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Bioengineering

2 डी मानव स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स में कार्डियक कॉन्ट्रैक्टिलिटी मॉड्यूलेशन थेरेपी का मूल्यांकन

Published: December 16, 2022 doi: 10.3791/64848
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Office of Science and Engineering Laboratories, Center for Devices and Radiological Health, U.S. Food and Drug Administration

Summary

यहां, हम 2 डी मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट (एचआईपीएससी-सीएम) मोनोलेयर का उपयोग करके एक गैर-इनवेसिव कार्डियक मेडिकल डिवाइस कॉन्ट्रैक्टिलिटी मूल्यांकन विधि का प्रदर्शन करते हैं, जिसे एक लचीले सब्सट्रेट पर चढ़ाया जाता है, वीडियो-आधारित माइक्रोस्कोपी के साथ युग्मित किया जाता है। यह उपकरण कार्डियक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी उपकरणों के सिकुड़ा हुआ गुणों के इन विट्रो मूल्यांकन के लिए उपयोगी होगा।

Abstract

मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (एचआईपीएससी-सीएम) वर्तमान में कई इन विट्रो अनुप्रयोगों के लिए खोजे जा रहे हैं और नियामक प्रस्तुतियों में उपयोग किए गए हैं। यहां, हम कार्डियक मेडिकल डिवाइस सुरक्षा या प्रदर्शन आकलन के लिए उनके उपयोग का विस्तार करते हैं। हमने एक लचीले बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) आधारित हाइड्रोगेल सब्सट्रेट पर चढ़ाए गए 2 डी एचआईपीएससी-सीएम मोनोलेयर को मजबूत रूप से अनुबंधित करने में कार्डियक मेडिकल डिवाइस सिकुड़ा हुआ गुणों का मूल्यांकन करने के लिए एक नई विधि विकसित की। यह उपकरण मानक प्रयोगशाला उपकरणों के साथ मानव हृदय समारोह (जैसे, सिकुड़ा हुआ गुण) पर कार्डियक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी डिवाइस सिग्नल के प्रभावों का परिमाणीकरण करने में सक्षम बनाता है। 2 डी एचआईपीएससी-सीएम मोनोलेयर को 48-वेल प्रारूप में लचीले हाइड्रोगेल सब्सट्रेट पर 2-4 दिनों के लिए संवर्धित किया गया था।

एचआईपीएससी-सीएम को मानक कार्डियक कॉन्ट्रैक्टिलिटी मॉड्यूलेशन (सीसीएम) चिकित्सा उपकरण विद्युत संकेतों से अवगत कराया गया था और नियंत्रण (यानी, केवल पेसिंग) एचआईपीएस-सीएम की तुलना में किया गया था। 2 डी एचआईपीएससी-सीएम के बेसलाइन सिकुड़ा हुआ गुण पिक्सेल विस्थापन के आधार पर वीडियो-आधारित पहचान विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया गया था। लचीले हाइड्रोगेल सब्सट्रेट पर चढ़ाए गए सीसीएम-उत्तेजित 2 डी एचआईपीएससी-सीएम ने बेसलाइन (यानी, सीसीएम उत्तेजना से पहले) के सापेक्ष काफी बढ़े हुए सिकुड़ा हुआ गुण प्रदर्शित किया, जिसमें एक बढ़ा हुआ चरम संकुचन आयाम और त्वरित संकुचन और विश्राम कैनेटीक्स शामिल हैं। इसके अलावा, लचीले हाइड्रोगेल सब्सट्रेट का उपयोग स्वस्थ और रोगग्रस्त एचआईपीएस-सीएम में वीडियो-आधारित कार्डियक-उत्तेजना संकुचन युग्मन रीडआउट (यानी, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, कैल्शियम हैंडलिंग और संकुचन) के मल्टीप्लेक्सिंग को सक्षम बनाता है। मानव हृदय संकुचन पर कार्डियक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल संकेतों के प्रभावों का सटीक पता लगाना और परिमाणीकरण कार्डियक चिकित्सा उपकरण के विकास, अनुकूलन और डी-रिस्किंग के लिए महत्वपूर्ण है। यह विधि कार्डियक सिंकेटियम के सिकुड़ा हुआ गुणों के मजबूत विज़ुअलाइज़ेशन और परिमाणीकरण को सक्षम करती है, जो गैर-नैदानिक कार्डियक चिकित्सा उपकरण सुरक्षा या प्रभावशीलता परीक्षण के लिए मूल्यवान होना चाहिए। यह पेपर विस्तार से, 2 डी एचआईपीएससी-सीएम हाइड्रोगेल सब्सट्रेट मोनोलेयर उत्पन्न करने के लिए पद्धति का वर्णन करता है।

Introduction

जैसे-जैसे संयुक्त राज्य अमेरिका की आबादी की उम्र बढ़ती है, दिल की विफलता के रोगियों की संख्या में वृद्धि जारी है, साथ ही प्रत्यक्ष चिकित्सा लागत 1,2 है। दिल की विफलता के इलाज के लिए नए उपचार विकसित करने और इस तरह के उपचारों का परीक्षण करने के लिए अभिनव गैर-नैदानिक पद्धतियों को विकसित करने की महत्वपूर्ण आवश्यकता है। मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (एचआईपीएससी-सीएम) को चिकित्सीय विकास प्रक्रिया में सहायता के लिए एक इन विट्रो उपकरण के रूप में प्रस्तावित किया गया है और इसका उपयोग नियामक प्रस्तुतियों 3,4 में किया गया है। हालांकि, मानक कठोर 2 डी संस्कृति स्थितियों (यानी, पारंपरिक ऊतक संस्कृति प्लास्टिक या ग्लास) 5,6,7,8 में चढ़ाए जाने पर मजबूत सिकुड़ा हुआ गुणों की कमी के कारण अनुबंध अध्ययन के लिए उनका व्यापक उपयोग सीमित रहा है। हमने पहले मजबूत दृश्यमान सिकुड़ा हुआ गुण उत्पन्न करने के लिए एक लचीले हाइड्रोगेल सब्सट्रेट पर पृथक एकल एचआईपीएससी-सीएम चढ़ाना की उपयोगिता का प्रदर्शनकिया था। हमने दिखाया कि पृथक HIPSC-CM में ताजा पृथक वयस्क खरगोश वेंट्रिकुलर कार्डियोमायोसाइट्स के साथ तुलनीय सिकुड़ा हुआ गुण होता है। इसके अलावा, हमने फार्माकोलॉजिकल एजेंटों के लिए सिकुड़ा हुआ प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए इस विधि की उपयोगिता का प्रदर्शनकिया। इसके अलावा, अन्य अध्ययनों ने इस तकनीक को बुनियादी विज्ञान और रोग मॉडलिंग10,11,12 के लिए यंत्रवत आकलन के लिए लागू किया है। यहां, इस पद्धति को 2 डी एचआईपीएससी-सीएम मोनोलेयर तक बढ़ाया गया है, और शारीरिक रूप से प्रासंगिक कार्डियक कॉन्ट्रैक्टिलिटी मॉड्यूलेशन (सीसीएम) चिकित्सा उपकरण विद्युत संकेतों के मूल्यांकन में इसकी उपयोगिता का प्रदर्शन किया गया है।

सीसीएम एक इंट्राकार्डियक हार्ट फेल्योर थेरेपी है जिसमें हृदय चक्र13,14 की पूर्ण दुर्दम्य अवधि के दौरान मायोकार्डियम को गैर-उत्तेजक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल सिग्नल दिए जाते हैं। मानव कार्डियक सेल मॉडल में सीसीएम का मूल्यांकन करने के लिए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीकों की कमी है। पिछले काम ने सीसीएम सिकुड़ा हुआ प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने के लिए विभिन्न कार्डियक सेल मॉडल को नियोजित किया है। हमने विट्रो में प्रदर्शित किया कि ताजा पृथक खरगोश वेंट्रिकुलर कार्डियोमायोसाइट्स कैल्शियम और संकुचन आयाम 15 में क्षणिक वृद्धि द्वारा सीसीएम उत्तेजना का जवाबदेते हैं। पृथक कैनाइन वेंट्रिकुलर कार्डियोमायोसाइट्स में एक अन्य अध्ययन ने इंट्रासेल्युलर कैल्शियम क्षणिक आयाम16 के सीसीएम-प्रेरित वृद्धि का प्रदर्शन किया। हालांकि, अधिकांश सीसीएम अध्ययनों ने एक्स विवो और विवो पशु तैयारी में उपयोग किया है। इन अध्ययनों को एक दूसरे के साथ सहसंबंधित करना मुश्किल है क्योंकि वे विभिन्न प्रकार के सीसीएम पल्स पैरामीटर और प्रजातियों17 को लागू करते हैं। एक पृथक खरगोश पेपिलरी मॉडल में एक अध्ययन ने सीसीएम-प्रेरित संकुचन8,18 में वृद्धि का खुलासा किया, और पूरे दिल के अध्ययनों की एक सरणी ने सिकुड़ा हुआ फ़ंक्शन 19,20,21 के सीसीएम-प्रेरित वृद्धि का प्रदर्शन किया है। इन अध्ययनों ने महत्वपूर्ण यांत्रिक अंतर्दृष्टि प्रदान की है। हालांकि, सीसीएम सहित इन विट्रो कार्डियक ईपी सिकुड़ा हुआ अध्ययन के लिए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मानव मॉडल की कमी है। उस अंत की ओर, हमने कई 2 डी और 3 डी एचआईपीएस मॉडल विकसित किए हैं और पैरामीटर-निर्भर तरीके से सिकुड़ा हुआ गुणों की सीसीएम-प्रेरित वृद्धि का प्रदर्शन किया है। इसके अलावा, सीसीएम-प्रेरित इनोट्रोपिक प्रभाव न्यूरोनल इनपुट और β-एड्रीनर्जिक सिग्नलिंग 8,17,22 द्वारा मध्यस्थ पाए गए हैं। फिर भी, सीसीएम थेरेपी के तंत्र के बारे में अधिक जानने की आवश्यकता है, और मानव कार्डियोमायोसाइट्स के अनुबंध का उपयोग करने से इस परिणाम को प्राप्त करने में सहायता मिल सकती है। इस प्रकार, नए सीसीएम उपकरणों और संकेतों का मूल्यांकन करने, नियामक प्रक्रिया को तेज करने, पशु मॉडल पर बोझ को कम करने और डिवाइस डेवलपर निर्णय लेने में सहायता करने के लिए मानव गैर-नैदानिक उपकरणविकसित करने की महत्वपूर्ण आवश्यकता है। आसान, डू-इट-योरसेल्फ प्रोटोकॉल विकसित करना महत्वपूर्ण है जिसे किसी भी प्रयोगशाला में स्थानांतरित किया जा सकता है और जो लागत को कम करने के लिए मानक उपकरण और कम सेल आवश्यकताओं का उपयोग करते हैं। यह विधि मानव कार्डियोमायोसाइट फ़ंक्शन पर सीसीएम उत्तेजना के प्रभावों को स्पष्ट करती है और सीसीएम सुरक्षा या प्रभावशीलता पर महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करतीहै। यहां, हम स्वास्थ्य और बीमारी में तीव्र कार्डियक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी चिकित्सा उपकरण (यानी, सीसीएम) सिकुड़ा हुआ प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए एक मानकीकृत गैर-नैदानिक उपकरण का उत्पादन करने के लिए एक लचीले हाइड्रोगेल सब्सट्रेट पर 2 डी एचआईपीएससी-सीएम मोनोलेयर उत्पन्न करने की विधि का वर्णन करते हैं।

Protocol

1. प्लेटों और मीडिया की तैयारी

नोट: एक विशिष्ट बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) आधारित हाइड्रोगेल एलिकोट -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत बाँझ 1.5 एमएल ट्यूब में ~ 200 μL है।

  1. एक बाँझ ऊतक संवर्धन हुड में, प्रत्येक कुएं में 0.1% जिलेटिन (सामग्री की तालिका) के 2 एमएल को स्थानांतरित करके एक बाँझ 6-वेल प्लेट तैयार करें। ढक्कन को 6-वेल प्लेट पर रखें, और लेपित प्लेट को न्यूनतम 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करने दें।
  2. लचीले हाइड्रोगेल सब्सट्रेट पर एचआईपीएससी-सीएम को बोने से एक दिन पहले, बर्फ पर रेफ्रिजरेटर में एक हाइड्रोगेल (सामग्री की तालिका) एलिकोट को पिघलाएं।
  3. आरपीएमआई 1640 के 500 एमएल, 50x B-27 पूरक के 10 एमएल और पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन9 के 5 एमएल को मिलाकर कार्डियोमायोसाइट माध्यम (सामग्री की तालिका) तैयार करें।

2. क्रायोसंरक्षित एचआईपीएससी-सीएम की सीडिंग

  1. लचीले हाइड्रोगेल सब्सट्रेट पर एचआईपीएससी-सीएम को सीड करने से दो दिन पहले, एचआईपीएस-सीएम को 0.1% जिलेटिन-लेपित बाँझ 6-वेल प्लेटों पर प्री-प्लेट करें। एक मानक पिघलने प्रोटोकॉल 9,25 का उपयोग करके एचआईपीएससी-सीएम को पिघलाएं।
  2. फिर, निर्माता के निर्देशों (चित्रा 1 ए) 26 के अनुसार प्लेट 1,500,000 कुल एचआईपीएस-सीएम (सामग्री की तालिका) प्रति कुएं।
  3. 2-4 दिनों के लिए मानक कार्डियोमायोसाइट्स माध्यम में एचआईपीएससी-सीएम को कल्चर करें ताकि एचआईपीएससी-सीएम को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर क्रायोप्रिजर्वेशन से उबरने की अनुमतिमिल सके। हर 48 घंटे में 100% कार्डियोमायोसाइट माध्यम के साथ खर्च किए गए माध्यम को ताज़ा करें।

3. प्री-प्लेटेड एचआईपीएससी-सीएम का पृथक्करण और गिनती

  1. पृथक्करण से पहले एचआईपीएससी-सीएम की स्थिति की जांच करें। व्यवहार्यता और स्थिर धड़कन सुनिश्चित करते हुए, एचआईपीएससी-सीएम के स्वास्थ्य का मूल्यांकन करें।
    नोट: एचआईपीएससी-सीएम आबादी की शुद्धता महत्वपूर्ण है (उदाहरण के लिए, >90% कार्डियक ट्रोपोनिन टी)7। गैर-कार्डियोमायोसाइट्स कोशिकाओं25,26 द्वारा हाइड्रोगेल सब्सट्रेट के विघटन को कम करने के लिए एक कार्डियोमायोसाइट्स चयन विधि (जैसे, चयापचय चयन या छंटाई) की सिफारिश की जाती है।
  2. एचआईपीएससी-सीएम 2 एक्स को सीएसीएल 2 याएमजीसीएल 2 (सामग्री की तालिका) के बिना डी-पीबीएस के 4 एमएल प्रति कुएं के साथ धोएं। डी-पीबीएस को एस्पिरेट करें, प्रत्येक कुएं में 1 एमएल कमरे का तापमान पृथक्करण अभिकर्मक जोड़ें, और फिर 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. एक बाँझ 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 10 एमएल कार्डियोमायोसाइट्स माध्यम जोड़ें।
  4. 1,000 μL पिपेट के साथ 6-वेल प्लेट से HIPSC-CM को अलग करें (चित्रा 1B)। सेल निलंबन को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब26 में जोड़ें।
  5. किसी भी अवशिष्ट HIPSC-CMs को इकट्ठा करने के लिए 1 एमएल ताजा कार्डियोमायोसाइट माध्यम के साथ कुएं को कुल्ला करें, और उन्हें 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में जोड़ें। शंक्वाकार ट्यूब के अंतिम आयतन को 15 एमएल तक लाएं।
  6. 5 मिनट (200 × ग्राम) के लिए सेंट्रीफ्यूज। 1 एमएल निशान तक सतह पर तैरने वाले को हटा दें। कार्डियोमायोसाइट्स माध्यम में कोशिकाओं को 5 एमएल की अंतिम मात्रा में पुन: निलंबित करें।
  7. एक मैनुअल या स्वचालित सेल काउंटर के साथ HIPSC-CM की गणना करें।
  8. कमरे के तापमान पर एचआईपीएससी-सीएम निलंबन को इनक्यूबेट करें, जबकि लचीले हाइड्रोगेल सब्सट्रेट तैयार किए जा रहे हैं (अधिकतम 30 मिनट)।

4. लचीले हाइड्रोगेल सब्सट्रेट्स की तैयारी

  1. 1 μL, 20 μL पिपेट युक्तियाँ (उदाहरण के लिए, 20 μL), और एक बाँझ 48-अच्छी तरह से ग्लास बॉटम प्लेट पर एक 20 μL पिपेट सेट तैयार करें। सुनिश्चित करें कि हाइड्रोगेल सब्सट्रेट बनाने से पहले एक स्टॉपवॉच / टाइमर तैयार है।
  2. बाँझ ऊतक संस्कृति हुड में, ट्यूब को धीरे से टैप करके ईसीएम-आधारित हाइड्रोगेल सब्सट्रेट मिलाएं, और तुरंत इसे बर्फ पर वापस रखें।
  3. फिर, पहले हाइड्रोगेल सब्सट्रेट को चढ़ाने से तुरंत पहले स्टॉपवॉच / टाइमर शुरू करें- यह समय शून्य है।
  4. पिपेट टिप को ठंडा करने के लिए हाइड्रोगेल सब्सट्रेट के पिपेट 1 μL को ऊपर और नीचे ~ 3x। 48-वेल प्लेट (चित्रा 1 सी, चित्रा 2 ए, और चित्रा 3 ए) के प्रत्येक कुएं के तल पर क्षैतिज रूप से बिना पतला हाइड्रोगेल सब्सट्रेट के ~ 1 μL लागू करें, पिपेट को 45 ° कोण पर रखें। 40x आवर्धन 7,9,17,27 पर प्रयोगों का प्रदर्शन करते समय सब्सट्रेट की पहचान करने में मदद करने के लिए प्रत्येक कुएं (चित्रा 2 और चित्रा 3) में एक ही अभिविन्यास में सभी हाइड्रोगेल सब्सट्रेट्स को प्लेट करें।
    नोट: प्रत्येक ~ 1 μL लाइन एक हाइड्रोगेल सब्सट्रेट है (चित्रा 3)। आमतौर पर, 48 कुओं को तैयार करने में ~ 5 मिनट लगते हैं। क्षैतिज रूप से झुके हुए माइक्रोप्लेट स्टैंड (जैसे, 30 °) का उपयोग कुएं के तल और हाइड्रोगेल सब्सट्रेट के बेहतर दृश्य को सक्षम कर सकता है। कुएं की पूरी लंबाई (यानी, बाएं से दाएं) जाना सुनिश्चित करें। लघु हाइड्रोगेल सब्सट्रेट बहुत मोटे हो सकते हैं, इस प्रकार सब्सट्रेट स्थिरता कम हो जाती है। हाइड्रोगेल सब्सट्रेट को पिपेट टिप में सूखने की अनुमति न दें। यदि ऐसा होता है, तो जल्दी से एक नई टिप पर स्विच करें, और तुरंत जारी रखें। वैकल्पिक रूप से, ठंडा पिपेट युक्तियों का उपयोग किया जा सकता है। ईसीएम-आधारित हाइड्रोगेल सब्सट्रेट जल्दी से बहुलक हो सकता है जब यह बर्फ पर नहीं होता है। एक समय में कई कुओं की तैयारी (जैसे, 10) का सुझाव दिया जाता है। इसके अतिरिक्त, मॉक 48-वेल प्लेट में अभ्यास करने की सिफारिश की जाती है।
  5. ढक्कन को 48-वेल प्लेट पर रखें, और हाइड्रोगेल सब्सट्रेट्स को कोशिकाओं को जोड़ने से पहले बाँझ ऊतक संस्कृति हुड में कमरे के तापमान पर 8-10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करने की अनुमति दें (चित्रा 2 बी)।
    नोट: सुझाए गए इनक्यूबेशन समय का पालन करना महत्वपूर्ण है। 10 मिनट से अधिक के इनक्यूबेशन समय से कठोर हाइड्रोगेल सब्सट्रेट ्स होंगे और कोई दिखाई देने वाला संकुचन नहीं होगा। 8 मिनट से कम के इनक्यूबेशन समय से सब्सट्रेट्स ढह सकते हैं।
  6. एचआईपीएस-सीएम ड्रॉपवाइज को सीधे हाइड्रोगेल सब्सट्रेट्स पर बीज दें, जिसमें 1,000 μL पिपेट (चित्रा 2B और चित्रा 3B) का उपयोग करके कार्डियोमायोसाइट्स माध्यम की कम मध्यम मात्रा में ~ 30,000 व्यवहार्य HIPSC-CM प्रति कुएं होते हैं।
    नोट: यह प्रक्रिया हाइड्रोगेल सब्सट्रेट पोलीमराइजेशन को रोकती है और यह सुनिश्चित करती है कि एचआईपीएससी-सीएम सब्सट्रेट 7,9,17,27 पर हैं।
  7. प्लेट पर ढक्कन रखें, और एचआईपीएससी-सीएम को बाँझ ऊतक संस्कृति हुड में कमरे के तापमान (चित्रा 2 सी) पर 10-15 मिनट के लिए निर्विवाद रूप से इनक्यूबेट करने की अनुमति दें ताकि एचआईपीएससी-सीएम हाइड्रोगेल सब्सट्रेट का पालन करने में सक्षम हो सकें।
  8. धीरे से प्रत्येक कुएं में ताजा कार्डियोमायोसाइट माध्यम के ~ 100 μL जोड़ें (अंतिम मात्रा: ~ 300 μL प्रति अच्छी तरह से)। प्लेट पर ढक्कन रखें, और 2-4 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर एक इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें। संकुचन प्रयोगों को करने से पहले हर 24 घंटे में 100% माध्यम को ताज़ा करें।
    नोट: सही आकृति विज्ञान के लिए HIPSC-CM का नेत्रहीन निरीक्षण; चढ़ाना के तुरंत बाद, HIPSC-CM को गोल दिखाई देना चाहिए (चित्रा 3B)। बीज बोने के बाद दूसरे दिन तक, मजबूत दृश्य संकुचन (पूरक वीडियो एस 2) के साथ एक कंफ्लुएंट 2 डी एचआईपीएससी-सीएम मोनोलेयर सिंसाइटियम (चित्रा 3 सी) (पूरक वीडियो एस 1) देखा जाएगा।

5. संकुचन रिकॉर्डिंग और विश्लेषण

  1. सीसीएम परख माध्यम तैयार करें, जो टायरोड का समाधान है जिसमें निम्नलिखित (mmol / L में) शामिल हैं: CaCl2 0.5, NaCl 134, KCl 5.4, MgCl2 1, ग्लूकोज 10, और HEPES 10, पीएच को NaOH के साथ 7.4 तक समायोजित किया जाता है, और पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस तक समतुल्य होता है।
    नोट: सीसीएम परख विंडो को बढ़ाने के लिए उप-अधिकतम बाह्य कैल्शियम (0.5 एमएम) का उपयोग किया जाता है।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 के बराबर होने के लिए माइक्रोस्कोप और पर्यावरण नियंत्रण कक्ष चालू करें।
  3. कार्डियोमायोसाइट्स माध्यम को 48-वेल प्लेट से निकालें, और धीरे से सीसीएम परख माध्यम के 600 μL के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से दो बार कुल्ला करें।
  4. प्रति अच्छी तरह से सीसीएम परख माध्यम के 300 μL जोड़ें, और पर्यावरण नियंत्रण कक्ष में माइक्रोस्कोप पर 48-वेल प्लेट रखें। इलेक्ट्रोड डालें, और 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को बराबर करें।
  5. संकुचन वीडियो रिकॉर्ड करने के लिए वीडियो-आधारित माइक्रोस्कोपी का उपयोग करें। वीडियो रिकॉर्डिंग सॉफ़्टवेयर खोलें, और 100 फ्रेम / सेकंड की फ्रेम दर सेट करें। HIPSC-CM मोनोलेयर के केंद्र के पास रुचि के क्षेत्र (ROI) का चयन करें।
    नोट: हाईपीएससी-सीएम मोनोलेयर के किनारे के पास एक आरओआई का चयन न करें क्योंकि यह सिकुड़ा हुआ रिकॉर्डिंग के लिए अस्थिर हो सकता है।
  6. फिर, क्षेत्र 2 डी एचआईपीएससी-सीएम मोनोलेयर को विद्युत रूप से गति देने के लिए एक वाणिज्यिक पल्स जनरेटर (सामग्री की तालिका) के साथ कोशिकाओं को उत्तेजित करता है। बेसलाइन पल्स पैरामीटर (उदाहरण के लिए, ~ 14 वी / सेमी की 2 एमएस उत्तेजना पल्स अवधि के साथ मोनोफैसिक स्क्वायर वेव पेसिंग पल्स) के साथ 1 हर्ट्ज पर 1.5 एक्स सीमा पर एचआईपीएससी-सीएम को गति दें।
  7. बेसलाइन रिकॉर्ड करें, केवल पेसिंग (यानी, सीसीएम से पहले) (चित्रा 1 डी) संकुचन वीडियो को कम से कम पांच बीट17,28 के लिए रिकॉर्ड करें।
  8. फिर, एक प्रयोगात्मक विद्युत संकेत (चित्रा 1 डी) के साथ एचआईपीएससी-सीएम मोनोलेयर को उत्तेजित करें। इस प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए, मानक सीसीएम उत्तेजना मापदंडों का उपयोग करें: 5.14 एमएस चरण अवधि (20.56 एमएस कुल अवधि), ~ 28 वी / सेमी (चरण आयाम), शून्य इंटरफेज अंतराल, और 30 एमएस देरी (यानी, पेसिंग पल्स के अंत से सीसीएम पल्स की शुरुआत तक का समय) (चित्रा 1 डी) 29,30 , और सीसीएम-प्रेरित संकुचन वीडियो को कम से कम पांच बीट्स के लिए रिकॉर्ड करें।
  9. सीसीएम सिग्नल को बंद करें, बेसलाइन पेसिंग पल्स के साथ उत्तेजित करें, और कम से कम पांच बीट्स के लिए रिकवरी अवधि (यानी, सीसीएम के बाद) का संकुचन वीडियो रिकॉर्ड करें।
  10. संकुचन वीडियो का स्वचालित रूप से विश्लेषण करने और प्रमुख सिकुड़ा हुआ गुणों (जैसे, संकुचन आयाम, संकुचन ढलान, विश्राम ढलान, चरम पर समय, बेसलाइन 90% तक समय, और संकुचन अवधि 50% ) 7,17,31,32 को निर्धारित करने के लिए मानक संकुचन सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।
  11. सब्सट्रेट पर चढ़ाना के बाद 2-14 दिनों से सिकुड़ा हुआ प्रयोगों के लिए लचीले हाइड्रोगेल सब्सट्रेट पर 2 डी एचआईपीएस-सीएम का उपयोग करें।

Representative Results

इस प्रोटोकॉल में वर्णित एक लचीला हाइड्रोगेल सब्सट्रेट पर स्पष्ट रूप से अनुबंधित 2 डी एचआईपीएससी-सीएम मोनोलेयर उत्पन्न करने के लिए एक सरल, मजबूत उपकरण है। सिकुड़ा हुआ गुणों का माप अनुबंध विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ युग्मित वीडियो-आधारित रिकॉर्डिंग के साथ पूरा किया जाता है। यह कार्डियोमायोसाइट संकुचन के प्रमुख मापदंडों की मात्रा का परिमाणीकरण सक्षम बनाता है, जिसमें संकुचन आयाम, संकुचन ढलान, विश्राम ढलान, चरम पर समय, बेसलाइन 90% तक समय और संकुचन अवधि 50% शामिल है। मॉडल का उपयोग विभिन्न "स्वस्थ" दाताओं से एचआईपीएससी-सीएम (चित्रा 4) के बेसलाइन सिकुड़ा हुआ गुणों को चिह्नित करने के लिए किया जाता है और इसे कार्डियक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी मेडिकल डिवाइस सिग्नल (यानी, सीसीएम) के मूल्यांकन के लिए बढ़ाया जा सकता है। मानक सीसीएम उत्तेजना मापदंडों (चित्रा 1 डी) 29,30 के आवेदन के परिणामस्वरूप विट्रो में सिकुड़ा हुआ गुण बढ़ गया (चित्रा 5 और तालिका 1)17।

हमने आगे दिखाया कि इस विधि का उपयोग सीसीएम उत्तेजना के साथ और बिना मानव सिकुड़ा हुआ गुणों पर बाह्य कैल्शियम सांद्रता के मॉड्यूलेशन के प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है (चित्रा 6)17)। संकुचन की अपेक्षित आधारभूत कैल्शियम निर्भरता 7,17 देखी गई, साथ ही कार्डियोमायोसाइट्स मोनोलेयर के स्तर पर कैल्शियम संवेदनशीलता में सीसीएम-प्रेरित वृद्धि हुई। इसके अलावा, β-एड्रीनर्जिक सिग्नलिंग मार्ग (चित्रा 7) की औषधीय पूछताछ से पता चला कि सीसीएम-प्रेरित इनोट्रोपिक प्रभाव β-एड्रीनर्जिक सिग्नलिंग17 द्वारा मध्यस्थ थे। इसके अलावा, इस उपकरण को रोगी-विशिष्ट रोग कार्डियोमायोसाइट्स तक विस्तारित किया जा सकता है, जिसमें रोग की स्थिति के संदर्भ में सीसीएम के प्रभाव को समझने के लिए पतला कार्डियोमायोपैथी (डीसीएम) 33,34,35 (चित्रा 8) शामिल हैं; वास्तव में, यहां परीक्षण किए गए सीसीएम "खुराक" में बढ़े हुए सिकुड़ा हुआ आयाम और त्वरित संकुचन और विश्राम कैनेटीक्स देखा गया (चित्रा 8)। जबकि हमारे पास हमारी प्रयोगशाला में एक सीसीएम-नकल उपकरण है, यहां उपयोग की जाने वाली पद्धति उस प्रणाली के लिए विशिष्ट नहीं है और इसे अन्य कार्डियक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी उपकरणों पर लागू किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: विट्रो सीसीएम मॉडल में 2 डी एचआईपीएससी-सीएम का योजनाबद्ध सारांश। (ए) हाईपीएससी-सीएम जिलेटिन (0.1%) -लेपित 6-वेल प्लेटों पर मोनोलेयर प्रारूप में प्री-प्लेटेड होते हैं। (बी) संस्कृति में 2 दिनों के बाद, एचआईपीएससी-सीएम को अलग कर दिया जाता है और एक लचीले हाइड्रोगेल सब्सट्रेट पर चढ़ाना के लिए तैयार किया जाता है। (सी) पृथक एचआईपीएससी-सीएम को 48-वेल प्रारूप (बाएं) में सरणी हाइड्रोगेल सब्सट्रेट्स पर उच्च घनत्व पर चढ़ाया जाता है और (0.5 एमएम) बाह्य कैल्शियम टायरोड के समाधान (दाएं) में परख की जाती है। (डी) एक वाणिज्यिक पल्स जनरेटर और मानक नैदानिक सीसीएम पल्स पैरामीटर29,30 (दाएं) का उपयोग एचआईपीएससी-सीएम को प्रोत्साहित करने के लिए किया जाता है; कार्डियक फ़ंक्शन का मूल्यांकन वीडियो-आधारित विश्लेषण (बाएं) द्वारा किया जाता है। (ई) सीसीएम से पहले प्रतिनिधि संकुचन रिकॉर्डिंग (बेसलाइन: 5 वी), सीसीएम (सीसीएम: 10 वी) के दौरान, और सीसीएम के बाद (रिकवरी: 5 वी)। इस आंकड़े को फीस्टर एट अल.17 से पुनर्मुद्रित किया गया है। संक्षेप: HIPSC-CM = मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट; सीसीएम = कार्डियक कॉन्ट्रैक्टिलिटी मॉड्यूलेशन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
(A) पूरी तरह से पिघला हुआ, बिना पिघला हुआ ईसीएम-आधारित हाइड्रोगेल सब्सट्रेट एक बाँझ 48-वेल प्लेट (बाएं पैनल) पर लागू होता है, जिसमें प्रति कुएं (दाएं पैनल) हाइड्रोगेल सब्सट्रेट का 1 μL होता है। (बी) हाइड्रोगेल सब्सट्रेट को 8-10 मिनट (दाएं पैनल) के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करने की अनुमति है, इसके बाद उच्च घनत्व वाले एचआईपीएससी-सीएम को कम मध्यम मात्रा (~ 200 μL) (बाएं पैनल) में चढ़ाना है। (सी) इनक्यूबेशन के 10-15 मिनट के बाद, प्रत्येक कुएं (बाएं पैनल) में माध्यम जोड़ा जाता है, और प्लेटों को एक मानक ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर (दाएं पैनल) में ले जाया जाता है। संक्षेप: ईसीएम = बाह्य मैट्रिक्स, एचआईपीएससी-सीएम = मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट; आरटी = कमरे का तापमान। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
(ए) प्रतिनिधि हाइड्रोगेल सब्सट्रेट (कोई कोशिका नहीं) सब्सट्रेट को कुएं पर लागू करने के तुरंत बाद 48-वेल ग्लास बॉटम प्लेट के एक कुएं में। (बी) एचआईपीएससी-सीएम को जोड़ने के बाद समय 0। (ग) उच्च रक्तचाप-मुख्यमंत्रियों को बीज दिए जाने के 24 घंटे बाद का समय। इस पैनल को फीस्टर एट अल.17 से पुनर्मुद्रित किया गया था। सफेद तीर हाइड्रोगेल सब्सट्रेट के किनारे, 4x आवर्धन को इंगित करते हैं। स्केल बार = 1 मिमी। संक्षिप्त नाम: HIPSC-CM = मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: 2D HIPSC-CM मोनोलेयर सिकुड़ा हुआ गुणों का लक्षण वर्णन। (A) 2D HIPSC-CM की प्रतिनिधि संकुचन रिकॉर्डिंग 1 Hz (5 V) पर गति करती है। (बी) प्रतिनिधि संकुचन के निशान एक संकुचन चक्र को दर्शाते हैं। (सी) सारांश बार ग्राफ। डेटा SEM ± माध्य है। n = 18. संक्षिप्त नाम: HIPSC-CM = मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्र 5: 2D HIPSC-CM सिकुड़ा हुआ गुणों पर CCM का तीव्र प्रभाव। (A) CCM से पहले (5 V), CCM (10 V) के दौरान और CCM (5 V) के बाद के लिए प्रतिनिधि संकुचन रिकॉर्डिंग। (बी) तत्काल प्रभावों के प्रतिनिधि संकुचन निशान (यानी, अंतिम पूर्व-सीसीएम बीट, पहला सीसीएम बीट, और पहला आफ्टर-सीसीएम बीट, +द्वारा इंगित)। (सी) तत्काल प्रभावों के सारांश बार ग्राफ। प्रतिशत परिवर्तन, डेटा SEM ± माध्य है। n = 23. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ***p < 0.0001. इस आंकड़े को फीस्टर एट अल.17 से पुनर्मुद्रित किया गया है। संक्षेप: HIPSC-CM = मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट; सीसीएम = कार्डियक कॉन्ट्रैक्टिलिटी मॉड्यूलेशन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्र 6: सीसीएम प्रतिक्रिया पर बाह्य कैल्शियम मॉड्यूलेशन का प्रभाव। (ए) सीसीएम (5 वी) से पहले, सीसीएम (10 वी) के दौरान और सीसीएम (5 वी) के बाद प्रत्येक समूह के लिए तत्काल प्रभाव के प्रतिनिधि संकुचन निशान; एचआईपीएससी-सीएम को 0.25-2 एमएम के बाह्य कैल्शियम (सीएओ) की बढ़ती सांद्रता के संपर्क में लाया गया था। (बी-डी) सिकुड़ा हुआ गुणों (यानी, आयाम और कैनेटीक्स) (पहाड़ी ढलान = 1.0) की कैल्शियम संवेदनशीलता पर सीसीएम के प्रभाव का प्रदर्शन करने वाली आंखों का मार्गदर्शन करने के लिए परिवर्तित डेटा (सिग्मोइडल)। n = 6-8 प्रति समूह। इस आंकड़े को फीस्टर एट अल.17 से पुनर्मुद्रित किया गया है। संक्षेप: HIPSC-CM = मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट; सीसीएम = कार्डियक कॉन्ट्रैक्टिलिटी मॉड्यूलेशन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्रा 7: औषधीय चुनौती। सीसीएम (5 वी) से पहले, सीसीएम (10 वी) के दौरान, और सीसीएम (5 वी) के बाद प्रत्येक समूह के लिए प्रतिनिधि संकुचन निशान; HIPSC-CM को (A) वाहन या (B) metoprolol (2 μM) के साथ इलाज किया गया था। (C, D) प्रत्येक स्थिति के लिए सारांश बार ग्राफ़. प्रतिशत परिवर्तन, डेटा SEM ± माध्य है। n = 10 प्रति समूह। *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. इस आंकड़े को फीस्टर एट अल.17 से पुनर्मुद्रित किया गया है। संक्षेप: HIPSC-CM = मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट; सीसीएम = कार्डियक कॉन्ट्रैक्टिलिटी मॉड्यूलेशन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 8
चित्र 8: रोगग्रस्त 2 डी एचपीएससी-सीएम के सिकुड़ा हुआ गुणों पर सीसीएम का तीव्र प्रभाव( ए) डीसीएम एल 35 पी के लिए प्रतिनिधि संकुचन ट्रेस, नियंत्रण बेसलाइन (पहले, 6 वी), और डीसीएम एल 35 पी प्लस सीसीएम (10 वी)। (बी) सारांश बार ग्राफ। प्रतिशत परिवर्तन, डेटा SEM ± माध्य है। n = 3. * पी < 0.05, ** पी < 0.01। संक्षेप: HIPSC-CM = मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट; सीसीएम = कार्डियक कॉन्ट्रैक्टिलिटी मॉड्यूलेशन; डीसीएम = पतला कार्डियोमायोपैथी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक वीडियो एस 1: बाह्य मैट्रिक्स-आधारित हाइड्रोगेल पर एचआईपीएससी-सीएम का टाइमलैप्स। लचीले हाइड्रोगेल सब्सट्रेट पर चढ़ाए गए दो-आयामी HIPSC-CM; समय: 0-90 घंटे; 48-वेल ग्लास बॉटम प्लेट का एक कुआं; 4x आवर्धन। HIPSC-CMs एक क्षैतिज मोनोलेयर सिंकिटियम (यानी, बाएं से दाएं) बनाते हैं। स्केल बार = 1 मिमी कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक वीडियो एस 2: बाह्य मैट्रिक्स-आधारित हाइड्रोगेल पर एचआईपीएससी-सीएम। लचीले हाइड्रोगेल सब्सट्रेट पर चढ़ाए गए दो-आयामी HIPSC-CM; समय: ~ 24 घंटे; 48-वेल ग्लास बॉटम प्लेट का एक कुआं; 4x आवर्धन। HIPSC-CMs मोनोलेयर आकृति विज्ञान बनाते हैं और ~ 24 घंटे पोस्ट प्लेटिंग पर मजबूत संकुचन दिखाते हैं। स्केल बार = 1 मिमी। यह वीडियो फीस्टर एट अल.17 का है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

प्राचल CCM के बाद
आयाम 16 ± 4% ** 4 ± 5%
पीक 50% तक का समय -20 ± 9% * 7 ± 5%
पीक 90% तक का समय -22 ± 8% * 6 ± 5%
बेसलाइन के लिए समय 50% -8 ± 5% 4 ± 4%
बेसलाइन पर समय 90% -12 ± 6% * 5 ± 5%
संकुचन अवधि 10% -13 ± 6% 3 ± 5%
संकुचन अवधि 50% -6 ± 5% 3 ± 5%
संकुचन अवधि 90% 0 ± 5% 3 ± 4%
N 23 23

तालिका 1: सिकुड़ा हुआ गुण। सीसीएम (5 वी) से पहले के सापेक्ष प्रतिशत परिवर्तन; डेटा सीसीएम (10 वी) के दौरान और सीसीएम (5 वी) के बाद प्रत्येक समूह में सभी बीट्स के लिए एसईएम के ± का मतलब है। n = 23. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. इस तालिका को फीस्टर एट अल.17 से पुनर्मुद्रित किया गया है।

Discussion

यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल वाणिज्यिक अभिकर्मकों7,17 के साथ एक लचीले बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) आधारित हाइड्रोगेल सब्सट्रेट पर मजबूत रूप से अनुबंधित 2 डी एचआईपीएससी-सीएम मोनोलेयर उत्पन्न करने की एक विधि का वर्णन करता है। लचीले हाइड्रोगेल सब्सट्रेट पर बीजित एचआईपीएससी-सीएम व्यवहार्य रहते हैं और इनमें सिकुड़ा हुआ गुण बढ़जाता है। यह तकनीक मानक प्रयोगशाला उपकरण और क्षमताओं पर निर्भर करतीहै। प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम हैं, जिसमें ईसीएम-आधारित हाइड्रोगेल सब्सट्रेट के साथ काम करने के संबंध में शामिल है, जिसके लिए विस्तार से सावधानीपूर्वक ध्यान देने की आवश्यकता होती है। एक संभावित मुद्दा माध्यम में सीरम की उपस्थिति है। इसके परिणामस्वरूप एचआईपीएससी-सीएम एक कॉन्फ्लुएंट मोनोलेयर शीट के बजाय नेटवर्क (जैसे, एंडोथेलियल / संवहनी नेटवर्क) बना सकते हैं; इसलिए, लचीले हाइड्रोगेल एचआईपीएससी-सीएम मोनोलेयर (यानी, दिन 0 से दिन 4) की स्थापना के दौरान एक सीरम-मुक्त माध्यम की सिफारिश की जाती है। इसी तरह, एक समय में बहुत सारे हाइड्रोगेल सब्सट्रेट तैयार करने से ऑपरेटर थकान के कारण खराब या असमान सब्सट्रेट हो सकते हैं। हालांकि जल्दी से काम करना महत्वपूर्ण है, प्रत्येक हाइड्रोगेल सब्सट्रेट की अखंडता महत्वपूर्ण है। इसी तरह, किसी को सावधानीपूर्वक एचआईपीएससी-सीएम को जोड़ना चाहिए और माध्यम बदलना चाहिए; यह बलपूर्वक नहीं किया जाना चाहिए। माध्यम को बदलते समय, इसे कुएं के ऊपरी किनारे से धीरे से जोड़ा जाना चाहिए ताकि हाइड्रोगेल सब्सट्रेट या कोशिकाओं को बाधित न किया जा सके। मानक 2 डी एचआईपीएस-सीएम संस्कृतियों (यानी, पारंपरिक ऊतक संस्कृति प्लास्टिक या ग्लास) के साथ, कम घनत्व पर चढ़ाना अपूर्ण मोनोलेयर गठन का परिणाम होगा। यह पुष्टि करने के लिए कि वे हाइड्रोगेल सब्सट्रेट पर हैं और सटीक समय सुनिश्चित करने के लिए टाइमर का उपयोग करने के लिए एचआईपीएससी-सीएम का नेत्रहीन निरीक्षण करना महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, हाइड्रोगेल सब्सट्रेट पर 14 दिनों से अधिक समय तक 2 डी एचआईपीएससी-सीएम मोनोलेयर की खेती करने से ईसीएम गुणों और सब्सट्रेट के निर्माता के निर्देशों के आधार पर मोनोलेयर व्यवधान हो सकता है।

वर्तमान विधि की कई सीमाएं हैं जिन पर विचार किया जाना चाहिए। सबसे पहले, इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली कोशिकाएं एक वाणिज्यिक HIPSC-CM प्रदाता से थीं, और वे कोशिकाएं विद्युत रूप से युग्मित कोशिकाओं का एक सिंकिटियम बनाती हैं। सिंसाइटियम में सभी तीन कार्डियक उपप्रकारों (यानी, वेंट्रिकुलर, एट्रियल और नोडल) से एचआईपीएससी-सीएम का मिश्रण होता है। अध्ययन एक उपप्रकार-अनन्य HIPSC-CM आबादी (यानी, 100% वेंट्रिकुलर या 100% एट्रियल) से लाभान्वित हो सकते हैं। दूसरा, इस विधि ने केवल एचआईपीएससी-सीएम का उपयोग किया, जबकि कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट, एंडोथेलियल कोशिकाओं और न्यूरॉन्स सहित गैर-मायोसाइट्स, एचआईपीएससी-सीएम कार्यक्षमता22,36 को बढ़ा सकते हैं। तीसरा, 2 डी एचआईपीएससी-सीएम अपेक्षाकृत अपरिपक्व कार्डियोमायोसाइट्स की कई विशेषताओं को प्रदर्शित करते हैं, जिसमें सहज धड़कन, अमॉर्फिक आकृति विज्ञान और एक इनोट्रोपिक प्रतिक्रिया 8,37 की कमी शामिल है। चौथा, जबकि यह प्रोटोकॉल 2 डी एचआईपीएससी-सीएम मोनोलेयर को मजबूत रूप से अनुबंधित करता है, यह संभावना है कि कार्यात्मक रूप से बढ़ाए गए 3 डी एचआईपीएससी-सीएम मॉडल जैसे कि इंजीनियर कार्डियक ऊतक (ईसीटी) के परिणामस्वरूप शारीरिक कैल्शियम सांद्रता8,38 के तहत एक बढ़ी हुई सीसीएम-प्रेरित सिकुड़ा हुआ प्रतिक्रिया होगी। अंत में, यहां वर्णित प्रोटोकॉल 48-वेल प्रारूप के लिए डिज़ाइन किया गया है। हालांकि, अनुकूलन और स्वचालन के समावेश के साथ, इसे उच्च-थ्रूपुट प्रारूप (जैसे, 96-वेल या 384-वेल प्लेट्स) तक बढ़ाया जा सकता है।

HIPSC-CM अध्ययन के लिए वर्तमान स्वर्ण मानक पारंपरिक कठोर 2 D संस्कृति स्थितियां (यानी, ऊतक संस्कृति प्लास्टिक या ग्लास) है। जबकि इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी3 और कैल्शियम हैंडलिंग39 अध्ययनों के लिए उपयोगी है, पारंपरिक पद्धति के परिणामस्वरूप न्यूनतम सिकुड़ा हुआ गुण 5,6,7 है। नतीजतन, पारंपरिक कठोर 2 डी संस्कृति की स्थिति सीसीएम सिकुड़ा हुआ प्रभाव8 के आकलन के लिए उत्तरदायी नहीं है। कार्यात्मक रूप से उन्नत 3 डी एचआईपीएससी-सीएम ईसीटी विधियां38 तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण, समय लेने वाली हैं, और परिष्कृत उपकरणों की आवश्यकता होती है जो हर प्रयोगशाला में आसानी से उपलब्ध नहीं हैं। इस प्रोटोकॉल में, हम 3 डी ईसीटी विधियों या दीर्घकालिक, पारंपरिक 2 डी विधियों 7,40,41 की तुलना में कम समय सीमा में मजबूत रूप से अनुबंधित 2 डी एचआईपीएससी-सीएम मोनोलेयर उत्पन्न करने के लिए एक सरल पद्धति का वर्णन करते हैं। इसके अलावा, यहां उपयोग किए जाने वाले अभिकर्मक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, जिसमें हाइड्रोगेल सब्सट्रेट और एचआईपीएस-सीएम शामिल हैं, और दोनों में काफी बहुत अधिक स्थिरता है। जबकि हमने हटाने योग्य प्लैटिनम तार इलेक्ट्रोड (इंटरइलेक्ट्रोड दूरी: 2.0 मिमी, चौड़ाई: 1.0 मिमी) का उपयोग किया, विभिन्न इलेक्ट्रोड सामग्री और विन्यास विट्रो 8,15,17,18,22 में सीसीएम सिकुड़ा हुआ आकलन के लिए उत्तरदायी हैं। इसी तरह, कई स्वचालित सॉफ्टवेयर उपलब्ध हैं जो संकुचन वीडियो 7,31,32 के विश्लेषण को सक्षम करते हैं।

कार्डियक चिकित्सा उपकरण संकुचन का मूल्यांकन करने के लिए अधिकांश गैर-नैदानिक तरीके विवो पशु मॉडल (जैसे, कुत्ते या सूअर) और तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण पैपिलरी मांसपेशी स्ट्रिप्स (जैसे, खरगोश) 18 में महंगे पर निर्भर करते हैं। इस पेपर ने अनुबंध पर कार्डियक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी चिकित्सा उपकरण संकेतों के प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए एक मानव इन विट्रो मॉडल का वर्णन किया। यह उपकरण पशु अध्ययन पर निर्भरता को कम कर सकता है और कार्डियक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी उपकरणों के सिकुड़ा हुआ गुणों के इन विट्रो मूल्यांकन के लिए उपयोगी हो सकता है।

Disclosures

यह लेख लेखकों के विचारों को दर्शाता है और इसे अमेरिकी खाद्य और औषधि प्रशासन के विचारों या नीतियों का प्रतिनिधित्व करने के लिए नहीं माना जाना चाहिए। यहां दी गई सामग्री के संबंध में वाणिज्यिक उत्पादों, उनके स्रोतों या उनके उपयोग के उल्लेख को स्वास्थ्य और मानव सेवा विभाग द्वारा ऐसे उत्पादों के वास्तविक या निहित समर्थन के रूप में नहीं माना जाना चाहिए। लेखक इस काम के लिए कोई प्रतिस्पर्धी हित घोषित नहीं करते हैं।

Acknowledgments

इस काम को अमेरिकी ऊर्जा विभाग और अमेरिकी खाद्य और औषधि प्रशासन के बीच एक अंतर-एजेंसी समझौते के माध्यम से ओक रिज इंस्टीट्यूट फॉर साइंस एंड एजुकेशन द्वारा प्रशासित सेंटर फॉर डिवाइसेस एंड रेडियोलॉजिकल हेल्थ में अनुसंधान भागीदारी कार्यक्रम में नियुक्ति द्वारा समर्थित किया गया था। लेखक रिचर्ड ग्रे, ट्रेंट रॉबर्टसन और अन्ना अविला को उनके सुझावों और तकनीकी सहायता के लिए धन्यवाद देते हैं। अध्ययन को अमेरिकी खाद्य और औषधि प्रशासन, विज्ञान और इंजीनियरिंग प्रयोगशालाओं के कार्यालय के माध्यम से वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1% Gelatin STEMCELL Technologies 7903 Pre-plating Culture Substrate
48-well Plate MatTek  P48G-1.5-6-F Hydrogel Substrate hiPSC-CM Culture, Glass
6-well Plate Thermofisher 140675 hiPSC-CM Culture, Plastic
B-27 Supplement, with insulin Invitrogen 17504-044 Cardiomyocyte Media
Calcium Chloride dihydrate (CaCl2) Fisher Scientific c70-500 Tyrode’s solution
CellOPTIQ Platform and Software  Clyde Biosciences Contraction Recording and Analysis
Conical tube 15 mL Corning  352099 hiPSC-CM Dissociation
Digital CMOS Camera Hamamatsu C11440-42U30 Contraction Video Recording
D-PBS Life Technologies 14190-144 Cell Wash
Environmental Control Chamber OKOLAB INC H201-K-FRAME Environmental Regulation
Glucose  Sigma-Aldrich G8270-1kg Tyrode’s solution
Hemocytometer Fisher Scientific 22-600-107 hiPSC-CM Counting
HEPES Sigma-Aldrich H3375 Tyrode’s solution
iCell Cardiomyocytes Plating Medium Fujifilm Cellular Dynamic, Inc.  M1001 hiPSC-CM Plating Media
iCell Cardiomyocytes2, 01434 Fujifilm Cellular Dynamic, Inc.  R1017 hiPSC-CMs
Incubator (37 °C, 5% CO2) Thermofisher 50116047 Maintain hiPSC-CMs
Inverted Microscope Olympus IX73 Imaging hiPSC-CMs
Magnesium Chloride hexahydrate (MgCl2)  Fisher Scientific m33-500 Tyrode’s solution
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix Corning  356230 Flexible Hydrogel Substrate
Microcentrifuge tubes 1.5 ml Fisher Scientific 05-408-129 Hydrogel Substrate Aliquot
Model 4100 Isolated High Power Stimulator AM-Systems Model 4100  Pulse Generator
MyCell Cardiomyocytes DCM LMNA L35P, 01016 Fujifilm Cellular Dynamic, Inc.  R1153 DCM hiPSC-CMs
Pen-Strep Invitrogen 15140-122 Cardiomyocyte Media
Pipette L-20 Rainin 17014392 Plating Hydrogel Substrate
Pipette P1000 Fisher Scientific F123602G
Pipette tips, 1000 ul Fisher Scientific 02-707-509
Pipette tips, 20 ul Rainin GPS-L10S Making Hydrogel Substrate
Potassium Chloride (KCl)  Fisher Scientific P330-500 Tyrode’s solution
RPMI 1640, with glucose  Invitrogen 11875 Cardiomyocyte Media
Sodium Chloride (NaCl) Fisher Scientific s641-212 Tyrode’s solution
Sodium Hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich 221465 Tyrode’s solution
Stimulation Electrodes Pacing and CCM Stimulation
Stopwatch/Timer Fisher Scientific 02-261-840 Plating Hydrogel Substrate
Trypan Blue Stain Life Technologies T10282 hiPSC-CM Counting
TrypLE Express  Life Technologies 12605-010 hiPSC-CM Dissociation

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 190 2 डी एचआईपीएस-सीएम कार्डियक कॉन्ट्रैक्टिलिटी मॉड्यूलेशन कार्डियोमायोसाइट्स सिकुड़न स्टेम सेल
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Feaster, T. K., Casciola, M.,… More

Feaster, T. K., Casciola, M., Narkar, A., Blinova, K. Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (190), e64848, doi:10.3791/64848 (2022).

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