Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Genredigering av primære Rhesus Macaque B-celler

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/64858
Automatic Translation
1, 2, 2, 3,5, 1, 1,6, 1, 2, 1,4
1Laboratory of Molecular Immunology, The Rockefeller University, 2Laboratory of Molecular Microbiology, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 3Laboratory of Retrovirology, The Rockefeller University, 4Howard Hughes Medical Institute, The Rockefeller University, 5Laboratory of Applied Virology and Precision Medicine, King Abdullah University of Science and Technology (KAUST), 6Vaccine and Immunotherapy Center, Wistar Institute

Summary

Vi presenterer en metode for dyrking og genredigering av primære rhesusmakake B-celler ved bruk av CRISPR/Cas9 og rekombinant adenoassosiert virus serotype 6 for studier av B-celleterapier.

Abstract

B-celler og deres avkom er kildene til høyt uttrykte antistoffer. Deres høye proteinuttrykksevner sammen med deres overflod, enkel tilgjengelighet via perifert blod og tilgjengelighet til enkle adoptivoverføringer har gjort dem til et attraktivt mål for genredigeringsmetoder for å uttrykke rekombinante antistoffer eller andre terapeutiske proteiner. Genredigering av mus og humane primære B-celler er effektiv, og musemodeller for in vivo-studier har vist løfte, men gjennomførbarhet og skalerbarhet for større dyremodeller har hittil ikke blitt demonstrert. Vi utviklet derfor en protokoll for å redigere rhesus macaque primære B-celler in vitro for å muliggjøre slike studier. Vi rapporterer betingelser for in vitro-dyrkning og genredigering av primære rhesusmakak-B-celler fra mononukleære celler eller splenocytter i perifert blod ved bruk av CRISPR/Cas9. For å oppnå målrettet integrering av store (<4,5 kb) kassetter, ble en rask og effektiv protokoll inkludert for fremstilling av rekombinant adenoassosiert virus serotype 6 som en homologirettet reparasjonsmal ved bruk av en tetracyklinaktivert selvdeaktiverende adenoviral hjelpervektor. Disse protokollene muliggjør studier av prospektive B-celleterapier i rhesusmakaker.

Introduction

B-celler er grunnlaget for humoral immunitet. Ved aktivering av kognitive antigen- og sekundærsignaler gir naive B-celler opphav til germinal center B-celler, minne B-celler og plasmaceller1. Sistnevnte er kilden til de utskilte antistoffene som formidler beskyttelsesfunksjonene til de mest tilgjengelige vaksinene2. Plasmaceller har blitt beskrevet som antistofffabrikker da de skiller ut store mengder antistoffer i serum-ca 2 ng / dag / celle3, som utgjør 7-16 g / l serum, noe som gjør antistoffer til et av de tre mest tallrike proteinene i serum4. B-celler er rikelig i blod og kan dermed lett oppnås og infunderes tilbake til et individ.

Disse egenskapene har gjort B-celler til et mål for celleterapiinnsats for å genredigere B-cellereseptoren (BCR) og uttrykke bredt nøytraliserende antistoffer (bNAbs) mot humant immunsviktvirus (HIV) 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 og andre proteiner 16, 17,18,19,20,21. Slike tilnærminger har vist potensial i en rekke musestudier in vivo 7,8,10,11,16,22. Imidlertid må flere hindringer fortsatt overvinnes for klinisk oversettelse 9,15,23, blant annet sikkerhet, varighet og størrelse på terapeutisk effekt, samt skalering til større dyr som ikke-menneskelige primater (NHP). Faktisk er NHP, og spesielt rhesusmakaker, som har en lang historie innen antistoff- og HIV-forskning24,25, den mest egnede modellen for å teste disse parametrene.

Her har vi utviklet protokoller som gjør det mulig å løse disse problemene. Hittil har få studier forsøkt å dyrke rhesus macaque B-celler ex vivo, og bare positiv seleksjon ved bruk av CD20 har blitt rapportert for rensing av rhesus macaque B-celler26,27,28. Vi har etablert en protokoll for isolering av uberørte rhesusmakak-B-celler ved negativ uttømming av andre celletyper. Videre er dyrkningsbetingelser definert for målrettet genredigering av rhesusmakak-B-celler. Denne protokollen skisserer bruken av CRISPR / Cas9 ribonukleoproteiner (RNP) og rekombinant adenoassosiert virus serotype 6 (rAAV6) som homologirettet reparasjonsmal (HDRT) for å genredigere dyrkede rhesusmakak-B-celler. Ved hjelp av denne protokollen ble redigeringseffektivitet opptil 40% med store (~ 1,5 kb) innsatser oppnådd. Vi presenterer også en rask og kostnadseffektiv metode for å produsere rAAV6 ved hjelp av en tetracyklinaktivert, selvdeaktiverende adenoviral hjelper29 for å muliggjøre rask testing av HDRT i dette formatet. Kombinert beskriver disse protokollene en effektiv arbeidsflyt for genredigering av rhesus macaque B-celler (figur 1), noe som muliggjør evaluering av B-celleterapier i en NHP-modell.

For å starte forsøkene kan donormateriale bestilles fra kommersielle kilder eller oppnås ved flebotomier eller splenektomi. I denne studien ble flebotomiene og blodsamlingene utført som tidligere beskrevet30 ved bruk av antikoagulanten EDTA. For å oppnå milt ble primære rhesusmakak-B-celler, partielle (25%-50%) eller totale splenektomier utført ved hjelp av teknikker rapportert tidligere31. Dyrene ble fastet over natten før operasjonen. Kort, under operasjonen ble magen klippet og forberedt med vekslende skrubber klorhexidin og 70% isopropylalkohol tre ganger. Det ble gjort et snitt (5-10 cm) i abdomen for å identifisere og isolere milten. Miltens vaskulatur ble ligert med enten suturer eller vaskulære klemmer. Snittet ble lukket i to lag med 4-0 PDS polydioksanon suturer. Splenektomi ble utført en enkelt gang for et enkelt dyr. Encellede suspensjoner ble fremstilt fra makakmilt ved maserasjon gjennom cellesiler. Mononukleære celler fra blod- og miltcellesuspensjoner ble fremstilt ved bruk av tetthetsgradientsentrifugering og lagret i flytende nitrogen.

Protocol

Alle dyreprosedyrer og eksperimenter ble utført i henhold til protokoller godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health. Et sammendrag av følgende protokoller er presentert i figur 1. Mannlige og kvinnelige rhesusmakaker (Macaca mulatta) av indisk genetisk opprinnelse i alderen 2-8 år ble plassert og tatt vare på i samsvar med retningslinjene fra komiteen for omsorg og bruk av laboratoriedyr i et biosikkerhetsnivå 2-anlegg.

FORSIKTIG: Alle eksperimenter ble utført i samsvar med universelle forholdsregler for blodbårne patogener, med sterile/aseptiske teknikker og riktig biosikkerhetsnivå 2-utstyr i laminære strømningshetter.

1. rAAV6 produksjon

  1. Forbered reagensene for rAAV6-produksjon.
    1. Design og klon den homologirettede reparasjonsmalen mellom de inverterte terminalrepetisjonene (ITR) av AAV2 i vektor-pAAV ved hjelp av standardteknikker. Forsikre deg om at homologiarmene er på minst ~ 250 bp på hver side, men så lite som 60 bp kan være tilstrekkelig, selv om lengre homologiske armer foretrekkes hvis konstruksjonsdesignet tillater det. Hvis målsekvenser av noen av de brukte sgRNAene er tilstede i HDRT, fjern dem ved hjelp av stille mutasjoner, som er mest effektive i protospacer-tilstøtende motiv eller frøområde på målstedet.
      MERK: Gensyntese kombinert med Gibson-montering for effektiv kloning32 kan utføres. Forbered en Maxiprep av en riktig klon for transfeksjon. For sgRNA-design anbefales CHOPCHOP33, og en liste over flere verktøy finner du på https://zlab.bio/guide-design-resources. Maksimal pakkekapasitet for AAV inkludert ITR er ~4,7 kb. AAV6 er den mest brukte serotypen for redigering av hematopoietiske celler, spesielt B-celler9. Andre serotyper av AAV for genredigering av rhesusmakake B-celler er ikke testet, men AAV28 og AAV-DJ10,11 er brukt i musestudier.
    2. Utarbeide 293AAV dyrkningsmedium og produksjonsmedium i henhold til tabell 1 og tabell 2. Sterilt filter gjennom en 0,2 μm polyetersulfon (PES) membranfilterenhet. Oppbevares ved 4 °C.
    3. Klargjør 1x polyetylenimin (PEI) oppløsning (1 mg/ml, 100 ml).
    4. I et 250 ml glassbeger, varme ~ 70 ml H2O i en mikrobølgeovn i ~ 30 s, og tilsett deretter 100 mg PEI. Tilsett en magnetomrører, og rør til PEI for det meste er oppløst.
    5. Juster pH til 7 med 1 M HCl, fyll deretter på opptil 100 ml med H2O, vent 10 min, kontroller pH igjen og juster om nødvendig.
    6. Steril filtrer PEI-oppløsningen gjennom en 0,2 μm PES membranfilterenhet, alikot og lagre -20 °C. Etter tining kan oppløsningen oppbevares ved 4 °C i opptil 2 måneder.
    7. Klargjør 5x polyetylenglykol (PEG) / NaCl løsning.
    8. Vei ut 400 g PEG 8000 og 24 g NaCl.
    9. Legg til en magnetisk omrører til et 2 L glassbeger, tilsett veid PEG 8,000 og NaCl, og skyll med ~ 550 ml avionisert vann.
    10. Rør med oppvarming, og kok opp eller 80-90 °C til helt oppløst.
    11. Juster pH til ~ 7,4 med 1 M NaOH, juster deretter volumet til 1 L ved hjelp av en målesylinder, og overfør den til en 2 L glassflaske med magnetomrøreren.
    12. Autoklav flasken, magnetomrøreren og oppløsningen i et vannbad i 30 minutter ved 121 °C.
    13. Etter autoklavering, avkjøl løsningen i et kaldt rom mens du rører ved hjelp av magnetomrøreren for å forhindre separasjon i forskjellige faser. Aliquot om nødvendig, og oppbevares ved 4 °C.
    14. Forbered formuleringsbufferen.
    15. Bland 500 ml DPBS med 50 μL av 10% Pluronic F-68. Sterilt filter gjennom en 0,2 μm PES membranfilterenhet, og oppbevares ved romtemperatur (RT).
  2. Cellekultur, transfeksjon og transduksjon for rAAV6 produksjon
    1. Tine, dyrke og fryse 293AAV celler som beskrevet av produsenten ved hjelp av ovennevnte 293AAV kulturmedium og Trypsin-EDTA for splitting. Det anbefales å fryse ned noen tidlige passasjer og bruke cellene til AAV-produksjon før de når passasje 40.
    2. For rAAV6 produksjon, frø fire 15 cm cellekulturfat med 5 x 106 celler i 30 ml hver. Cellene er klare for transfeksjon vanligvis 1-2 dager etter sådd når de når 80% -90% samløp.
    3. Tine en Maxiprep av pAAV-plasmid som inneholder HDRT som skal pakkes inn i AAV6. Resuspender 85,6 μg av pAAV-plasmidet i 3 ml rent DMEM-medium.
    4. Løs opp 342 mikrol 1 mg/ml PEI-oppløsning i 3 ml rent DMEM-medium. Inkuber begge løsningene i 10 min ved RT.
    5. Bland begge 3 ml rørene i ett rør med ~ 6,4 ml transfeksjonsblanding, og inkuber i 20 minutter ved RT.
    6. I mellomtiden tiner du den tetracyklinaktiverte, selvdempende hjelpervektoren RepCap6 fra fryseren på -80 °C i et vannbad på 37 °C. For å transdusere de 293AAV-cellene, legg til hjelpervektoren ved en infeksjonsmultiplikasjon (MOI) på 25 ved bruk av median vevskulturinfeksiøs dose (TCID 50) og antar 1,15 x10 7 celler/fat; Vanligvis brukes 2-10 μL per 15 cm tallerken. Rock og virvle oppvasken forsiktig for å fordele.
    7. Etter inkubering av transfeksjonsblandingen, tilsett 1,6 ml av den dråpevis over hver av de fire 15 cm retter. Inkuber ved 37 °C og 5 % CO2 over natten.
      MERK: Alternativt, hvis rAAV6-vektorene av interesse allerede er tilgjengelige, kan disse vektorene brukes til å gi virusgenomet som skal pakkes, noe som negerer behovet for plasmider med dette systemet og gir sammenlignbare rAAV6-titer. For denne tilnærmingen blir 293AAV-cellene samtransdusert med ønsket rAAV6 ved en MOI på 50 (basert på rAAV6-genomkopier [GC]/ml) sammen med hjelpervektoren.
    8. Neste dag, aspirer forsiktig og kast kulturmediet, og erstatt med 30 ml forvarmet produksjonsmedium. Inkuber i ytterligere 96 timer før høsting. Ingen ytterligere middels endring anbefales for å maksimere utbyttet.
  3. Høsting og rensing av den rekombinante AAV6 fra mediet
    1. Uten å løsne celler fra fatet, samle all cellesupernatanten i en filterenhet med en 0,2 μm PES-membran som er minst 50% større enn volumet av medium som skal filtreres. Deretter filtrerer du supernatanten.
      MERK: Hvis høyere utbytter av rAAV6 er ønsket, kan cellene høstes og rAAV ekstraheres fra cellepelleten ved hjelp av kommersielle sett eller etablerte protokoller34,35. Siden AAV6 for det meste skilles ut i medium36, ble bare supernatant brukt, noe som reduserte arbeidskraft, kostnader og tid.
    2. Tilsett 5x PEG/NaCl-oppløsning til den filtrerte supernatanten ved 25 % av det oppsamlede volumet; Dette er vanligvis 30 ml hvis det brukes fire 15 cm fat på 30 ml.
    3. Bland godt ved å invertere, og inkuber deretter over natten ved 4 °C for å utfelle viruspartiklene.
      MERK: AAV-partikler er stabile i opptil 2 dager i denne oppløsningen.
    4. Forkjøl en svingbøttesentrifuge med 250 ml rørinnlegg til 4 °C. Forbered en 4 ml sentrifugalfilterenhet med en 100 kDa cutoff og et 0,22 μm hydrofilt PES-sprøytefilter ved å forbehandle hver membran med 2 ml 10% Pluronic F-68 i minst 1 time ved RT.
    5. Overfør AAV-PEG/NaCl-blandingen til et 250 ml rør, sentrifuge ved 2 500 x g i 1 time ved 4 °C, og fjern deretter forsiktig hele supernatanten ved aspirasjon.
    6. Resuspender den beige til hvite virale pelleten ved å virvle i 4 ml 1 M HEPES til den er helt resuspendert. Om nødvendig, la det stå i 5 min, og virvel igjen. Resuspenderes med en 5 ml serologisk pipette, og overfør totalvolumet til et 15 ml rør.
    7. I en avtrekkshette tilsettes et like stort volum kloroform til virussuspensjonen – typisk 4 ml.
    8. Kraftig virvel i 2 min, og deretter sentrifuge ved 1000 x g i 5 min ved RT.
    9. Samle det øverste laget (AAV-holdig supernatant) i et nytt 50 ml rør, og kast bunnlaget (kloroform).
      FORSIKTIG: Kloroformholdige løsninger er farlig avfall. Følg institusjonelle retningslinjer for avhending.
    10. Legg den AAV-holdige supernatanten under en avtrekkshette, og la den gjenværende kloroformen fordampe i 30 minutter.
    11. I mellomtiden vasker du den forbehandlede sentrifugalfilterenheten og sprøytefilteret.
    12. Tilsett 1,5 ml formuleringsbuffer til den forbehandlede sentrifugalfilterenheten. Sentrifuge ved 3 500 x g i 10 minutter ved 15 °C i svingbar bøtterotor. Gjenta dette trinnet med 4 ml formuleringsbuffer for å vaske membranen.
    13. Skyll sprøytefilteret to ganger med 5 ml formuleringsbuffer med en 5 ml sprøyte.
    14. Legg ~4 ml AAV-holdig supernatant fra kloroformekstraksjonen i en 5 ml sprøyte, fest det vaskede sprøytefilteret og filtrer direkte inn i sentrifugalfilterenheten.
    15. Sentrifuger ved 3 500 x g i 25 min ved 15 °C, og bekreft deretter at AAV-løsningen i filteret ligger rundt 50-100 μL. Hvis volumet av løsningen er >100 μL, fortsett å sentrifuge.
    16. Etter fjerning av filtratet, tilsett 4 ml formuleringsbuffer inne i koppen på sentrifugalfilterenheten, og bland oppløsningen jevnt ved pipettering. Sentrifuger ved 3 500 x g i 25 min ved 15 °C, og bekreft deretter at AAV-løsningen i filteret er mellom 50-100 μL. Hvis volumet av løsningen er >100 μL, fortsett å sentrifuge. Gjenta dette trinnet for en annen vask.
    17. Etter den endelige sentrifugeringen, bekreft volumet av løsningen er 50-70 μL; Hvis ikke, fortsett å sentrifuge. Overfør preparatet til et 1,5 ml rør. Aliquot om ønskelig, og oppbevares ved -80 °C.
  4. Rekombinant bestemmelse av AAV6-titer ved qPCR
    MERK: qPCR-primerne anneal i ITR-regionen og bør dermed være egnet for alle konstruksjoner klonet til pAAV.
    1. Tine en aliquot av rAAV6 som skal titeres og en aliquot av AAV6 referansemateriale. AAV6-referansematerialet bør være nær 4 x 1011 GC/ml; Ellers juster fortynningene tilsvarende.
    2. Utfør en DNase I-fordøyelse for å fjerne gjenværende fritt plasmid-DNA i rAAV6-preparatet ved å kombinere 2,0 μL av prøven eller AAV6-referansematerialet med 15,6 μL nukleasefriH2O, 2,0 μL 10x DNase I-buffer og 0,4 μL DNase I.
    3. Bland forsiktig og inkuber i 30 minutter ved 37 °C, og overfør deretter til is. Dette er fortynning 1 (se tabell 3).
    4. Lag femdoble seriefortynninger av alle prøvene og referansematerialet AAV6 som i tabell 3 nedenfor med vann.
    5. Forbered en SYBR Green qPCR master mix. Per brønn, bland 4,7 μL nukleasefritt vann med 10 μL SYBR Green masterblanding, 0,15 μL ITR-primer fremover ved 100 μM og 0,15 μL ITR-primer revers ved 100 μM.
      MERK: Hver prøve måles i duplikat, med 16 brønner for referansestandarden, 8 brønner per prøve og 2 brønner for en no-template-kontroll. Klargjør 10 % mer mastermiks for å ta høyde for pipetteringsfeil.
    6. I en optisk 96-brønns eller 384-brønns reaksjonsplate, last 15 μL / brønn av SYBR Green qPCR-masterblandingen.
    7. Deretter laster du 5 μL prøver og AAV6-referansemateriale eller nukleasefritt vann for no-template-kontrollen. For referansestandarden AAV6 skal fortynning 2 fortynnes 9. For prøver, legg fortynning 5 til fortynning 8. Mål hver fortynning i duplikat. Unngå bobler.
    8. Forsegl den lastede platen med optisk gjennomsiktig film, sentrifuge ved 800 x g i 1 min ved RT, og legg platen inn i qPCR-instrumentet med passende 96-brønns eller 384-brønns oppsett.
    9. Konfigurer og kjør qPCR-instrumentet ved hjelp av SYBR-deteksjon med følgende sykkelforhold: 98 °C i 3 minutter, deretter 40 sykluser på 98 °C i 15 s og 58 °C i 30 s, etterfulgt av en smeltekurve.
    10. Analysere dataene med instrumentets programvare med AAV6-referansematerialets konsentrasjon i genomkopier per millimeter (GC/ml) som standardkurve (se tabell 3). Beregn prøvens endelige konsentrasjon ved å multiplisere med fortynningsfaktoren.
    11. Forsikre deg om at standardkurven R2 er nær 1,0, PCR-effektiviteten er 90% -110%, grunnlinjen er fjernet, smeltekurven viser en enkelt topp, C-t-verdiene endres i samsvar med fortynningene, og duplikatene er innenfor 0,5C t; Hvis ikke, ekskluderer du uteliggere. Forvent avkastning som i figur 2.

2. Forbereder B-cellemedier og stimuli

  1. Forbered tinemedium: Kombiner RPMI-1640 med 20 % FCS. Sterilt filter gjennom en 0,2 μm PES membranfilterenhet. Oppbevares ved 4 °C.
  2. Forbered B-cellekulturmedium: Kombiner reagensene i tabell 4, og sterilt filter gjennom en 0,2 μm PES membranfilterenhet. Oppbevares ved 4 °C.
  3. Resuspender hvert av de B-cellestimulerende midlene i tabell 5 ved stamkonsentrasjoner i B-cellekulturmedium, unntatt CpG ODN som skal resuspenderes i nukleasefritt vann. Oppbevares ved -80 °C.
  4. Hvis du utfører ikke-B-celle negativ uttømming (valgfritt trinn 4), klargjør DPBS (ingen kalsium, ingen magnesium) med 2% FCS (DPBS 2% FCS). Sterilt filter gjennom en 0,2 μm PES membranfilterenhet. Oppbevares ved 4 °C.

3. Forberedelse og kultur av rhesus macaque B-celler

MERK: Cryopreserved rhesus macaque PBMCs eller splenocytter brukes til å sette opp cellekulturen30,31.

  1. Forvarm tinemedium og B-cellekulturmedier i et vannbad på 37 °C. Tine de B-cellestimulerende midlene fra tabell 5 på is.
  2. Forbered et passende størrelse rør som inneholder forvarmet tinemedium. Dette bør ideelt sett være mer enn 10 ganger volumet av de tinte cellene.
  3. Tine en til to kryovialer av PBMC eller splenocytter om gangen i et vannbad på 37 °C, og dekanter inn i det tilberedte røret med forvarmet medium. Skyll kryorørene for å samle alle cellene.
  4. Sentrifuge cellene ved 200 x g i 10 minutter ved RT.
    MERK: Disse sentrifugeringsinnstillingene reduserer blodplatekontaminasjonen samtidig som PBMC-utbyttet opprettholdes. Høyere hastigheter som 350 x g i 5 min kan brukes.
  5. Resuspender cellene i 10 ml tinemedium for vask.
  6. Gjenta trinn 3.4 og trinn 3.5 for totalt tre sentrifugasjoner for å fjerne frysemediet. Etter den siste sentrifugeringen, resuspender cellene ved anslagsvis ~ 5 x 106 celler / ml i B-cellekulturmedium.
    MERK: Protokollen ovenfor kulturerer hele PBMC- eller miltocyttpreparater med forurensning av andre celler. Hvis renere B-cellekulturer kreves, om enn ved signifikant redusert total B-cellemengde, fortsett med trinn 4. Det er ikke observert forskjeller i redigeringseffektivitet mellom de to metodene.
  7. Fortynn en alikot på 10 μL celler etter behov med B-cellekulturmedium for telling. Telle ved hjelp av et hemocytometer og trypanblå farging, kombinere like volumer av resuspenderte celler og trypanblå 0,4% løsning.
  8. Juster cellekonsentrasjonen til 3 x 106 celler / ml med B-cellekulturmedium i henhold til celletallet. Deretter legger du til B-cellestimulerende midler til deres endelige konsentrasjoner i henhold til tabell 5, og blander.
  9. Overfør cellene til en passende cellekulturskål. Totalt anbefales 0,6 x 10 6-0,7 x 106 celler/cm2. Inkuber cellene ved 37 °C med 5 % CO 2 i 48 timer ±2 timer.

4. Valgfri negativ uttømming av ikke-B-celler

MERK: Utbytte og renhet avhenger av inngangsprosenten til B-celler blant PBMCene, som kan variere drastisk blant individuelle rhesusmakaker27. Forvent 80% -95% renhet, 60% effektivitet og 1 x 10 6-1,5 x 106 celler fra 1 x 107 PBMCs.

  1. Etter siste vask (trinn 3.6), resuspender cellene ved 1 x 108 celler/ml i DPBS 2 % FCS og human Fc-blokk fortynnet 1:200. Celletallene er basert på antall tinte celler.
  2. Inkuber i 15 minutter på is for å blokkere Fc-reseptorene, og legg deretter til de biotinylerte antistoffene i tabell 6. Inkuber i ytterligere 20 minutter på is.
  3. Fyll på røret med DPBS 2 % FCS, og spinn ved 200 x g i 10 minutter ved 4 °C.
  4. Resuspender cellene i DPBS 2 % FCS ved 80 % av volumet fra trinn 4.1 (dvs. 80 μL per 1 x 107 celler).
  5. Legg magnetiske streptavidinperler til cellesuspensjonen ved 20% av volumet fra trinn 4.1 (dvs. 20 μL perler per 1 x 107 celler).
  6. Inkuber cellene i 15 min på is, og beveg av og til.
  7. I mellomtiden, per 1 x 108 celler, lag en magnetisk separator med en stor magnetisk uttømmingskolonne og et pre-separasjonsfilter. Skyll preseparasjonsfilteret og kolonnen med 2 ml DPBS 2% FCS ved tyngdekraftstrømmen, og kast gjennomstrømningen. Installer et 15 ml oppsamlingsrør.
    MERK: Bruk av andre kolonner som positive utvalgskolonner eller andre magnetiske dråperensingssystemer kan redusere renheten drastisk.
  8. Etter inkubering, fyll opp cellene til 0,5 ml med DPBS 2% FCS hvis volumet er <0,5 ml. Hvis volumet er ≥0,5 ml, bare fortsett.
  9. Legg cellesuspensjonen i preseparasjonsfilteret på den forberedte kolonnen, og samle gjennomstrømningen inn i 15 ml røret.
  10. Elute de ubundne berikede B-cellene to ganger ved å legge til 1 ml DPBS 2 % FCS i preseparasjonsfilteret. Samle de ubundne cellene i samme rør ved tyngdekraftstrømmen.
    MERK: Ytterligere eluering kan øke utbyttet marginalt. Renheten og effektiviteten kan evalueres av flowcytometrien til inngangscellene, berikede celler og celler som holdes på kolonnen. For å oppnå cellene som holdes på kolonnen, fjern kolonnen fra magneten og skyll med 3 ml DPBS 2% FCS ved bruk av det medfølgende stempelet. Vurder eventuelt renheten ved flowcytometri som i figur 3 ved hjelp av reagensene i tabell 7.
  11. Sentrifuger de berikede B-cellene ved 200 x g i 10 minutter ved 4 °C.
  12. Resuspender cellene ved anslagsvis ~5 x 106 celler/ml i B-cellekulturmedium, og fortsett i trinn 3.7.

5. Primær rhesus macaque B-celle genredigering

  1. Etter å ha aktivert rhesusmakak-B-cellene i 48 timer ± 2 timer, klargjør reagensene for elektroporering og transduksjon.
    1. Forvarm DMSO, nukleasefri dupleksbuffer, buffer T og buffer E (10 μL elektroporasjonssett) eller E2 (100 μL elektroporasjonssett) fra elektroporasjonssettet til RT.
    2. Tine rAAV6 HDRT og B-cellestimulerende midler fra tabell 5 på is.
  2. Resuspender CRISPR-Cas9 sgRNA ved 100 μM i dupleksbuffer. Rekonstituer i 10 min ved RT, og bland ved vortexing og flicking. Oppbevar de rekonstituerte sgRNAene på is inntil bruk. Oppbevares ved -80 °C.
    MERK: CRISPR-Cas9 sgRNA kan utformes med ulike elektroniske verktøy (se 1.1.1) og kan variere drastisk i skjæreeffektiviteten. Empirisk testing av skjæreeffektiviteten anbefales ved bruk av analyser som TIDE37 eller ICE38.
  3. Per 10 μL elektroporering, lag 550 μL B-cellekulturmedium med alle stimulantene fra tabell 5, og tilsett 1% DMSO. Skaler volumene 10 ganger for 100 μL elektroporasjoner. Eventuelt kan 10% av dette mediet fremstilles uten antibiotika-antimykotisk, noe som øker cellens levedyktighet etter transfeksjon.
  4. Per 10 μL elektroporering, lag en brønn med en 48-brønns cellekulturplate med 50 μL av B-cellekulturmediet med stimulanter og uten antibiotika-antimykotisk, hvis du bruker den. For 100 μL elektroporasjoner, pipette 500 μL inn i brønnene til en 6-brønnsplate.
  5. Legg rAAV6 HDRT til mediet i brønnene, opptil 20% av volumet i brønnen. Sikt på MOIer fra 1 x 10 5-1 x 10 6 basert på antall celler per transfeksjon (10 μL elektroporering: 5 x 10 5 celler, 100 μL elektroporering:5 x 106 celler) og GC i rAAV6-preparatet. Høye rAAV6-lagerkonsentrasjoner på 5 x 1013 GC/ml til 5 x 1014 GC/ml anbefales for å oppnå høye MOIer med lave volumer.
    MERK: Lavere MOI-er kan føre til redusert redigeringseffektivitet, og MOI-er på 5 x 105 er generelt nær den maksimale redigeringseffektiviteten vi har sett. En påvirkning av varierende MOIer på B-cellenes levedyktighet er ikke observert. Det anbefales å inkludere kontroller uten rAAV6 HDRT, uten RNP-transfeksjon, og uten begge deler.
  6. Forvarm de tilberedte rettene og det gjenværende mediet ved å overføre dem til en inkubator ved 37 ° C med 5% CO2.
  7. Per 10 μL elektroporering, lag 1,15 μL ribonukleoprotein (RNP): Bland 0,4 μL av 61 μM Cas9 med 0,75 μL 100 μM sgRNA i dupleksbuffer. Forbered ekstra (30% mer for en enkelt elektroporering anbefales) på grunn av pipetteringsfeil og for å unngå bobler når du laster elektroporeringsspissene. Skala 10 ganger for 100 μL spisser.
  8. Inkuber RNP i minst 15 minutter ved RT før du blander med cellene. Etter inkubasjon kan flere RNP-er kombineres hvis mer enn ett locus skal målrettes samtidig. Det er ikke observert signifikante forskjeller i effektivitet med opptil tre loci samtidig.
  9. I mellomtiden forbereder cellene for elektroporering. Hold cellene på RT til enhver tid for å unngå temperatursjokk. Høst cellene etter 48 timer ± 2 timers kultur i et passende fartøy. Skyll oppvasken med DPBS for å samle maksimalt antall celler.
  10. Sentrifuger cellene ved 200 x g i 10 minutter ved RT. Kast supernatanten, og resuspender cellene i DPBS ved ~ 2 x 106 celler / ml.
  11. Kombiner 10 μL trypanblå 0,4% løsning med 10 μL av cellesuspensjonen, og telle ved hjelp av et hemocytometer.
    MERK: På dette tidspunktet, på grunn av tap under høsting og vasking, forventer ca 60% av cellene som ble satt i kultur 48 timer ± 2 timer tidligere.
  12. I mellomtiden sentrifugerer du cellene ved 200 x g i 10 minutter ved RT. Kast supernatanten, og sørg for å minimere eventuelle gjenværende DPBS. Resuspender cellene i forvarmet (RT) buffer T ved 5,55 x 107 celler/ml basert på celletallet ovenfor.
  13. Sett opp transfeksjonssystemet ved å slå på maskinen og sette den til 1 350 V, 15 ms og 1 puls. Plasser pipettestasjonen inne i avtrekkshetten for laminær luftstrøm
  14. For hvert sett med 10 elektroporasjoner, lag et transfeksjonsrør med 3 ml buffer E (for 10 μL transfeksjoner) eller E2 (for 100 μL transfeksjoner). Sett røret inn i pipettestasjonen.
  15. Per 10 μL elektroporering, kombiner 1, 15 μL RNP med 9 μL celler. Sørg for å ha et tilstrekkelig volum (+ 30%) for å unngå å aspirere luft inn i elektroporasjonsspissen. Inkuber ved RT i 1-2 min før elektroporering.
  16. Aspirer 10 μL eller 100 μL RNP og celleblanding inn i elektroporasjonsspissen av passende størrelse på en elektroporeringspipette, sett den lastede pipetten inn i pipettestasjonen og start elektroporeringen. Pass på at proppene er helt fri for luftbobler for å forhindre lysbue. Se under elektroporering for å bekrefte at lysbue ikke forekommer.
  17. Kast umiddelbart ut de elektroporerte cellene i det forberedte, forvarmede, lille volumet av medium med eller uten rAAV6 inne i 48-brønnen (10 μL transfeksjoner) eller 6-brønnsplaten (100 μL transfeksjoner). Gjenta trinn 5.15-5.17 med de gjenværende prøvene. Legg kontrollprøver uten transfeksjon til kulturbrønnene.
  18. Inkuber cellene ved 37 °C med 5 % CO 2 i 4 timer ±2 timer, og tilsett deretter det forberedte, forvarmede B-cellekulturmediet som inneholder sentralstimulerende midler, DMSO og antibiotika/antimykotiske: 450 μL for 10 μL-transfeksjoner eller 4,5 ml for 100 μL-transfeksjoner.
  19. Fortsett inkubasjonen ved 37 °C med 5% CO2 i 12-24 timer. Deretter byttes medium til B-cellekulturmedium som inneholder sentralstimulerende midler og antibiotika/antimykotisk uten DMSO hvis man ønsker utvidet dyrking. Analyse av genomisk DNA kan gjøres etter 24 timer. Digital dråpe-PCR ved hjelp av en primer utenfor homologarmen og en primer inne i innsatsen kan brukes til å kvantifisere redigeringseffektiviteten39. Utfør PCR for å forsterke innsettingsstedet og Sanger-sekvensering for å bekrefte riktig redigering.
  20. For analyse av proteinnivåene, dyrk cellene i 40-48 timer etter elektroporering for å tillate proteinuttrykksendringer, og utfør en analyse ved flowcytometri ved bruk av reagensene i tabell 7.

Representative Results

Produksjonen av rAAV6 ved bruk av den tetracyklinaktiverte, selvinaktiverende adenovirale hjelperen resulterte i produksjon av 4 x 1010 GC / ml cellekulturmedium i gjennomsnitt, og dermed overgikk produksjonen ved hjelp av en standard, hjelperfri trippeltransfeksjon med 30-40 ganger (figur 2).

Den valgfrie rensingen av rhesusmakak-B-celler resulterte i eliminering av det store flertallet av CD3+ T-cellene og CD14+- og/eller CD16+-myeloide celler, med renheter på 80%-95% CD20+ B-celler som rutinemessig ble oppnådd (figur 3). Basert på våre tidligere design i murine B-celler7, utviklet vi en metode for å redigere B-cellereseptorspesifisiteten til rhesus macaque B-celler samtidig som vi opprettholder allelisk ekskludering i det store flertallet av B-celler ved å slette endogene antistoff lette kjeder gjennom forstyrrelsen av deres konstante region. Vi konstruerte en promotorløs HDRT som skulle settes inn i IGH-lokuset mellom det siste IGHJ-genet og Eμ-forsterkeren til rhesusmakak-B-celler (figur 4). Denne konstruksjonen benytter den endogene V H-promotoren av den naturlig omarrangerte oppstrøms VDJ-regionen i modne B-celler og uttrykkes dermed ikke av episomale AAV-genomer. Videre krever denne konstruksjonen spleising i nedstrøms antistoff tunge kjedekonstante regioner som skal uttrykkes på celleoverflaten. Spesifikk antigenbinding på celleoverflaten vist ved flowcytometri indikerer derfor korrekt mållokusintegrasjon og at den innsatte sekvensen er funksjonell.

Vi pakket et slikt konstruksjonskodende antistoff Ab1485, en rhesus makak-avledet anti-HIV bNAb40, inn i rAAV6 og brukte den til å redigere aktiverte primære rhesus macaque splenocyte eller PBMC kulturer, som beskrevet ovenfor (figur 5A). Protokollen opprettholdt høy celle levedyktighet (~ 90%) samtidig som lyskjedeuttrykket ble slettet i ~ 80% av B-cellene. Flertallet av B-cellene uttrykte fortsatt isotypen IgM (figur 5B). Tilsetningen av rAAV6-kodingen av Ab1485 HDRT resulterte i genredigering og Ab1485-overflateuttrykk i 16%-21% av B-cellene (figur 5A), om enn ved en lavere fluorescensintensitet for antistoffkjeder enn på uredigerte B-celler (figur 5A høyre panel, figur 5C). Dette kan være et resultat av epitopkonkurranse mellom antigenflekken og monoklonalene som brukes til å detektere overflaten BCR i flowcytometri, samt faktisk redusert proteinuttrykk på grunn av HDRTs polycistroniske natur og mindre effektiv skjøting. Tilsetningen av 1% DMSO og utvidede, konsentrerte inkubasjoner med rAAV6 HDRT økte generelt redigeringseffektiviteten (figur 6A-C). Ved hjelp av denne spesifikke metoden, vanligvis 5% -20% og opptil 40%, oppnås redigeringseffektivitet avhengig av den enkelte rhesusmakaken (figur 5A, figur 6A-E) og kvaliteten på rAAV6 HDRT-batchen (figur 6E). Samlet presenterer vi protokoller for effektiv rAAV6-produksjon, samt dyrking, rensing og genredigering av rhesusmakak-B-celler.

Reagenser Volum Lager Endelig konsentrasjon
DMEM, høy glukose 500 ml 1 x ~ 88,5%
FCS, varmeinaktivert 50 ml 1 x ~ 8,85%
Antibiotika/antimykotisk 5 ml 100 x 1 x
Glutamin 5 ml 200 mM 2 mM
Natriumpyruvat 5 ml 100 mM 1 mM

Tabell 1: 293AAV cellekulturmedium.

Reagenser Volum Lager Endelig konsentrasjon
DMEM, høy glukose 500 ml 1 x ~ 95,2%
FCS, varmeinaktivert 10 ml 1 x ~ 1,9%
Antibiotika/antimykotisk 5 ml 100 x 1 x
Glutamin 5 ml 200 mM 2 mM
Natriumpyruvat 5 ml 100 mM 1 mM

Tabell 2: 293AAV-celleproduksjonsmediet.

Fortynningsserie Prøvevolum (μL) Fortynningsmiddel og volum Fortynningsfaktor Total fortynning Referanse AAV6
GC/ml
Fortynning 1 2 μL prøve- eller AAV-referansestandard ved 4,1 x 1011 GC/ml 18 μL DNAseI buffer og enzym 10 x 10 x 4,1 x 1010
Fortynning 2 15 μL Dil. 1 60 μL H2O 5 x 50 x 8,2 x 109
Fortynning 3 20 μL Dil. 2 80 μL H2O 5 x 250 x 1,6 x 109
Fortynning 4 20 μL Dil. 3 80 μL H2O 5 x 1250 x 3,3 x 108
Fortynning 5 20 μL Dil. 4 80 μL H2O 5 x 6250x 6,6 x 107
Fortynning 6 20 μL Dil. 5 80 μL H2O 5 x 31250 x 1,3 x 107
Fortynning 7 20 μL Dil. 6 80 μL H2O 5 x 156250 x 2,6 x 106
Fortynning 8 20 μL Dil. 6 80 μL H2O 5 x 781250 x 5,24 x 105
Fortynning 9 20 μL Dil. 7 80 μL H2O 5 x 3906250 x 1,05 x 105

Tabell 3: fortynningstabell for qPCR.

Reagent Volum Lager Endelig konsentrasjon
RPMI-1640 420 ml 1 x 84%
FCS, varmeinaktivert 50 ml 1 x 10%
Antibiotika/antimykotisk 5 ml 100 x 1 x
Glutamin 5 ml 200 mM 2 mM
Natriumpyruvat 5 ml 100 mM 1 mM
HEPES 5 ml 1 M 10 mM
2-B-merkapto-etanol 550 μL 55 mM 55 μM
Ikke-essensielle aminosyrer 5 ml 100 x 1 x
Insulin-transferin-selen 5 ml 100 x 1 x

Tabell 4: B-cellekulturmedium.

Reagent Fortynning Lager Endelig konsentrasjon
MegaCD40L 1:1000 100 μg/ml 100 ng/ml
CpG ODN 1:300 1 mg/ml 3,33 μg/ml
Menneskelig BAFF 1:1000 40 μg/ml 40 ng/ml
Menneskelig IL-2 1:1000 50 μg/ml 50 ng/ml
Menneskelig IL-10 1:1000 50 μg/ml 50 ng/ml

Tabell 5: B-cellestimulerende midler.

Antistoff Klon Fortynning Avsluttende Conc.
anti-human CD3 FN-18 1:40 2,5 μg/ml
anti-human CD8a RPA-T8 1:200 2,5 μg/ml
anti-human CD14 M5E2 1:200 2,5 μg/ml
anti-human CD16 3G8 1:200 2,5 μg/ml
anti-human CD33 AC104.3E3 1:50 1 test
anti-menneskelig CD64 10.1 1:800 0,625 μg/ml
anti-menneskelig CD66 TET2 1:11 1 test
anti-menneskelig CD89 A59 1:800 0,625 μg/ml

Tabell 6: Antistoffer for valgfri uttømming av ikke-B-celler.

Reagent Type/klone Arbeidsfortynning/konsentrasjon
anti-human CD14 AlexaFluor647 M5E2 1:50
anti-human CD16 AlexaFluor700 3G8 1:50
anti-human CD20 PECy7 2H7 1:50
anti-human CD3 PE SP34-2 1:50
Zombie-NIR - 1:500
anti-menneskelig HLA-DR BV605 L243 1:200
anti-menneskelig Ig lett kjede lambda APC MHL-38 1:50
anti-menneskelig Kappa Light Chain FITC polyklonal 1:500
anti-menneskelig IgM BV421 MHM-88 1:50
RC1-antigen, tilfeldig biotinylert - 5 mikrogram/ml
Streptavidin-PE - 1:500

Tabell 7: Flowcytometriske reagenser for analyse.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk oversikt over rAAV6-produksjon og genredigering av primære rhesusmakake B-celler. Protokollene er delt inn i rAAV6-produksjon (trinn 1) og genredigering av rhesusmakak-B-celler (trinn 2-5), inkludert et valgfritt trinn for uttømming av ikke-B-celler (trinn 4). Trinn i protokollene er indikert med røde sirkler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Høyt rAAV6-utbytte ved bruk av en selvinaktiverende adenoviral hjelper. rAAV6 ble produsert ved hjelp av metodene beskrevet her (pAAV-transfeksjon [TF] + selvinaktiverende hjelper RepCap6, selvinaktiverende adenoviral hjelper) eller typisk hjelperfri trippeltransfeksjon av pAAV, pHelper og pRepCap6 (pRC6). rAAV6 ble kun renset fra cellesupernatanten. Metodene som brukte de selvinaktiverende adenovirale hjelpervektorene produserte 30-40 ganger mer rAAV titered av qPCR, som beskrevet ovenfor. Hvert punkt representerer en individuell rAAV-produksjon ved hjelp av ulike pAAV-konstruksjoner fra 2 til 20 uavhengige eksperimenter. Mean ± SEM er plottet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: B-celleanrikning ved negativ uttømming av ikke-B-celler. Rhesus macaque B-celler ble anriket fra PBMC ved hjelp av protokollen beskrevet og anriket til 90% renhet. Inngang og utgang for forhåndsanrikning etter berikelse vises. Gated på live, singlet PBMCs. Representant for fem uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Målrettingsstrategi brukt for redigering av B-cellereseptorspesifisiteten til rhesusmakak-B-celler. rAAV6 ble produsert med HDRT avbildet. HDRT består av en 266 bp 5' homologiarm, etterfulgt av 111 bp av rhesusmakaken IGHM exon 1 spleisakseptor, deretter en GSG-linker med et Thosea asigna-virus selvspaltende 2A peptidsekvens (T2A), etterfulgt av en ledersekvens og den komplette lyskjeden av rhesus makakantistoff Ab1485 som rhesus macaque IGLC1. Dette etterfølges av et furinspaltningssted, en GSG-linker og en svine-teschovirus selvspaltende 2A-peptidsekvens (Furin-P2A), etterfulgt av en annen ledersekvens og Ab1485 tungkjedevariabel, etterfulgt av 52 bp av rhesusmakaken IGHJ4 spleisdonorsekvens, for å tillate skjøting i nedstrøms antistoff tunge kjedekonstante regioner, og en 514 bp homologiarm. Denne konstruksjonen ble målrettet inn i IGH-lokuset mellom det siste IGHJ-genet og Eμ-forsterkeren ved bruk av sgRNA-målsekvensen GAGATGCCAGCAAACCAG. Begge homologiarmene ble designet for å ende på kuttstedet for dette sgRNA, og dermed fjerne målsekvensen og muliggjøre optimal integrasjonseffektivitet. Samtidig, for å opprettholde allelisk eksklusjon og ekspresjon av en enkelt B-cellereseptor, slettet vi endogene lyskjeder ved hjelp av sgRNA rettet mot rhesusmakaken IGKC med målsekvensen GGCGGGAAGATGAAGACAGA og IGLC1, IGLC2, IGLC3, IGLC6 og IGLC7S ved hjelp av målsekvensen CTGATCAGTGACTTCTACCC. HDRT inkluderte stille mutasjoner som forhindret spaltningen av IGLC1-sekvensen av dette sgRNA. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Genredigering av primære rhesusmakak-B-celler. (A) Primære splenocytter (topppanel) eller PBMC (nederste panel) fra samme rhesusmakaker ble dyrket uten uttømming av ikke-B-celler og redigert som beskrevet ovenfor. Målrettingsstrategien var som vist i figur 4. To dager etter elektroporering ble cellene høstet og overflatefarget for flowcytometrisk analyse. Den venstre kolonnen ble inngjerdet på singletceller, og de andre kolonnene ble deretter gatet, som angitt i øverste rad. Levedyktigheten til cellene, renheten til B-cellene, delesjonseffektiviteten til lyskjedene og innslagseffektiviteten til Ab1485 ved farging med det spesifikke antigenet RC141 er indikert i ubehandlede, RNP-transfekterte eller RNP-transfekterte + rAAV6-transduserte prøver (MOI = 5 x 105). Representant for seks uavhengige eksperimenter med celler fra forskjellige rhesusmakaker. (B) IgM-uttrykk på dyrkede rhesusmakak-B-cellekontroller eller etter redigering og (C) geometrisk gjennomsnittlig fluorescensintensitet (gMFI) av IgM på B-celler som ikke har mistet Ig-uttrykk på grunn av IgLC- og IgKC-målretting (uredigert) eller B-celler som binder det forventede antigenet (redigert). Den røde prikken indikerer gMFI av dyrkede utransfekterte kontroll-B-celler. Angir p < 0,0001 i paret t-test. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Effekter av DMSO, langvarig konsentrert inkubasjon med rAAV6 HDRT, rAAV batchkvalitet og reproduserbarhet blant ulike donor NHP på genredigeringseffektivitet i primære rhesus macaque B-celler. (A) Splenocytter ble dyrket og redigert som beskrevet. Etter elektroporering ble 5 x 10 5 celler dyrket i medium med eller uten 1% DMSO og inkubert i 50 μL medium inneholdende rAAV6 HDRT ved en MOI på 5 x 10 5 i enten 2 timer eller5 timer før tilsetning av ytterligere 450 μL medium. Cellene ble analysert 2 dager etter elektroporering ved flowcytometri, som i figur 5. Representant for fire uavhengige eksperimenter. (B) Kvantifisering av (A) over fire uavhengige eksperimenter. Punktene indikerer tekniske replikater med transfeksjonsinnstillinger på 1,350 V, 10-20 ms og 1 pulselektroporasjonsvarighet og DMSO-konsentrasjoner fra 0,75% -1,25%. (C) Gjennomsnittlig foldeendring i redigeringseffektivitet fra (B). * p > 0,05 i Mann-Whitney U test. (D) Redigeringseffektivitet over uavhengige eksperimenter med forskjellige makaker ved bruk av en kommersiell rAAV6-batch med lavere effektivitet. (E) Redigeringseffektivitet ved hjelp av to forskjellige kommersielle batcher av rAAV6 der samme konstruksjon ble pakket inn i B-cellene til to forskjellige NHP-er i samme eksperiment. Punktene indikerer tekniske replikater med transfeksjonsinnstillinger på 1,350 V, 10-20 ms og 1 pulselektroporering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Protokollene som presenteres her gir en rask og effektiv metode for å generere høye utbytter og titere av rAAV6s som HDRT og nye metoder for effektivt genredigering av primære rhesus macaque B-celler in vitro.

rAAV6-produksjonsprotokollen er relativt enkel og rask, og tillater produksjon og testing av mange forskjellige konstruksjoner samtidig uten overdreven arbeidskraft. Om ønskelig kan rAAV6 renses ytterligere ved hjelp av etablerte protokoller som jodixanolgradient, ultrasentrifugering34 eller vandig tofasepartisjonering35 før bufferutveksling og konsentrasjon.

Selv om det reduserte det totale utbyttet, valgte vi å bare bruke serumredusert cellekulturmedium for rAAV6-rensingen i stedet for rensing fra cellepelleten, siden flertallet av rAAV6 slippes ut i mediet36, og rensing fra cellepelleten gir mer kostnad og arbeidskraft. Bruken av den selvinaktiverende adenovirale hjelperen økte utbyttet 30-40 ganger i gjennomsnitt, slik at testing av konstruksjoner pakket inn i AAV6 i en enkelt 15 cm tallerken. Selv om rensemetoden vår er grunnleggende, oppnår vi ved hjelp av denne metoden relativt liten batch-til-batch-variasjon i genredigeringseffektivitet eller cellelevedyktighet etter transduksjon ved hjelp av forskjellige cellelinjer eller andre primære celler (data ikke vist).

Vi utviklet en rhesus macaque B-cellerensingsprotokoll for å oppnå uberørte primære B-celler ved å bruke den negative uttømmingen av uønskede populasjoner. Selv om det ikke er nødvendig for genredigering av disse cellene, gir det en måte å oppnå en relativt ren populasjon av primære rhesusmakak-B-celler for denne eller andre applikasjoner dersom andre celletyper forstyrrer de eksperimentelle målene. Imidlertid kommer renhet på bekostning av reduserte samlede B-celleutbytter. Spesielt for både de berikede og uanrikede B-cellekulturer er fraksjonen av B-celler i de første PBMC- eller miltocyttpreparatene avgjørende. Spesielt for PBMC anbefaler vi screening av forskjellige makaker for personer med høy prosentandel av B-celler i perifert blod for å oppnå høyt antall B-celler for eksperimenter, da denne verdien kan variere dramatisk mellom individer27. PBMC kan fås ved regelmessig blødning eller leukaferese42.

Genredigeringsprotokollen fører til effektiv genredigering, typisk mellom 60%-80% av knock-out og 5%-20% av knock-in B-celler, selv om vi har oppnådd opptil 90% BCR knock-out og 40% BCR knock-in B-celler (figur 5 og figur 6).

De viktigste parametrene for effektiv redigering av rhesus macaque B-celler er skjæreeffektiviteten til sgRNA, elektroporasjonsparametrene, MOI og kvaliteten på rAAV6-preparatet. Skjæreeffektiviteten til kandidat-sgRNA bør bestemmes empirisk for å muliggjøre optimal redigering og utforming av HDRT. Elektroporasjonsparametrene som presenteres her, balanserer effektivitet med levedyktighet for å oppnå maksimalt totalt antall redigerte B-celler i stedet for den høyeste prosentandelen av redigerte B-celler. Hvis en høyere prosentandel av redigerte celler kreves, anbefales økte spenninger (opptil 1,750 V) eller endrede pulslengder (10-30 ms), selv om mer celledød kan observeres. Vi bemerket også litt høyere redigeringseffektivitet i milt B-celler sammenlignet med B-celler fra PBMC fra samme individ (figur 5); Den underliggende årsaken til dette er imidlertid foreløpig ukjent.

Vi fant at tilsetningen av 1% DMSO etter elektroporering signifikant økte genredigeringseffektiviteten med ~ 40% i rhesus macaque B-celler uten å påvirke cellens levedyktighet (figur 6A-C), i tråd med rapporter i andre celler43. Utvidet dyrkning hos 1 % DMSO bør imidlertid unngås og kan påvirke cellens levedyktighet. DMSO kan utelates helt om ønskelig.

Kulturen av cellene i et lite volum etter elektroporering i flere timer sammen med rAAV6 fører til høyere redigeringseffektivitet, sannsynligvis på grunn av bedre transduksjon av HDRT av rAAV6 og dermed den høyere intracellulære konsentrasjonen av HDRT på det aktuelle tidspunktet når Cas9 er aktiv. Vi fant at dyrking av cellene på denne måten i opptil 8 timer ikke påvirket cellens levedyktighet, men redigeringseffektiviteten økte ikke dramatisk utover 5 timer (figur 6). Hvis bare utstansing i stedet for innbanking er nødvendig, kan dette trinnet utelates.

Avslutningsvis presenterer vi omfattende protokoller for genredigering av rhesus macaque B-celler in vitro og produksjon av rAAV6 HDRT som er nødvendig for effektiv innbanking av ønskede konstruksjoner. Disse protokollene muliggjør rask, kostnadseffektiv testing av mange konstruksjoner pakket som rAAV6 og muliggjør preklinisk testing av gjennomførbarheten og skalerbarheten av B-celleterapier i en mer relevant ikke-menneskelig primatmodell.

Disclosures

Ingen konkurrerende interesser er erklært.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke Harry B. Gristick og Pamela Bjorkman for å gi RC1-antigenet og hele Nussenzweig- og Martin-laboratoriene for kritisk diskusjon. Dette arbeidet ble støttet av The Bill and Melinda Gates Foundation grant INV-002777 (til MCN) og Intramural Research Program fra National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health. (RG og MAM). M.C.N. er en HHMI-etterforsker.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL tube sterile, Dnase, Rnase and purogen free Stellar Scientific T17-125 or similar
10 mL serological pipette, polystyrene, sterile, nonpyrogenic, DNase-/RNase-free, and Human DNA-free Corning 4488 or similar
15 cm tissue culture dish Falcon 353025 or similar
15 mL polypropylene conical tybe Falcon 352097 or similar
25 mL serological pipette, polystyrene, sterile, nonpyrogenic, DNase-/RNase-free, and Human DNA-free Corning 4489 or similar
250 mL polypropylene conical tybe Corning 430776 or similar
293AAV cell line Cell Biolabs AAV-100
2-B-mercapto-ethanol, 55mM (1000x) Gibco 21985-023
48-well tissue culture plate Corning 3548 or similar
5 mL serological pipette, polystyrene, sterile, nonpyrogenic, DNase-/RNase-free, and Human DNA-free Corning 4487 or similar
5 mL syringes with Luer-Lok Tip BD 309646 or similar
50 mL polypropylene conical tybe Falcon 352070 or similar
50 mL serological pipette, polystyrene, sterile, nonpyrogenic, DNase-/RNase-free, and Human DNA-free Corning 4490 or similar
6-well tissue culture plate Falcon 353046 or similar
AAV-6 Packaging System (plasmids) Cell Biolabs VPK-406
AAV6 Reference Materials (full capsids) Charles River RS-AAV6-FL
Accu-jet S Pipette Controller Brand 26350 or similar pipette controller
Antibiotic/Antimycotic 100x Gibco 15260-062
anti-human CD14 AlexaFluor647 Biolegend 301812
anti-human CD14 biotin BioLegend 301826
anti-human CD16 AlexaFluor700 BD Biosciences 557920
anti-human CD16 biotin BioLegend 302004
anti-human CD20 PECy7 Biolegend 302312
anti-human CD3 biotin Thermo Fisher APS0309
anti-human CD3 PE BD Biosciences 552127
anti-human CD33 biotin Miltenyi 130-113-347
anti-human CD64 biotin BioLegend 305004
anti-human CD66 biotin Miltenyi 130-100-143
anti-human CD89 biotin BioLegend 354112
anti-human CD8a biotin BioLegend 301004
anti-human HLA-DR BV605 Biolegend 307640
anti-human Ig light chain lambda APC Biolegend 316610
anti-human IgM BV421 Biolegend 314516
anti-Human Kappa Light Chain FITC Fisher Scientific A18854
Autoclave Steris Amsco Lab 250 or similar
Cell culture CO2 incubator Fisher Scientific 51026331 or similar
Centrifugal Filter Unit (Amicon Ultra - 4, 100 kDa) Millipore UFC810024
Centrifuge 5920 R Eppendorf EP022628188 or any other, coolable swinging bucket centrifuge with inserts for 96-well plates, 15, 50 and 250 mL size tubes
Chloroform Fisher Scientific C298SK-4
Cpg ODN Invivogen tlrl-2395
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich 34869-500ML
DMEM, High Glucose Gibco 11965092
DNaseI (RNase-free) New England Biolabs M0303L
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco 14190144
Electroporation kit (Neon Transfection System 10 µL) Fisher Scientific MPK1096 or other sizes or 100 uL transfection kit MPK 10096
Electroporation system (Neon Transfection System) Fisher Scientific MPK5000
FCS Hyclone SH30910.03*
Ficoll-PM400 (Ficoll-Paque PLUS) Cytiva 17144002 or similar
Fume Hood Fisher Scientific FH3943810244 or similar
Glutamine 200 mM Gibco 25030-081
Graduated Cylinder 1L Corning 3022-1L or similar
Hemocytometer Sigma-Aldrich Z375357-1EA or similar
HEPES 1M Gibco 15630-080
HEPES 1M Gibco 15630-080
Hot Plate Magnetic Stirrer Fisher Scientific SP88857200 or similar
Human BAFF Peprotech  310-13
Human BD Fc Block BD 564220
Human IL-10 Peprotech  200-10
Human IL-2 Peprotech  200-02
Hydrochloric acid Fisher Scientific A144S-500
Hydrophilic Polyethersulfone Syringe Filters, (Supor membrane), Sterile - 0.2 µm, 25 mm  Pall 4612
Insulin-Transferin-Selenium, 100x Gibco 41400-045
ITR primer forward: GGAACCCCTAGTGATGGAGTT Integrated DNA Technologies custom
ITR primer reverse: CGGCCTCAGTGAGCGA Integrated DNA Technologies custom
Laminar flow biosafety cabinet The Baker Company SG403A or similar
Large magnetic depletion (LD) Column Miltenyi Biotec 130-042-901
Magentic seperator (MidiMACS separator and multistand) Miltenyi Biotec 130-090-329
Magnetic stir bar Fisher Scientific 14-512-127 or similar
Magnetic streptavidin beads (Streptavidin MicroBeads) Miltenyi Biotec 130-048-101
Maxiprep kit Machery-Nagel 740414.5 or similar
Media Bottles 2L with cap Cole-Parmer UX-34514-26 or similar
MegaCD40L Enzo ALX-522-110-C010
MicroAmp Optical 384-well Reaction Plate Fisher Scientific 4309849
MicroAmp Optical Adhesive Film Fisher Scientific 4311971
Microcentrifuge 5424 R Eppendorf 5404000014 or any other table top centrifuge for 1.5 mL tubes
Microwave oven Panasonic NN-SD987SA or similar
Nikon TMS Inverted Phase Contrast Microscope Nikon TMS or any other Inverted phase-contrast microscope for cell culture
Non-essential amino acids, 100x Gibco 11140-050
Nuclease-free Duplex buffer Integrated DNA Technologies 11-01-03-01
Nuclease-free Water Qiagen 129115
pH meter Mettler Toledo 30019028 or similar
Pipetman Classic Starter Kit, 4 Pipette Kit, P2, P20, P200, P1000 and tips Gilson F167380 or similar set of pipettes and tips
Pluronic F-68 10 % Gibco 24040-032
Polyethylene Glycol 8000 Fisher Scientific BP233-1
Polyethylenimine, Linear, MW 25000, Transfection Grade (PEI 25K Polysciences 23966-100
Precision Balance Mettler Toledo ME4001TE or similar
Pre-Separation Filters (30 µm) Miltenyi Biotec 130-041-407
Pyrex glass beaker 2 L Cole-Parmer UX-34502-13 or similar
Pyrex glass beaker 250 mL Millipore Sigma CLS1000250 or similar
qPCR Instrument Fisher Scientific 4485691 or similar
RC1 antigen randomly biotinylated Bjorkman lab, CalTech in house
RPMI-1640 Gibco 11875-093
S.p. Cas9 Nuclease Integrated DNA Technologies 1081059
Scientific 1203 Water Bath VWR 24118 or any water bath set to  37 °C
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653-5KG
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S8045-500G
Sodium Pyruvate 100 mM Gibco 11360-070
Sterile Disposable Filter Units with PES Membranes Thermo Scientific Nalgene  567-0020 
Streptavidin-PE BD Biosciences 554061
SYBR Green Master Mix  Fisher Scientific A25742
Tetracycline-enabled, self-silencing adenoviral vector RepCap6  Oxgene TESSA-RepCap6
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250061
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300054
Water Purification System Millipore Sigma ZEQ7000TR or similar
Zombie-NIR Biolegend 423106

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Victora, G. D., Nussenzweig, M. C. Germinal centers. Annual Review of Immunology. 40, 413-442 (2022).
  2. Plotkin, S. A. Correlates of protection induced by vaccination. Clinical and Vaccine Immunology. 17 (7), 1055-1065 (2010).
  3. Brinkmann, V., Heusser, C. H. T cell-dependent differentiation of human B cells into IgM, IgG, IgA, or IgE plasma cells: High rate of antibody production by IgE plasma cells, but limited clonal expansion of IgE precursors. Cellular Immunology. 152 (2), 323-332 (1993).
  4. Chernecky, C. C., Berger, B. J. Protein Electrophoresis - Serum., 6th edition. , Elsevier Saunders. St Louis, MO. 917-920 (2013).
  5. Balazs, A. B., et al. Antibody-based protection against HIV infection by vectored immunoprophylaxis. Nature. 481 (7379), 81-84 (2011).
  6. Greiner, V., et al. CRISPR-mediated editing of the B cell receptor in primary human B cells. iScience. 12, 369-378 (2019).
  7. Hartweger, H., et al. HIV-specific humoral immune responses by CRISPR/Cas9-edited B cells. Journal of Experimental Medicine. 216 (6), 1301-1310 (2019).
  8. Huang, D., et al. Vaccine elicitation of HIV broadly neutralizing antibodies from engineered B cells. Nature Communications. 11, 5850 (2020).
  9. Jeske, A. M., Boucher, P., Curiel, D. T., Voss, J. E. Vector strategies to actualize B cell-based gene therapies. Journal of Immunology. 207 (3), 755-764 (2021).
  10. Nahmad, A. D., et al. In vivo engineered B cells secrete high titers of broadly neutralizing anti-HIV antibodies in mice. Nature Biotechnology. 40 (8), 1241-1249 (2022).
  11. Nahmad, A. D., et al. Engineered B cells expressing an anti-HIV antibody enable memory retention, isotype switching and clonal expansion. Nature Communications. 11, 5851 (2020).
  12. Voss, J. E., et al. Reprogramming the antigen specificity of B cells using genome-editing technologies. eLife. 8, 42995 (2019).
  13. Pesch, T., et al. Molecular design, optimization, and genomic integration of chimeric B cell receptors in murine B cells. Frontiers in Immunology. 10, 2630 (2019).
  14. Cheong, T. C., Compagno, M., Chiarle, R. Editing of mouse and human immunoglobulin genes by CRISPR-Cas9 system. Nature Communications. 7, 10934 (2016).
  15. Rogers, G. L., Cannon, P. M. Genome edited B cells: A new frontier in immune cell therapies. Molecular Therapy. 29 (11), 3192-3204 (2021).
  16. Hung, K. L., et al. Engineering protein-secreting plasma cells by homology-directed repair in primary human B cells. Molecular Therapy. 26 (2), 456-467 (2018).
  17. Johnson, M. J., Laoharawee, K., Lahr, W. S., Webber, B. R., Moriarity, B. S. Engineering of primary human B cells with CRISPR/Cas9 targeted nuclease. Scientific Reports. 8, 12144 (2018).
  18. Wu, C. M., et al. Genetic engineering in primary human B cells with CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins. Journal of Immunological Methods. 457, 33-40 (2018).
  19. Luo, B., et al. Engineering of alpha-PD-1 antibody-expressing long-lived plasma cells by CRISPR/Cas9-mediated targeted gene integration. Cell Death and Disease. 11 (11), 973 (2020).
  20. Laoharawee, K., et al. Genome engineering of primary human B cells using CRISPR/Cas9. Journal of Visualized Experiments. (165), e61855 (2020).
  21. Laoharawee, K., Johnson, M. J., Moriarity, B. S. CRISPR/Cas9-mediated genome engineering of primary human B cells. Methods in Molecular Biology. 2115, 435-444 (2020).
  22. Moffett, H. F., et al. B cells engineered to express pathogen-specific antibodies protect against infection. Science Immunology. 4 (35), (2019).
  23. Hartweger, H., Nussenzweig, M. C. CRISPR comes a-knock-in to reprogram antibodies in vivo. Nature Biotechnology. 40 (8), 1183-1184 (2022).
  24. Nishimura, Y., Martin, M. A. Of mice, macaques, and men: Broadly neutralizing antibody immunotherapy for HIV-1. Cell Host & Microbe. 22 (2), 207-216 (2017).
  25. Shedlock, D. J., Silvestri, G., Weiner, D. B. Monkeying around with HIV vaccines: Using rhesus macaques to define 'gatekeepers' for clinical trials. Nature Reviews Immunology. 9 (10), 717-728 (2009).
  26. Kreuser, S., et al. Efficient methods for generation and expansion of, and gene delivery to rhesus macaque plasma B cells. bioRxiv. , (2021).
  27. Gujer, C., Sundling, C., Seder, R. A., Karlsson Hedestam, G. B., Lore, K. Human and rhesus plasmacytoid dendritic cell and B-cell responses to Toll-like receptor stimulation. Immunology. 134 (3), 257-269 (2011).
  28. Kim, J. S., et al. Cell enrichment-free massive ex-vivo expansion of peripheral CD20(+) B cells via CD40-CD40L signals in non-human primates. Biochemical and Biophysical Research Communications. 473 (1), 92-98 (2016).
  29. Su, W., et al. Self-attenuating adenovirus enables production of recombinant adeno-associated virus for high manufacturing yield without contamination. Nature Communications. 13, 1182 (2022).
  30. Endo, Y., et al. Short- and long-term clinical outcomes in rhesus monkeys inoculated with a highly pathogenic chimeric simian/human immunodeficiency virus. Journal of Virology. 74 (15), 6935-6945 (2000).
  31. Balaphas, A., Buchs, N. C., Meyer, J., Hagen, M. E., Morel, P. Partial splenectomy in the era of minimally invasive surgery: The current laparoscopic and robotic experiences. Surgical Endoscopy. 29 (12), 3618-3627 (2015).
  32. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  33. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: Expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
  34. Strobel, B., Miller, F. D., Rist, W., Lamla, T. Comparative analysis of cesium chloride- and iodixanol-based purification of recombinant adeno-associated viral vectors for preclinical applications. Human Gene Therapy Methods. 26 (4), 147-157 (2015).
  35. Guo, P., et al. Rapid and simplified purification of recombinant adeno-associated virus. Journal of Virological Methods. 183 (2), 139-146 (2012).
  36. Vandenberghe, L. H., et al. Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing. Human Gene Therapy. 21 (10), 1251-1257 (2010).
  37. Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
  38. Conant, D., et al. Inference of CRISPR edits from Sanger trace data. The CRISPR Journal. 5 (1), 123-130 (2022).
  39. Wilkinson, A. C., et al. Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice. Nature Communications. 12, 686 (2021).
  40. Wang, Z., et al. A broadly neutralizing macaque monoclonal antibody against the HIV-1 V3-Glycan patch. eLife. 9, 61991 (2020).
  41. Escolano, A., et al. Immunization expands B cells specific to HIV-1 V3 glycan in mice and macaques. Nature. 570 (7762), 468-473 (2019).
  42. Pathiraja, V., Matar, A. J., Gusha, A., Huang, C. A., Duran-Struuck, R. Leukapheresis protocol for nonhuman primates weighing less than 10 kg. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 52 (1), 70-77 (2013).
  43. Stratigopoulos, G., De Rosa, M. C., LeDuc, C. A., Leibel, R. L., Doege, C. A. DMSO increases efficiency of genome editing at two non-coding loci. PLoS One. 13 (6), 0198637 (2018).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 192 B-celler genredigering genomteknikk CRISPR / Cas9 adenoassosiert virus rhesusmakak ikke-menneskelig primat celleterapi
Genredigering av primære Rhesus Macaque B-celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hartweger, H., Gautam, R.,… More

Hartweger, H., Gautam, R., Nishimura, Y., Schmidt, F., Yao, K. H., Escolano, A., Jankovic, M., Martin, M. A., Nussenzweig, M. C. Gene Editing of Primary Rhesus Macaque B Cells. J. Vis. Exp. (192), e64858, doi:10.3791/64858 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter