Summary
Her presenterer vi en metode for å få bilder av tarmen ved laserindusert sår. Ved å utsette musetarmen for en multifotonlaser, induseres tapet av en enkelt eller flere krypter lokalt. Ved å gjentatte ganger avbilde det skadede området over måneder, fanges sanntidsdynamikken i tarmutvinning.
Abstract
Å undersøke intestinal utvinning in vivo er en utsøkt teknisk utfordring. Mangel på langsgående avbildningsprotokoller har forhindret dypere innsikt i celle- og vevsskaladynamikken som orkestrerer tarmregenerering. Her beskriver vi en intravital mikroskopimetode som lokalt induserer vevsskade på enkeltkryptskalaen og følger den regenerative responsen til tarmepitelet hos levende mus. Enkeltkrypter eller større tarmfelt ble ablert av en høyintensiv multifoton infrarød laser på en tids- og romstyrt måte. Påfølgende langvarig repeterende intravital avbildning muliggjorde sporing av de skadede områdene over tid og tillot overvåking av kryptdynamikk under vevgjenoppretting over en periode på flere uker. Kryptremodelleringshendelser som kryptfisjon, fusjon og forsvinning ble observert i nabovevet ved laserindusert skade. Denne protokollen muliggjør studier av kryptdynamikk både i homeostatiske og patofysiologiske innstillinger, for eksempel aldring og tumorinitiering.
Introduction
Epitelforingen i tarmen blir stadig utfordret av magesyrer, toksiner og mikrobiota som kan forårsake forstyrrelse av epitelbarrieren. Tarmstruktur og vevsorganisasjon er spesialisert på å stadig selvfornye og reparere skader. Det enkeltlags epitelet i tynntarmen er organisert i krypt-villus-enheter1. I homeostase gir selvfornyende Lgr5+ intestinale stamceller som ligger i bunnen av krypten opphav til differensiert avkom. De differensierte dattercellene reiser til spissen av villusaksen i en transportbåndmote, hvor de kastes slik at tarmforingen fylles på 3-5 dager 2,3. På lang sikt bidrar ikke alle Lgr5+-celler like mye til vevsfornyelse, da dette også avhenger av cellens evne til å bevege seg mot transportbåndet mot bunnen av krypten (dvs. retrograd bevegelse)4,5. Faktisk, ved ablasjon av Lgr5 + celler ved for eksempel stråling, beveger stamceller utenfor kryptens base inn i basen for å dedifferensiere og fylle stamcellebassenget 6,7,8.
Akutt betennelse kan føre til tap av Lgr5+ stamceller 9,10. I tillegg til tap av stamceller, kan mange eksterne faktorer forårsake akutt skade på epitelet i kryptskalaen. Stråling, kjemiske behandlinger og antibiotika har vist seg å skade tarmkrypter og villi11. Større felt av krypter og villi kan påvirkes av bakterielle, virale og parasittiske infeksjoner12. Tarmen har en bemerkelsesverdig evne til å komme seg etter indre og ytre skader i kryptskalaen ved kryptfisjon (en deling av en krypt i to)13. Ved sår gjennomgår krypter i området ved siden av skaden fisjon for å fylle opp kryptnumrene. Dette fenomenet forekommer også, men i mindre grad under homeostase14,15. For å motvirke en potensiell økning i kryptnumre under homeostase, kan krypter også smelte sammen (slå sammen to krypter til en)16,17. Hvorvidt kryptfusjon også spiller en rolle i å gjenopprette kryptnumre etter sår, er ukjent. Videre gjenstår dynamikken og reguleringsfaktorene i denne prosessen å bli belyst.
Skademodeller er uunnværlige for å studere vevregenerering in vivo. Ulike skademodeller har blitt brukt til å studere regenerering av tarmvev. Tidligere eksperimentelle strategier benyttet høydosestråling for å tømme stamcellebassenger18 eller behandling med dekstransulfatnatrium (DSS) for å indusere kronisk og akutt kolitt og krypttap hos mus19,20. Enkeltcelleablasjon ved genetiske eller optiske midler har blitt brukt til å avgrense vevskader og ansett som et attraktivt verktøy for å disentangle rollen som stam- og stamceller 21,22 og studere vaskulær regenerering23. I tillegg er det utviklet et biopsiskadesystem for å indusere skade i større felt i flere krypter og villi24. Det er viktig at responsen på den skadelige fornærmelsen kan variere langs tarmens proksimal-distale akse, som rapportert for stråling, noe som forårsaket mer skade i tynntarmen enn i tykktarmen25. Dette understreker behovet for målrettede metoder som kontrollerer både omfanget av den skadelige fornærmelsen og lokaliseringen i tarmkanalen.
Skadeomfang og gjenvinning har tradisjonelt blitt vurdert med statiske midler, som gir begrenset informasjon om dynamikken i vevsgjenvinning. Intravital mikroskopi (IVM) har åpnet unike muligheter til å kvantifisere stamcelleadferd, epitelial remodellering og regenerering i mange organer 26,27,28,29,30, og har gitt virkningsfull innsikt i tarmbiologi 4,5,21,31,32,33,34, 35,36.
Her beskriver vi en metode for å forårsake spatiotemporal definert tarmskade og fange opp gjenvinningen av tarmepitelforingen. Vi bruker to fotonbaserte laserablasjon for å skade tarmkrypter og følge den umiddelbare sårresponsen og langsiktig gjenoppretting ved repeterende intravital mikroskopi. Vår protokoll gjør det mulig å kartlegge den regenerative remodelleringen av tarmvevsarkitekturen som respons på lokale vevskader. Kryptdynamikk, inkludert fisjons- og fusjonshendelser, kan lett kvantifiseres og spores over tid. Anvendelsen av laserablasjon og repeterende intravital avbildning kan benyttes som en plattform for å undersøke vevsskaladynamikken i tarmarkitekturen under homeostase og patofysiologi, for eksempel tumorinitiering.
Protocol
Alle dyreforsøk beskrevet i denne studien ble utført i henhold til retningslinjene og godkjenningen fra Animal Welfare Body (AWB) ved Netherlands Cancer Institute (NKI).
MERK: Rådfør deg med instituttets dyreetiske komité før du utfører dyreforsøk.
1. Forberedelse til kirurgi og intravital bildebehandling
- Pre-kirurgiske behandlinger
- Indusere 8-12 uker gamle K19-CreERT237: Rosa26-mTmG 38 og Lgr5eGFP-IRES-CreERT218: Rosa26-Confetti39 mus ved å injisere tamoksifen oppløst i solsikkeolje intraperitonealt 4-6 uker før operasjonen (figur 1).
- Påfør analgesi. Injiser 200 mikrol buprenorfin (0,1 mg/kg kroppsvekt) fortynnet i NaCl 0,9 % per 30 g mus subkutant 30 minutter før kirurgi. Administrer karprofen (0,067 mg / ml) i en flaske som inneholder 125 ml ikke-surgjort autoklavert drikkevann 24 timer før kirurgi. Alternativt kan du gi en subkutan injeksjon med karprofen (5 mg/kg) 30 minutter før operasjonen starter.
- Forberedelse til kirurgi
- Introduser autoklaverte sterile kirurgiske verktøy i biohazard-skapet.
- Slå på varmeputen og sett temperaturen på 37 °C.
- Forberedelse til intravital avbildning
- Slå på mikroskopets temperaturkontrollerte kammer minst 4 timer før avbildning for å gi tilstrekkelig tid til temperaturstabilisering.
MERK: Tiden som trengs kan variere avhengig av maskinen som brukes. - Hold temperaturen inne i klimakammeret stabil på 37 °C.
- Slå på to-foton mikroskop, skanner og laser.
- Start bildebehandlingsprogramvaren.
- Still inn bølgelengden til laseren til 960 nm og åpne lukkeren.
- Slå på mikroskopets temperaturkontrollerte kammer minst 4 timer før avbildning for å gi tilstrekkelig tid til temperaturstabilisering.
2. Kirurgi og intravital bildebehandling
- Kirurgisk eksponering av tarmen
- Bedøv musen med 2% -3% isofluran og legg den på en varmepute, dekket med en steril klut. Sjekk dybden av anestesi ved å vurdere frekvensen og kvaliteten på pusten (ett pust / sekund) og ved å sjekke refleksen til musen.
- Dekk øynene til musen med øyesalve.
- Injiser 200 μL forvarmet steril saltoppløsning subkutant.
- Barber magen og fjern håret. Bytt den sterile kluten i operasjonsområdet.
- Sett inn en rektal sonde for å overvåke temperaturen på musen.
MERK: Temperaturen skal være ca. 37 °C. - Ta på deg et nytt par sterile hansker.
- Rengjør operasjonsområdet på en sirkulær måte med vekslende skrubber av antiseptisk løsning etterfulgt av 80% etanol tre ganger. Fjern overflødig etanol med en steril bomullspinne.
MERK: Det er viktig å overvåke musen for hypotermi på dette punktet. - Dekk musen med en steril kirurgisk drapering.
- Kontroller refleksen til musen.
- Lag et ~ 10 mm vertikalt midtlinjesnitt gjennom huden ved hjelp av en steril skalpell.
- Snitt linea alba ved hjelp av saks for å skille rectus abdominis muskler og åpne magen.
- Finn musens cecum ved hjelp av sterile bomullspinner dynket i sterilt forvarmet saltvann for å bruke det som referansepunkt.
- Lag et lite kutt i et stykke sterilt gasbind, våt det i forvarmet sterilt saltvann, og legg det over snittet.
- Ta ut tarmen med sterile bomullspinner dynket i forvarmet sterilt saltvann. Hold tarmen hydrert ved å legge til steril, forvarmet saltvann.
- Plasser et sterilt, skreddersydd bildekammer ved siden av musen.
- Overfør musen til den forvarmede sterile bildeboksen.
- Plasser tarmen på det sterile glasset i bildeboksen. Plasser mushodet inne i innåndingsslangen i avbildningsboksen, som vist i figur 1.
- Fest om nødvendig musen med steril, fleksibel film og tape.
- Plasser bildeboksen som inneholder musen i mikroskopkammeret.
- Intravital avbildning
- Overvåk musen under avbildning ved å sjekke frekvensen og dybden på pusten og temperaturen via en rektal sonde hvert 15. minutt. Prosentandelen av isofluran bør holdes mellom 1-2 %. Juster om nødvendig.
- Finn et område i tarmen ved hjelp av mikroskopets okular.
- Få et bredt bilde av interesseområdet ved hjelp av mikroskopets interne kamera, som vist i figur 2A.
- Avbilde interesseområdet ved hjelp av 960 nm laser i multifotonmikroskopet. Juster lasereffekten og bølgelengden i henhold til fluoroforene som ble brukt i forsøket.
- Skaff deg en 10-20 trinns z-stabel på 3 μm av interesseområdet.
- Laser ablasjon
- Velg én eller flere posisjoner fra flisen som ble avbildet tidligere.
- Bruk blekepunktkalibreringsfunksjonen i bildebehandlingsprogramvaren ved en zoom på 32 og 124 x 124 pikslers oppløsning med en skannehastighet på 400 Hz, ved å bruke toveis skanningsegenskapen i 3-10 s, avhengig av størrelsen på skaden det siktes mot. Initiering av skade i kryptområdet kan gjenkjennes av en økning i autofluorescens i både grønne og røde kanaler.
- Gjenta de to foregående trinnene for flere områder i samme mus.
- Etter ablasjon, skaff deg z-stabler av de skadede områdene for å bekrefte plasseringen og omfanget av skaden.
- Stenging av operasjonsstedet
- Plasser musen, mens den fortsatt er under anestesi, i et sterilt suturområde.
- Sett den eksponerte tarmen tilbake i magen ved hjelp av sterile bomullspinner dynket i forvarmet sterilt saltvann.
- Sutur linea alba ved å utføre en enkel kontinuerlig sutur ved hjelp av en absorberbar 5-0 sutur. Lukk ekstremiteter av suturen med kirurgiske knuter.
- Gjenta det samme trinnet med hudlaget.
- Slå av isofluran stasjon og rengjør og steriliser avbildningsboksen og innlegget.
- Rengjør operasjonsverktøyene med kirurgisk instrumentrenser, enzymatisk rengjøringsmiddel og kirurgisk instrumentsmøremiddel. Når det er tørket, steriliser operasjonsverktøyene sammen med operasjonsboksen i autoklaven.
- Behandling etter operasjonen
- La musen komme seg etter operasjonen mens buret er plassert på varmeputen i ~ 1 time.
MERK: Plasser musen sammen med andre burkamerater hvis mulig. Ensom bolig er ikke nødvendig for utvinning. - Kontroller temperaturen på musen hvert 15. minutt under gjenoppretting.
- Injiser 200 mikrol buprenorfin (0,1 mg/kg kroppsvekt) fortynnet i NaCl 0,9 % per 30 g mus subkutant 6-12 timer etter operasjonen.
- Administrer karprofen (0,067 mg / ml) i en flaske som inneholder 125 ml ikke-surgjort autoklavert drikkevann i 72 timer etter operasjonen.
- Vei musen og overvåk velferden hver dag i 1 uke etter operasjonen.
- La musen komme seg etter operasjonen mens buret er plassert på varmeputen i ~ 1 time.
3. Repeterende kirurgi og intravital bildebehandling
- Kirurgi
- Gjenta trinn 1.1.2, 1.2, 1.3 og 2.1 på det andre tidspunktet (minst 1 uke etter den første bildebehandlingen).
- Intravital avbildning
- Gjenta trinn 2.2.1-2.2.3.
- Bruk mønsteret av blodkar for å finne de samme interesseområdene som er avbildet på det første tidspunktet.
- Gjenta trinn 2.2.4 og 2.2.5.
- Stenging av operasjonsstedet
- Gjenta trinn 2.4.1.
- Hvis musen ikke er ment å bli avbildet på et annet tidspunkt, ofre musen ved å utføre cervical dislokasjon under terminal anestesi. Ellers fortsetter du med neste trinn.
MERK: I henhold til retningslinjene i EU-direktiv 2010/63 / EU, vedlegg IV, er cervikal dislokasjon en akseptabel metode. - Gjenta trinn 2.4.2-2.4.6.
- Behandling etter operasjonen
- Gjenta trinn 2.5.1-2.5.5.
Representative Results
For å demonstrere hvilken type resultater som kan oppnås fra laserablasjonsmetoden kombinert med intravital avbildning, utførte vi et eksperiment som vist i figur 1. Først injiserte vi K19-CreERT2;mTmG (K19cre-mTmG) og Lgr5eGFP-IRES-CreERT2; Rosa26-konfetti (Lgr5cre-Confetti) mus med tamoxifen for stokastisk å merke celler med en av konfettifargene (eller grønt fluorescerende protein [GFP] når det gjelder mTmG-mus). K19-cre induserer avstamningssporing fra alle epitelceller, mens Lgr5-cre induserer sporing fra stamceller bare 8,18,37. Tamoxifen-injeksjonen ble administrert 4-6 uker før operasjonen og den første bildebehandlingsøkten for å oppnå krypter der alle cellene er monoklonale for en bestemt farge. Robust identifisering av de samme vevsområdene over flere uker er avgjørende for å spore skjebnen til de samme kryptene over tid. Iboende vevsarkitektoniske trekk, som vaskulaturen, kan brukes som pålitelige vevslandemerker, og ble her registrert med mikroskopets interne kamera. I tillegg bidro merking av en liten brøkdel av krypter med (minst to) forskjellige farger til å gjenkjenne de samme kryptene i hver bildebehandlingsøkt og følge deres oppførsel under den regenerative prosessen etter laserskade. Ved kirurgisk eksponering av musens tarm og anskaffelse av både kamera og fluorescerende bilder av interesseområdet (figur 2A), kan blekepunktinnstillinger for multifotonlaseren brukes til å ablate en eller flere krypter (figur 2B,C). Initiering av skade kan gjenkjennes av en økning i autofluorescens i både de grønne og røde kanalene. For å studere dynamikken i kryptutvinning ble operasjonen og bildeprosedyren gjentatt uker / måneder etter den første bildebehandlingen, og vevsiboende strukturer (vaskulatur og mønstre av klonalt merkede krypter) ble brukt som landemerker for å finne nøyaktig samme skadested (figur 2). Når denne metoden ble brukt i Lgr5Cre-Confetti-mus, hvor Lgr5-eGFP uttrykkes på en ujevn måte, kunne endringer i kryptnummer og former etter laserindusert skade fanges opp (figur 3). Mens noen regioner ikke viste noen endringer i antall og struktur av krypter (figur 3B), viste andre regioner omfattende kryptombygging, som vist i antall kryptfisjon og fusjonshendelser (figur 3C) og tap av krypter 2 uker etter laserindusert skade (figur 3D). Ved å introdusere forskjellige størrelser av skade og kvantifisere fisjons-, fusjons- og forsvinningshendelsene etter ablasjon, som i eksemplet vist i (figur 3E), kan dynamikken i skadeindusert regenerering kartlegges i forskjellige musemodeller.
Figur 1: Skjematisk fremstilling av det eksperimentelle oppsettet. In vivo-merking av tarmceller oppnås ved å injisere tamoksifen intraperitonealt i genetisk modifiserte musemodeller for å indusere Cre-mediert rekombinasjon i tarmkrypter. Etter dager eller uker (når kryptene er monoklonale for en bestemt farge), blir tarmen kirurgisk eksponert og utsatt for laserablasjon ved hjelp av et multifotonmikroskop med et temperaturkontrollert kammer. Omfanget av kryptskader karakteriseres umiddelbart etter ablasjon, og musen får lov til å komme seg etter prosedyren. Gjentatt kirurgisk eksponering og IVM brukes til å overvåke intestinal utvinning over tid. Mønsteret og fordelingen av blodvaskulaturen og krypter i forskjellige farger brukes til å finne tilbake de samme områdene uker eller måneder etter ablasjon. Kryptombygging (f.eks. fisjon eller fusjon) kan observeres på skadestedet uker etter ablasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Langsgående avbildning av vevsregenerering ved laserindusert skade i tarmen. Når tarmen er plassert på nøyaktig samme måte, kan blodkar i tarmen brukes som et kart for å finne og avbilde nøyaktig samme regioner. (A) Kameraoversikt bilder av tarmen. Stiplede hvite linjer representerer mønsteret til vaskulaturen som grenser til skadestedet (hvit boks), brukt som et landemerke for å finne det samme laserablerte området på et annet tidspunkt. De to nederste bildene viser den innzoomede visningen av den hvite boksen. Pilen viser det nøyaktige stedet for laserablasjon på dag 1 og 1 måned senere. (B) Fluorescerende bilder av en enkelt kryptskade fanget av multifotonmikroskop. Pilen i den blå boksen viser skadestedet på dag 1 og 1 måned senere. (C) Fluorescerende bilder av et skadet felt av krypter. Pilene i den blå boksen markerer skadeområdet på dag 1 og 1 måned senere. Skalastenger: 1 mm (A, topp); 0,25 mm (A, bunn); 200 μm (stor oversikt B og C); og 50 μm (zoombilder B og C). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Intravital avbildning av kryptskjebner etter laserablasjon. (A) Ved hjelp av konfettimodellen kan krypter merket med forskjellige farger følges over tid for å kartlegge dynamikken i utvinning. Den hvite pilen viser stedet for laserablasjon. Den gule boksen representerer en naboregion (<100 μm fra skadestedet), mens de blå og lilla boksene representerer regioner langt (>100 μm) fra den laserablerte regionen. Ulike regenereringsmåter observeres. (B) Noen regioner forblir uendret som i den lilla boksen. (C) Andre regioner viser kryptombygging i form av kryptfisjon eller fusjon; De stiplede hvite linjene og pilene skildrer kryptfisjonshendelser, og de oransje stiplede linjene og pilene skildrer kryptfusjonshendelser. (D) I noen regioner observeres kryptforsvinning, som i den gule boksen der krypten uthevet med en oransje stiplet linje forsvant. (E) Et eksempel på kvantifisering som viser antall kryptombyggingshendelser observert i områdene som er nærliggende (dvs. mindre enn 100 μm) og langt fra (dvs. mer enn 100 μm) skadestedet. Skala barer: 200 μm (A); 50 μm (B-D). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Denne protokollen kombinerer mikroskopisk laserablasjon og langsgående intravital mikroskopi for å følge intestinal regenerering fra tidlig skaderespons til langvarig vevsremodellering. Teknikken er etablert i streng overholdelse av etiske hensyn for å indusere og avbilde mikroskopisk laserablasjon, og når den følges nøyaktig, vil den opprettholde dyrs velvære. Under operasjonen er det viktig å sørge for at tarmens integritet er godt bevart. Dette kan oppnås ved forsiktig håndtering av vevet med sterile våte bomullspinner, som forhindrer blødning eller uttørking av vevet. Omfanget av laserindusert mikroskopisk skade bør også vurderes nøye ved avbildning av de forskjellige tarmlagene i området etter laserablasjon. Dersom forskeren ønsker å tilpasse hyppigheten av forsøkstrinnene beskrevet i denne protokollen, bør instituttets dyreetiske komité konsulteres før forsøket for å fastslå konsekvensen for velferden.
Repeterende intravital mikroskopi gjør det mulig å overvåke vevsgjenoppretting i samme mus over tid. Gjentatt kirurgisk eksponering av tarmen gir lett optisk tilgang til hele tarmkanalen. Vevets iboende egenskaper, som vaskulaturen, tjener som landemerker for å identifisere de samme tarmområdene i hver bildebehandling. Dermed kan det samme vevsområdet avbildes over flere uker, noe som gjør det mulig å kvantifisere langvarig vevregenerering i samme tarmområde i samme mus. Den spatiotemporale kontrollen som tilbys av den kombinerte kirurgiske og avbildningsmetoden, gir fordelen at det samme organet kan avbildes under både homeostatiske og regenererende forhold i samme mus, noe som står i motsetning til tidligere helorganskademodeller hvor kontroller og regenererende prøver stammer fra forskjellige mus 11,12,18,19,20 . Derfor minimerer vår eksperimentelle innstilling det nødvendige antall dyr som trengs for forsøket og reduserer intra-animalsk variasjon.
Feilsøking av protokoller bør starte med en gjennomgang av mus- og tarmhåndteringsteknikken, og en kontroll av mikroskopiutstyr og innstillinger. Det er mange kritiske trinn i denne protokollen som krever ekstra oppmerksomhet. For det første, for å sikre dyrevelferd og kontinuerlig høy datakvalitet, må alt arbeid utføres i et rent, sterilt miljø ved hjelp av aseptisk teknikk, og musetemperaturen bør opprettholdes under operasjonen og hver avbildningsøkt. Å holde vevet hydrert med sterilt, forvarmet saltvann under avbildning er viktig og forhindrer vevsfibrose.
For å sikre at eksperimentet utføres på en reproduserbar måte, er det viktig å justere laserne før bruk for optimal anskaffelse og å måle utgangseffekten til multifotonlaseren i begynnelsen av hver økt. Parametere som type mål, forstørrelse, boligtid, lasereffekt og bølgelengde har innflytelse på omfanget av mikroskopisk laserablasjon og bør vurderes. I denne studien utføres både laserablasjon og avbildning med en lasereffekt på 1,2 W (ut av linsen) ved en bølgelengde på 960 nm gjennom et Fluotar VISIR 25x/0,95 VANNMÅL. Endring av bølgelengde eller optisk skanningsegenskaper påvirker omfanget av mikroskopisk skade. En lavere bølgelengde (for eksempel 840 nm) oversetter til fotoner med høyere energi og ofte i en høyere utgang av laseren, og kan forbedre mikroskopisk skade. En høyere zoom resulterer i mer energi per region, og derfor mindre tid til å ablate krypter, og omvendt. Pikseloppholdstiden kan også økes eller reduseres for å endre ablasjonshastigheten og skadeomfanget. Når det avbildede vevet ikke er stabilt (f.eks. på grunn av peristaltiske bevegelser), må ablasjon utføres raskt. For dette formålet bør ablasjonshastigheten optimaliseres ved for eksempel å øke zoom- og/eller laserutgangen.
Å finne det samme tarmområdet over flere bildebehandlingsøkter er et annet kritisk skritt som må utføres riktig for å sikre at eksperimentet lykkes. For å gjøre det, må tarmen plasseres på nøyaktig samme måte til enhver tid. Vi anbefaler å alltid bruke cecum som referansepunkt for å finne de samme områdene i tynn- og tyktarmen. Forsiktig strekking av vevet av interesse med bomullspinner sikrer at interesseområdet er innenfor rekkevidden av den objektive arbeidsavstanden og maksimerer antall regioner som kan spores tilbake. I tillegg anbefaler vi at du alltid ablater og avbilder flere mikroskopiske posisjoner i hver mus for å ta hensyn til regioner som kanskje ikke er lokalisert tilbake i en senere bildebehandlingsøkt. Hvis regionene ikke kan bli funnet, selv om plasseringen av tarmen er riktig, kan det bidra til å flytte musen og endre orienteringen til det eksponerte området. Sporing av krypter over tid kan være tungvint for eksperimenter der større tarmfelt i flere tilstøtende krypter ablateres. Slike skadelige fornærmelser kan fremkalle vevsremodellering utover epitelmonolaget, noe som kan kulminere i modifikasjon av vevslandemerkene som brukes til sporing av regionen over tid. Å velge landemerker i tilstrekkelig avstand til det skadede stedet og fange større synsfelt som overgår det skadede området med flere hundre mikrometer, øker sjansen for vellykkede langsiktige eksperimenter. I tillegg til feil posisjonering av tarmen på mikroskopstadiet, kan peristaltiske bevegelser i mage-tarmkanalen forstyrre avbildning. Dette problemet kan bedres på to måter. Hvis bevegelsesfrekvensen ikke er for høy, kan prosessen gjentas i samme region med økt eksponeringstid. Alternativt kan høyere mengder anestesi brukes til å redusere peristaltikk. Vi anbefaler å begrense høyere doser isofluran til korte justeringer. Samlet sett bør bildeøktene holdes så korte som mulig, optimalt under 3 timer, for å sikre rask restitusjon.
Den kombinerte laserablasjon og langsgående intravital mikroskopi tilnærming har flere fordeler sammenlignet med andre skademodeller. Tidligere (kjemiske) skademodeller manglet evnen til lokalt å begrense den skadelige fornærmelsen 6,11,12,19,20. Laserablasjon overvinner denne mangelen ved å begrense skaden til et definert område av interesse. Dette gjør det mulig for forskerne å kontrollere skadestedet, samt skadeomfanget. Skadealvorlighetsgrad kan moduleres for å ablate krypter eller hele mikroskopiske tarmfelt for å informere om regenerative responser i kryptskalaen. I tillegg til romlig kontroll, tillater laserablasjon også å nøyaktig time utbruddet av skade, og overgår dermed presisjonen til tidligere legemiddel-, kjemiske og infeksjonsmodeller 9,10,11,12,19,20. Vår protokoll utvider tidligere studier som brukte laserindusert termisk ablasjon som en metode for å indusere lokalisert skade i tarmen21,23. Tidligere laserinduserte skademodeller avbildet lokale områder i tynntarm21 eller luminaloverflaten til distal colon23. Den kombinerte kirurgiske og laserablasjonsmetoden gjør det mulig å visualisere tarmepitelet (spesielt krypter) med høy oppløsning, og å utføre laserablasjon og oppfølgingsavbildning av vevsgjenoppretting i en hvilken som helst posisjon i tynntarmen, cecum og proksimal kolon. Den fanger utvinningen av de samme tarmområdene over tid, slik at man kan visualisere forskjellige lag i tarmen (slimhinner, submukosa, muscularis og serosa) i henhold til eksperimentelt oppsett. Vår teknikk er hovedsakelig skreddersydd for langvarig gjentatt avbildning i en periode på flere uker / måneder. For å studere den kortsiktige gjenopprettingsdynamikken til krypter (f.eks. i flere påfølgende dager etter skade), kan laserablasjonsmetoden beskrevet her kombineres med intravitale bildevinduer27,28,40.
Denne protokollen kan brukes til en rekke forskningsapplikasjoner fra ulike vitenskapelige områder som spenner over regenerering, immunologi og kreftforskning. Longitudinell avbildning av intestinal regenerering kaster lys over den cellulære dynamikken som bevarer epitelintegritet og barrierefunksjon, muliggjør vertsforsvar mot patogener i tarmlumenet, og som ligger til grunn for clearance og spredning av onkogene mutasjoner. Hvert vitenskapelig spørsmål vil stille unike krav til omfanget av laserindusert skade og varigheten av bildebehandling. Fluorescerende reportermus og injiserte fargestoffer kan drastisk utvide og forfine dataene som kan anskaffes ved å tillate visualisering av hvilken som helst celle og struktur av interesse. For eksempel kan en Lgr5-CreERt2: Rosa26-Confetti-mus brukes til å visualisere stamcelleprogenier, mens Rosa26-mTmG-reporteren informerer om vevsarkitektur. Sammen gjør disse nylige teknologiske fremskrittene intravital intestinal eksperimentering et lukrativt verktøy for å fremme vår forståelse av tarmbiologi og sykdom.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av Netherlands Organization of Scientific Research NWO (Vici grant 09150182110004 til JVR og Veni grant 09150161910151 til H.A.M.), OCENW. GROOT.2019.085 (til J.v.R), og et EMBO postdoktorstipend (stipend ALTF 452-2019 til H.A.M).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia induction box | Veterinary Technics | ||
| Autoclave | Certoclav | ||
| Betadine | Mylan | 202809 | |
| Diaper (underpad) | Absorin comfort | ||
| Dumont forceps | Fine Scientific Tools | 11255-20 or 11272-40 | Inox, style #55, used to hold the peritoneum |
| Enzymatic instrument cleaner | Roboz | EC-1000 | |
| Ethanol 80% | homemade | NA | |
| Eye ointment | Duratears Z (Alcon) | 288/28282-6 | |
| Fine Scissors Straight 9 cm | Fine Scientific Tools | 14060-09 | Used to cut skin and peritoneum of the mouse |
| Gauze 5 cmX5 cm | Cutisoft (Bsn medical) | 45847-00 | |
| Graefe Forceps Curved Serrated | Fine Scientific Tools | 11051-10 | Used to hold the skin |
| Hartman Hemostat Straight | Fine Scientific Tools | 13002-10 | Used for suturing |
| Heating pad | Comfort | T5-5000 | |
| Imaging box | Custom made | ||
| Incision film | Nobafilm | 172215 | |
| Inverted multi-photon microscope with automated stage | Leica Microsystems | NA | |
| Isoflurane (vetflurane) | Pharmachemie BV, Haarlem, Netherlands | 305788 | |
| Isoflurane vaporizer | Penlon sigma delta | ||
| Micropore paper tape | Micropore | ||
| NaCl 0.9% | Braun | Other brands available | |
| Needle 25G | BD | 300600 | |
| Paper tape tesa | Tesa | NA | |
| Parafilm | Bemis | PM-994 | semi-transparent tape |
| Razor blades | Supermax stainless steel | Other brands available | |
| Rectal probe | Kent Scientific | 20250-91 | |
| Rimadyl Cattle (carprofen) | Zoetis B.V | Registration# REG NL 10130 | |
| Student Fine Scissors Straight 11.5 cm | Fine Scientific Tools | 91460-11 | Used to cut gauze |
| Surgical instrument cleaner | Roboz | IC-1000 | |
| Surgical instrument lubricant | Roboz | IL-1000 | |
| Syringes (1 ml) | BD | 303172 | Other brands available |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Temgesic (Buprenorphine hydrochloride) | Indivior UK Limited/Reckitt Benckiser Healthcare | Registration# RVG 08725 | |
| Vicryl polyglactin suture 5-0 FS-2 needle | Ethicon | V292ZH | |
| VirkonS | Bio-services | antiseptic solution | |
| Wooden cotton swab (sterile) | Klinion | 531530 | Other brands available |
References
- Clevers, H. The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment. Cell. 154 (2), 274-284 (2013).
- Darwich, A. S., Aslam, U., Ashcroft, D. M., Rostami-Hodjegan, A. Meta-analysis of the turnover of intestinal epithelia in preclinical animal species and humans. Drug Metabolism and Disposition. 42 (12), 2016-2022 (2014).
- Beumer, J., Clevers, H. Regulation and plasticity of intestinal stem cells during homeostasis and regeneration. Development. 143 (20), 3639-3649 (2016).
- Ritsma, L., et al. Intestinal crypt homeostasis revealed at single-stem-cell level by in vivo live imaging. Nature. 507 (7492), 362-365 (2014).
- Azkanaz, M., et al. Retrograde movements determine effective stem cell numbers in the intestine. Nature. 607 (7919), 548-554 (2022).
- van Es, J. H., et al. Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage. Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).
- Tomic, G., et al. Phospho-regulation of ATOH1 is required for plasticity of secretory progenitors and tissue regeneration. Cell Stem Cell. 23 (3), 436-443 (2018).
- Asfaha, S., et al. Krt19+/Lgr5- cells are radioresistant cancer-initiating stem cells in the colon and intestine. Cell Stem Cell. 16 (6), 627-638 (2015).
- Schmitt, M., et al. Paneth cells respond to inflammation and contribute to tissue regeneration by acquiring stem-like features through SCF/c-Kit signaling. Cell Reports. 24 (9), 2312-2328 (2018).
- Davidson, L. A., et al. Alteration of colonic stem cell gene signatures during the regenerative response to injury. Biochimica et Biophysica Acta. 1822 (10), 1600-1607 (2012).
- Ijiri, K., Potten, C. S. Further studies on the response of intestinal crypt cells of different hierarchical status to eighteen different cytotoxic agents. British Journal of Cancer. 55 (2), 113-123 (1987).
- Andersson-Rolf, A., Zilbauer, M., Koo, B. K., Clevers, H. Stem cells in repair of gastrointestinal epithelia. Physiology. 32 (4), 278-289 (2017).
- Totafurno, J., Bjerknes, M., Cheng, H. The crypt cycle. Crypt and villus production in the adult intestinal epithelium. Biophysical Journal. 52 (2), 279-294 (1987).
- Dekaney, C. M., Gulati, A. S., Garrison, A. P., Helmrath, M. A., Henning, S. J. Regeneration of intestinal stem/progenitor cells following doxorubicin treatment of mice. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297 (3), G461-G470 (2009).
- Cairnie, A. B., Millen, B. H. Fission of crypts in the small intestine of the irradiated mouse. Cell and Tissue Kinetics. 8 (2), 189-196 (1975).
- Bruens, L., Ellenbroek, S. I. J., van Rheenen, J., Snippert, H. J. In vivo imaging reveals existence of crypt fission and fusion in adult mouse intestine. Gastroenterology. 153 (3), 674-677 (2017).
- Baker, A. M., et al. Crypt fusion as a homeostatic mechanism in the human colon. Gut. 68 (11), 1986-1993 (2019).
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
- Okayasu, I., et al. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).
- Rakoff-Nahoum, S., Paglino, J., Eslami-Varzaneh, F., Edberg, S., Medzhitov, R. Recognition of commensal microflora by toll-like receptors is required for intestinal homeostasis. Cell. 118 (2), 229-241 (2004).
- Choi, J., et al. Intestinal crypts recover rapidly from focal damage with coordinated motion of stem cells that is impaired by aging. Scientific Reports. 8 (1), 10989 (2018).
- Tian, H., et al. A reserve stem cell population in small intestine renders Lgr5-positive cells dispensable. Nature. 478 (7368), 255-259 (2011).
- Choi, M., Yun, S. H. In vivo femtosecond endosurgery: an intestinal epithelial regeneration-after-injury model. Optics Express. 21 (25), 30842-30848 (2013).
- Seno, H., et al. Efficient colonic mucosal wound repair requires Trem2 signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (1), 256-261 (2009).
- Hua, G., et al. Distinct levels of radioresistance in Lgr5+ colonic epithelial stem cells versus Lgr5+ small intestinal stem cells. Cancer Research. 77 (8), 2124-2133 (2017).
- Rompolas, P., et al. Live imaging of stem cell and progeny behaviour in physiological hair-follicle regeneration. Nature. 487 (7408), 496-499 (2012).
- Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging: General overview and technical insights. Intravital. 3 (2), e29917 (2014).
- Rakhilin, N., et al. An intravital window to image the colon in real time. Nature Communications. 10 (1), 5647 (2019).
- Messal, H. A., et al. Antigen retrieval and clearing for whole-organ immunofluorescence by FLASH. Nature Protocols. 16 (1), 239-262 (2021).
- Farrelly, O., et al. Two-photon live imaging of single corneal stem cells reveals compartmentalized organization of the limbal niche. Cell Stem Cell. 28 (7), 1233-1247 (2021).
- Krndija, D., et al. Active cell migration is critical for steady-state epithelial turnover in the gut. Science. 365 (6454), 705-710 (2019).
- Bruens, L., et al. Calorie restriction increases the number of competing stem cells and decreases mutation retention in the intestine. Cell Reports. 32 (3), 107937 (2020).
- Bietar, B., Zhou, J., Lehmann, C. Utility of intestinal intravital microscopy for the study of CNS injury-induced immunodepression syndrome (CIDS). Clinical Hemorheology and Microcirculation. 79 (1), 137-147 (2021).
- Erreni, M., Doni, A., Weigert, R. Method for acute intravital imaging of the large intestine in live mice. Methods in Molecular Biology. 2304, 285-299 (2021).
- Hiltensperger, M., et al. Skin and gut imprinted helper T cell subsets exhibit distinct functional phenotypes in central nervous system autoimmunity. Nature Immunology. 22 (7), 880-892 (2021).
- Martínez-Sánchez, L. D. C., et al. Epithelial RAC1-dependent cytoskeleton dynamics controls cell mechanics, cell shedding and barrier integrity in intestinal inflammation. Gut. 72 (2), 275-294 (2022).
- Means, A. L., Xu, Y., Zhao, A., Ray, K. C., Gu, G. A CK19(CreERT) knockin mouse line allows for conditional DNA recombination in epithelial cells in multiple endodermal organs. Genesis. 46 (6), 318-323 (2008).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
- Messal, H. A., van Rheenen, J., Scheele, C. L. An intravital microscopy toolbox to study mammary gland dynamics from cellular level to organ scale. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 26 (1), 9-27 (2021).
