Summary
Här beskriver vi en enkel metod för att implantera en kommersiell kontinuerlig glukosmonitor utformad för patienter på möss och tillhandahåller skript för att analysera resultaten.
Abstract
Möss är en vanlig modellorganism som används för att studera metaboliska sjukdomar som diabetes mellitus. Glukosnivåer mäts vanligtvis genom svansblödning, vilket kräver hantering av mössen, orsakar stress och ger inte data om fritt betande möss under den mörka cykeln. Toppmodern kontinuerlig glukosmätning hos möss kräver att en sond sätts in i musens aortabåge, liksom ett specialiserat telemetrisystem. Denna utmanande och dyra metod har inte antagits av de flesta laboratorier. Här presenterar vi ett enkelt protokoll som involverar användning av kommersiellt tillgängliga kontinuerliga glukosmonitorer som används av miljontals patienter för att mäta glukos kontinuerligt i möss som en del av grundforskningen. Den glukosavkännande sonden sätts in i det subkutana utrymmet på baksidan av musen genom ett litet snitt på huden och hålls på plats tätt med ett par suturer. Enheten sys på mushuden för att säkerställa att den förblir på plats. Enheten kan mäta glukosnivåer i upp till 2 veckor och skickar data till en närliggande mottagare utan att behöva hantera mössen. Skript för grundläggande dataanalys av registrerade glukosnivåer tillhandahålls. Denna metod, från kirurgi till beräkningsanalys, är kostnadseffektiv och potentiellt mycket användbar i metabolisk forskning.
Introduction
Diabetes mellitus (DM) är en förödande sjukdom som kännetecknas av höga blodsockernivåer. Typ 1 DM kan vara ett resultat av en autoimmun attack på de insulinproducerande betacellerna i bukspottkörteln. Typ 2 DM och graviditets-DM, å andra sidan, kännetecknas av ett misslyckande av betacellerna att utsöndra tillräckligt med insulin som svar på en ökning av glukosnivåerna1. Musen är en vanlig modellorganism som används för att studera DM eftersom den har liknande fysiologi och dess normala glukosnivåer ligger nära människors. Dessutom kan specifika musstammar utveckla DM på grund av mutationer i viktiga signalvägar eller efter exponering för specifika dieter, vilket möjliggör sjukdomsmodellering 2,3,4.
Blodglukos mäts vanligen hos möss med hjälp av glukometrar avsedda för patienter genom att extrahera en liten droppe blod (1-2 μL) från spetsen av musens svans. Denna metod orsakar stress och kräver hantering av musen, vilket påverkar glukosnivåerna och förbjuder mätning av blodsockernivåer hos fritt betande möss eller när forskaren inte är nära5. Blödning av möss kan orsaka stress hos närliggande möss, särskilt hos möss i samma bur vars glykemi ännu inte har mätts, vilket påverkar resultaten. Möss svarar olika beroende på hanterare, och den person som mäter glukos kan påverka glukosnivåerna hos mössen. Dessa fallgropar kräver noggrann experimentell design och ligger till grund för vissa inkonsekvenser mellan experiment.
Det är möjligt att mäta glukos i fritt rörliga möss utan blödning genom att implantera glukossensorer i mössens aortabåge med hjälp av toppmodern telemetri6. De resulterande mätningarna är mycket bra och kan upprätthållas under en lång period, men det är utmanande att implantera dessa sensorer, och telemetrisystemet är dyrt, vilket leder till en måttlig användning av denna metod och ingen adoption i icke-specialiserade laboratorier. Subkutana eller andra glukossensorer som är skräddarsydda för mössens dimensioner och deras fysiologi har utvecklats de senaste åren, men dessa kräver återigen högkvalificerade experter och är i vissa fall kostsamma 6,7,8,9,10.
Kommersiella kontinuerliga glukosmonitorer (CGM) som ursprungligen utvecklades för att övervaka glukosnivåerna hos DM-patienter erbjuder ett annat alternativ för att mäta glukos i fritt rörliga möss, med lägre kostnad och tekniska expertkrav än implanterade sonder. Sådana sonder har använts i grundforskning av några laboratorier 5,11,12,13,14,15 inklusive våra kollegor som använde detta protokoll 16. Dessa enheter inkluderar vanligtvis en sensor, en monteringsenhet, en mottagare och ett program. Sensorn har en kanyl som styr den enzymatiska glukosensorn, tejp, en energikälla, korttidsminne och en trådlös kommunikationsmodul som lagrar och skickar data till mottagaren. Mottagaren kan visa aktuella glukosnivåer och skickar data till en server; Denna mottagare kan vara en mobiltelefon. Programvaran tillhandahåller data för patienten och sjukvårdsteamet om patientens glykemi. Hos patienter fästs sensorn enkelt med monteringsanordningen. Kanylen sätts in subkutant genom att trycka monteringsanordningen mot huden, och sensorn förblir på plats med hjälp av tejp.
Detta är ett detaljerat protokoll för att anpassa en kommersiell CGM-enhet för att mäta glukosnivåer hos möss. Detta protokoll beskriver hur man kirurgiskt sätter in glukossensorn och fäster den på musen. Skript för grundläggande dataanalys och datavisualisering tillhandahålls. Potentiella fallgropar, felsökning och exempel på standardresultat tillhandahålls. Protokollet nedan är specifikt för en viss CGM men kan enkelt anpassas till andra typer av kommersiella CGM när de blir tillgängliga.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Experimenten godkändes av Hebrew University's Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
OBS: Alla verktyg måste steriliseras och hantering av kanylen måste utföras med steril teknik. Protokollet nedan är finjusterat till en specifik CGM. Protokollet kan anpassas till andra CGM.
1. Analgetisk administrering före proceduren
- Administrera 5 % dextros och 0,45 % saltlösning med meloxikam subkutant 5 mg/kg kroppsvikt.
2. Administrering av anestesi
- Placera musen i induktionskammaren och stäng locket ordentligt. Ställ in induktionen av anestesi i induktionskammaren på 3% isofluran vid en flödeshastighet på 500 ml/min.
- När musen inte svarar tar du bort musen från kammaren och monterar näskonen på musen. Bekräfta anestesinivån med en interdigital nypa. Ställ in koncentrationen på 1%-1,5% isofluran och flödeshastigheten till 100 ml/min i en mus som väger 30 g.
- Applicera oftalmisk salva i ögonen för att förhindra torrhet under anestesi.
3. Förberedelse av sensor
- Montera sensorn på sensorns monteringsenhet för att exponera sensorns tejp och kanylsida (bild 1A). Var försiktig eftersom nålen förs in i kanylen och exponeras.
- Suturera två 5-0 koniska punktsuturer till tejpen på båda sidor av kanylen (figur 1A).
4. Hårborttagning och desinfektion
- Raka en yta på ca 4 cm x 4 cm på mittlinjen på musens baksida.
- Administrera en hårborttagningskräm till det rakade området för att säkerställa fullständig hårborttagning.
- Torka av huden och desinficera den med en antiseptisk lösning innehållande 2% klorhexidinglukonat och 70% isopropylalkohol.
5. Förberedelse av dorsal hud
- Gör ett snitt på 2 mm i mitten av det rakade området ovanför ryggraden med en vass sax (figur 1B).
- Sätt kortfattat in små pincett med en trubbig kant under huden för att bilda en liten subkutan ficka så att kanylen lätt kan sättas in i den subkutana fickan (figur 1B).
- För en sutur från steg 3.2 genom huden på vardera sidan av snittet (figur 1C).
6. Insättning av sensor
- Ta bort sensorn helt från sensorns monteringsenhet (kanylen är tom från nålen) och håll sensorn med pincett för att förhindra att den omgivande tejpen fastnar på sig själv.
- Sätt försiktigt in kanylen i den subkutana fickan.
- Dra i suturerna på varje sida och dra åt och knyt dem för att fästa sensorn ordentligt på plats, vilket förhindrar att kanylen glider ut ur den subkutana fickan när tejpen lossnar med tiden.
7. Sensorfäste och suturering
- Fäst sensorn ordentligt på baksidan genom att binda de inre suturerna och använda tejpen som omger sensorn.
- Gör åtta diskontinuerliga suturer runt sensorn och fäst kanten på sensorns tejp på huden (figur 1D).
8. Aktivering av läsaren
- När sensorn har satts in aktiverar du läsaren genom att slå på läsaren, trycka på Starta ny sensor och svepa sensorn enligt tillverkarens instruktioner.
- Den första avläsningen kan bara tas några minuter efter installationen av CGM. När det gäller denna CGM kan den första avläsningen göras efter 60 minuter.
9. Läsa resultat
- Placera läsaren nära musen (du behöver inte röra den). All data som lagras i sensorn överförs till läsaren.
Olika CGM-enheter kan skilja sig åt under perioden med historisk datasparande kapacitet. När det gäller denna CGM kan högst 8 timmar lagras mellan två avläsningar.
10. Ta bort sensorn
- Bedöva musen (se avsnitt 2).
- Klipp suturerna som ansluter sensorn till musens baksida med en vass sax.
- Ta bort och skär suturerna vid snittet genom att försiktigt ta bort sensorn.
- Använd vid behov en enda sutur för att stänga snittet på baksidan av musen.
11. Analys av data
- Nedladdning av data: Ladda ned data enligt instruktionerna från CGM-tillverkaren.
Varje CGM har ett annat format, som kanske eller inte är lättillgängligt för användaren. Detta är en viktig faktor vid valet av CGM. - För analys med den medföljande programvaran, formatera data enligt instruktionerna i readme-filen på Github (https://github.com/mika-littor/CGM-in-Mice-Analysis.git).
Bild 1: Fäst sensorn på musen . (A) Två suturer markerade med röda pilar förs genom sensortejpen på båda sidor av kanylen på undersidan av CGM-sensorn, markerade med en vit pil. (B) Ett litet snitt på 2 mm görs i mitten av det rakade området längs ryggraden med en vass sax. Små pincett med en trubbig kant sätts kort in under huden för att bilda en liten subkutan ficka så att kanylen kan sättas in subkutant. (C) Samma suturer från A passeras subkutant på vardera sidan av snittet. De röda pilarna markerar suturerna som är fästa vid sensorn som i A, de blå pilarna markerar platsen suturerna passerade till huden på baksidan av musen och den svarta pilen visar snittet. (D) Efter att kanylen har satts in dras de inre suturerna åt och knyts nära snittet för att säkra CGM. Sensorn sys sedan till huden. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kirurgiskt resultat
Resultat från åtta HSD: ICR-möss (i åldern 8 veckor) matade en fettrik högsackarosdiet (HFHS) i 18 veckor och fem magra HSD: ICR-möss (i åldern 12 veckor) visas. Enheten vi använde lagrar data i upp till 8 timmar. Tillgång till den lokala djuranläggningen begränsades till 07:00-19:00, vilket förbjöd datainsamling under de sena PM-timmarna, när mössen är aktiva. Mössen placerades därför i ett rum med omvänd belysning i 7 dagar före det kirurgiska ingreppet, med mörka timmar mellan 8:30 och 20:30. Detta är inte nödvändigt för alla enheter eller djuranläggningar, och vi rekommenderar att du använder enheter som kan lagra information i över 12 timmar.
Det fanns ingen dödlighet efter operationen. Operationen ledde till en viktminskning på cirka 10% under experimentets tid (figur 2A). Därför bör mätningarna som görs under de första dagarna efter operationen, under viktminskning, tolkas med försiktighet. Viktminskning berodde inte på mössens oförmåga att nå mat och vatten. Jämförelsen av CGM-mätningar och mätningar av blodsocker med svansspets visade god överensstämmelse i fastande och icke-fastande tillstånd (figur 2B). CGM var aktiv i genomsnitt 11 dagar (figur 2C). Det maximala antalet dagar för denna typ av enhet är 14 dagar. När enheten blev inaktiv tidigare berodde det inte på att CGM föll av.
Figur 2: Allmänna resultat av att tillämpa CGM. (A) Genomsnittlig viktminskning under den tid CGM var aktiv. n = 8 möss. (B) Den genomsnittliga skillnaden mellan glukosavläsningarna med den handhållna glukometern och CGM-anordningen. Skillnaden skilde sig inte signifikant från 0 mg/dl. n = 10 avläsningar i sex möss. (C) Den genomsnittliga tid CGM var aktiv under i n = 8 möss. Felstaplar representerar medelvärdets standardfel. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Rå utgång
Glukosnivåerna för en enda dag visas på ett diagram som produceras av CGM-programvaran (figur 3A). Data från några dagar kan ses med hjälp av den angivna koden (figur 3B). Vi visar data från 3 dagar för tydlighetens skull.
Figur 3: Dataanalys . (A) Kommersiell produktion. Data samlades inte in mellan 18:00 och midnatt. Det skuggade området visar normoglykemivärden hos patienter, som ligger mellan 70-100 mg / dL. (B) Rådata på 3 dagar från en enda mus med hjälp av den angivna koden. Observera skillnaden i skala i y-axeln mellan A och B. Axelparametrarna och alla andra parametrar kan moduleras i koden. Data för 3 dagar visas för tydlighet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Analys
När data har extraherats kan analysen göras med hjälp av den medföljande koden eller någon annan specialbyggd programvara. Nedan visas medelvärdet (figur 4A, C) och median (figur 4B, D) glukosnivåer vid varje tidpunkt för en enda mus. Ett skjutfönster kan användas för att jämna ut tomten. Endast två möss visas för tydlighet.
Bild 4: Utdata för dataanalys med hjälp av de medföljande skripten . (A) Medelvärde och (B) medianglukosnivåer vid varje tidpunkt i en specifik mus. Det skuggade området anger standardavvikelsen i glukosnivåer. (C) Medelvärde och (D) medianglukosnivåer från två möss. Endast två möss visas för tydlighet. En streckad linje anger övergången från ljus (20:30-08:30) till mörk (8:30-20:30). Ett skjutfönster på 20 minuter användes för att jämna ut kurvan. Fönstrets storlek och alla parametrar kan ändras i koden. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll erbjuder en enkel, billig metod för att övervaka glukosnivåer hos möss som inte kräver utmanande mikrokirurgi och inte innebär blödning eller hantering av mössen. Metoden är lätt att implementera i alla anläggningar och orsakar inte dödlighet, smärta eller alltför obehag för mössen. Det mest kritiska steget i protokollet är att sätta in kanylen på glukossensorn under musens hud. Tillägget av några suturer gör att kanylen kan stanna på plats under en längre tid. Sensorerna är små och kan blockeras eller tappas bort när musen rör sig. Sensorn måste säkras av de inre suturerna och fästas på musens baksida med några suturer. Protokollet kan anpassas till många kommersiella CGM-system.
Mössen gick ner i vikt efter operationen, vilket förväntas efter operationen och kan associeras med stressen vid operation och anestesi, bördan att bära enheten och det enda hölje som införs av det specifika protokollet som används i denna studie. Eftersom CGM-enheter blir gradvis lättare och mer exakta förväntas dessa effekter bli mindre. Vi observerade att möss som bar CGM rörde sig fritt i buren och nådde matpellets som krävde klättring. Metoden begränsas av varje CGM:s förmåga att fungera över tid. Forskare bör övervaka viktminskning och överväga fördelarna och nackdelarna med denna metod jämfört med standardalternativ som kräver frekvent hantering och blödning av mössen, vilket förutsätter att blödning av en mus har liten effekt på sina grannars glykemi och involverar mätning av glukosnivåer i ett stressigt tillstånd under dagtid.
Protokollet som beskrivs ovan är ganska enkelt, snabbt och skalbart. Det kräver ingen speciell inställning i djuranläggningen eller dyr utrustning, kan användas parallellt med andra förfaranden som ingår i experimentet och kan användas på vilken genetisk bakgrund som helst eller med någon näring. Dataanalysskript tillhandahålls för att underlätta analys av forskargrupper som är mindre erfarna inom dataanalys. Förhoppningsvis kommer detta detaljerade protokoll och dataanalysskript att göra det möjligt för andra laboratorier att mäta glukos i sina experiment inom metaboliska och andra forskningsområden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Dvir Mintz DVM och veterinär- och djurhållningspersonalen i djuranläggningen, liksom medlemmar i vår grupp, för givande diskussioner. Denna studie stöddes av ett Israel Science Foundation-bidrag 1541/21 som tilldelades DBZ. DBZ är en Zuckerman STEM-fakultet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2% Chlorhexidine Gluconate and 70% Isopropyl Alcohol | 3M | ID 7000136290 | |
| 5% Dextrose and 0.45% Sodium Chloride Injection, USP | Braun | L6120 | |
| Castroviejo needle holder | FST | 12061-02 | |
| Extra Fine Bonn scissors | FST | 14084-08 | |
| FreeStyle Libre 1 reader | Abbott | ART27543 | |
| FreeStyle Libre sensor | Abbott | ART36687 | |
| FreeStyle Libre sensor applicator | Abbott | ART36787 | |
| Gauze pads | Sion medical | PC912017 | |
| Graefe Forceps | FST | 11052-10 | |
| Hair Removal Cream | Veet | 3116523 | |
| High-fat high-sucrose diet | Envigo Teklad diets | TD.08811 | |
| Isoflurane, USP Terrell | Piramal | 26675-46-7 | |
| Meloxicam 5 mg/mL | Chanelle Pharma | 08749/5024 | |
| MiniARCO Clipper kit | Moser | CL8787-KIT | |
| PROLENE Polypropylene Suture 5-0 | Ethicon | 8725H | |
| Puralube Opthalmic Ointment | Perrigo | 574402511 | |
| Q-tips | B.H.W | 271676 | |
| SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System | Kent Scientific | SOMNO |
References
- Polonsky, K. S. The past 200 years in diabetes. New England Journal of Medicine. 367 (14), 1332-1340 (2012).
- Rees, D. A., Alcolado, J. C.
- Pearson, J. A., Wong, F. S., Wen, L. The importance of the non-obese diabetic (NOD) mouse model in autoimmune diabetes. Journal of Autoimmunity. 66, 76-88 (2016).
- Heydemann, A. An overview of murine high fat diet as a model for Type 2 diabetes mellitus. Journal of Diabetes Research. 2016, 2902351 (2016).
- Kennard, M. R., et al. The use of mice in diabetes research: The impact of experimental protocols. Diabetic Medicine. 38 (12), 14705 (2021).
- Klueh, U., et al. Continuous glucose monitoring in normal mice and mice with prediabetes and diabetes. Diabetes Technology and Therapeutics. 8 (3), 402-412 (2006).
- Wuyts, C., Simoens, C., Pinto, S., Philippaert, K., Vennekens, R. Continuous glucose monitoring during pregnancy in healthy mice. Scientific Reports. 11, 4450 (2021).
- Korstanje, R., et al. Continuous glucose monitoring in female NOD mice reveals daily rhythms and a negative correlation with body temperature. Endocrinology. 158 (9), 2707-2712 (2017).
- Han, B. G., et al. Markers of glycemic control in the mouse: Comparisons of 6-h-and overnight-fasted blood glucoses to Hb A1c. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 295 (4), 981-986 (2008).
- Xie, X., et al. Reduction of measurement noise in a continuous glucose monitor by coating the sensor with a zwitterionic polymer. Nature Biomedical Engineering. 2 (12), 894-906 (2018).
- Van Der Meulen, T., et al. Urocortin3 mediates somatostatin-dependent negative feedback control of insulin secretion. Nature Medicine. 21 (7), 769-776 (2015).
- Peterson, Q. P., et al. A method for the generation of human stem cell-derived alpha cells. Nature Communications. 11, 2241 (2020).
- Klueh, U., Liu, Z., Feldman, B., Kreutzer, D. Interstitial fluid physiology as it relates to glucose monitoring technologies: Importance of Interleukin-1 and Interleukin-1 receptor antagonist in short-term glucose sensor function in vivo. Journal of Diabetes Science and Technology. 4 (5), 1073 (2010).
- Klueh, U., Antar, O., Qiao, Y., Kreutzer, D. L. Role of interleukin-1/interleukin-1 receptor antagonist family of cytokines in long-term continuous glucose monitoring in vivo. Journal of Diabetes Science and Technology. 7 (6), 1538 (2013).
- Klueh, U., Kaur, M., Qiao, Y., Kreutzer, D. L. Critical role of tissue mast cells in controlling long-term glucose sensor function in vivo. Biomaterials. 31 (16), 4540-4551 (2010).
- Kogot-Levin, A., et al. Mapping the metabolic reprogramming induced by sodium-glucose cotransporter 2 inhibition. JCI Insight. , 164296 (2023).
