloxicam a 5 mg/kg de peso corporal por vía subcutánea.
2. Administración de anestesia
- Coloque el ratón en la cámara de inducción, cerrando la tapa herméticamente. Ajuste la inducción de la anestesia en la cámara de inducción a isoflurano al 3% a un caudal de 500 mL/min.
- Una vez que el mouse no responda, retire el mouse de la cámara y ajuste el cono de la nariz al mouse. Confirme el nivel de anestesia con un pellizco interdigital. Ajuste la concentración a 1% -1.5% isoflurano y el caudal a 100 ml / min en un ratón que pesa 30 g.
- Aplique ungüento oftálmico en los ojos para prevenir la sequedad durante la anestesia.
3. Preparación del sensor
- Monte el sensor en el dispositivo de montaje del sensor para exponer la cinta y el lado de la cánula del sensor (Figura 1A). Tenga cuidado ya que la aguja se inserta en la cánula y se expone.
- Suture dos suturas de punto cónico 5-0 a la cinta en ambos lados de la cánula (Figura 1A).
4. Depilación y desinfección
- Afeite un área de aproximadamente 4 cm x 4 cm en la línea media de la parte posterior del ratón.
- Administrar una crema depilatoria en la zona afeitada para asegurar la depilación completa.
- Limpie la piel y desintéctela con una solución antiséptica que contenga 2% de gluconato de clorhexidina y 70% de alcohol isopropílico.
5. Preparación de la piel dorsal
- Haga una incisión de 2 mm en el centro del área afeitada por encima de la columna vertebral con tijeras afiladas (Figura 1B).
- Brevemente, inserte fórceps pequeños con un borde romo debajo de la piel para formar un pequeño bolsillo subcutáneo para que la cánula se pueda insertar fácilmente en el bolsillo subcutáneo (Figura 1B).
- Pasar una sutura del paso 3.2 a través de la piel a cada lado de la incisión (Figura 1C).
6. Inserción del sensor
- Retire el sensor completamente del dispositivo de montaje del sensor (la cánula está vacía de la aguja) y sostenga el sensor con pinzas para evitar que la cinta circundante se pegue a sí misma.
- Inserte cuidadosamente la cánula en el bolsillo subcutáneo.
- Tire de las suturas de cada lado, y apriételas y átelas para fijar el sensor firmemente en su lugar, evitando así que la cánula se salga del bolsillo subcutáneo una vez que la cinta adhesiva se afloje con el tiempo.
7. Fijación y sutura del sensor
- Fije el sensor a la parte posterior firmemente atando las suturas internas y utilizando la cinta adhesiva que rodea el sensor.
- Haga ocho suturas discontinuas alrededor del sensor, fijando el borde de la cinta del sensor a la piel (Figura 1D).
8. Activación del lector
- Una vez insertado el sensor, active el lector encendiéndolo, presionando Iniciar nuevo sensor y deslizando el sensor de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- La primera lectura solo se puede tomar unos minutos después de instalar el CGM. En el caso de este MCG, la primera lectura se puede tomar después de 60 minutos.
9. Lectura de resultados
- Coloque el lector cerca del ratón (no es necesario tocarlo). Todos los datos almacenados en el sensor se transmiten al lector.
NOTA: Los diferentes dispositivos CGM pueden diferir en el período de capacidad histórica de ahorro de datos. En el caso de este MCG, se puede almacenar un máximo de 8 h entre dos lecturas.
10. Extracción del sensor
- Anestesiar el ratón (ver sección 2).
- Corte las suturas que conectan el sensor a la parte posterior del ratón con unas tijeras afiladas.
- Retire y corte las suturas en la incisión retirando suavemente el sensor.
- Si es necesario, use una sola sutura para cerrar la incisión en la parte posterior del ratón.
11. Análisis de datos
- Descarga de datos: descargue los datos según las instrucciones proporcionadas por el fabricante de CGM.
NOTA: Cada CGM tiene un formato diferente, que puede o no ser fácilmente accesible para el usuario. Esta es una consideración importante en la elección del MCG. - Para el análisis con el software proporcionado, formatee los datos de acuerdo con las instrucciones del archivo léame en Github (https://github.com/mika-littor/CGM-in-Mice-Analysis.git).
Figura 1: Fijación del sensor al ratón . (A) Dos suturas marcadas con flechas rojas se pasan a través de la cinta del sensor a ambos lados de la cánula en la parte inferior del sensor CGM, marcado por una flecha blanca. (B) Se realiza una pequeña incisión de 2 mm en el centro del área afeitada a lo largo de la columna vertebral con tijeras afiladas. Pequeños fórceps con un borde romo se insertan brevemente debajo de la piel para formar un pequeño bolsillo subcutáneo para que la cánula se pueda insertar por vía subcutánea. (C) Las mismas suturas de A se pasan por vía subcutánea a cada lado de la incisión. Las flechas rojas marcan las suturas unidas al sensor como en A, las flechas azules marcan la ubicación a través de la cual las suturas pasaron a la piel en la parte posterior del ratón, y la flecha negra muestra la incisión. (D) Después de insertar la cánula, las suturas internas se aprietan y se atan cerca de la incisión para asegurar el MCG. A continuación, el sensor se sutura a la piel. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Representative Results
Resultado quirúrgico
Se muestran los resultados de ocho ratones HSD: ICR (de 8 semanas) alimentados con una dieta alta en grasas y alta en sacarosa (HFHS) durante 18 semanas y cinco ratones HSD: ICR magros (de 12 semanas). El dispositivo que utilizamos almacena datos durante un máximo de 8 h. El acceso a la instalación local de animales estaba restringido a las 07:00-19:00, prohibiendo así la recopilación de datos durante las últimas horas de la tarde, cuando los ratones están activos. Por lo tanto, los ratones se colocaron en una habitación con iluminación inversa durante 7 días antes del procedimiento quirúrgico, con horas oscuras entre las 8:30 y las 20:30. Esto no es necesario para todos los dispositivos o instalaciones para animales, y recomendamos utilizar dispositivos que puedan almacenar información durante más de 12 h.
No hubo mortalidad después de la cirugía. La cirugía condujo a una pérdida de peso de aproximadamente el 10% durante el tiempo del experimento (Figura 2A). Por lo tanto, las mediciones tomadas en los primeros días después de la cirugía, durante la pérdida de peso, deben interpretarse con cuidado. La pérdida de peso no se debió a la incapacidad de los ratones para alcanzar comida y agua. La comparación de las mediciones de MCG y las mediciones de glucosa en sangre en la punta de la cola mostró una buena concordancia en los estados de ayuno y no ayuno (Figura 2B). El MCG estuvo activo durante 11 días en promedio (Figura 2C). El número máximo de días para este tipo de dispositivo es de 14 días. Cuando el dispositivo se volvió inactivo antes, no se debió a que el CGM se cayera.
Figura 2: Resultados generales de la aplicación del MCG. (A) Reducción media de peso durante el tiempo que el MCG estuvo activo. n = 8 ratones. (B) La diferencia media entre las lecturas de glucosa del glucómetro de mano y el dispositivo CGM. La diferencia no fue significativamente diferente de 0 mg/dL. n = 10 lecturas en seis ratones. (C) El tiempo medio que el MCG estuvo activo en n = 8 ratones. Las barras de error representan el error estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Salida bruta
Los niveles de glucosa de un solo día se muestran en un gráfico producido por el software CGM (Figura 3A). Los datos de unos pocos días se pueden ver utilizando el código proporcionado (Figura 3B). Mostramos datos de 3 días para mayor claridad.
Figura 3: Análisis de datos . (A) Producción comercial. Los datos no fueron recolectados entre las 18:00 y la medianoche. El área sombreada muestra valores de normoglucemia en pacientes, que están entre 70-100 mg/dL. (B) Datos de salida sin procesar de 3 días desde un solo mouse utilizando el código proporcionado. Tenga en cuenta la diferencia de escala en el eje y entre A y B. Los parámetros del eje, y todos los demás parámetros, se pueden modular en el código. Los datos de 3 días se muestran para mayor claridad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Análisis
Una vez que se extraen los datos, el análisis se puede realizar utilizando el código proporcionado o cualquier otro software personalizado. A continuación se muestran los niveles medios (Figura 4A, C) y mediana (Figura 4B, D) de glucosa en cada punto de tiempo para un solo ratón. Se puede utilizar una ventana corredera para suavizar la trama. Solo se muestran dos ratones para mayor claridad.
Figura 4: Salida del análisis de datos utilizando los scripts proporcionados . (A) Niveles medios y (B) medios de glucosa en cada punto de tiempo en un ratón específico. El área sombreada denota la desviación estándar en los niveles de glucosa. (C) Niveles medios y (D) medios de glucosa de dos ratones. Solo se muestran dos ratones para mayor claridad. Una línea discontinua denota la transición de la luz (20:30-08:30) a la oscuridad (8:30-20:30). Se utilizó una ventana corredera de 20 min para suavizar la curva. El tamaño de la ventana y todos los parámetros se pueden modificar en el código. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo ofrece un método simple y económico para monitorear los niveles de glucosa en ratones que no requiere microcirugía desafiante y no implica sangrado o manipulación de ratones. El método es fácil de implementar en todas las instalaciones y no causa mortalidad, dolor o molestias excesivas a los ratones. El paso más crítico en el protocolo es insertar la cánula del sensor de glucosa debajo de la piel del ratón. La adición de algunas suturas permite que la cánula permanezca en su lugar durante más tiempo. Los sensores son pequeños y pueden bloquearse o extraviarse a medida que el ratón se mueve. El sensor debe estar asegurado por las suturas internas y unido a la parte posterior del ratón mediante unas suturas. El protocolo se puede adaptar a muchos sistemas comerciales de MCG.
Los ratones perdieron peso después de la cirugía, lo que se espera después de la cirugía y puede estar asociado con el estrés de la cirugía y la anestesia, la carga de llevar el dispositivo y la carcasa única impuesta por el protocolo específico utilizado en este estudio. A medida que los dispositivos CGM se vuelven progresivamente más ligeros y precisos, se espera que estos efectos se vuelvan más pequeños. Observamos que los ratones portadores del MCG se movían libremente en la jaula y alcanzaban pellets de comida que requerían escalada. El método está limitado por la capacidad de cada MCG para funcionar con el tiempo. Los investigadores deben monitorear la pérdida de peso y considerar las ventajas y desventajas de este método en comparación con las alternativas estándar que requieren el manejo frecuente y el sangrado de los ratones, que asumen que el sangrado de un ratón tiene poco efecto sobre la glucemia de sus vecinos e implica medir los niveles de glucosa en una condición estresante durante el día.
El protocolo descrito anteriormente es bastante simple, rápido y escalable. No requiere un entorno especial en la instalación de animales o equipo costoso, se puede usar en paralelo con otros procedimientos que forman parte del experimento y se puede usar en cualquier fondo genético o con cualquier nutrición. Los guiones de análisis de datos se proporcionan para facilitar el análisis por parte de grupos de investigación que tienen menos experiencia en el análisis de datos. Con suerte, este protocolo detallado y los scripts de análisis de datos permitirán a otros laboratorios medir la glucosa en sus experimentos en campos de investigación metabólicos y otros.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Dvir Mintz DVM y al personal veterinario y ganadero de la instalación para animales, así como a los miembros de nuestro grupo, por las fructíferas discusiones. Este estudio fue apoyado por una subvención 1541/21 de la Fundación de Ciencias de Israel otorgada a D.B.Z. D.B.Z. es una facultad de Zuckerman STEM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2% Chlorhexidine Gluconate and 70% Isopropyl Alcohol | 3M | ID 7000136290 | |
| 5% Dextrose and 0.45% Sodium Chloride Injection, USP | Braun | L6120 | |
| Castroviejo needle holder | FST | 12061-02 | |
| Extra Fine Bonn scissors | FST | 14084-08 | |
| FreeStyle Libre 1 reader | Abbott | ART27543 | |
| FreeStyle Libre sensor | Abbott | ART36687 | |
| FreeStyle Libre sensor applicator | Abbott | ART36787 | |
| Gauze pads | Sion medical | PC912017 | |
| Graefe Forceps | FST | 11052-10 | |
| Hair Removal Cream | Veet | 3116523 | |
| High-fat high-sucrose diet | Envigo Teklad diets | TD.08811 | |
| Isoflurane, USP Terrell | Piramal | 26675-46-7 | |
| Meloxicam 5 mg/mL | Chanelle Pharma | 08749/5024 | |
| MiniARCO Clipper kit | Moser | CL8787-KIT | |
| PROLENE Polypropylene Suture 5-0 | Ethicon | 8725H | |
| Puralube Opthalmic Ointment | Perrigo | 574402511 | |
| Q-tips | B.H.W | 271676 | |
| SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System | Kent Scientific | SOMNO |
References
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