Summary
يقدم هذا البروتوكول تقنيات وممارسات زراعة الخلايا الأساسية لاستخدامها في مختبر زراعة الخلايا البحثية لتجنب التلوث بالفطريات والبكتيريا. ضمن فئة البكتيريا ، سيتم التركيز بشكل خاص على منع تلوث الميكوبلازما.
Abstract
زراعة الخلايا هي مهارة دقيقة ضرورية لزراعة الخلايا البشرية والحيوانية والحشرية ، أو الأنسجة الأخرى ، في بيئة خاضعة للرقابة. الهدف من البروتوكول هو التأكيد على التقنيات الصحيحة المستخدمة في مختبر الأبحاث لمنع التلوث من الفطريات والبكتيريا. يتم التركيز بشكل خاص على تجنب تلوث الميكوبلازما ، وهو مصدر قلق كبير في غرفة زراعة الخلايا نظرا لصغر حجمها ومقاومتها لمعظم المضادات الحيوية المستخدمة في زراعة الخلايا. هذه التقنيات نفسها تضمن النمو المستمر والحفاظ على الخلايا السليمة. بالنسبة لمستخدمي زراعة الخلايا الجدد وذوي الخبرة على حد سواء ، من المهم الالتزام باستمرار بأفضل الممارسات هذه للتخفيف من مخاطر التلوث. مرة واحدة في السنة ، يجب على المختبرات مراجعة أفضل ممارسات زراعة الخلايا والمتابعة بمناقشة أو تدريب إضافي إذا لزم الأمر. إن اتخاذ إجراءات مبكرة لمنع التلوث في المقام الأول سيوفر الوقت والمال ، مقارنة بالتنظيف بعد حدوث التلوث. تحافظ أفضل الممارسات العالمية على صحة مزارع الخلايا ، وبالتالي تقليل الحاجة إلى إذابة الخلايا الجديدة باستمرار ، وشراء وسائط زراعة الخلايا باهظة الثمن ، وتقليل كمية تطهير الحاضنة ووقت التوقف عن العمل.
Introduction
زراعة الخلايا لها العديد من الاستخدامات في مختبر الأبحاث. منذ نشأة زراعة الخلايا في أوائل القرن 20 ، ساعدت خطوط الخلايا في تقدم العلوم. خطوط الخلايا لها العديد من المزايا. يمكن أن تساعد خطوط الخلايا المختلفة الباحثين في دراسة بيولوجيا الخلية ، أو إنتاج فيروس البقعي لمزيد من الدراسات ، أو إنتاج كميات كبيرة من البروتين ذي الأهمية ، على سبيل المثال لا الحصر1. تشمل بعض الاستخدامات الإضافية دراسة نمو الأنسجة ، والمساعدة في تطوير اللقاح ، وأبحاث السموم ، ودراسة دور الجينات في الكائنات الحية السليمة والنماذج المريضة ، وإنتاج خطوط الخلايا الهجينة 2,3. يمكن لخطوط الخلايا أيضا تمكين إنتاج الدواء3. تقنيات التعقيم المناسبة ضرورية عند العمل مع خطوط الخلايا ؛ تنطبق الممارسات والتقنيات الموضحة في هذه المخطوطة على مختبرات الأبحاث حيث يتم تنفيذ أعمال زراعة الخلايا. لا تتم مناقشة إعدادات المختبر الأخرى.
غالبا ما يكون التلوث هو الشاغل الرئيسي عند القيام بعمل زراعة الخلايا. في سياق هذه الورقة ، يشير التلوث عموما إلى الفطريات والبكتيريا. الهدف العام من الطريقة الموضحة في هذه الورقة هو وصف شامل لأفضل الممارسات لتجنب التلوث. يجب على جميع أعضاء المختبر الالتزام بهذه الممارسات عند العمل في غرفة زراعة الخلايا في مختبر الأبحاث. يجب أن تضمن المختبرات أن جميع العمال مشاركون نشطون في استخدام أفضل الممارسات هذه لمنع التلوث. ستساعد معرفة الممارسات والتقنيات الصحيحة على ضمان بقاء مزارع الخلايا قابلة للحياة وصحية وخالية من التلوث. يعتمد تطوير هذه التقنية على البحث في الأدبيات ، وسبع سنوات من الخبرة في العمل مع مزارع الخلايا ، والحاجة إلى طريقة يمكن لكل من المبتدئين والعاملين ذوي الخبرة في زراعة الخلايا الرجوع إليها على أساس سنوي.
هناك حاجة إلى تقنية واضحة وموحدة يجب أن تتبعها جميع مختبرات زراعة الخلايا البحثية. تناقش الكثير من الأدبيات حول تلوث زراعة الخلايا الكشف عن الميكوبلازما ، وتقنيات التعقيم ، ومصادر التلوث ، والقضاء على الملوثات ، والوقاية باستخدام المضادات الحيوية والاختبار المنتظم4،5،6،7،8. في حين أن هذه المعلومات مفيدة ، لا توجد مقاطع فيديو موجودة في الأدبيات توضح تقنيات زراعة الخلايا المناسبة التي يجب على المرء اتباعها. تتمثل ميزة الممارسات المقدمة على التقنيات البديلة في التركيز على منع التلوث قبل حدوثه ، بدلا من اكتشاف الأخطاء وتصحيحها لاحقا. علاوة على ذلك ، فإن العرض الشامل لتقنيات التعقيم ، ومناقشة حول منع نمو الفطريات والبكتيريا ، والمعلومات المتعلقة بتدفق هواء خزانة السلامة الحيوية ذات قيمة لكل من العاملين المبتدئين وذوي الخبرة في زراعة الخلايا على حد سواء.
البكتيريا والفطريات هما النوعان الأكثر شيوعا من الملوثات. ضمن فئة البكتيريا ، تعد الميكوبلازما مصدر قلق كبير نظرا لصغر حجمها وقدرتها على التكاثر مع بقائها دون أن يلاحظها أحد. وهي كائنات حية ذاتية التكاثر ليس لها جدار خلوي صلب وتعتمد على الخلايا الحقيقية النواة لتنمو. لقد قللت من القدرات الأيضية ويمكن أن تتكاثر بشكل كبير بينما تظل غير معترف بها في الفحص البصري الروتيني لثقافات الخلايا والتحليل المجهري المنتظم ، على الرغم من أن المجهر الإلكتروني النافذ يمكنه اكتشاف الميكوبلازما 9,10. علاوة على ذلك ، يمكنهم المرور عبر المرشحات الميكروبيولوجية10. يوفر وسط زراعة الخلايا الميكوبلازما بالمواد المغذية ، على الرغم من أن تكملة الوسائط بالمضادات الحيوية للأسف لا تؤثر على الميكوبلازما10. ينبغي للمرء أن يلاحظ أنه ، بشكل عام ، ليس من الضروري استكمال الوسائط بالمضادات الحيوية. يجب أن تكون التقنيات المناسبة كافية في إبعاد التلوث. لا تؤدي الإصابة بالميكوبلازما إلى موت الخلايا الفوري ، ولكنها تثير قلق الباحثين لأنها تؤثر على قابلية استنساخ البيانات وجودتها.
يجب على جميع موظفي المختبر الالتزام الصارم بممارسات زراعة الخلايا الجيدة. يجب اختبار الثقافات بحثا عن الميكوبلازما بعد شرائها حديثا ، أثناء زراعتها حاليا ، وقبل حفظها بالتبريد ، وعند إذابتها من النيتروجين السائل 2,10. تتوفر اختبارات مختلفة في السوق باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) أو مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) أو التلوين المناعي. 3 تشير الأدبيات إلى أن "العزلات البشرية تمثل نسبة كبيرة من ملوثات الميكوبلازما الموجودة في زراعة الخلايا"5. على الرغم من وصف أكثر من 200 نوع من الميكوبلازما ، إلا أن حوالي ستة منها تمثل معظم الإصابات. هذه الأنواع الستة هي M. arginini و M. fermentans و M. hominis و M. hyorhinis و M. orale و Acholeplasma laidlawii10. كما هو الحال مع أنواع التلوث الأخرى ، فإن الهواء والهباء الجوي يجلبانها إلى مزارع الخلايا5. يتردد صدى هذا في أوراق أخرى لأن "المشغل البشري يحتمل أن يكون أكبر خطر في المختبر"7. على الرغم من أن هذا يتم من خلال خطأ بشري ، إلا أنه يمكن القضاء على المخاطر إذا تم اتباع إجراء قياسي. لا يقتصر التساقط من الموظفين على تلوث الميكوبلازما فقط. عادة ما تصاب مزارع الخلايا في أحد المختبرات بنفس أنواع الميكوبلازما ، مما يشير إلى أن التلوث ينتشر من قارورة إلى أخرى بسبب تقنيات زراعة الخلايا غير الصحيحة10.
منع التلوث المتبادل هو أيضا سبب آخر لاتباع تقنيات زراعة الخلايا المناسبة. تجدر الإشارة إلى أن ما لا يقل عن 15٪ -18٪ من خطوط الخلايا في جميع أنحاء العالم قد تكون ملوثة أو تم تحديدها بشكل خاطئ11،12. بالإضافة إلى اختبار خطوط الخلايا للتلوث بالميكوبلازما ، يجب أيضا اختبارها للتلوث المتبادل10. بالنسبة لخطوط الخلايا البشرية ، فإن مصادقة خط الخلية بواسطة تقنية غير مكلفة قائمة على الحمض النووي تسمى التنميط القصير للتكرار الترادفي (STR) هي المعيار المرجعي الدولي الحالي ، لأنها طريقة سهلة لتأكيد هوية خط الخلية2،10،13،14. يمكن ل STR تحديد خطوط الخلايا ذات العلامات الخاطئة أو الملوثة ، ولكن لا يمكنها اكتشاف أصل الأنسجة غير الصحيح10،13،14. يمكن أن تتعرض صحة بيانات البحث للخطر إذا تم تسمية خطوط الخلايا بشكل خاطئ أو تم تحديدها بشكل خاطئ أو ملوثة13. على غرار الأنواع الأخرى من التلوث ، يمكن أن يحدث التلوث المتبادل بسبب سوء التقنية التي تتسبب في انتشار الهباء الجوي ، أو الاتصال الخاطئ الذي يؤدي إلى دخول نوع الخلية الخطأ إلى قارورة ، أو استخدام نفس زجاجة الوسائط والكواشف بخطوط خلايا مختلفة10. لا ينبغي أن يحدث أي مشاركة لزجاجات الوسائط ؛ يمكن أن تسمح مشاركة زجاجة واحدة من الوسائط بين خطين خلويين مختلفين بخلط مجموعات الخلايا هذه ، مما يؤدي إلى استيلاء نوع الخلية الأسرع نموا على القارورة تماما. هذا الاستبدال غير ملحوظ ويؤدي إلى خطأ في التسمية والتعريفالخاطئ 2. يمكن أيضا الخلط بين خط الخلية وخط آخر إذا تم الخلط بين الثقافات أثناء المناولة أو وضع العلاماتعلى 10. يجب إيلاء اهتمام دقيق للحفاظ على الكواشف والوسائط والقوارير منفصلة عن بعضها البعض. يجب أن يكون لكل عضو في المختبر زجاجات وسائط خاصة به ؛ يجب ألا تحدث مشاركة بين أعضاء المختبر. يجب شراء خطوط الخلايا نفسها من بنك خلوي مؤهل ومزود. يجب ألا تشارك المختبرات الخلايا. تشير الدراسات إلى أنه على الرغم من استخدام اختبارات STR والميكوبلازما بانتظام ، فقد استخدمت العديد من الأوراق البحثية في الأدبيات بالفعل خطوط خلايا خاطئة أو ملوثة15. إن غربلة البحث للعثور على هذه الأوراق الإشكالية وإبلاغ القراء بأثر رجعي بهذا الأمر أمر مرهق. الوقاية هي أفضل طريقة لضمان عدم حدوث هذه المشكلة في المقام الأول.
الإجراء البسيط لرش العناصر بنسبة 70٪ EtOH يمكن أن يقتل الكائنات الحية ؛ يعمل 70٪ EtOH عن طريق تغيير طبيعة البروتينات وإذابة الدهون في الكائنات الحية الأكثر تلويثا ، بما في ذلك البكتيريا والفطريات16. وقد أظهرت الدراسات أن 70 ٪ هو التركيز الأكثر فعالية. لا تتخثر البروتينات السطحية بسرعة مع 70٪ EtOH حتى تتمكن من دخول الخلية ، في حين أن الماء الذي يحتوي عليه ضروري لعملية تغيير طبيعة البروتينات. بسبب اختلاف تركيز الماء والكحول على جانبي جدار الخلية ، يدخل 70٪ EtOH الخلية لتشويه كل من البروتينات الأنزيمية والهيكلية. إذا لوحظ نمو العفن في قوارير ، فيجب تطهير الحاضنة بأكملها عن طريق رشها أولا بنسبة 70٪ EtOH ومسحها جافة ، تليها حضانة ليلية لمدة 16 ساعة عند 60 درجة مئوية17. هذا يقتل معظم العفن وأي بكتيريا.
الميزة الرئيسية لممارسات الوقاية على التقنيات البديلة للقضاء على التلوث بعد حدوثه هي أنه من خلال منع التلوث في وقت مبكر ، يمكن للعاملين في المختبرات التأكد من أن مزارع الخلايا الخاصة بهم صحية ولن تكون هناك تكاليف عالية مرتبطة بإزالة التلوث من الحاضنات أو التخلص من مزارع الخلايا. القضاء على ملوثات الميكوبلازما بعد ، على سبيل المثال ، ليس فعالا7. إن أخذ الوقت مبكرا لضمان تدريب موظفي المختبر بشكل صحيح ، وغرفة زراعة الخلايا قائمة بذاتها ، واستخدام إجراء قياسي سيوفر الوقت والمال.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. الاستعدادات
- عام
- ارتداء معطف مختبر نظيف مخصص لارتدائه فقط في غرفة زراعة الخلايا وليس في أجزاء أخرى من المختبر.
ملاحظة: لا يلزم أن يكون معطف المختبر معقما. - ارتد قفازات جديدة لم تلمس أي أسطح أخرى. تأكد من أن القفازات مناسبة بإحكام. النتريل ، قفازات خالية من مسحوق هي الأفضل.
ملاحظة: لا تحتاج القفازات إلى أن تكون معقمة. - للتحضير للعمل ، قم برش القفازات وأكمام معطف المختبر والجزء الداخلي من خزانة السلامة البيولوجية بنسبة 70٪ EtOH. امسح سطح العمل واللوحة الزجاجية جافة بمنشفة ورقية خالية من النسالة.
ملاحظة: استخدام 70٪ EtOH يقتل البكتيريا بأعلى كفاءة16. لا تحتاج المنشفة الورقية إلى أن تكون معقمة. - احتفظ بحمامات المياه داخل غرفة زراعة الخلايا واستخدمها فقط لتدفئة وسائط الثقافة أو إذابة الخلايا. استنزاف وغسل الحمامات المائية مرة واحدة في الأسبوع ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة للتنظيف.
- ارتداء معطف مختبر نظيف مخصص لارتدائه فقط في غرفة زراعة الخلايا وليس في أجزاء أخرى من المختبر.
- داخل خزانة السلامة البيولوجية
- الحد من عدد العناصر التي يتم إحضارها إلى الخزانة. لا تقاطع تدفق الهواء داخل خزانة السلامة البيولوجية عن طريق سد الشوايات الأمامية أو الخلفية.
ملاحظة: انظر الشكل 1 للحصول على شرح لكيفية تدفق الهواء داخل الخزانة. - رش جميع العناصر الموضوعة داخل الخزانة بنسبة 70٪ EtOH وامسحها حتى تجف. ابدأ برش الجزء العلوي من زجاجة الوسائط والعمل لأسفل. وبالمثل ، باستخدام منشفة ورقية نظيفة ، امسحها حتى تجف ، واعمل تدريجيا في طريقها إلى الأسفل. لا تعود نحو الغطاء.
- إذا كانت الخزانة كبيرة بما يكفي لاستيعاب الماصات المصلية ، فيمكن وضعها في الداخل ، وإلا يمكن تخزينها في وعاء مركب على السطح الخارجي للخزانة. تحقق من جانبي الماصة المغلفة بحثا عن ثقوب أو تمزق أو ثقوب في العبوة قبل الاستخدام. لا تمزق الغلاف. بدلا من ذلك ، قشر أطراف الغلاف برفق ، وأدخل الماصة المصلية في أداة مساعدة الماصة ، وقم بإزالة الغلاف بحركة سائلة واحدة.
- لا تحوم فوق زجاجات أو قوارير مفتوحة ؛ قم بالوصول إلى الزجاجات أو القوارير المفتوحة ، أو افتح العناصر فوق قمم العناصر المفتوحة بالفعل في خزانة السلامة البيولوجية.
ملاحظة: يدفع تدفق الهواء داخل الخزانة لأسفل على سطح العمل ، لذلك قد يدخل أي تلوث موجود على الغلاف ، على سبيل المثال ، إلى مزارع الخلايا. - لا تصب السوائل. بدلا من ذلك ، قم بإضافتها باستخدام ماصة مصلية. بعد استكمال الوسائط ، امزج المحتويات جيدا وقم ببدء الزجاجة. تأكد أيضا من تضمين ملصق لما تم استكمال الوسائط به.
- الحد من عدد العناصر التي يتم إحضارها إلى الخزانة. لا تقاطع تدفق الهواء داخل خزانة السلامة البيولوجية عن طريق سد الشوايات الأمامية أو الخلفية.
2. العمل مع خطوط الخلايا الملتصقة
- إذا كانت هناك حاجة إلى قارورة بلاستيكية ، قم برش الكيس بالكامل وضعه داخل الخزانة.
- استخدم ماصات زجاجية معقمة أو ماصات بلاستيكية معقمة يمكن التخلص منها لشفط الوسائط أو محاليل الغسيل. قم بإزالة الغطاء المعدني بعناية من حاوية التخزين. اعزل ماصة زجاجية واحدة عن طريق هز الحاوية برفق بزاوية. عند الوصول إلى الحاوية ، تجنب لمس أي ماصات أخرى.
ملاحظة: تعامل مع الماصة المختارة من طرف واحد فقط. - استبدل الأغطية الموجودة على الزجاجات بسرعة في أسرع وقت ممكن. ضع الأغطية على سطح العمل رأسا على عقب حتى لا تلمس الحافة سطح العمل. لا تمسك الغطاء من الأعلى أو الأسفل ؛ بدلا من ذلك ، المس القبعات من الجانبين.
- عند شفط السوائل ، استخدم قارورة مصيدة فراغ تقع خارج الخزانة في حاوية ثانوية على الأرض.
ملاحظة: لا ترمي أي نفايات سائلة في أكياس النفايات البيولوجية الخطرة لأن الأكياس سوف تتسرب. سيتم إنشاء النفايات أثناء العمل داخل الخزانة. سيؤدي تحريك اليدين داخل وخارج الخزانة في كثير من الأحيان إلى مقاطعة تدفق الهواء. اترك أي نفايات داخل الخزانة مؤقتا. ضعه على الجانب حتى لا يقطع العمل. - رش القفازات بسخاء بنسبة 70٪ EtOH في أي وقت تصبح فيه جافة. افرك يديك معا حتى لا تقطر القفازات مبللة.
- إذا لامست ماصة مصلية عن طريق الخطأ شيئا ما في الخزانة ، فلا تتردد في التخلص منه. ابدأ من جديد باستخدام ماصة مصلية نظيفة بدلا من استخدام ماصة قد تكون ملوثة.
4. فحص وتخزين الخلايا
- قبل وضع الخلايا في الحاضنة ، تحقق لترى كيف تبدو تحت المجهر. إذا تم تعليق الخلايا تماما ، فيجب ملاحظة الخلايا المفردة.
- لا تتحدث أو تعطس أو تسعل أو تتنفس بشدة في الحاضنات. فتح وإغلاق أبواب الحاضنة بسرعة. قد يسمح ترك الأبواب مفتوحة لفترة أطول من اللازم للملوثات الموجودة في الهواء بدخول الحاضنات.
ملاحظة: ارتداء قناع أثناء العمل في غرفة زراعة الخلايا يمكن أن يساعد لأن الميكوبلازما قد تكون موجودة في فم الإنسان. تجنب استخدام الهواتف المحمولة في غرفة الثقافة الخلوية ، حيث لا ينصح بالتحدث. - تأكد من إغلاق الأغطية الموجودة على جميع الزجاجات بإحكام قبل إزالة الزجاجات من الخزانة.
- قم بتخزين وسائط زراعة الخلايا في الظلام عند 4 درجات مئوية عندما لا تكون قيد الاستخدام لأنها حساسة للضوء.
- رش الجزء الداخلي من الخزانة بنسبة 70٪ EtOH مرة أخرى بعد اكتمال عمل زراعة الخلايا وامسح السطح حتى يجف بمنشفة ورقية. أفرغ أكياس نفايات النفايات البيولوجية. كرر هذه العملية واستبدل القفازات عند التبديل إلى خط خلية مختلف.
5. العمل مع خطوط خلايا التعليق
- بالنسبة للخلايا المعلقة المزروعة في قوارير زجاجية ، تأكد من رش القفازات جيدا بنسبة 70٪ EtOH ، ثم المس ورق الألمنيوم بالقفازات المبللة ورش الجزء السفلي من القارورة فقط قبل وضعها داخل الخزانة.
- عند أخذ عينة لعد الخلايا، أزل أنبوبا واحدا فقط حجمه 1.5 mL من الحاوية الخاصة به. لا تلمس أي أنابيب أخرى. ضع الغطاء رأسا على عقب على سطح العمل. لا تلمس الحافة الداخلية. تعامل معها بعناية من الجوانب واستبدلها بمجرد الانتهاء.
- قم بإزالة قطعة رقائق الألومنيوم المطوية المزدوجة بعناية والتي تغطي عنق القارورة بالكامل. تعامل مع القارورة الزجاجية من الأسفل فقط - لا تلمسها من الرقبة - بمجرد إزالة الرقاقة. استخدم ماصة مصلية سعة 1 مل لأخذ عينة لعد الخلايا.
- لا تدع الوسائط تقطر على جانب القوارير ؛ إذا حدث ذلك ، قم برش منشفة ورقية بنسبة 70٪ EtOH وقم بتنظيفه على الفور.
- تأكد من إحكام ربط الأغطية ورقائق الألومنيوم قبل إزالة الزجاجات أو القوارير من خزانات السلامة البيولوجية.
6. حضانة الخلايا
- استخدم حاضنات منفصلة لأنواع الخلايا المختلفة لمنع التلوث المتبادل لأنواع الخلايا المختلفة.
7. جمع النفايات السائلة
- اجمع النفايات السائلة في دورق مصيدة مفرغة يقع خارج الخزانة على الأرض في حاوية ثانوية تحمل علامة "النفايات".
ملاحظة: يتم توصيل الخرطوم بمرشح امتصاص الجسيمات عالي الكفاءة (HEPA) ، والذي يتم استبداله على أساس شهري.
8. تنظيف
- قم بإزالة كيس النفايات البيولوجية وغسل القوارير الزجاجية في أسرع وقت ممكن. احتفظ ببروتوكول غسيل الزجاج بجوار الحوض. انظر الملف التكميلي 1 لبروتوكول الغسيل.
- الأوتوكلاف الأواني الزجاجية ثقافة الخلية بدلا من إرسالها إلى مرفق غسيل الزجاج. احتفظ بها منفصلة عن الأواني الزجاجية في المنطقة الرئيسية من المختبر.
ملاحظة: تترك خلايا SF-9 حافة من الخلايا الميتة على جانب القوارير إذا لم يتم تنظيف الزجاج جيدا. انظر الملف التكميلي 1 لبروتوكول الأوتوكلاف.
9. التنظيم
- تنظيم غرفة زراعة الخلايا بحيث تكون جميع الإمدادات موجودة في منطقة واحدة ، وبالتالي تقليل الحاجة إلى مغادرة أعضاء المختبر للغرفة بحثا عن الإمدادات.
- قم بتسمية أي زجاجات بلاستيكية تستخدم لحصاد الخلايا ويعاد استخدامها في زراعة الخلايا بعد ذلك على أنها "لاستخدام زراعة الخلايا فقط". استخدم زجاجات زراعة الخلايا المخصصة لنوع خلية واحد محدد. قم بتخزين الزجاجات في غرفة زراعة الخلايا لسهولة الوصول إليها.
10. تحديد تلوث البكتيريا والفطريات والميكوبلازما
ملاحظة: يمكن أن يؤدي عدم اتباع سير العمل أعلاه إلى تلوث البكتيريا والفطريات والميكوبلازما.
- دائما قبل البدء في العمل ، لاحظ قوارير التعكر الثقيل ، والنمو الإضافي في شكل كرات غامضة ، وتراكمات كثيفة من الخلايا على الجانب ، وكلها مؤشرات على التلوث.
ملاحظة: يمكن للعين ذات الخبرة معرفة الفرق بين التعكر الناجم عن التلوث الميكروبي مقابل الخلايا الفعلية. بينما تتسبب الخلايا في ظهور الوسائط الصافية عادة غائمة ، فإن التلوث البكتيري يسبب تعكرا شديدا باللون الأبيض.- حدد بصريا تلوث العفن من خلال ملاحظة ظهور كرات مستديرة غامضة تطفو في الوسائط (انظر الشكل 2).
- حدد بصريا التلوث البكتيري إذا كانت الوسائط غائمة أو بيضاء أو مضطربة (انظر الشكل 2).
- تحديد تلوث الميكوبلازما عن طريق إجراء اختبار الميكوبلازما الشهري. يرشد أحد الاختبارات المستندة إلى تفاعل البوليميراز المتسلسل المستخدمين إلى أخذ عينة 1.5 مل من الخلايا ، وإجراء عدد الخلايا باستخدام 10 ميكرولتر ، والتخفيف إلى 0.08 × 106 خلايا / مل ، وتدوير الخلايا لأسفل ، وتحلل الخلايا باستخدام المخزن المؤقت الموجود في المجموعة ، وتدور مرة أخيرة. يتم تحضين المادة الطافية بمواد أولية تضخم مجموعة من أنواع الميكوبلازما. قم بتشغيل هلام الحمض النووي لتصور الأساور. لا توجد عصابات تعني أنه لم يتم تحديد الميكوبلازما.
ملاحظة: يمكن أن يكون هذا الملوث الرئيسي موجودا في فم الإنسان. من الممارسات الجيدة اختبار تلوث الميكوبلازما في الخلايا بعد إذابتها وقبل استخدامها في التجارب. بعد ذلك ، راقب الخلايا بحثا عن تلوث الميكوبلازما مرة واحدة في الشهر. تقدم العديد من الشركات مجموعات اختبار الميكوبلازما. اختر واحدة مناسبة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
إذا لم يتم اتباع تقنيات وممارسات زراعة الخلايا المناسبة الموضحة في هذه الورقة ، فقد يحدث تلوث بالفطريات والبكتيريا في مختبر زراعة الخلايا البحثي. يوضح الشكل 2 قوارير تحتوي على تلوث في كل من الثقافات المعلقة والملتصقة.
عند عدم اتباع تقنيات التعقيم ، قد يحدث تلوث العفن بعد 2-3 أيام. يمكن ملاحظة الكرات الغامضة المستديرة العائمة في الوسائط في الخلايا المعلقة ، بينما يمكن ملاحظة نمو العفن في الخلايا المرفقة على شكل بقع كبيرة أو غير منتظمة أو بيضاء أو خضراء.
بالنسبة للبكتيريا ، لوحظ التلوث في اليوم التالي. وسائل الإعلام مضطربة وبيضاء وغائمة. اللون الأبيض هو نموذجي للخلايا البكتيرية ، والتي تتكاثر بسرعة أكبر بكثير من خطوط الخلايا. العين المتمرسة قادرة على معرفة الفرق بين الوسائط غير الملوثة والوسائط الملوثة. بالنسبة للخلايا المرفقة ، يمكن للمرء مقارنة زجاجة من الوسائط غير المفتوحة مع قارورة للتحقق مما إذا كان هناك أي اضطراب في القارورة.
داخل خزانة السلامة البيولوجية ، يجب الاحتفاظ بعدد العناصر عند الحد الأدنى. تجنب وضع العناصر على الشوايات الخلفية والأمامية (انظر الشكل 3). في هذه الخزانة ، توجد مجموعة من الماصات والنصائح والماصات الزجاجية المعقمة ومساعد الماصة والعلامات بالداخل. منطقة العمل في المنتصف واضحة. يعد الحفاظ على تنظيم الخزانات بهذه الطريقة فكرة جيدة. بالإضافة إلى ذلك ، يجب على المشغل ارتداء معطف مختبر نظيف وقفازات قبل بدء العمل. يجب الاحتفاظ بزجاجة رذاذ تحتوي على 70٪ EtOH في مكان قريب حتى يتمكن المشغل من رش قفازاته كثيرا. الجلد مغطى بالقفازات أو معطف المختبر. يجب على المشغل ضبط كرسيه بحيث تكون أذرعه بزاوية 90 درجة عند العمل داخل الخزانة ، ويجب أن تكون العناصر في متناول اليد داخل الخزانة (انظر الشكل 4).
يمكن تحديد العديد من أنواع الميكوبلازما بشكل موثوق باستخدام مقايسة قائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل. يوضح الشكل 5 نتائج اختبار الميكوبلازما السلبي. يوضح الشريط الموجود على اليسار معايير الوزن الجزيئي للحمض النووي. النطاقات الأربعة الموجودة على اليمين هي عناصر تحكم موجبة. لا تظهر أي نطاقات تحت أنواع الخلايا المختبرة لأنه لم يتم اكتشاف الميكوبلازما.
إذا كانت الوسائط تحتوي على مؤشرات الأس الهيدروجيني ، فستكون حمراء لقيمة الأس الهيدروجيني المثلى للخلايا عند 7.4. بمجرد نمو الخلايا ، سيتغير لون الوسائط من الأحمر إلى الأصفر3. يمكن أن يحدث هذا التغير في اللون أيضا إذا استولت البكتيريا على القارورة ونمت بشكل مفرط (الشكل 6). يشير اللون الأصفر إلى أن الرقم الهيدروجيني منخفض. تعد مراقبة زجاجة وسائط جديدة غير مفتوحة بجوار قارورة طريقة موضوعية لمراقبة التلوث في الخلايا المرفقة. بالنسبة لثقافات التعليق ، يمكن للمستخدم مراقبة القارورة عن كثب بحثا عن أي نمو يطفو في الوسائط أو ما إذا كانت هناك حلقة سميكة من الخلايا البكتيرية المتضخمة موجودة حول الجزء الداخلي من القارورة الزجاجية. بالنسبة لكلا النوعين من الخلايا ، يمكن أخذ عينة صغيرة ومراقبتها تحت المجهر. إذا لوحظت زيادات أو أشكال خلايا أخرى ، خاصة إذا كانت الخلايا تتحرك ، فهذا مؤشر على التلوث (الشكل 7). يجب إجراء تطهير شامل لمقياس الدم قبل عد الخلايا ، لأن هذا النوع من الحطام قد يكون موجودا فقط على مقياس الدم وليس في مزارع الخلايا نفسها.
قد تكون الرائحة مؤشرا آخر على التلوث في الحاضنة. فرط نمو البكتيريا له رائحة نموذجية سيلاحظها مستخدم زراعة الخلايا المتمرس. تتزامن الرائحة دائما مع قارورة ملوثة ، على الرغم من أن قارورة واحدة مصابة قد لا تتسبب دائما في شم رائحة الحاضنة بأكملها.
يميل تلوث العفن إلى أن يكون أكثر انتشارا في خلايا HEK 293 S المزروعة في المعلق. التلوث البكتيري أكثر شيوعا في خلايا SF-9. قد يكون هذا بسبب نمو خلايا RIC مع الرطوبة ، مما يؤدي إلى تراكم الرطوبة في الحاضنات. تزرع خلايا SF-9 بدون رطوبة ، وبالتالي فإن البيئة أكثر جفافا. معدل التلوث في الثقافات الملتصقة أقل من معدل التلوث في الثقافات المعلقة. قد يكون هذا بسبب حجم القارورة الأصغر ، أو الطبيعة غير القابلة لإعادة الاستخدام للقارورة ، أو الغطاء المهواة بدلا من استخدام رقائق الألومنيوم.
لا يمكن ملاحظة الميكوبلازما بالعين المجردة ولا بالمجهر الضوئي العادي ، على الرغم من أن المجهر الإلكتروني المتخصص يمكن أن يكتشف الميكوبلازما. يجب استخدام مجموعة تحديد الميكوبلازما لاختبار مزارع الخلايا شهريا. يمكن تحديد العديد من أنواع الميكوبلازما بشكل موثوق باستخدام مقايسة قائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل. يمكن العثور على وصف موجز حول كيفية إجراء اختبار PCR هذا في قسم البروتوكول ، ويمكن العثور على مزيد من المعلومات حول الميكوبلازما في قسم المناقشة.
الشكل 1: كيف يتدفق الهواء في خزانة السلامة الأحيائية. تسحب خزانات السلامة البيولوجية الهواء الملوث من الغرفة نفسها ومن الخزانة عبر الشوايات الأمامية والخلفية. يمر هذا الهواء تحت سطح العمل المعدني ، باتجاه الجزء الخلفي من الخزانة ، وحتى الجزء العلوي من الوحدة حيث يوجد مرشح HEPA. هناك ، يمر الهواء عبر المرشح ويتم تصفيته. هذا الهواء النظيف يدفع لأسفل على سطح العمل. نظرا لكيفية دفع تدفق الهواء المصفى لأسفل داخل الخزانة ، فمن الممارسات الجيدة عدم التحليق. على سبيل المثال ، من غير المرغوب فيه أن يكون لديك غلاف فوق زجاجة مفتوحة والمخاطرة بدفع أي ملوثات محتملة إلى الوسائط. يجب الاحتفاظ بعدد العناصر التي يتم إحضارها داخل الخزانة عند الحد الأدنى ، ويجب عدم وضع العناصر على الشوايات الأمامية أو الخلفية حتى لا تقطع تدفق الهواء. يمكن أن يؤدي تحريك الأذرع داخل وخارج الخزانة بسرعة كبيرة إلى إزعاج تدفق الهواء. تم إنشاؤها لشركة NuAire، Inc. ، بواسطة Jeff Kaphingst ، Jeff the Designer، LLC. مستخدمة بإذن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الخلايا المعلقة غير الملوثة والخلايا الملتصقة والخلايا الملوثة بالعفن أو البكتيريا. تحتوي الصورة الأولى على اليسار على خلايا حشرية (خلايا SF-9) غير ملوثة. تظهر الصورة الثانية قارورة أخرى من هذه الخلايا ملوثة بالعفن. القارورة الثالثة ملوثة بالبكتيريا ، كما يمكن ملاحظته من خلال المظهر السميك والأبيض والغائم. كانت القوارير الثانية والثالثة ملوثة لأنه لم يتم اتباع أي من تقنيات وممارسات زراعة الخلايا المناسبة. تم إعداد جميع القوارير في نفس اليوم. لوحظ النمو في اليوم التالي للتلوث البكتيري وبعد 2 أيام لتلوث العفن. تظهر الخلايا الملتصقة غير الملوثة (خلايا Hek293) جنبا إلى جنب مع العفن والتلوث البكتيري في الثقافات الملتصقة. يظهر تلوث العفن في السطر الثاني في طبق بتري مستدير. الصورة مأخوذة من أعلى الطبق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تنظيم خزانة زراعة الخلايا. داخل خزانة السلامة البيولوجية ، يجب الاحتفاظ بكمية العناصر عند الحد الأدنى. يجب تجنب وضع العناصر على الشوايات الخلفية والأمامية. في هذه الخزانة ، توجد مجموعة من الماصات والنصائح والماصات الزجاجية المعقمة ومساعد الماصة والعلامات بالداخل. منطقة العمل في المنتصف واضحة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الطريقة الصحيحة لعمل المشغل تحت غطاء التدفق. يجب على المشغل ارتداء معطف مختبر نظيف وقفازات قبل بدء العمل. يجب الاحتفاظ بزجاجة رذاذ تحتوي على 70٪ EtOH في مكان قريب حتى يتمكن المشغل من رش قفازاته كثيرا. الجلد مغطى بالقفازات أو معطف المختبر. يجب على المشغل ضبط كرسيه بحيث تكون أذرعه بزاوية 90 درجة عند العمل داخل الخزانة. يجب أن تكون العناصر في متناول اليد داخل الخزانة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: نتيجة اختبار الميكوبلازما السلبية. يمكن تحديد العديد من أنواع الميكوبلازما بشكل موثوق باستخدام مقايسة قائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل. يوضح الشريط الموجود على اليسار معايير الوزن الجزيئي للحمض النووي. النطاقات الأربعة الموجودة على اليمين هي عناصر تحكم موجبة. لا تظهر أي نطاقات تحت أنواع الخلايا المختبرة لأنه لم يتم اكتشاف الميكوبلازما. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: تغير لون الوسائط العادي من الأحمر إلى الأصفر. تغير وسائط زراعة الخلايا اللون من الأحمر إلى الأصفر في حالة وجود مؤشرات الأس الهيدروجيني. يشير اللون الأصفر إلى أن الرقم الهيدروجيني منخفض ويجب استبدال الوسائط. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: الملوثات التي لوحظت تحت المجهر الضوئي. إذا لوحظت زيادات أو أشكال خلايا أخرى تحت المجهر الضوئي أثناء إجراء تعداد الخلايا ، فقد يكون هذا مؤشرا على التلوث. تجدر الإشارة إلى أنه يجب إجراء تطهير شامل لمقياس الدم قبل عد الخلايا لأن هذا النوع من الحطام قد يكون موجودا فقط على مقياس الدم وليس في مزارع الخلايا نفسها. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الملف التكميلي 1: الملحق الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في حين أن التلوث هو أحد الاهتمامات الرئيسية عند القيام بأعمال زراعة الخلايا ، فإن الممارسات والتقنيات الموضحة في هذه المخطوطة ستساعد في التخفيف من المخاطر. تشمل الخطوات الحاسمة ارتداء معطف مختبر نظيف ، والذي يستخدم فقط في غرفة زراعة الخلايا ، واستخدام قفازات نظيفة وخالية من البودرة يتم رشها بنسبة 70٪ EtOH في كثير من الأحيان والتي يتم تغييرها عند التبديل بين خطوط الخلايا ، وتشجيع كل فرد على عدم مشاركة زجاجات الوسائط ، وتنظيف الخزانة جيدا قبل وبعد الانتهاء من العمل ، قم بفك الماصات المصلية بدقة ، وتجنب الاتصال الوثيق المطول بالزجاجات أو القوارير المفتوحة ، وعدم مشاركة زجاجات الوسائط بين خطوط الخلايا المتعددة ، وفتح وإغلاق أبواب الحاضنة بسرعة. بالإضافة إلى ذلك ، يضمن غسل الأواني الزجاجية الخاصة وتعقيمها مراقبة الجودة ، وبالتالي تقليل احتمالية إدخال الملوثات الخارجية. تشمل طرق مراقبة الجودة استخدام شريط الأوتوكلاف للإشارة إلى ما إذا كان جهاز التعقيم قد وصل إلى درجة الحرارة المناسبة البالغة 121 درجة مئوية ، والصيانة الوقائية المنتظمة للمعدات ، وفحص القارورة بصريا للتأكد من تنظيفها بشكل صحيح18. نقطة أخرى مهمة هي استخدام حاضنات منفصلة لأنواع الخلايا المختلفة لضمان عدم نقل التلوث من نوع واحد من الخلايا إلى أنواع أخرى وأيضا لضمان عدم حدوث التلوث المتبادل مع الخلايا.
الالتهابات البكتيرية والفطرية هما أكثر المتسللين شيوعا في مزارع الخلايا. أحد الملوثات الرئيسية ، M. orale ، هو أكثر أنواع الميكوبلازما شيوعا في فم الإنسان وأيضا "يمثل العزلة الوحيدة الأكثر شيوعا التي تمثل 20٪ -40٪ من جميع عدوى الميكوبلازما في مزارع الخلايا"4. وبعبارة أخرى ، فإن موظفي المختبر هم المصدر الرئيسي لهذا التلوث. إنه دائما مصدر قلق في غرفة زراعة الخلايا لأن الميكوبلازما هي كائن حي دقيق صغير بطيء النمو يفتقر إلى جدار خلوي صلب يمكن أن يمر عبر مرشحات 0.45 ميكرومتر4. تشير الدراسات إلى أن حدوث تلوث الميكوبلازما هو 15٪ -35٪ من خطوط الخلايا البشرية أو الحيوانية المستمرة4. علاوة على ذلك ، تشير الإحصاءات إلى أن حوالي 5٪ إلى 30٪ من خطوط الخلايا في العالم ملوثة بالميكوبلازما6. لسوء الحظ ، فإن الميكوبلازما مقاومة لمعظم المضادات الحيوية المستخدمة في زراعة الخلايا ، ويمكن أن تؤثر العدوى على فسيولوجيا الخلية والتمثيل الغذائي 4,6. على الرغم من أن التلوث لا يبطئ عملية التمثيل الغذائي للخلايا ، إلا أنه قد يلوث المنتج النهائي6. يمكن أن تستمر العدوى دون أن يلاحظ أعضاء المختبر تلف الخلايا. إذا حدث التلوث، فإن تكلفة إذابة الخلايا الجديدة، والوقت الذي يقضيه في نشر الثقافات الجديدة، والوسائط باهظة الثمن التي تم إهدارها، وتطهير الحاضنات، ومقدار الوقت الذي يقضيه الزملاء في الانتظار لبدء تجاربهم مرة أخرى، هائلة. يقدر مختبرنا أن إجمالي حسابات الوقت الضائع لمدة 2 أسابيع والتكلفة الإجمالية المرتبطة بتلوث تعبير بروتين خلية الثدييات البشرية النموذجي البالغ 8 لتر هو 1,400 دولار. تقدم الممارسات والتقنيات الموضحة في هذه المخطوطة تدابير وقائية جيدة للتخفيف من التكاليف الإضافية والخلايا المفقودة ووقت التوقف عن العمل.
لا يوصى بتعديل هذه الممارسات. يجب تدريب جميع أعضاء المختبر قبل العمل في غرفة زراعة الخلايا ثم تلقي تدريب تنشيطي كل عام7. يجب على أعضاء المختبر أيضا تنظيم غرفة زراعة الخلايا بحيث تكون جميع الإمدادات الضرورية في منطقة واحدة ، وبالتالي تقليل الحاجة إلى خروج أعضاء المختبر من غرفة زراعة الخلايا بحثا عن الإمدادات.
يتم ملاحظة قيود التقنيات المقدمة إذا كان التلوث يأتي من مصادر خارجية مثل المصل أو الحاضنات أو الأوتوكلاف المعطل أو معاطف المختبر المتسخة أو مصدر الخلايا. قد يكون استكشاف أخطاء التقنية وإصلاحها ضروريا في حالة حدوث تلوث على الرغم من الالتزام الصارم بهذا البروتوكول. يمكن أن تساهم العديد من العوامل الخارجية في هذا النوع من التلوث. يحتاج أعضاء المختبر إلى توخي الحذر والتحقق من المصادر الخارجية. على سبيل المثال ، قد يكون الكثير من مصل الأبقار الجنيني (FBS) الذي تم شراؤه من المورد ملوثا بالميكوبلازما. بالمقارنة مع خمسينيات القرن العشرين ، وهذا هو الآن حدوث نادر ، ولكن لا يزال من الممكن أن يحدث6. يجب التخلص من جميع زجاجات الوسائط في حالة ملاحظة أي تلوث ، وإعادة تشغيل البروتوكول عن طريق إذابة الخلايا الجديدة واستخدام وسائط جديدة. قد يكون التلوث موجودا بالفعل داخل الحاضنة إذا كان العفن أو البكتيريا ؛ يجب فحص القوارير الأخرى داخل نفس الحاضنة لمعرفة ما إذا كان نمو البكتيريا أو العفن قد لوحظ. يجب التخلص من جميع القوارير الملوثة وتطهير الحاضنة. إذا لم يتم العثور على تلوث ، يجب فحص الأوتوكلاف بحثا عن أخطاء معطلة ؛ ربما لم يتم تعقيم الأواني الزجاجية بشكل صحيح في المقام الأول. قد يتغير لون شريط الأوتوكلاف على الرغم من عدم وصول الأوتوكلاف إلى 121 درجة مئوية. بعد ذلك ، يجب التحقق من تواريخ انتهاء الصلاحية على محاليل المضادات الحيوية المستخدمة ؛ قد يلزم شراء حلول جديدة. أخيرا ، ينبغي النظر في مصدر الخلايا ؛ هل كانت من مورد مختبر موثوق به أم مستعارة من مختبر آخر؟ يجب دائما شراء الخلايا من مورد مختبر موثوق به ويجب عدم استعارتها من مختبر آخر. أخيرا ، يجب غسل معاطف المختبر لضمان نظافتها19. يجب النظر في إزالة التلوث من الحاضنات كلما تلوثت قارورة. يجب عدم السماح لخلايا البكتيريا أو جراثيم العفن بالتكاثر والاستمرار في نشر التلوث.
الأساليب الحالية تنعكس على القضاء على التلوث. تركز الأساليب الموضحة في هذه المخطوطة على الوقاية بدلا من القضاء على التلوث. توجد العديد من الإجراءات المتعلقة باستخدام المضادات الحيوية لإزالة الميكوبلازما20. ومع ذلك ، فإن استخدام المضادات الحيوية محفوف بالمخاطر لأنها قد لا تقضي تماما على العدوى و "قد تسمح للكائنات المقاومة بالتطور"12. في الواقع ، "تبين أن 72٪ من الثقافات التي نمت باستمرار في المضادات الحيوية إيجابية الميكوبلازما بينما أصيب 7٪ فقط في غياب المضادات الحيوية"12. تؤكد هذه البيانات على فكرة أنه في حين أن استخدام المضادات الحيوية موصى به ويمكن أن يكون مفيدا ، فإن الإفراط في استخدام المضادات الحيوية أو الاعتماد الكامل عليها ليس مفيدا. علاوة على ذلك ، فإن استخدام المضادات الحيوية لإزالة التلوث قد يسمح فقط باستمرار المشكلة. حلول المضادات الحيوية ليست ضرورية. إذا تم اتباع التقنيات الواردة في هذه الورقة ، فيجب منع التلوث بنجاح.
يمكن استخدام الممارسات والتقنيات الموضحة في هذه المخطوطة في المستقبل للحفاظ على بيئة معقمة عند إجراء اختبار الميكوبلازما الشهري وعند صنع خلايا بكتيرية مختصة محلية الصنع. يتطلب كلا البروتوكولين بيئة نظيفة ، على غرار عمل زراعة الخلايا ، بحيث لا يكون المنتج النهائي ملوثا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلف أي مصالح متضاربة.
Acknowledgments
أصبح هذا العمل ممكنا بفضل التمويل من معهد هوارد هيوز الطبي (HHMI). نود أن نشكر رئيسة مختبرنا ، جو تشين ، على قراءة المخطوطة وعلى دعمها المستمر ، ودونا تالنت على تعديلاتها وتعليقاتها المفيدة ، وجيف هينيفيلد من قسم تكنولوجيا المعلومات في جامعة روكفلر لمساعدته في مكون الفيديو في هذه المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS | Gibco | 14-190-144 | |
| DMEM F-12 Media | ATCC | 30-2006 | |
| Glass Baffled Flask | Pyrex | 09-552-40 | |
| Glass Pipettes | Fisher | 13-678-6B | |
| Pipette Aid | Drummond | 13-681-15A | |
| Serological Pipette | Corning | 07-200-573 | |
| T75 flask | Corning | 07-202-004 | |
| Trypsin | Gibco | 25-300-054 | |
| *Items may vary because this video is about general cell culture techniques |
References
- Johnson, Z. L., Chen, J. Structural basis of substrate recognition by the multidrug resistance protein MRP1. Cell. 168 (6), 1075-1085 (2017).
- Capes-Davis, A., et al. Cell lines as biological models: practical steps for more reliable research. Chemical Research in Toxicology. 32 (9), 1733-1736 (2019).
- Segeritz, C. P., Vallier, L. Cell culture: growing cells as model systems in vitro. Basic Science Methods for Clinical Researchers. , 151-172 (2017).
- Drexler, H. G., Uphoff, C. C. Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention. Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).
- Lincoln, C. K., Gabridge, M. G. Cell culture contamination: sources, consequences, prevention, and elimination. Methods in Cell Biology. 57, 49-65 (1998).
- Nikfarjam, L., Farzaneh, P. Prevention and detection of mycoplasma contamination in cell culture. Cell Journal. 13 (4), 203-212 (2012).
- Stacey, G. N.
- Young, L., Sung, J., Stacey, G., Masters, J. R.
- Barth, O. M., Majerowicz, S. Rapid detection by transmission electron microscopy of mycoplasma contamination in sera and cell cultures. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 83 (1), 63-66 (1988).
- Mirabelli, P., Coppola, L., Salvatore, M. Cancer cell lines are useful model systems for medical research. Cancers. 11 (8), 1098 (2019).
- Gabelli, S., Zhao, C., Oberst, J. A cell culture master class: What your cells wish they could tell you. Science. , Available from: https://www.science.org/content/webinar/cell-culture-master-class-your-cells-wish-they-could-tell-you (2020).
- Langdon, S. P. Cell culture contamination: an overview. Methods in Molecular Medicine. 88, 309-317 (2004).
- Babic, Z., et al. Meta-research: Incidences of problematic cell lines are lower in papers that use RRIDs to identify cell lines. eLife. 8, e41676 (2019).
- Visconti, P., et al. Short tandem repeat profiling for the authentication of cancer stem-like cells. International Journal of Cancer. 148 (6), 1489-1498 (2021).
- Horbach, S. P. J. M., Halffman, W. The ghosts of HeLa: How cell line misidentification contaminates the scientific literature. PLoS One. 12 (10), 0186281 (2017).
- Why 70% isopropyl alcohol is a better disinfectant than 99% isopropyl alcohol when it comes to Covid-19. MunGlobal. , Available from: https://munglobal.com.au/resources/knowledge-base/pathogens/why-70-isopropyl-alcohol-is-a-better-disinfectant-than-99-isopropyl-alcohol/#:~:text=Due%20to%20the%20concentration%20difference,potency%20of%20its%20antimicrobial%20properties (2023).
- United States Department of Agriculture. Processing and Safety. Food Safety Publications. , Available from: https://www.ars.usda.gov/ARSUserFiles/60701000/FoodSafetyPublications/p328.pdf (2004).
- Sterilizing Practices. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/infectioncontrol/guidelines/disinfection/sterilization/sterilizing-practices.html (2023).
- Coté, R. J. Aseptic technique for cell culture. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 1, Unit 1.3 (2001).
- Uphoff, C. C., Drexler, H. G. Eradication of Mycoplasma contamination from cell cultures. Current Protocols in Molecular Biology. 106, 1-12 (2014).
- Bykowski, T., Stevenson, B.
- Penning, S. D. How a Class II, Type A2 Biosafety Cabinet Works. Nuaire. , Available from: https://www.nuaire.com/resources/class-ii-type-a2-biosafety-cabinet-how-it-works-article (2020).
- Phelan, K., May, K. M. Mammalian cell tissue culture techniques. Current Protocols in Pharmacology. 73, 1-23 (2016).
