Summary
Burada, lazerle indüklenen yaralama üzerine bağırsak görüntülerini elde etmek için bir yöntem sunuyoruz. Fare bağırsağını bir multifoton lazere maruz bırakarak, tek veya birden fazla kript (ler) in kaybı yerel olarak indüklenir. Hasarlı bölgeyi aylar boyunca tekrar tekrar görüntüleyerek, bağırsak iyileşmesinin gerçek zamanlı dinamikleri yakalanır.
Abstract
Bağırsak iyileşmesini in vivo olarak araştırmak mükemmel bir teknik zorluktur. Uzunlamasına görüntüleme protokollerinin eksikliği, bağırsak rejenerasyonunu düzenleyen hücre ve doku ölçeği dinamiklerine daha derin bir bakış açısı getirmiştir. Burada, tek kript ölçeğinde lokal olarak doku hasarını indükleyen ve canlı farelerde bağırsak epitelinin rejeneratif tepkisini takip eden intravital bir mikroskopi yöntemini tanımladık. Tek kriptler veya daha büyük bağırsak alanları, zaman ve mekan kontrollü bir şekilde yüksek yoğunluklu bir multifoton kızılötesi lazer tarafından ablatlandı. Daha sonraki uzun süreli tekrarlayan intravital görüntüleme, zaman içinde hasarlı alanların izlenmesini sağladı ve birkaç haftalık bir süre boyunca doku iyileşmesi sırasında kript dinamiklerinin izlenmesine izin verdi. Lazerle indüklenen hasar üzerine komşu dokuda kript fisyonu, füzyonu ve kaybolması gibi kript yeniden şekillenme olayları gözlendi. Bu protokol, yaşlanma ve tümör başlangıcı gibi hem homeostatik hem de patofizyolojik ortamlarda kript dinamiklerinin incelenmesini sağlar.
Introduction
Bağırsağın epitel astarı, epitel bariyerinin bozulmasına neden olabilecek mide asitleri, toksinler ve mikrobiyota tarafından sürekli olarak zorlanır. Bağırsak yapısı ve doku organizasyonu, sürekli kendini yenilemek ve hasarları onarmak için uzmanlaşmıştır. İnce bağırsağın tek katmanlı epiteli, kript-villus üniteleri1 olarak düzenlenir. Homeostazda, kriptin tabanında bulunan kendini yenileyen Lgr5 + bağırsak kök hücreleri, farklılaşmış soylara yol açar. Farklılaşmış yavru hücreler, villus ekseninin ucuna bir konveyör bant tarzında hareket eder, burada bağırsak astarı 3-5 gün içinde doldurulur 2,3. Uzun vadede, tüm Lgr5+ hücreleri doku yenilenmesine eşit derecede katkıda bulunmaz, çünkü bu aynı zamanda hücrelerin taşıyıcı banttan kriptin tabanına doğru hareket etme kabiliyetine de bağlıdır (yani, retrograd hareket)4,5. Gerçekten de, Lgr5 + hücrelerinin örneğin radyasyon ile ablasyonu üzerine, kript tabanının dışındaki progenitör hücreler, kökhücre havuzunu 6,7,8'i farklılaştırmak ve yenilemek için tabana doğru hareket eder.
Akut inflamasyon Lgr5+ kök hücre kaybına neden olabilir 9,10. Kök hücre kaybına ek olarak, birçok dış faktör kript ölçeğinde epitelyumda akut hasara neden olabilir. Radyasyon, kimyasal tedaviler ve antibiyotiklerin bağırsak kriptlerine ve villuslara zarar verdiği gösterilmiştir11. Daha geniş kript ve villus alanları bakteriyel, viral ve paraziter enfeksiyonlardan etkilenebilir12. Bağırsak, kript fisyonu (bir kriptin ikiye bölünmesi) ile kript ölçeğindeki iç ve dış hasarlardan kurtulma konusunda olağanüstü bir yeteneğe sahiptir13. Yaralanma üzerine, hasara bitişik alandaki kriptler, kript numaralarını yenilemek için fisyona uğrar. Bu fenomen, daha az ölçüde olsa da, homeostaz14,15 sırasında da ortaya çıkar. Homeostaz sırasında kript sayılarındaki potansiyel bir artışı dengelemek için, kriptler de kaynaşabilir (iki kriptoyu bir araya getirerek)16,17. Kript füzyonunun, yaralamadan sonra kriptol numaralarının yeniden kurulmasında da rol oynayıp oynamadığı bilinmemektedir. Dahası, bu sürecin dinamikleri ve düzenleyici faktörleri açıklığa kavuşturulmaya devam etmektedir.
Yaralanma modelleri, in vivo doku rejenerasyonunu incelemek için vazgeçilmezdir. Bağırsak dokusu rejenerasyonunu incelemek için çeşitli yaralanma modelleri kullanılmıştır. Önceki deneysel stratejiler, kök hücre havuzlarını tüketmek için yüksek dozda radyasyon kullandı18 veya farelerde kronik ve akut kolit ve kript kaybını indüklemek için dekstran sülfat sodyum (DSS) ile tedavi19,20. Genetik veya optik yollarla tek hücreli ablasyon, doku hasarını iyileştirmek için kullanılmış ve kök ve progenitör hücrelerin rolünü çözmek için çekici bir araç olarak kabul edilmiştir 21,22 ve vasküler rejenerasyonu incelemek23. Ek olarak, birkaç kript ve villus24'ün daha geniş alanlarında hasara neden olmak için bir biyopsi-yaralanma sistemi geliştirilmiştir. Önemli olarak, zararlı hakarete verilen yanıt, radyasyon için bildirildiği gibi, bağırsağın proksimal-distal ekseni boyunca değişebilir, bu da ince bağırsakta kolon25'ten daha fazla hasara neden olmuştur. Bu, hem zararlı hakaretin derecesini hem de bağırsak sistemindeki lokalizasyonunu kontrol eden hedefli yöntemlere duyulan ihtiyacı vurgulamaktadır.
Hasar derecesi ve iyileşme geleneksel olarak statik yollarla değerlendirilmiştir, bu da doku iyileşmesinin dinamikleri hakkında sınırlı bilgi sağlar. İntravital mikroskopi (IVM), birçok organda kök hücre davranışını, epitel yeniden şekillenmesini ve yenilenmesini ölçmek için eşsiz fırsatlar açmıştır 26,27,28,29,30 ve bağırsak biyolojisi 4,5,21,31,32,33,34, 35,36.
Burada, mekansal zamansal tanımlı bağırsak hasarına neden olmak ve bağırsak epitel astarının iyileşmesini yakalamak için bir yöntem tarif ediyoruz. Bağırsak kriptlerine zarar vermek için iki foton bazlı lazer ablasyonu kullanıyoruz ve tekrarlayan intravital mikroskopi ile anında yara tepkisini ve uzun süreli iyileşmeyi takip ediyoruz. Protokolümüz, lokal doku hasarına yanıt olarak bağırsak dokusu mimarisinin rejeneratif yeniden şekillenmesini haritalandırmaya izin verir. Fisyon ve füzyon olayları da dahil olmak üzere kript dinamikleri, zaman içinde kolayca ölçülebilir ve izlenebilir. Lazer ablasyon ve tekrarlayan intravital görüntüleme uygulamaları, homeostaz ve tümör başlangıcı gibi patofizyoloji sırasında bağırsak mimarisinin doku ölçeği dinamiklerini araştırmak için bir platform olarak kullanılabilir.
Protocol
Bu çalışmada açıklanan tüm hayvan deneyleri, Hollanda Kanser Enstitüsü (NKI) Hayvan Refahı Kurumu'nun (AWB) yönergelerine ve onayına uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
NOT: Herhangi bir hayvan deneyi yapmadan önce enstitünün hayvan etik kuruluna danışınız.
1. Ameliyat ve intravital görüntüleme için hazırlık
- Ameliyat öncesi tedaviler
- 8-12 haftalık K19-CreERT237: Rosa26-mTmG 38 ve Lgr5eGFP-IRES-CreERT218: Rosa26-Konfeti39 fareyi, ameliyattan 4-6 hafta önce intraperitoneal olarak ayçiçek yağında çözünmüş tamoksifen enjekte ederek indükleyin (Şekil 1).
- Analjezi uygulayın. Ameliyattan 30 dakika önce 30 g fare başına NaCl içinde %0,9 oranında seyreltilmiş 200 μL buprenorfin (0,1 mg/kg vücut ağırlığı) enjekte edin. Ameliyattan 24 saat önce 125 mL asitlenmemiş otoklavlanmış içme suyu içeren bir şişede karprofen (0.067 mg / mL) uygulayın. Alternatif olarak, ameliyatın başlamasından 30 dakika önce deri altından (5 mg / kg) bir karprofen enjeksiyonu uygulayın.
- Ameliyata hazırlık
- Biyolojik tehlike kabinine otoklavlanmış steril cerrahi aletleri tanıtın.
- Isıtma yastığını açın ve sıcaklığı 37 ° C'ye ayarlayın.
- İntravital görüntüleme için hazırlık
- Sıcaklık stabilizasyonu için yeterli zamana izin vermek için görüntülemeden en az 4 saat önce mikroskobun sıcaklık kontrollü odasını açın.
NOT: Gereken süre, kullanılan makineye bağlı olarak değişebilir. - İklim odasının içindeki sıcaklığı 37 ° C'de sabit tutun.
- İki fotonlu mikroskopu, tarayıcıyı ve lazeri açın.
- Görüntüleme yazılımını başlatın.
- Lazerin dalga boyunu 960 nm'ye ayarlayın ve deklanşörü açın.
- Sıcaklık stabilizasyonu için yeterli zamana izin vermek için görüntülemeden en az 4 saat önce mikroskobun sıcaklık kontrollü odasını açın.
2. Cerrahi ve intravital görüntüleme
- Bağırsağın cerrahi maruziyeti
- Fareyi% 2 -% 3 izofluran kullanarak uyuşturun ve steril bir bezle kaplı bir ısıtma yastığına yerleştirin. Solunumun sıklığını ve kalitesini (bir nefes/saniye) değerlendirerek ve farenin refleksini kontrol ederek anestezinin derinliğini kontrol edin.
- Farenin gözlerini göz merhemi ile örtün.
- Deri altından 200 μL önceden ısıtılmış steril salin enjekte edin.
- Karnı tıraş edin ve saçları çıkarın. Ameliyat bölgesindeki steril bezi değiştirin.
- Farenin sıcaklığını izlemek için bir rektal prob takın.
NOT: Sıcaklık yaklaşık 37 °C olmalıdır. - Yeni bir çift steril eldiven giyin.
- Cerrahi alanı, alternatif antiseptik solüsyon fırçaları ve ardından üç kez% 80 etanol ile dairesel bir şekilde temizleyin. Fazla etanolün steril bir pamuklu çubukla çıkarılması.
NOT: Bu noktada fareyi hipotermi açısından izlemek çok önemlidir. - Fareyi steril bir cerrahi örtü ile örtün.
- Farenin refleksini kontrol edin.
- Steril bir neşter kullanarak deriden ~ 10 mm'lik dikey orta hat kesisi yapın.
- Rektus abdominis kaslarını ayırmak ve karnı açmak için makas kullanarak linea alba'yı kesin.
- Referans noktası olarak kullanmak için steril önceden ısıtılmış salin içine batırılmış steril pamuklu çubuklar kullanarak farenin çekumunu bulun.
- Bir parça steril gazlı bez içinde küçük bir kesim yapın, önceden ısıtılmış steril salin içinde ıslatın ve insizyonun üzerine yerleştirin.
- Önceden ısıtılmış steril salin içine batırılmış steril pamuklu çubuklarla bağırsağı çıkarın. Steril önceden ısıtılmış salin ekleyerek bağırsağı nemli tutun.
- Farenin yanına steril bir özel yapım görüntüleme odası yerleştirin.
- Fareyi önceden ısıtılmış steril görüntüleme kutusuna aktarın.
- Bağırsağı görüntüleme kutusunun steril camına yerleştirin. Farenin kafasını, Şekil 1'de gösterildiği gibi görüntüleme kutusunun inhalasyon tüpünün içine yerleştirin.
- Gerekirse, fareyi steril esnek film ve bantla sabitleyin.
- Fareyi içeren görüntüleme kutusunu mikroskop odasına yerleştirin.
- İntravital görüntüleme
- Her 15 dakikada bir rektal prob ile solunum sıklığını ve derinliğini ve sıcaklığı kontrol ederek görüntüleme sırasında fareyi izleyin. İzofluran yüzdesi% 1 -% 2 arasında tutulmalıdır. Gerekirse ayarlayın.
- Mikroskobun göz merceğini kullanarak bağırsakta bir bölge bulun.
- Şekil 2A'da görüldüğü gibi, mikroskopun dahili kamerasını kullanarak ilgilenilen bölgenin geniş alan görünümünü elde edin.
- Çoklu foton mikroskobunun 960 nm lazerini kullanarak ilgilenilen bölgeyi görüntüleyin. Lazer gücünü ve dalga boyunu deneyde kullanılan floroforlara göre ayarlayın.
- İlgilenilen bölgenin 3 μm'lik 10-20 adımlı bir z-yığını elde edin.
- Lazer ablasyon
- Daha önce görüntülenen kutucuktan tek bir konum veya birden fazla konum seçin.
- Görüntüleme yazılımındaki ağartıcı noktası kalibrasyon işlevini, hedeflenen hasarın boyutuna bağlı olarak 3-10 sn için çift yönlü tarama özelliğini kullanarak 400 Hz tarama hızıyla 32 ve 124 x 124 piksel çözünürlükte kullanın. Kript alanındaki hasarın başlaması, hem yeşil hem de kırmızı kanallardaki otofloresandaki artışla tanınabilir.
- Aynı faredeki birden çok bölge için önceki iki adımı yineleyin.
- Ablasyondan sonra, hasarın yerini ve kapsamını doğrulamak için hasarlı bölgelerin z-yığınlarını edinin.
- Cerrahi bölgenin kapatılması
- Fareyi hala anestezi altındayken steril bir dikiş alanına yerleştirin.
- Açıkta kalan bağırsağı, önceden ısıtılmış steril tuzlu suya batırılmış steril pamuklu çubuklar kullanarak tekrar karın içine yerleştirin.
- Emilebilir bir 5-0 sütür kullanarak basit bir sürekli sütür uygulayarak linea alba'yı dikin. Dikişin ekstremitelerini cerrahi düğümlerle kapatın.
- Aynı adımı cilt tabakasıyla tekrarlayın.
- İzofluran istasyonunu kapatın ve görüntüleme kutusunu ve kakmayı temizleyin ve sterilize edin.
- Ameliyat aletlerini cerrahi alet temizleyici, enzimatik temizleyici ve cerrahi alet yağlayıcısı ile temizleyin. Kurutulduğunda, ameliyat aletlerini otoklavdaki ameliyat kutusuyla birlikte sterilize edin.
- Ameliyat sonrası bakım
- Kafes ~ 1 saat boyunca ısıtma yastığına yerleştirilirken farenin ameliyattan kurtulmasına izin verin.
NOT: Mümkünse fareyi diğer kafes montaj ilişkileriyle birlikte yerleştirin. İyileşme için yalnız konut gerekli değildir. - Kurtarma sırasında farenin sıcaklığını her 15 dakikada bir kontrol edin.
- Ameliyattan 6-12 saat sonra 30 g fare başına NaCl içinde% 0.9 oranında seyreltilmiş 200 μL buprenorfin (0.1 mg / kg vücut ağırlığı) enjekte edin.
- Ameliyat sonrası 72 saat boyunca 125 mL asitlenmemiş otoklavlanmış içme suyu içeren bir şişede karprofen (0.067 mg / mL) uygulayın.
- Fareyi tartın ve ameliyat sonrası 1 hafta boyunca her gün refahı izleyin.
- Kafes ~ 1 saat boyunca ısıtma yastığına yerleştirilirken farenin ameliyattan kurtulmasına izin verin.
3. Tekrarlayan cerrahi ve intravital görüntüleme
- Ameliyat
- İkinci zaman noktasında (ilk görüntüleme seansından en az 1 hafta sonra), 1.1.2, 1.2, 1.3 ve 2.1 adımlarını tekrarlayın.
- İntravital görüntüleme
- 2.2.1-2.2.3 arasındaki adımları yineleyin.
- İlk zaman noktasında görüntülenen aynı ilgi bölgelerini bulmak için kan damarlarının modelini kullanın.
- 2.2.4 ve 2.2.5 numaralı adımları yineleyin.
- Cerrahi bölgenin kapatılması
- 2.4.1 adımını yineleyin.
- Farenin başka bir zaman noktasında görüntülenmesi amaçlanmamışsa, terminal anestezi altında servikal çıkık gerçekleştirerek fareyi feda edin. Aksi takdirde, sonraki adımla devam edin.
NOT: AB Direktifi 2010/63/EU, Ek IV'ün yönergelerine göre, servikal çıkık kabul edilebilir bir yöntemdir. - 2.4.2-2.4.6 arasındaki adımları yineleyin.
- Ameliyat sonrası bakım
- 2.5.1-2.5.5 arasındaki adımları yineleyin.
Representative Results
İntravital görüntüleme ile kombine lazer ablasyon yönteminden elde edilebilecek sonuçların türünü göstermek için, Şekil 1'de gösterildiği gibi bir deney yaptık. İlk olarak, K19-CreERT2; mTmG (K19cre-mTmG) ve Lgr5eGFP-IRES-CreERT2 enjekte ettik; Rosa26-Konfeti (Lgr5cre-Konfeti) fareleri, hücreleri Konfeti renklerinden biriyle (veya mTmG fareler durumunda yeşil floresan proteini [GFP]) stokastik olarak etiketlemek için tamoksifenli fareler. K19-cre, tüm epitel hücrelerinden soy izlemeyi indüklerken, Lgr5-cre kök hücrelerden sadece 8,18,37 izlemeyi indükler. Tamoksifen enjeksiyonu, ameliyattan 4-6 hafta önce ve tüm hücrelerin belirli bir renk için monoklonal olduğu kriptler elde etmek için ilk görüntüleme seansından önce uygulandı. Aynı doku bölgelerinin birkaç hafta boyunca sağlam bir şekilde tanımlanması, aynı kriptlerin zaman içindeki kaderini izlemek için gereklidir. Vaskülatür gibi doğal doku mimari özellikleri, güvenilir doku işaretleri olarak kullanılabilir ve burada mikroskobun iç kamerasıyla kaydedilmiştir. Ek olarak, kriptlerin küçük bir kısmını (en az iki) farklı renklerle etiketlemek, her görüntüleme seansında aynı kriptlerin tanınmasına ve lazer hasarından sonra rejeneratif süreç sırasındaki davranışlarının takip edilmesine yardımcı oldu. Farenin bağırsağının cerrahi olarak açığa çıkarılması ve ilgilenilen bölgenin hem kamera hem de floresan görüntüleri elde edildikten sonra (Şekil 2A), multifoton lazerin ağartma noktası ayarları bir veya daha fazla kripti ablate etmek için kullanılabilir (Şekil 2B, C). Hasarın başlaması, hem yeşil hem de kırmızı kanallardaki otofloresandaki artışla tanınabilir. Kript iyileşmesinin dinamiklerini incelemek için, cerrahi ve görüntüleme prosedürü ilk görüntüleme seansından haftalar / aylar sonra tekrarlandı ve doku doğal yapıları (vaskülatür ve klonal olarak etiketlenmiş kriptlerin paternleri) yaralanmanın tam olarak aynı yerini bulmak için yer işaretleri olarak kullanıldı (Şekil 2). Bu yöntem, Lgr5-eGFP'nin yamalı bir şekilde ifade edildiği Lgr5Cre-Konfeti farelerde uygulandığında, lazer kaynaklı hasarı takiben kript sayılarındaki ve şekillerindeki değişiklikler yakalanabilir (Şekil 3). Bazı bölgeler kriptlerin sayısında ve yapısında herhangi bir değişiklik göstermezken (Şekil 3B), diğer bölgeler kript fisyonu ve füzyon olaylarının sayısında (Şekil 3C) ve lazerin neden olduğu yaralanmadan 2 hafta sonra kriptoların kaybında (Şekil 3D) görüldüğü gibi kapsamlı kript yeniden şekillenmesi göstermiştir. Farklı boyutlarda hasar getirerek ve (Şekil 3E) örnekte gösterildiği gibi, ablasyon sonrası fisyon, füzyon ve kaybolma olaylarını ölçerek, yaralanmaya bağlı rejenerasyonun dinamikleri farklı fare modellerinde haritalanabilir.
Şekil 1: Deney düzeneğinin şematik gösterimi. Bağırsak hücrelerinin in vivo etiketlemesi, bağırsak kriptlerinde Cre aracılı rekombinasyonu indüklemek için genetiği değiştirilmiş fare modellerinde tamoksifenin intraperitoneal olarak enjekte edilmesiyle elde edilir. Günler veya haftalar sonra (kriptler belirli bir renk için monoklonal olduğunda), bağırsak cerrahi olarak maruz bırakılır ve sıcaklık kontrollü bir odaya sahip bir multifoton mikroskobu kullanılarak lazer ablasyonuna tabi tutulur. Kript hasarının kapsamı, ablasyondan hemen sonra karakterize edilir ve farenin prosedürden kurtulmasına izin verilir. Tekrarlanan cerrahi maruziyet ve IVM, zamanla bağırsak iyileşmesini izlemek için kullanılır. Kan vaskülatürünün paterni ve dağılımı ve farklı renkli kriptler, ablasyondan haftalar veya aylar sonra aynı bölgeleri geri bulmak için kullanılır. Kript yeniden şekillenmesi (örneğin, fisyon veya füzyon), ablasyondan haftalar sonra hasar bölgesinde gözlenebilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Bağırsakta lazerle indüklenen hasar üzerine doku rejenerasyonunun uzunlamasına görüntülenmesi. Bağırsak tam olarak aynı şekilde konumlandırıldığında, bağırsağın kan damarları aynı bölgeleri bulmak ve görüntülemek için bir harita olarak kullanılabilir. (A) Bağırsağın kameraya genel bakış görüntüleri. Kesikli beyaz çizgiler, başka bir zaman noktasında aynı lazerle ablatlanmış bölgeyi bulmak için bir dönüm noktası olarak kullanılan, hasar bölgesine (beyaz kutu) komşu vaskülatürün modelini temsil eder. Alttaki iki resim, beyaz kutunun yakınlaştırılmış görünümünü gösterir. Ok, lazer ablasyonunun tam yerini 1. ve 1. günlerde ve 1 ay sonra göstermektedir. (B) Çoklu foton mikroskobu ile yakalanan tek bir kript hasarının floresan görüntüleri. Mavi kutudaki ok, hasarın yerini 1. günde ve 1 ay sonra gösterir. (C) Hasarlı bir kript alanının floresan görüntüleri. Mavi kutudaki oklar, hasar bölgesini 1. ve 1. gün sonra işaretler. Ölçek çubukları: 1 mm (A, üst); 0,25 mm (A, alt); 200 μm (büyük genel bakış B ve C); ve 50 μm (yakınlaştırılmış görüntüler B ve C). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Lazer ablasyon sonrası kript kaderlerinin intravital görüntülenmesi. (A) Konfeti modelini kullanarak, kurtarma dinamiklerini haritalamak için farklı renklerle etiketlenmiş kriptler zaman içinde takip edilebilir. Beyaz ok, lazer ablasyon bölgesini göstermektedir. Sarı kutu komşu bir bölgeyi (hasar bölgesinden <100 μm) temsil ederken, mavi ve mor kutular lazerle ablatlanmış bölgeden uzak bölgeleri (>100 μm) temsil eder. Farklı rejenerasyon modları gözlenir. (B) Bazı bölgeler mor kutuda olduğu gibi değişmeden kalır. (C) Diğer bölgeler, kript fisyonu veya füzyonu şeklinde kript yeniden modellemesi sergiler; kesikli beyaz çizgiler ve oklar kript fisyon olaylarını, turuncu kesikli çizgiler ve oklar ise kript füzyon olaylarını gösterir. (D) Bazı bölgelerde, turuncu kesikli bir çizgiyle vurgulanan kriptin kaybolduğu sarı kutuda olduğu gibi, kriptonun kaybolduğu gözlenir. (E) Hasar bölgesine komşu (yani 100 μm'den az) ve uzak (yani 100 μm'den fazla) bölgelerde gözlemlenen kript yeniden şekillendirme olaylarının sayısını gösteren örnek bir niceleme. Ölçek çubukları: 200 μm (A); 50 μm (B-D). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Bu protokol, erken hasar yanıtından uzun süreli doku yeniden şekillenmesine kadar bağırsak rejenerasyonunu takip etmek için mikroskobik lazer ablasyon ve uzunlamasına intravital mikroskopiyi birleştirir. Teknik, mikroskobik lazer ablasyonunu indüklemek ve görüntülemek için etik hususlara sıkı sıkıya bağlı kalarak kurulmuştur ve tam olarak takip edildiğinde hayvan refahını koruyacaktır. Ameliyat sırasında, bağırsağın bütünlüğünün iyi korunduğundan emin olmak önemlidir. Bu, dokuyu steril ıslak pamuklu çubuklarla nazikçe tutarak elde edilebilir, bu da kanamayı veya dokunun kurumasını önler. Lazerle indüklenen mikroskobik hasarın derecesi, lazer ablasyon sonrası bölgenin farklı bağırsak katmanları görüntülenerek dikkatlice değerlendirilmelidir. Araştırmacı bu protokolde açıklanan deneysel adımların sıklığını uyarlamak isterse, deneyden önce enstitünün hayvan etik kuruluna danışılarak refah üzerindeki sonucun belirlenmesi gerekir.
Tekrarlayan intravital mikroskopi, zaman içinde aynı farede doku iyileşmesini izlemeye izin verir. Bağırsağın tekrar tekrar cerrahi olarak maruz kalması, tüm bağırsak sistemine kolayca optik erişim sağlar. Vaskülatür gibi dokuya özgü özellikler, her görüntüleme seansında aynı bağırsak bölgelerini tanımlamak için işaretler görevi görür. Böylece, aynı doku bölgesi birkaç hafta boyunca görüntülenebilir, bu da aynı farede aynı bağırsak bölgesinde uzun süreli doku rejenerasyonunu ölçmeyi sağlar. Kombine cerrahi ve görüntüleme yönteminin sunduğu mekansal zamansal kontrol, aynı organın aynı farede hem homeostatik hem de rejenere koşullar altında görüntülenebilmesi avantajını getirir; bu, kontrollerin ve yenilenen örneklerin farklı farelerden kaynaklandığı önceki tüm organ hasarı modellerinin aksine durmaktadır 11,12,18,19,20 . Bu nedenle, deney ortamımız, deney için gereken gerekli hayvan sayısını en aza indirir ve hayvanlar arası çeşitliliği azaltır.
Protokol sorun giderme, fare ve bağırsak taşıma tekniğinin gözden geçirilmesi ve mikroskopi ekipmanının ve ayarlarının kontrolü ile başlamalıdır. Bu protokolde ekstra dikkat gerektiren birçok kritik adım vardır. İlk olarak, hayvan refahını ve sürekli yüksek veri kalitesini sağlamak için, tüm çalışmaların aseptik teknik kullanılarak temiz steril bir ortamda yapılması ve ameliyat sırasında ve her görüntüleme seansında fare sıcaklığının korunması gerekir. Görüntüleme sırasında dokunun steril, önceden ısıtılmış salin ile nemlendirilmesi esastır ve doku fibrozunu önler.
Deneyin tekrarlanabilir bir şekilde yapılmasını sağlamak için, optimum elde etme için lazerleri kullanmadan önce hizalamak ve her seansın başında çoklu foton lazerin güç çıkışını ölçmek önemlidir. Hedefin türü, büyütme, kalma süresi, lazer gücü ve dalga boyu gibi parametrelerin mikroskobik lazer ablasyonunun kapsamı üzerinde etkileri vardır ve dikkate alınmalıdır. Bu çalışmada, hem lazer ablasyonu hem de görüntüleme, bir Fluotar VISIR 25x / 0.95 WATER hedefi aracılığıyla 960 nm dalga boyunda 1.2 W'lık bir lazer gücü (lens dışında) ile gerçekleştirilmiştir. Dalga boyunun veya optik tarama özelliklerinin değiştirilmesi, mikroskobik hasarın boyutunu etkiler. Daha düşük bir dalga boyu (840 nm gibi) daha yüksek enerjili fotonlara ve genellikle lazerin daha yüksek bir çıkışına dönüşür ve mikroskobik hasarı artırabilir. Daha yüksek bir yakınlaştırma, bölge başına daha fazla enerji ile sonuçlanır ve bu nedenle kriptoları ablate etmek için daha az zaman kalır ve bunun tersi de geçerlidir. Piksel kalma süresi, ablasyon hızını ve hasarın derecesini değiştirmek için de artırılabilir veya azaltılabilir. Görüntülenen doku stabil olmadığında (örneğin, peristaltik hareketler nedeniyle), ablasyonun hızlı bir şekilde yapılması gerekir. Bu amaçla, ablasyon hızı, örneğin yakınlaştırma ve / veya lazer çıkışı artırılarak optimize edilmelidir.
Birden fazla görüntüleme seansında aynı bağırsak bölgesini bulmak, deneyin başarısını sağlamak için uygun şekilde yürütülmesi gereken bir başka kritik adımdır. Bunu yapmak için, bağırsağın tüm zaman noktalarında aynı şekilde konumlandırılması gerekir. İnce ve kalın bağırsakta aynı bölgeleri bulmak için çekumu her zaman bir referans noktası olarak kullanmanızı öneririz. İlgilenilen dokunun pamuklu çubuklarla nazikçe gerilmesi, ilgilenilen bölgenin objektif çalışma mesafesi aralığında olmasını sağlar ve geriye doğru izlenebilecek bölge sayısını en üst düzeye çıkarır. Ek olarak, daha sonraki bir görüntüleme oturumunda tekrar lokalize olmayabilecek bölgeleri hesaba katmak için her farede her zaman birden fazla mikroskobik pozisyonun ablate edilmesini ve görüntülenmesini öneririz. Bölgeler bulunamazsa, bağırsağın konumlandırılması doğru olsa bile, fareyi yeniden konumlandırmaya ve maruz kalan alanın yönünü değiştirmeye yardımcı olabilir. Zaman içinde kriptoları izlemek, birkaç bitişik kriptonun daha büyük bağırsak alanlarının ablatlandığı deneyler için hantal olabilir. Bu tür zarar verici hakaretler, epitel monokatmanının ötesinde doku yeniden şekillenmesini uyandırabilir ve bu da zamanla bölgenin izlenmesi için kullanılan doku işaretlerinin değiştirilmesiyle sonuçlanabilir. Hasarlı bölgeye yeterli mesafede yer işaretleri seçmek ve hasarlı alanı birkaç yüz mikrometre aşan daha büyük görüş alanlarını yakalamak, başarılı uzun vadeli deneyler için şansı arttırır. Bağırsağın mikroskop aşamasında yanlış konumlandırılmasına ek olarak, gastrointestinal sistemin peristaltik hareketleri görüntülemeye müdahale edebilir. Bu sorun iki şekilde düzeltilebilir. Hareketlerin sıklığı çok yüksek değilse, işlem aynı bölgede artan maruz kalma süresi ile tekrarlanabilir. Alternatif olarak, peristalsis'i azaltmak için daha yüksek miktarlarda anestezi kullanılabilir. Daha yüksek izofluran dozlarını kısa ayarlamalarla sınırlamanızı öneririz. Toplamda, hızlı iyileşmeyi sağlamak için görüntüleme seansları mümkün olduğunca kısa, en uygun şekilde 3 saatin altında tutulmalıdır.
Kombine lazer ablasyon ve boyuna intravital mikroskopi yaklaşımının diğer hasar modellerine kıyasla birçok avantajı vardır. Önceki (kimyasal) hasar modelleri, zarar verici hakareti yerel olarak sınırlama yeteneğinden yoksundu 6,11,12,19,20. Lazer ablasyon, hasarı tanımlanmış bir ilgi alanıyla sınırlayarak bu eksikliğin üstesinden gelir. Bu, araştırmacıların yaralanmanın yerini ve hasar derecesini kontrol etmelerini sağlar. Hasar şiddeti, kript ölçeğinde rejeneratif tepkiler hakkında bilgi vermek için kriptleri veya tüm mikroskobik bağırsak alanlarını ablate etmek için modüle edilebilir. Uzamsal kontrole ek olarak, lazer ablasyon ayrıca hasarın başlangıcını hassas bir şekilde zamanlamaya izin verir, böylece önceki ilaç, kimyasal ve enfeksiyon modellerinin hassasiyetini aşar 9,10,11,12,19,20. Protokolümüz, bağırsakta lokalize hasarı indüklemek için bir yöntem olarak lazerle indüklenen termal ablasyonu kullanan önceki çalışmaları genişletmektedir21,23. Önceki lazer kaynaklı hasar modelleri, ince bağırsak21'deki lokal alanları veya distal kolon23'ün luminal yüzeyini görüntüledi. Kombine cerrahi ve lazer ablasyon yaklaşımı, bağırsak epitelinin (özellikle kriptler) yüksek çözünürlükte görüntülenmesini ve ince bağırsağın herhangi bir pozisyonunda doku iyileşmesinin lazer ablasyonu ve takip görüntülemesinin yapılmasını mümkün kılar. Aynı bağırsak bölgelerinin zamanla iyileşmesini yakalar ve deney düzeneğine göre bağırsağın farklı katmanlarını (mukoza, submukoza, muscularis ve seroza) görselleştirmeye izin verir. Tekniğimiz esas olarak birkaç hafta/ay boyunca uzun süreli tekrarlanan görüntüleme için uyarlanmıştır. Kriptlerin kısa süreli iyileşme dinamiklerini incelemek için (örneğin, hasarı takip eden birkaç ardışık gün boyunca), burada açıklanan lazer ablasyon yaklaşımı, intravital görüntüleme pencereleri27,28,40 ile birleştirilebilir.
Bu protokol, rejenerasyon, immünoloji ve kanser araştırmalarını kapsayan çeşitli bilimsel alanlardan çok sayıda araştırma uygulaması için kullanılabilir. İntestinal rejenerasyonun uzunlamasına görüntülenmesi, epitel bütünlüğünü ve bariyer fonksiyonunu koruyan, bağırsak lümenindeki patojenlere karşı konak savunmasını sağlayan ve onkojenik mutasyonların temizlenmesinin ve yayılmasının altında yatan hücresel dinamiklere ışık tutmaktadır. Her bilimsel soru, lazer kaynaklı hasarın kapsamı ve görüntüleme süresi konusunda benzersiz talepler ortaya koyacaktır. Floresan muhabir fareler ve enjekte edilen boyalar, herhangi bir hücrenin ve ilgilenilen yapının görselleştirilmesine izin vererek elde edilebilecek verileri büyük ölçüde genişletebilir ve hassaslaştırabilir. Örneğin, bir Lgr5-CreERt2: Rosa26-Konfeti faresi kök hücre soylarını görselleştirmek için kullanılabilirken, Rosa26-mTmG muhabiri doku mimarisi hakkında bilgi verir. Birlikte, bu son teknolojik gelişmeler, intravital bağırsak deneylerini, bağırsak biyolojisi ve hastalığı hakkındaki anlayışımızı ilerletmek için kazançlı bir araç haline getirmektedir.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü NWO (J.v.R.'ye Vici hibe 09150182110004 ve H.A.M.'a Veni hibe 09150161910151), OCENW tarafından desteklenmiştir. GROOT.2019.085 (J.v.R'ye) ve bir EMBO doktora sonrası bursu (H.A.M.'ye ALTF 452-2019 hibesi).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia induction box | Veterinary Technics | ||
| Autoclave | Certoclav | ||
| Betadine | Mylan | 202809 | |
| Diaper (underpad) | Absorin comfort | ||
| Dumont forceps | Fine Scientific Tools | 11255-20 or 11272-40 | Inox, style #55, used to hold the peritoneum |
| Enzymatic instrument cleaner | Roboz | EC-1000 | |
| Ethanol 80% | homemade | NA | |
| Eye ointment | Duratears Z (Alcon) | 288/28282-6 | |
| Fine Scissors Straight 9 cm | Fine Scientific Tools | 14060-09 | Used to cut skin and peritoneum of the mouse |
| Gauze 5 cmX5 cm | Cutisoft (Bsn medical) | 45847-00 | |
| Graefe Forceps Curved Serrated | Fine Scientific Tools | 11051-10 | Used to hold the skin |
| Hartman Hemostat Straight | Fine Scientific Tools | 13002-10 | Used for suturing |
| Heating pad | Comfort | T5-5000 | |
| Imaging box | Custom made | ||
| Incision film | Nobafilm | 172215 | |
| Inverted multi-photon microscope with automated stage | Leica Microsystems | NA | |
| Isoflurane (vetflurane) | Pharmachemie BV, Haarlem, Netherlands | 305788 | |
| Isoflurane vaporizer | Penlon sigma delta | ||
| Micropore paper tape | Micropore | ||
| NaCl 0.9% | Braun | Other brands available | |
| Needle 25G | BD | 300600 | |
| Paper tape tesa | Tesa | NA | |
| Parafilm | Bemis | PM-994 | semi-transparent tape |
| Razor blades | Supermax stainless steel | Other brands available | |
| Rectal probe | Kent Scientific | 20250-91 | |
| Rimadyl Cattle (carprofen) | Zoetis B.V | Registration# REG NL 10130 | |
| Student Fine Scissors Straight 11.5 cm | Fine Scientific Tools | 91460-11 | Used to cut gauze |
| Surgical instrument cleaner | Roboz | IC-1000 | |
| Surgical instrument lubricant | Roboz | IL-1000 | |
| Syringes (1 ml) | BD | 303172 | Other brands available |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Temgesic (Buprenorphine hydrochloride) | Indivior UK Limited/Reckitt Benckiser Healthcare | Registration# RVG 08725 | |
| Vicryl polyglactin suture 5-0 FS-2 needle | Ethicon | V292ZH | |
| VirkonS | Bio-services | antiseptic solution | |
| Wooden cotton swab (sterile) | Klinion | 531530 | Other brands available |
References
- Clevers, H. The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment. Cell. 154 (2), 274-284 (2013).
- Darwich, A. S., Aslam, U., Ashcroft, D. M., Rostami-Hodjegan, A. Meta-analysis of the turnover of intestinal epithelia in preclinical animal species and humans. Drug Metabolism and Disposition. 42 (12), 2016-2022 (2014).
- Beumer, J., Clevers, H. Regulation and plasticity of intestinal stem cells during homeostasis and regeneration. Development. 143 (20), 3639-3649 (2016).
- Ritsma, L., et al. Intestinal crypt homeostasis revealed at single-stem-cell level by in vivo live imaging. Nature. 507 (7492), 362-365 (2014).
- Azkanaz, M., et al. Retrograde movements determine effective stem cell numbers in the intestine. Nature. 607 (7919), 548-554 (2022).
- van Es, J. H., et al. Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage. Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).
- Tomic, G., et al. Phospho-regulation of ATOH1 is required for plasticity of secretory progenitors and tissue regeneration. Cell Stem Cell. 23 (3), 436-443 (2018).
- Asfaha, S., et al. Krt19+/Lgr5- cells are radioresistant cancer-initiating stem cells in the colon and intestine. Cell Stem Cell. 16 (6), 627-638 (2015).
- Schmitt, M., et al. Paneth cells respond to inflammation and contribute to tissue regeneration by acquiring stem-like features through SCF/c-Kit signaling. Cell Reports. 24 (9), 2312-2328 (2018).
- Davidson, L. A., et al. Alteration of colonic stem cell gene signatures during the regenerative response to injury. Biochimica et Biophysica Acta. 1822 (10), 1600-1607 (2012).
- Ijiri, K., Potten, C. S. Further studies on the response of intestinal crypt cells of different hierarchical status to eighteen different cytotoxic agents. British Journal of Cancer. 55 (2), 113-123 (1987).
- Andersson-Rolf, A., Zilbauer, M., Koo, B. K., Clevers, H. Stem cells in repair of gastrointestinal epithelia. Physiology. 32 (4), 278-289 (2017).
- Totafurno, J., Bjerknes, M., Cheng, H. The crypt cycle. Crypt and villus production in the adult intestinal epithelium. Biophysical Journal. 52 (2), 279-294 (1987).
- Dekaney, C. M., Gulati, A. S., Garrison, A. P., Helmrath, M. A., Henning, S. J. Regeneration of intestinal stem/progenitor cells following doxorubicin treatment of mice. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297 (3), G461-G470 (2009).
- Cairnie, A. B., Millen, B. H. Fission of crypts in the small intestine of the irradiated mouse. Cell and Tissue Kinetics. 8 (2), 189-196 (1975).
- Bruens, L., Ellenbroek, S. I. J., van Rheenen, J., Snippert, H. J. In vivo imaging reveals existence of crypt fission and fusion in adult mouse intestine. Gastroenterology. 153 (3), 674-677 (2017).
- Baker, A. M., et al. Crypt fusion as a homeostatic mechanism in the human colon. Gut. 68 (11), 1986-1993 (2019).
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
- Okayasu, I., et al. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).
- Rakoff-Nahoum, S., Paglino, J., Eslami-Varzaneh, F., Edberg, S., Medzhitov, R. Recognition of commensal microflora by toll-like receptors is required for intestinal homeostasis. Cell. 118 (2), 229-241 (2004).
- Choi, J., et al. Intestinal crypts recover rapidly from focal damage with coordinated motion of stem cells that is impaired by aging. Scientific Reports. 8 (1), 10989 (2018).
- Tian, H., et al. A reserve stem cell population in small intestine renders Lgr5-positive cells dispensable. Nature. 478 (7368), 255-259 (2011).
- Choi, M., Yun, S. H. In vivo femtosecond endosurgery: an intestinal epithelial regeneration-after-injury model. Optics Express. 21 (25), 30842-30848 (2013).
- Seno, H., et al. Efficient colonic mucosal wound repair requires Trem2 signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (1), 256-261 (2009).
- Hua, G., et al. Distinct levels of radioresistance in Lgr5+ colonic epithelial stem cells versus Lgr5+ small intestinal stem cells. Cancer Research. 77 (8), 2124-2133 (2017).
- Rompolas, P., et al. Live imaging of stem cell and progeny behaviour in physiological hair-follicle regeneration. Nature. 487 (7408), 496-499 (2012).
- Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging: General overview and technical insights. Intravital. 3 (2), e29917 (2014).
- Rakhilin, N., et al. An intravital window to image the colon in real time. Nature Communications. 10 (1), 5647 (2019).
- Messal, H. A., et al. Antigen retrieval and clearing for whole-organ immunofluorescence by FLASH. Nature Protocols. 16 (1), 239-262 (2021).
- Farrelly, O., et al. Two-photon live imaging of single corneal stem cells reveals compartmentalized organization of the limbal niche. Cell Stem Cell. 28 (7), 1233-1247 (2021).
- Krndija, D., et al. Active cell migration is critical for steady-state epithelial turnover in the gut. Science. 365 (6454), 705-710 (2019).
- Bruens, L., et al. Calorie restriction increases the number of competing stem cells and decreases mutation retention in the intestine. Cell Reports. 32 (3), 107937 (2020).
- Bietar, B., Zhou, J., Lehmann, C. Utility of intestinal intravital microscopy for the study of CNS injury-induced immunodepression syndrome (CIDS). Clinical Hemorheology and Microcirculation. 79 (1), 137-147 (2021).
- Erreni, M., Doni, A., Weigert, R. Method for acute intravital imaging of the large intestine in live mice. Methods in Molecular Biology. 2304, 285-299 (2021).
- Hiltensperger, M., et al. Skin and gut imprinted helper T cell subsets exhibit distinct functional phenotypes in central nervous system autoimmunity. Nature Immunology. 22 (7), 880-892 (2021).
- Martínez-Sánchez, L. D. C., et al. Epithelial RAC1-dependent cytoskeleton dynamics controls cell mechanics, cell shedding and barrier integrity in intestinal inflammation. Gut. 72 (2), 275-294 (2022).
- Means, A. L., Xu, Y., Zhao, A., Ray, K. C., Gu, G. A CK19(CreERT) knockin mouse line allows for conditional DNA recombination in epithelial cells in multiple endodermal organs. Genesis. 46 (6), 318-323 (2008).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
- Messal, H. A., van Rheenen, J., Scheele, C. L. An intravital microscopy toolbox to study mammary gland dynamics from cellular level to organ scale. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 26 (1), 9-27 (2021).
