Summary
Фракционирование плотности почвы разделяет органическое вещество почвы на отдельные пулы с различными механизмами стабилизации, химическим составом и временем оборота. Растворы поливольфрамата натрия с определенной плотностью позволяют разделять органические вещества свободных частиц и органические вещества, связанные с минералами, в результате чего получаются фракции органического вещества, пригодные для описания реакции почвы на управление и изменение климата.
Abstract
Органическое вещество почвы (SOM) представляет собой сложную смесь различных соединений, которые охватывают диапазон от свободных, частично разложившихся растительных компонентов до более микробно измененных соединений, содержащихся в почвенных агрегатах, до побочных продуктов с высокой степенью переработки микробов с сильными ассоциациями с реактивными минералами почвы. Ученые-почвоведы изо всех сил пытались найти способы разделения почвы на фракции, которые легко измеримы и полезны для моделирования углерода (C) почвы. Все чаще используется фракционирование почвы на основе плотности, оно легко выполняется и дает пулы C в зависимости от степени связи между SOM и различными минералами; таким образом, фракционирование плотности почвы может помочь охарактеризовать СОМ и определить механизмы стабилизации СОМ. Тем не менее, протоколы фракционирования плотности почвы значительно различаются, что затрудняет сравнение результатов различных исследований и экосистем. Здесь мы описываем надежную процедуру фракционирования плотности, которая разделяет твердые частицы и органические вещества, связанные с минералами, и объясняем преимущества и недостатки разделения почвы на две, три или более фракции плотности. Такие фракции часто различаются по своему химическому и минеральному составу, времени оборачиваемости и степени микробной обработки, а также степени стабилизации минералов.
Introduction
Почва является крупнейшим хранилищем земного углерода (C), содержащим более 1,500 Pg C в верхнем 1 м и почти вдвое больше на более глубоких уровнях во всем мире, что означает, что почва содержит больше C, чем растительная биомасса и атмосфера вместе взятые1. Органическое вещество почвы (SOM) удерживает воду и питательные вещества почвы и имеет важное значение для продуктивности растений и функционирования наземной экосистемы. Несмотря на всемирное признание важности адекватных запасов СОМ для здоровья почвы и продуктивности сельского хозяйства, запасы почвенного углерода были существенно истощены из-за неустойчивого управления лесами и сельским хозяйством, изменения ландшафта и потепления климата 2,3. Возросший интерес к восстановлению здоровья почвы и использованию удержания почвы С в качестве ключевого игрока в естественных климатических решениях привел к усилиям по пониманию факторов, которые контролируют связывание и стабилизацию почвы С в различных средах 4,5.
Органическое вещество почвы (SOM) представляет собой сложную смесь различных соединений, которые охватывают диапазон от свободных, частично разложившихся растительных компонентов до более микробно измененных соединений, содержащихся в почвенных агрегатах (определяемых здесь как материал, образованный комбинацией отдельных единиц или элементов), до субпродуктов высокой степени переработки микробов с сильными ассоциациями с реактивными минераламипочвы 6 . В тех случаях, когда нецелесообразно идентифицировать полный набор отдельных соединений в SOM, исследователи часто сосредотачиваются на выявлении меньшего числа функциональных пулов C, которые существуют как физические реальности и которые различаются по скорости оборота, общему химическому составу и степени стабилизации с минеральными компонентами почвы1. 7. Для того, чтобы пулы могли быть критически интерпретированы и смоделированы, важно, чтобы отдельные пулы были небольшими по количеству, поддавались прямому измерению, а не только теоретически, и демонстрировали явные различия в составе и реакционной способности8.
Для выделения значимых бассейнов почвы С было использовано множество различных методов, как химических, так и физических, и они хорошо обобщены фон Лютцовым и др.9 и Поеплау и др.10. Методы химической экстракции направлены на выделение определенных пулов, таких как C, связанных либо с плохо кристаллическими, либо с кристаллическими Fe и Al11. Органические растворители использовались для экстракции специфических соединений, таких как липиды12, а гидролиз или окисление SOM использовались в качестве меры лабильного пула C13,14. Однако ни один из этих методов экстракции не классифицирует все пулы C на измеримые или моделируемые дроби. Физическое фракционирование почвы классифицирует всю почву C на пулы в зависимости от размера и предполагает, что разложение растительных остатков приводит к фрагментации и все более мелким частицам. Хотя размер сам по себе не может отделить свободные растительные остатки от связанных с минералами SOM15, количественная оценка этих двух бассейнов имеет решающее значение для понимания стабилизации почвы C из-за общих пространственных, физических и биогеохимических различий в образовании и обороте16.
Все чаще используется фракционирование почвы С на основе плотности, и его легко выполнить, и он идентифицирует различные пулы С в зависимости от степени связи с различными минералами17,18,19; таким образом, фракционирование плотности почвы может помочь выяснить различные механизмы стабилизации почвы С. Основным требованием к фракционированию почвы является способность полностью рассеивать органические и минеральные частицы. После диспергирования разложившееся органическое вещество, относительно свободное от минералов, плавает в растворах легче ~ 1,85 г / см 3 , в то время как минералы обычно находятся в диапазоне 2-4,5 г / см 3 , хотя оксиды железа могут иметь плотность до 5,3 г / см3 . Легкая или свободная фракция твердых частиц, как правило, имеет более короткое время оборота (если нет значительного загрязнения древесным углем) и, как было показано, очень чувствительна к культивации и другим нарушениям. Тяжелая (>1,85 г/см3) или связанная с минералами фракция часто имеет более длительное время оборота из-за устойчивости к микробно-опосредованному разложению, получаемой при связывании органических молекул с реакционноспособными минеральными поверхностями. Однако тяжелая фракция может насыщаться (т.е. достигать верхнего предела минеральной комплексообразующей способности), в то время как легкая фракция теоретически может накапливаться почти бесконечно. Таким образом, понимание физического распределения органического вещества в пулах связанного с минералами и твердых органических веществ помогает выяснить, какими экосистемами можно управлять для эффективного связывания углерода и как различные системы будут реагировать на изменение климата и меняющиеся модели антропогенных возмущений20.
Несмотря на то, что за последнее десятилетие значительно возросло использование плотно-фракционного фракционирования с использованием растворов поливольфрамата натрия при разной плотности, методы и протоколы значительно различаются, что затрудняет сравнение результатов различных исследований и различных экосистем. Хотя было показано, что плотность 1,85 г/см3 позволяет извлекать наибольшее количество фракции свободного света с минимальным включением связанного с минералами органического вещества (МАОМ)17, во многих исследованиях использовались плотности в диапазоне от 1,65 до 2,0 г/см3. В то время как в большинстве исследований почвы были разделены только на две пулы (легкая фракция и тяжелая фракция, далее LF и HF), в других исследованиях использовались множественные плотности для дальнейшего измельчения тяжелой фракции в пулы, которые различаются минералами, с которыми они связаны, относительным отношением минералов к органическому покрытию или степенью агрегации (например, Sollins et al.17, Sollins et al.18, Hatton et al.21, Lajtha et al.22, Yeasmin et al.23, Wagai et al.24, Volk et al.25). Кроме того, были предложены более сложные процедуры фракционирования, которые сочетают в себе разделение как по размеру, так и по плотности, что приводит к увеличению числа бассейнов (например, Yonekura et al.26, Virto et al.27, Moni et al.15, Poeplau et al.10), но также и к большему количеству ошибок как в методологии, так и в отношении размера пула. Кроме того, авторы также использовали обработку ультразвуком с различной интенсивностью и временем, чтобы диспергировать агрегаты и MAOM с минеральных поверхностей28,29,30.
Здесь мы описываем надежную процедуру фракционирования плотности, которая идентифицирует, во-первых, два уникальных пула почвенного углерода (LF и HF, или POM и MAOM), и мы предлагаем как методы, так и аргументы для дальнейшего разделения пула HF на дополнительные фракции, которые различаются в зависимости от их минералогии, степени органического покрытия или агрегации. Показано, что идентифицированные здесь фракции различаются по химическому составу, времени оборота, степени микробной обработки и степени стабилизации минералов18,19.
Следующая процедура разделяет объемную почву на твердые органические вещества (POM) и минеральные органические вещества (MAOM) путем смешивания известного количества почвы в растворе с определенной плотностью. Эффективность процедуры измеряется комбинированным извлечением почвенной массы и углерода по отношению к исходной массе образца почвы и содержанию углерода. Плотный раствор достигается растворением поливольфрамата натрия (SPT) в деионизированной воде. Почву сначала смешивают с плотным раствором SPT и перемешивают, чтобы тщательно перемешать и диспергировать почвенные агрегаты. Затем центрифугирование используется для отделения почвенных материалов, которые либо всплывают (легкая фракция), либо тонет (тяжелая фракция) в растворе. Этапы смешивания, изоляции, восстановления и промывки повторяются несколько раз, чтобы обеспечить разделение легких и тяжелых фракций, а также удаление SPT из материала. Наконец, фракции почвы сушат, взвешивают и анализируют на содержание C. Фракционированный материал может быть использован для последующих процедур и анализов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Изготовление исходных растворов поливольфрамата натрия (ППТ)
ВНИМАНИЕ: SPT является раздражителем и вреден при проглатывании или вдыхании. Он токсичен для водных организмов; избегать его попадания в окружающую среду.
- Чтобы получить 1 л раствора SPT плотностью 1,85 г/см3, растворите 1,051 г кристаллизованной SPT примерно в 600 мл деионизированной дистиллированной (DDI) воды. Перемешивайте раствор до полного растворения SPT, примерно в течение 15 мин, а затем доведите объем раствора до 1 л с помощью DDI.
ПРИМЕЧАНИЕ: Извлечение углерода с использованием плотности раствора <1,85 г/см3 может привести к недопривлечению углерода легкой фракции, полученного из твердых органических частиц17,18, что приводит к искажению количества углерода в образце. Таким образом, предлагается плотность раствора SPT 1,85 г/см3 8,17, чтобы в большей степени включать углерод, связанный с твердыми частицами органического вещества для типичного образца почвы (т.е. большинства песчаных, иловых и глинистых суглинков с содержанием C <10%). - Чтобы получить 1 л раствора SPT плотностью 2,40 г/см3, растворите 1,803 г твердого SPT примерно в 500 мл воды DDI. Перемешайте раствор до полного растворения SPT, а затем доведите объем раствора до 1 л с помощью DDI.
ПРИМЕЧАНИЕ: Помимо потенциального использования для фракционирования почвы, для корректировки раствора SPT на более поздних этапах протоколачасто требуется раствор с плотностью более 1,85 г/см3 (см. этап 3.2). Если остается дополнительный раствор 2,40 г/см3, раствор можно разбавить до 1,85 г/см3 деионизированной водой и использовать для фракционирования почвы. - Перед использованием во фракционировании проанализируйте SPT на содержание C и N. Выполните этот анализ с помощью твердотельного или жидкого элементного анализатора (примеры методов: ISO 10694:1995, ISO 20236:2018).
- Выполните разбавление раствора в соотношении 1:100 с этапа 1.1 для жидкостных элементных анализаторов, чтобы уменьшить износ элементарных скрубберов и катализаторов. Допуск на загрязнение C и N в растворе SPT будет зависеть от образца и последующего использования фракций почвы. Как правило, раствор SPT с содержанием C и N <1 ppm и <0,1 ppm, соответственно, считается пригодным для использования, поскольку такие растворы, как этот, обладают минимальной емкостью для изменения гораздо больших пулов C и N в почве.
2. Растворение почвы в СПТ
- Добавьте 50 г высушенной на воздухе и просеянной до 2 мм почвы в коническую полипропиленовую центрифужную пробирку объемом 250 мл. Запишите массу как минимум на четыре значимые цифры. Не используйте высушенную в духовке почву, так как это может увеличить растворимый углерод из-за термоиндуцированного лизисаклеток 31.
ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать влажную почву31 поля, но на более поздних этапах требуется дальнейшая корректировка для поддержания целевой плотности раствора SPT. Рекомендуется просеивать почвенный материал до 2 мм, чтобы удалить крупный материал, который может исказить результаты фракционирования, например, камни и древесный мусор.- Отрегулируйте массу почвы, чтобы обеспечить достаточную массу каждой фракции, чтобы избежать значительной ошибки в количественном определении. Наиболее частой причиной корректировки массы является низкое содержание ПОМ (например, <2% от общей массы почвы). Для таких почв обеспечьте дополнительную массу почвы, чтобы точно количественно оценить восстановление POM. В целом, допустимо корректировать массу почвы для каждого отдельного образца, поскольку изменение массы образца не изменит соотношение POM и MAOM. Тем не менее, часто полезно использовать постоянную массу, чтобы помочь сбалансировать центрифугу.
- Обработайте почвы, богатые карбонатами, для удаления неорганических карбонатов перед фракционированием32.
- Добавьте 50 мл SPT плотности 1,85 г/см3 в центрифужную пробирку и плотно закройте крышку. Как и в случае с количеством почвы, при необходимости отрегулируйте объем SPT. В поверхностных почвах, богатых ПОМ (например, во многих лесных почвах умеренного пояса), используйте большее соотношение почвы к ППТ (например, 30 г почвы на 60 мл СПТ) для достижения адекватного разделения материалов легкой и тяжелой фракции.
- Энергично встряхните трубку вручную в течение ~ 60 с, чтобы разбить неводостойкие агрегаты. Желательно сильное столкновение грунтовых агрегатов с боковыми стенками центрифужной пробирки, а это означает, что простого вихряния раствора может быть недостаточно.
- Прикрепите трубку к шейкеру платформы. Часто размещение трубки на боку способствует рассеиванию почвы, увеличивая силу выплескивания раствора и уменьшая высоту стояния слоя почвы. Позаботьтесь о том, чтобы трубка была плотно закрыта, и встряхивайте в течение 2 ч при 40-120 об/мин. Периодически вынимайте трубку из шейкера и энергично встряхивайте вручную, чтобы увеличить перемешивание более плотного агрегированного материала.
3. Выполнение грубого фракционирования почвы
- Извлеките трубку из шейкера. Выровняйте массы центрифужных пробирок, осторожно добавив дополнительный раствор SPT, чтобы достичь однородной массы по набору центрифугируемых пробирок, обеспечивая энергичное встряхивание вручную в течение 30 с после добавления раствора SPT. Центрифуга в течение 10 мин при 3 000 x g в центрифуге с качающимся ведром.
- Перед аспирацией образца проверьте плотность надосадочной жидкости, отобрав пипеткой 5 мл раствора и проверив массу на весах. Отрегулируйте плотность SPT по мере необходимости для достижения желаемой плотности. Встряхните и снова центрифугу, если была выполнена регулировка плотности раствора.
- Прикрепите колбу с боковым рычагом объемом 1 л к вакуумному насосу. Поместите стекловолоконный фильтр диаметром 110 мм (размер пор 0,7 мкм) в фарфоровую воронку Бюхнера с внутренним диаметром 12 см. Аккуратно загерметизируйте воронку с помощью конической резиновой прокладки на колбе с боковым рычагом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фильтры из стекловолокна следует предварительно промыть в сушильном шкафу при температуре 150 ° C и промыть DDI перед использованием. - Установите одну дополнительную колбу с боковым оружием объемом 1 л, прикрепленную к пылесосу. Поместите резиновую пробку в верхнюю часть колбы с прикрепленной выступающей длиной ~ 0,5 м трубки для аспирации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Может быть полезно прикрепить пластиковый наконечник (например, одноразовый наконечник для пипетки объемом 5 мл с концом, отрезанным под углом) к концу аспирационной трубки, чтобы улучшить контроль всасывания во время аспирации (см. рис. 1). - Аккуратно аспирируйте надосадочную жидкость и взвешенный материал, осевший в верхнем слое раствора, по бокам центрифужной пробирки, стараясь не касаться кончика аспирационной трубки поверхностью гранулированного грунта под ней.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если какой-либо материал почвенных гранул (тяжелая фракция) по ошибке отсасывается вместе с взвешенным материалом (легкая фракция), процедуру фракционирования следует повторить. Если ее не заметить, такая ошибка приведет к более высокой, чем ожидалось, массе легкой фракции с более низким, чем ожидалось, содержанием углерода, что может быть очевидно при анализе данных образцов с аналогичными свойствами почвы.- Чтобы очистить аспирационную трубку между образцами, быстро погрузите наконечник пробирки (например, погрузите на 0,1 с) в воду DDI и наберите ~ 5 мл воды DDI через линию с включенным вакуумным насосом. Повторяйте до тех пор, пока весь материал не будет смыт из вакуумной трубки.
- Снимите резиновую пробку и насадку аспирационной трубки с колбы с боковым рычагом и вылейте содержимое в верхнюю часть воронки Бюхнера с включенным вакуумным насосом.
- Промойте колбу водой DDI, перемешайте и вылейте содержимое колбы в воронку Бюхнера. Повторяйте до тех пор, пока не будут удалены все остатки, прилипшие к стенкам колбы.
- Добавьте 50 мл SPT в центрифужную пробирку и энергично встряхивайте вручную в течение 60 с (или используйте шейкерный стол, если почва не быстро рассеивается), обязательно разбивая твердые гранулы на дне пробирки, чтобы весь остаток ресуспендировался. Центрифуга в течение 10 мин в дозе 3 000 г.
- Повторите шаг 3.5. Вылейте содержимое колбы в ту же воронку Бюхнера, которая использовалась на шаге 3.5.2.
- Добавьте 50 мл SPT в центрифужную пробирку и энергично встряхните вручную, убедившись, что твердая гранула на дне пробирки разбита. Центрифуга в течение 10 мин в дозе 3 000 г.
- Повторите шаг 3.5. Вылейте содержимое колбы в ту же воронку Бюхнера, которая использовалась на шаге 3.5.2.
4. Дополнительное разделение плотности с использованием SPT более высокой плотности
ПРИМЕЧАНИЕ: При выполнении более одной дополнительной фракции плотности последующие фракции должны выполняться в порядке увеличения плотности. Здесь показаны этапы выделения с использованием SPT плотности 1,85-2,4 г/см3 и >2,4 г/см3.
- Добавьте 50 мл 2,4 г/см3 SPT в центрифужную пробирку, содержащую почвенный материал >1,85 г/см3 с этапа 3. Энергично встряхните вручную (>60 с), не отрывая твердых гранул на дне трубки. Центрифуга в течение 10 мин в дозе 3 000 г.
- Перед аспирацией образца проверьте плотность надосадочной жидкости, отобрав пипеткой 5 мл раствора и проверив массу на весах. Отрегулируйте плотность SPT по мере необходимости для достижения желаемой плотности. Встряхните и снова центрифугу, если была выполнена регулировка плотности раствора.
- Повторите шаг 3, используя раствор SPT 2,4 г/см3 вместо раствора SPT 1,85 г/см3, используемого ранее. В конце этапа 3 материал, изолированный в воронке Бюхнера, будет иметь плотность от 1,85 до 2,4 г/см3, в то время как материал, оставшийся в центрифужной пробирке, будет иметь плотность >2,4 г/см3.
5. Промывка СПТ от образцов тяжелой и легкой фракции
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие этапы промывки должны быть выполнены для всего фракционированного материала. Если раствор SPT не полностью смыт с материала, соответствующие веса фракции будут неточными.
- Добавьте 50 мл воды DDI в центрифужную пробирку с материалом тяжелой фракции и энергично встряхните вручную (60 с), убедившись, что твердые гранулы на дне пробирки разбиваются. Центрифуга в течение 10 мин в дозе 3 000 г.
- Придыхание, как в шаге 3.5. На этом этапе весь материал легкой фракции должен был быть удален. Выбросьте прозрачный аспират в ведро для отходов вместо того, чтобы добавлять его в воронку фильтра.
- Повторите шаги 5.1-5.2 дважды. Перед окончательной аспирацией раствора в пробирке используйте пипетку для переноса, чтобы отбрать 25 мл надосадочной жидкости, и проверьте плотность, разделив вес раствора на объем, чтобы убедиться, что SPT был адекватно удален из образца. Если плотность составляет <1,01 г/мл, переходите к следующему шагу. Если плотность составляет 1,01 г/мл или выше, выполните дополнительную промывку водой, как указано выше, до тех пор, пока плотность не станет менее 1,01 г/мл.
- Чтобы обеспечить полное удаление SPT из легкой фракции, заполните каждую воронку Buchner водой DDI и отфильтруйте содержимое через фильтры из стекловолокна. Как только вода полностью отфильтруется, повторите это еще дважды. Если в почве много органических веществ, фильтрация может занять до 48 часов.
6. Сбор материала тяжелой фракции
- Аккуратно соскребите почву из пробирки центрифуги в чистый, маркированный стеклянный стакан или банку. Налейте в трубку достаточное количество воды DDI, чтобы разрыхлить оставшуюся почву; Закройте крышку и встряхните, а затем добавьте суспензию в стеклянную емкость. Промойте всю оставшуюся почву из центрифужной пробирки и переложите в стеклянную емкость с помощью деионизированной воды.
- Поместите стеклянную емкость в сушильный шкаф при температуре 40-60 °C. Сушат до тех пор, пока не будет достигнут постоянный сухой вес, обычно в течение 24-72 часов.
7. Сбор материала легкой фракции
- Выключите вакуумный насос и извлеките воронку из колбы с пистолета. Держа воронку горизонтально над стеклянным стаканом или банкой с маркировкой, аккуратно промойте частицы из фильтра с помощью бутылки для мытья воды DDI.
ПРИМЕЧАНИЕ: Возможно, потребуется аккуратно соскрести фильтр с помощью шпателя и промыть фильтр с обеих сторон, чтобы удалить все остатки. - Поместите стеклянную емкость в сушильный шкаф при температуре 40-60 °C. Сушат до тех пор, пока не будет достигнут постоянный сухой вес, обычно в течение 24-72 часов.
8. Взвешивание сухой массы фракционированного материала
- Аккуратно соскребите весь высохший материал из каждого контейнера в пластиковую весовую лодку. Запишите массу с точностью до четвертого знака после запятой. Поместите образец в маркированный флакон или пакет для хранения.
- Повторите то же самое для всех высушенных образцов.
9. Сбор и анализ данных об общем органическом углероде
- Следуйте процедурам анализа в соответствии с прибором, который будет использоваться для анализа содержания элементарного С (например, ISO 10694:1995).
ПРИМЕЧАНИЕ: Измельчение высушенного фракционного материала в мелкий порошок является обычной практикой для обеспечения однородности фракционированного образца перед элементным анализом. - Убедитесь, что совокупная масса всех фракций равна не менее ~ 90% от исходной массы образца почвы. Если потери материала составляют >10%, рекомендуется дополнительное повторное фракционирование.
- Количественно оценить кумулятивное извлечение почвенного органического углерода (SOC) во фракциях. Потери SOC могут не полностью коррелировать с потерей массы из-за непропорциональной потери фракционного материала и потери растворенного органического углерода. Тем не менее, потери SOC также должны составлять <10 % от исходного SOC в образце почвы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Фракционирование плотности почвы идеально подходит для исследования того, как почвы различаются по содержанию твердых частиц и связанных с минералами органических веществ. Разделение ПОУ на эти два отдельных пула дает возможность прояснить изменения в содержании C в почве и динамику стабилизации, которые в противном случае могли бы быть неясными при наблюдении тенденций в массовом содержании C в почве. Дальнейшее разделение тяжелого материала (плотность >1,85 г/см3) дает дополнительное представление об изменениях и тенденциях стабилизации почвы С, но усложняет процедуру и связанную с ней интерпретацию и связано с дополнительными затратами. Тем не менее, фракционирование почвы на три или более пула плотности может пролить свет на сложные тенденции и химические различия в пулах почвенного С. Как и в случае с любой процедурой фракционирования почвы, разделение этих пулов почвы С является несовершенным, и потенциальное влияние таких ошибок и допущений метода должно быть признано при представлении результатов. Наконец, практикующие специалисты должны быть осведомлены о разнообразии существующих методов фракционирования почвы и их уникальных сильных и слабых сторонах (см. обзоры и сравнения, представленные фон Лютцовом и др.9 и Поеплау и др.10). Многие из этих методов фракционирования почвы не являются взаимоисключающими и могут быть надлежащим образом объединены для улучшения или проверки анализа динамики почвы C.
Выбор количества используемых фракций плотности является важным первым шагом перед началом процедуры фракционирования. В то время как несколько пулов всегда могут быть математически объединены для получения одной легкой и одной тяжелой фракций для сравнения результатов с другими исследованиями, фракционирование тяжелой фракции на более чем один пул значительно увеличивает время и затраты. Pierson et al.33 количественно оценили изменение SOC в трех пулах плотности после долгосрочного исследования детритных манипуляций. При объединении двух более тяжелых бассейнов (рис. 2) эффекты обработок обломками были различны между легкой (<1,85 г/см3) и тяжелой (>1,85 г/см3) фракциями, особенно по сравнению с эффектами, наблюдаемыми от объемного содержания SOC. Выполняя дополнительное фракционирование плотности при 2,40 г/см3 (рис. 3), можно дополнительно определить, что эффекты обработки на МАОМ были преимущественно ограничены материалом с более высокой плотностью (>2,4 г/см3). Наконец, представленное содержание C:N в объемной почве по сравнению с фракционированными пулами плотности (рис. 4) представляет собой четкую демонстрацию эффективности метода фракционирования плотности для отделения твердых частиц растительного происхождения от минерального вещества с относительно низким содержанием C:N.
После 50 лет манипуляций с детритами Lajtha et al.22 использовали шесть последовательных фракционирований плотности для тщательного изучения влияния детритов на стабилизацию и дестабилизацию SOC (рис. 5). Изолировав семь пулов SOC, авторы смогли наблюдать больший нюанс в ответе POM и MAOM после добавления и удаления помета. Бассейны с плотностью <2,20 г/см3 были более чувствительны к обработке, что согласуется с давним ожиданием положительной взаимосвязи между пометом и накоплением SOC. Однако реакция бассейнов SOC с плотностью >2,20 г/см3 была менее выраженной, и конкретно для обработки помета была выявлена противоположная, отрицательная зависимость между входами и SOC (т.е. входы были уменьшены, но содержание SOC фракции увеличилось). При проведении последующего анализа 14С были установлены вклады и потери более поздних поступлений С для каждого пула, что дало механистическое представление о детритальном контроле путей образования и дестабилизации МАОМ.
Сочетание изотопного анализа с последовательным фракционированием плотности дает дополнительные возможности для исследования тонкостей динамики SOM. Тем не менее, исследователи должны позаботиться о том, чтобы учитывать влияние минералогии на результаты фракционирования плотности. Уникальная минеральная структура и реакционная способность обуславливают врожденные различия в распределении плотности частиц между минералами. В качестве примера Sollins et al.18 изучили изотопные и химические характеристики пулов множественной плотности в четырех лесных почвах с разрозненными исходными материалами и морфологией (рис. 6). Контрастная минералогия между четырьмя почвами в значительной степени способствовала наблюдаемым различиям в 13 C, 14C и 15N для каждой доли плотности. Без учета минералогии такие результаты могут быть неверно истолкованы в отношении динамики образования и стабилизации SOC. Наконец, возвращаясь к практичности выполнения дополнительного разделения плотности, Sollins et al.18 получили мало дополнительной информации из анализа шести пулов плотности, а не только трех (рис. 6).
Helbling et al.31 определили влияние сезонности на содержание легкой фракции лесных почв, а также влияние обработки почвы сушкой на потерю С в растворимый пул (рис. 7). В результате этой работы были получены два важных результата. Во-первых, в то время как сушка почвы в печи приводила к значительно большей потере растворенного органического С в растворе SPT, количество потерянного С было незначительным. Во-вторых, как представляется, пул легкой фракции С не имеет какой-либо сезонности, а это означает, что сроки отбора проб почвы не влияют на результаты фракционирования. Однако можно ожидать, что результаты будут различаться в зависимости от почвы и окружающей среды, учитывая различия в запасах ПОМ и скоростях разложения.
Рисунок 1: Аппарат для аспирации легких фракций. Схема вакуумного аппарата для аспирации легкой фракции. * Парапленка может использоваться для закрепления и герметизации соединения между наконечником пипетки и вакуумной трубкой. ** Разрезание наконечника пипетки под углом может быть полезно для увеличения размера отверстия наконечника, а также для подачи близкого всасывания к боковым стенкам центрифужной пробирки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Сравнение содержания углерода для сыпучей, легкой и тяжелой фракции почвы. Почва была собрана с участков очистки от обломков (DIRT) в экспериментальном лесу Х.Д. Эндрюса после 20 лет обработки (n = 3). Минеральный С для обработки удаления корней (NR, NI) был значительно увеличен, в отличие от наблюдаемого влияния на объемное содержание C. Кроме того, фракционированные результаты показывают, что увеличение объемного содержания C в результате двойной обработки древесины (DW) было получено за счет увеличения легкой фракции C. Полосы погрешностей представляют собой стандартную ошибку. Эта цифра была изменена по сравнению с Pierson et al.33. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Сравнение пулов промежуточной и тяжелой фракций. Почва была собрана с участков очистки от обломков (DIRT) в экспериментальном лесу Х.Д. Эндрюса после 20 лет обработки (n = 3). Результаты демонстрируют результаты выделения промежуточной фракции (1,85-2,40 г/см3) и более тяжелой фракции (>2,40 г/см3). Содержание промежуточной фракции С показало большую вариабельность, и эффекты лечения не были значительными. Полосы погрешностей представляют собой стандартную ошибку. Эта цифра была изменена по сравнению с Pierson et al.33. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Соотношение углерода и азота для сыпучей, легкой и тяжелой фракции почвы. Почва была собрана с участков очистки от обломков (DIRT) в экспериментальном лесу Х.Д. Эндрюса после 20 лет обработки (n = 3). Учитывая высокое содержание C:N в растительной ткани по сравнению с минералами почвы, наблюдаемая разница в содержании C:N между легкой и тяжелой фракциями ясно демонстрирует способность фракционирования плотности почвы отделять твердые органические вещества от сыпучего слоя почвы. Полосы погрешностей представляют собой стандартную ошибку. Эта цифра была изменена по сравнению с Pierson et al.33. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Последовательное фракционирование плотности почвы после 50 лет манипуляций с обломками (n = 4). Разделение почвы на семь фракций плотности позволило получить представление о природе нагрузки C на почвенные минералы. Двойная обработка подстилки, которая увеличила почву С, привела к нагрузке С минеральным материалом во фракции 2,00-2,40 г/см3 , о чем свидетельствует изменение концентраций фракции С относительно контроля. Потери почвы С от безпометной обработки были наибольшими в почвенных фракциях с плотностью от 1,85 до 2,20 г/см3. Полосы погрешностей представляют собой стандартную ошибку. Эта цифра была изменена по сравнению с Lajtha et al.22. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Влияние минералогии на пулы плотности почвы. Почвы с уникальной морфологией были собраны на четырех лесных участках. Изотопный анализ демонстрирует, как минералогия почвы может влиять на биогеохимические свойства в бассейнах плотности почвы. Кроме того, в этом случае анализ трех пулов плотности, в отличие от шести или более, в значительной степени зафиксировал тенденции внутри и между различными изотопными сигнатурами. Эта цифра была изменена по сравнению с Sollins et al.18. Исходные данные и графики показаны в столбце с более чем шестью пулами; Данные были пересчитаны и отображены, чтобы продемонстрировать результаты только для трех пулов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Влияние отбора проб и подготовки на фракционирование плотности почвы. Helbling et al.31 обнаружили, что высушенная в печи почва часто дает больше растворенного органического углерода по сравнению с высушенной на воздухе, влажной и выщелоченной почвой. В разные сезоны отбора проб соотношение массы легкой и тяжелой фракции существенно не различалось. Эта цифра была изменена по сравнению с Helbling et al.31. Полосы погрешностей представляют собой стандартную ошибку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В протоколе фракционирования плотности почвы есть несколько конкретных процедур, которые необходимо тщательно контролировать, чтобы уменьшить ошибки при разделении и анализе фракций почвы. Важнейшим этапом процедуры фракционирования плотности почвы является многократная проверка плотности раствора SPT. Влага в образце почвы часто разбавляет раствор SPT, тем самым снижая плотность SPT. Поэтому исследователь всегда должен следить за тем, чтобы после центрифугирования было достигнуто полное разделение легких и тяжелых растворов. Если фракции не разделяются должным образом, следует добавить больше раствора SPT или уменьшить массу почвы. Песчаные почвы быстро отделяются, в то время как почвы с мелкой текстурой, такие как оксисолы, в частности, могут оставаться мутными в течение длительного времени во время центрифугирования из-за высокой взвешенной нагрузки мелких частиц. Когда растворы кажутся мутными после центрифугирования, следует увеличить время или скорость центрифугирования. В качестве альтернативы оценка потерь С из взвешенных отложений может быть определена путем анализа содержания С в аспирационном растворе.
Определение качества поливольфрамата натрия (SPT) для покупки зависит от анализов, которые будут проводиться после фракционирования. Kramer et al.34 обнаружили, что коммерческий SPT может быть обогащен аммонием с высоким содержанием 15 N и, таким образом, может значительно изменить сигнатуру 15N почвенных фракций. Таким образом, для обеспечения минимального загрязнения C и N для исследований, в которых будут измеряться изотопные сигнатуры почв, следует использовать SPT высокой чистоты (например, SPT-0). Однако SPT с классом чистоты, который на одну ступень ниже (например, SPT-1), часто имеет минимальное обогащение N и C и является менее дорогостоящим, что обеспечивает более экономичный вариант, когда изотопы не будут измеряться.
Чтобы избежать значительной погрешности, необходимо позаботиться об удалении из раствора всей легкой фракции, которая часто прилипает к боковым стенкам центрифужных пробирок во время аспирации и к воронке во время последующих этапов фильтрации. Избыток легкой фракции, остающийся в материале тяжелой фракции, приведет к низкой оценке легкой фракции С при одновременной завышенной оценке содержания С тяжелой фракции. Тщательное изучение окончательных данных может помочь выявить такие ошибки при фракционировании серии образцов со сходными свойствами почвы.
Потеря растворенного органического углерода (РОУ) в растворе, как правило, невелика, обычно <5% от общего содержания C в почве, и ее нельзя избежать (рис. 7)31. Однако потери РОУ могут быть намного больше при фракционировании почв с высокорастворимыми пулами углерода, таких как те, которые встречаются в некоторых пустынных средах35. В таких случаях следует также количественно определить водоизвлекаемый пул РОУ. Как правило, погрешности, связанные с потерей массы почвы, особенно легкой фракции, намного больше, чем погрешности, вызванные потерей РОУ.
Адсорбция поливольфрамата в образце почвы является химической возможностью, и степень, в которой происходит такой химический обмен, в настоящее время неизвестна. Кроме того, ожидается, что сродство связывания поливольфрамата будет варьироваться в зависимости от почвы с различными химическими свойствами. В настоящее время корреляция между потерей массы почвы и потерей SOC в конце процедуры обеспечивает простую и логистически осуществимую форму гарантии того, что любой прирост массы от обмена поливольфрамата незначителен для количественной оценки SOC в фракционированном материале. Если кумулятивная масса почвенной фракции больше, чем исходная масса образца, или если потери массы значительно меньше, чем потери SOC, то образцы могут поглощать поливольфрамат. Сначала следует выполнить дополнительные действия по стирке, чтобы попытаться решить такую проблему. Если поглощение поливольфрамата в фракционированном материале сохраняется, может потребоваться дополнительный элементный анализ для проверки и корректировки увеличения содержания вольфрама во фракционированном материале. Примечательно, что такие проблемы, связанные с невозможностью вымыть поливольфрамат из почвенного материала, встречаются редко.
Хотя фракционирование по плотности идеально отделяет свободные твердые частицы (POM) от связанного с минералами органического вещества (MAOM), наличие водостабильных агрегатов усложняет интерпретацию результатов фракционирования плотности. Ил и глина могут образовывать прочные ассоциации и связываться с органическим веществом, а почвенная биота, корни и гифы грибов могут образовывать макроагрегаты, которые помогают защитить органические соединения от микробного разложения. Это органическое вещество, защищенное агрегатом, часто называемое окклюзированным органическим веществом, не является МАОМ, но будет извлечено в тяжелой фракции (т.е. >1,85 г/см3). Включение окклюзированного ПОМ, вероятно, окажет наибольшее влияние на результаты и интерпретацию фракций промежуточной плотности. В то время как фракции с плотностью более ~ 2,40 г/см3, вероятно, содержат минералы с низким содержанием органических веществ, лишенные закупоренного органического материала, а материал с плотностью менее 1,85 г/см3 считается органическим веществом, не содержащим минералов, промежуточные фракции могут представлять собой смеси тяжелых минералов, богатых органическими веществами, агрегатов и легких минералов, бедных органическими веществами. На сегодняшний день не существует общего консенсуса или всепроникающего метода для интерпретации различий в C, обнаруженных в материале промежуточной фракции. Сообщая такую информацию, мы предлагаем признать потенциальное влияние окклюзированного органического вещества и минералогии на результаты.
Различные химические и физические методы были использованы для диспергирования агрегатов, чтобы облегчить высвобождение окклюзированного POM, при этом ультразвуковая энергия представляет собой наиболее часто используемый метод. К сожалению, не существует единого уровня энергии обработки ультразвуком, который мог бы вызвать полную дисперсию по всем агрегатам, поскольку совокупная прочность и механизмы связывания широко варьируются как по типам почвы, так и по классам размераагрегатов 36. Амелунг и Цех36 обнаружили, что микроагрегаты (20-250 мкм) требуют больше ультразвуковой энергии для диспергирования, чем более крупные макроагрегаты, но также обнаружили, что твердые органические вещества разрушаются при этих более высоких энергиях. Кроме того, последовательная обработка ультразвуком с возрастающей интенсивностью продолжает давать свободное окклюзированное органическое вещество37, снова предполагая, что не существует единого пула окклюзированного органического вещества и что при более высоких уровнях обработки ультразвуком большая часть разделенного материала легкой фракции может быть коллоидным артефактом. Кайзер и Гуггенбергер30 также продемонстрировали потенциал обработки ультразвуком для изменения распределения плотности смесей органического вещества легкой фракции с различными минералами. В то время как использование методов ультразвуковой дисперсии во время или после фракционирования плотности почвы предоставляет уникальные возможности для диспергирования и изоляции пулов SOM, эти исследования требуют рассмотрения эффективности дисперсии и разрушения POM и минеральных структур.
Наиболее распространенным альтернативным методом разделения почвы С на легко измеримые бассейны является фракционирование по размеру. Фракционирование по размеру является быстрым и недорогим по сравнению с фракционированием по плотности и может дать аналогичное представление о динамике SOM, учитывая корреляцию между содержанием глины и МАОМ. Действительно, Poeplau et al.10 не обнаружили существенной разницы в скоростях оборота SOM для пулов C, разделенных по размеру и плотности, фракционированию в трех разных почвах. Тем не менее, органическое вещество твердых частиц (POM) с размером, эквивалентным или меньшим, чем глина, является распространенным, а это означает, что методы фракционирования по размеру сами по себе не способны точно отделить POM от MAOM. Таким образом, включение ПОМ в мелкодисперсные фракции может привести к ошибкам в элементном и органическом химическом анализе в некоторых почвах со значительным количеством мелкодисперсных твердых частиц15. Если существует необходимость в количественном определении содержания С в минеральном материале при определенном размере частиц (например, песок, ил, глина), эти два метода могут быть объединены путем проведения фракционирования одной плотности с последующим фракционированием по размеру материала тяжелой фракции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам раскрывать нечего.
Acknowledgments
Для этой работы была оказана поддержка грантов Национального научного фонда DEB-1257032 для К.Л. и DEB-1440409 для программы долгосрочных экологических исследований Х. Дж.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aspirator/vacuum tubing 1/4 x 1/2" | Kimble | 10847-216 | |
| Conical polypropylene centrifuge tube, 250mL | Thermo Scientific | 376814 | |
| Conical rubber gasket for filtering flasks | DWK Life Sciences | 292020001 | |
| Double flat ended stainless steel spatula/scraper | Fisher Scientific | 14-373-25A | |
| Glass fiber filter, grade GF/F, 110 mm | Whatman | WHA1825110 | |
| Glass mason jar, 16 oz | Ball Corporation | 500 ml beaker or glass weigh dish are also suitable | |
| Polypropylene conical bottle adapter, 250mL | Beckman Coulter | 369385 | |
| Porcelain buchner funnel, 90mm | FisherBrand | FB966F | |
| Reciprocating shaker, 2-speed | Eberbach | E6000.00 | |
| Sidearm flask, 1000mL | VWR | 89000-386 | |
| Sodium Polytungstate, crystalline | Sometu | SPT-0 or SPT-1, see Discussion for SPT choice | Shipping via FedEx from Germany |
| Swinging bucket centrifuge | Beckman Coulter | 3362020 |
References
- Jackson, R. B., et al. The ecology of soil carbon: Pools, vulnerabilities, and biotic and abiotic controls. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 48, 419-445 (2017).
- Crowther, T. W., et al. Quantifying global soil carbon losses in response to warming. Nature. 540 (7631), 104-108 (2016).
- Deng, L., Zhu, G., Tang, Z., Shangguan, Z. Global patterns of the effects of land-use changes on soil carbon stocks. Global Ecology and Conservation. 5, 127-138 (2016).
- Griscom, B. W., et al.
- Fargione, J. E., et al. Natural climate solutions for the United States. Science Advances. 4 (11), (2018).
- Kögel-Knabner, I., Rumpel, C. Advances in molecular approaches for understanding soil organic matter composition, origin, and turnover: A historical overview. Advances in Agronomy. 149, 1-48 (2018).
- Schmidt, M. W. I., et al. Persistence of soil organic matter as an ecosystem property. Nature. 478 (7367), 49-56 (2011).
- Billings, S. A., et al. Soil organic carbon is not just for soil scientists: Measurement recommendations for diverse practitioners. Ecological Applications. 31 (3), 02290 (2021).
- von Lützow, M., et al. SOM fractionation methods: Relevance to functional pools and to stabilization mechanisms. Soil Biology and Biochemistry. 39 (9), 2183-2207 (2007).
- Poeplau, C., et al. Isolating organic carbon fractions with varying turnover rates in temperate agricultural soils - A comprehensive method comparison. Soil Biology and Biochemistry. 125, 10-26 (2018).
- Heckman, K., Lawrence, C. R., Harden, J. W. A sequential selective dissolution method to quantify storage and stability of organic carbon associated with Al and Fe hydroxide phases. Geoderma. 312, 24-35 (2018).
- Frostegård, Å, Tunlid, A., Bååth, E. Microbial biomass measured as total lipid phosphate in soils of different organic content. Journal of Microbiological Methods. 14 (3), 151-163 (1991).
- Plante, A. F., Conant, R. T., Paul, E. A., Paustian, K., Six, J. Acid hydrolysis of easily dispersed and microaggregate-derived silt- and clay-sized fractions to isolate resistant soil organic matter. European Journal of Soil Science. 57 (4), 456-467 (2006).
- Eusterhues, K., Rumpel, C., Kögel-Knabner, I. Stabilization of soil organic matter isolated via oxidative degradation. Organic Geochemistry. 36 (11), 1567-1575 (2005).
- Moni, C., Derrien, D., Hatton, P. -J., Zeller, B., Kleber, M. Density fractions versus size separates: does physical fractionation isolate functional soil compartments. Biogeosciences. 9 (12), 5181-5197 (2012).
- Lavallee, J. M., Soong, J. L., Cotrufo, M. F. Conceptualizing soil organic matter into particulate and mineral-associated forms to address global change in the 21st century. Global Change Biology. 26 (1), 261-273 (2020).
- Sollins, P., et al. Organic C and N stabilization in a forest soil: Evidence from sequential density fractionation. Soil Biology and Biochemistry. 38 (11), 3313-3324 (2006).
- Sollins, P., et al. Sequential density fractionation across soils of contrasting mineralogy: evidence for both microbial- and mineral-controlled soil organic matter stabilization. Biogeochemistry. 96 (1-3), 209-231 (2009).
- Crow, S. E., Swanston, C. W., Lajtha, K., Brooks, J. R., Keirstead, H. Density fractionation of forest soils: methodological questions and interpretation of incubation results and turnover time in an ecosystem context. Biogeochemistry. 85 (1), 69-90 (2007).
- Cotrufo, M. F., Ranalli, M. G., Haddix, M. L., Six, J., Lugato, E. Soil carbon storage informed by particulate and mineral-associated organic matter. Nature Geoscience. 12 (12), 989-994 (2019).
- Hatton, P. -J., et al. Transfer of litter-derived N to soil mineral-organic associations: Evidence from decadal 15N tracer experiments. Organic Geochemistry. 42 (12), 1489-1501 (2012).
- Lajtha, K., et al. Changes to particulate versus mineral-associated soil carbon after 50 years of litter manipulation in forest and prairie experimental ecosystems. Biogeochemistry. 119 (1-3), 341-360 (2014).
- Yeasmin, S., Singh, B., Johnston, C. T., Sparks, D. L. Organic carbon characteristics in density fractions of soils with contrasting mineralogies. Geochimica et Cosmochimica Acta. 218, 215-236 (2017).
- Wagai, R., Kajiura, M., Asano, M., Hiradate, S. Nature of soil organo-mineral assemblage examined by sequential density fractionation with and without sonication: Is allophanic soil different. Geoderma. 241-242, 295-305 (2015).
- Volk, M., Bassin, S., Lehmann, M. F., Johnson, M. G., Andersen, C. P. 13C isotopic signature and C concentration of soil density fractions illustrate reduced C allocation to subalpine grassland soil under high atmospheric N deposition. Soil Biology and Biochemistry. 125, 178-184 (2018).
- Yonekura, Y., et al. Soil organic matter dynamics in density and particle-size fractions following destruction of tropical rainforest and the subsequent establishment of Imperata grassland in Indonesian Borneo using stable carbon isotopes. Plant and Soil. 372 (1-2), 683-699 (2013).
- Virto, I., Moni, C., Swanston, C., Chenu, C. Turnover of intra- and extra-aggregate organic matter at the silt-size scale. Geoderma. 156 (1-2), 1-10 (2010).
- Poeplau, C., et al. Reproducibility of a soil organic carbon fractionation method to derive RothC carbon pools. European Journal of Soil Science. 64 (6), 735-746 (2013).
- Cerli, C., Celi, L., Kalbitz, K., Guggenberger, G., Kaiser, K. Separation of light and heavy organic matter fractions in soil - Testing for proper density cut-off and dispersion level. Geoderma. 170, 403-416 (2012).
- Kaiser, K., Guggenberger, G. Distribution of hydrous aluminium and iron over density fractions depends on organic matter load and ultrasonic dispersion. Geoderma. 140 (1-2), 140-146 (2007).
- Helbling, E., Pierson, D., Lajtha, K. Sources of soil carbon loss during soil density fractionation: Laboratory loss or seasonally variable soluble pools. Geoderma. 382, 114776 (2021).
- Nelson, D. W., Sommers, L. E. Total carbon, organic carbon, and organic matter. Methods of Soil Analysis: Part 3 Chemical Methods. Sparks, D. L., Page, A. L., Helmke, P. A., Loeppert, R. H. , Soil Science Society of America, Inc., American Society of Agronomy, Inc. 539-579 (2015).
- Pierson, D., et al. Mineral stabilization of soil carbon is suppressed by live roots, outweighing influences from litter quality or quantity. Biogeochemistry. 154 (3), 433-449 (2021).
- Kramer, M. G., Lajtha, K., Thomas, G., Sollins, P. Contamination effects on soil density fractions from high N or C content sodium polytungstate. Biogeochemistry. 92 (1-2), 177-181 (2009).
- Throop, H. L., Lajtha, K., Kramer, M. Density fractionation and 13C reveal changes in soil carbon following woody encroachment in a desert ecosystem. Biogeochemistry. 112 (1-3), 409-422 (2013).
- Amelung, W., Zech, W. Minimisation of organic matter disruption during particle-size fractionation of grassland epipedons. Geoderma. 92 (1-2), 73-85 (1999).
- Kaiser, M., Asefaw Berhe, A. How does sonication affect the mineral and organic constituents of soil aggregates?-A review. Journal of Plant Nutrition and Soil Science. 177 (4), 479-495 (2014).
