Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Genredigering af primære Rhesus Macaque B-celler

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/64858
Automatic Translation
1, 2, 2, 3,5, 1, 1,6, 1, 2, 1,4
1Laboratory of Molecular Immunology, The Rockefeller University, 2Laboratory of Molecular Microbiology, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 3Laboratory of Retrovirology, The Rockefeller University, 4Howard Hughes Medical Institute, The Rockefeller University, 5Laboratory of Applied Virology and Precision Medicine, King Abdullah University of Science and Technology (KAUST), 6Vaccine and Immunotherapy Center, Wistar Institute

Summary

Vi præsenterer en metode til dyrkning og genredigering af primære rhesusmakakke B-celler ved hjælp af CRISPR/Cas9 og rekombinant adeno-associeret virus serotype 6 til undersøgelse af B-celleterapier.

Abstract

B-celler og deres afkom er kilderne til stærkt udtrykte antistoffer. Deres høje proteinekspressionsevne sammen med deres overflod, let tilgængelighed via perifert blod og modtagelighed for enkle adoptivoverførsler har gjort dem til et attraktivt mål for genredigeringsmetoder til at udtrykke rekombinante antistoffer eller andre terapeutiske proteiner. Genredigering af mus og humane primære B-celler er effektiv, og musemodeller til in vivo-studier har vist lovende, men gennemførlighed og skalerbarhed for større dyremodeller er indtil videre ikke blevet demonstreret. Vi udviklede derfor en protokol til redigering af rhesus makakke primære B-celler in vitro for at muliggøre sådanne undersøgelser. Vi rapporterer betingelser for in vitro-dyrkning og genredigering af primære rhesusmakak-B-celler fra mononukleære celler i perifert blod eller splenocytter ved hjælp af CRISPR/Cas9. For at opnå den målrettede integration af store (<4,5 kb) kassetter blev der inkluderet en hurtig og effektiv protokol til fremstilling af rekombinant adenoassocieret virusserotype 6 som en homologirettet reparationsskabelon ved hjælp af en tetracyklinaktiveret selvhæmmende adenoviral hjælpervektor. Disse protokoller muliggør undersøgelse af prospektiv B-celleterapi i rhesusmakaker.

Introduction

B-celler er grundlaget for humoristisk immunitet. Ved aktivering af beslægtede antigen- og sekundære signaler giver naive B-celler anledning til germinale center B-celler, hukommelses B-celler og plasmaceller1. Sidstnævnte er kilden til de udskillede antistoffer, der formidler beskyttelsesfunktionerne i de fleste aktuelt tilgængelige vacciner2. Plasmaceller er blevet beskrevet som antistoffabrikker, da de udskiller store mængder antistoffer i serum - ca. 2 ng / dag / celle3, svarende til 7-16 g / L serum, hvilket gør antistoffer til et af de tre mest rigelige proteiner i serum4. B-celler er rigelige i blod og kan således let opnås og infunderes tilbage i et individ.

Disse træk har gjort B-celler til et mål for celleterapibestræbelser for at genredigere B-cellereceptoren (BCR) og udtrykke bredt neutraliserende antistoffer (bNAbs) mod den humane immundefektvirus (HIV)5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 og andre proteiner 16, 17,18,19,20,21. Sådanne tilgange har vist potentiale i talrige musestudier in vivo 7,8,10,11,16,22. Imidlertid skal flere forhindringer stadig overvindes for klinisk oversættelse 9,15,23, blandt dem sikkerhed, varighed og størrelse af den terapeutiske effekt samt skalering til større dyr såsom ikke-menneskelige primater (NHP'er). Faktisk er NHP'er, og især rhesusmakaker, som har en lang historie inden for antistof- og hiv-forskning24,25, den bedst egnede model til at teste disse parametre.

Her udviklede vi protokoller, der gør det muligt at løse disse problemer. Til dato har få undersøgelser forsøgt at dyrke rhesus makak B-celler ex vivo, og kun positiv selektion ved hjælp af CD20 er blevet rapporteret til oprensning af rhesus makak B-celler26,27,28. Vi har etableret en protokol til isolering af uberørte rhesusmakakke B-celler ved negativ udtømning af andre celletyper. Desuden er dyrkningsbetingelser defineret for målrettet genredigering af rhesus makak B-celler. Denne protokol skitserer brugen af CRISPR/Cas9 ribonukleoproteiner (RNP'er) og rekombinant adenoassocieret virus serotype 6 (rAAV6) som homologi-rettet reparationsskabelon (HDRT) til genredigering af dyrkede rhesusmakakke B-celler. Ved hjælp af denne protokol blev der opnået redigeringseffektivitet på op til 40% med store (~ 1,5 kb) skær. Vi præsenterer også en hurtig og omkostningseffektiv metode til fremstilling af rAAV6 ved hjælp af en tetracyklinaktiveret, selvhæmmende adenoviral hjælper29 for at muliggøre hurtig test af HDRT'er i dette format. Kombineret beskriver disse protokoller en effektiv arbejdsgang til genredigering af rhesusmakakke B-celler (figur 1), hvilket muliggør evaluering af B-celleterapier i en NHP-model.

For at starte forsøgene kan donormateriale bestilles fra kommercielle kilder eller opnås ved flebotomi eller splenektomi. I denne undersøgelse blev flebotomierne og blodsamlingerne udført som tidligere beskrevet30 ved hjælp af antikoagulanten EDTA. For at opnå milteniske, primære rhesusmakakke B-celler blev partielle (25% -50%) eller totale splenektomier udført ved hjælp af teknikker rapporteret tidligere31. Dyrene blev fastet natten over før operationen. Kort fortalt blev maven under operationen klippet og forberedt med skiftevis skrubber af chlorhexidin og 70% isopropylalkohol tre gange. Et snit (5-10 cm) blev lavet i maven for at identificere og isolere milten. Miltens vaskulatur blev ligeret med enten suturer eller vaskulære klemmer. Snittet blev lukket i to lag med 4-0 PDS polydioxanon suturer. Splenektomi blev udført en enkelt gang for et enkelt dyr. Enkeltcellesuspensioner blev fremstillet af makakmilt ved maceration gennem cellesi. Mononukleære celler fra blod og miltcellesuspensioner blev fremstillet under anvendelse af densitetsgradientcentrifugering og opbevaret i flydende nitrogen.

Protocol

Alle dyreforsøg og eksperimenter blev udført i henhold til protokoller godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee of National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health. Et resumé af følgende protokoller er vist i figur 1. Mandlige og kvindelige rhesusmakaker (Macaca mulatta) af indisk genetisk oprindelse i alderen 2-8 år blev anbragt og passet i overensstemmelse med retningslinjerne fra Udvalget for Pleje og Anvendelse af Laboratoriedyr i et biosikkerhedsniveau 2-anlæg.

FORSIGTIG: Alle eksperimenter blev udført i overensstemmelse med de universelle forholdsregler for blodbårne patogener, med sterile / aseptiske teknikker og korrekt biosikkerhedsniveau 2-udstyr i laminar flowhætter.

1. rAAV6 produktion

  1. Forbered reagenserne til rAAV6-produktion.
    1. Design og klon den homologistyrede reparationsskabelon mellem de inverterede terminalgentagelser (ITR'er) af AAV2 i vektoren pAAV ved hjælp af standardteknikker. Sørg for, at homologiarmene er på mindst ~ 250 bp på begge sider, men så lidt som 60 bp kan være tilstrækkeligt, selvom længere homologiarme foretrækkes, hvis konstruktionsdesignet tillader det. Hvis målsekvenser af nogen af de anvendte sgRNA'er er til stede i HDRT, skal du fjerne dem ved hjælp af tavse mutationer, som er mest effektive i protospacerens tilstødende motiv eller frøområde på målstedet.
      BEMÆRK: Gensyntese kombineret med Gibson-samling til effektiv kloning32 kan udføres. Forbered en Maxiprep af en korrekt klon til transfektion. Til sgRNA-design anbefales CHOPCHOP33, og en liste over flere værktøjer kan findes på https://zlab.bio/guide-design-resources. Den maksimale pakkekapacitet for AAV inklusive ITR'er er ~ 4,7 kb. AAV6 er den mest almindeligt anvendte serotype til redigering af hæmatopoietiske celler, især B-celler9. Andre serotyper af AAV til genredigering af rhesus makak B-celler er ikke blevet testet, men AAV28 og AAV-DJ10,11 er blevet anvendt i musestudier.
    2. Forbered 293AAV dyrkningsmedium og produktionsmedium i henhold til tabel 1 og tabel 2. Sterilfilter gennem en 0,2 μm polyethersulfon (PES) membranfilterenhed. Opbevares ved 4 °C.
    3. Forbered 1x polyethylenimin (PEI) opløsning (1 mg / ml, 100 ml).
    4. I et 250 ml glasbægerglas opvarmes ~ 70 ml H2O i en mikrobølgeovn i ~ 30 s, og tilsæt derefter 100 mg PEI. Tilsæt en magnetisk omrører, og rør, indtil PEI for det meste er opløst.
    5. Juster pH til 7 med 1 M HCl, fyld derefter op til 100 ml med H2O, vent 10 minutter, kontroller pH igen, og juster om nødvendigt.
    6. Sterilfiltrer PEI-opløsningen gennem en 0,2 μm PES-membranfilterenhed, alikvote, og opbevar -20 °C. Efter optøning kan opløsningen opbevares ved 4 °C i op til 2 måneder.
    7. Forbered 5x polyethylenglycol (PEG)/NaCl-opløsning.
    8. 400 g PEG 8.000 og 24 g NaCl afvejes.
    9. Tilsæt en magnetisk omrører til et 2 L glasbægerglas, tilsæt den udvejede PEG 8.000 og NaCl, og skyl med ~ 550 ml deioniseret vand.
    10. Rør rundt med opvarmning, og bring det i kog eller 80-90 °C, indtil det er helt opløst.
    11. Juster pH til ~7,4 med 1 M NaOH, juster derefter lydstyrken til 1 L ved hjælp af en målecylinder, og overfør den til en 2 L glasflaske med magnetomrøreren.
    12. Autoklave flasken, magnetomrøreren og opløsningen i vandbad i 30 minutter ved 121 °C.
    13. Efter autoklavering afkøles opløsningen i et koldt rum under omrøring ved hjælp af magnetomrøreren for at forhindre adskillelse i forskellige faser. Alikvote om nødvendigt og opbevares ved 4 °C.
    14. Forbered formuleringsbufferen.
    15. Bland 500 ml DPBS med 50 μL 10% Pluronic F-68. Sterilfiltrer gennem en 0,2 μm PES-membranfilterenhed, og opbevares ved stuetemperatur (RT).
  2. Cellekultur, transfektion og transduktion til rAAV6-produktion
    1. Optø, dyrk og frys 293AAV-celler som beskrevet af producenten ved hjælp af ovenstående 293AAV-dyrkningsmedium og Trypsin-EDTA til opdeling. Det anbefales at fryse nogle tidlige passager og bruge cellerne til AAV-produktion, før de når passage 40.
    2. Til rAAV6-produktion sås fire 15 cm cellekulturskåle med 5 x 106 celler i 30 ml hver. Cellerne er klar til transfektion normalt 1-2 dage efter såning, når de når 80% -90% sammenløb.
    3. Optø en Maxiprep pAAV-plasmid indeholdende HDRT, der skal pakkes i AAV6. 85,6 μg pAAV-plasmidet resuspenderes i 3 ml rent DMEM-medium.
    4. 342 μL 1 mg/ml PEI-opløsning opløses i 3 ml rent DMEM-medium. Inkuber begge opløsninger i 10 minutter ved RT.
    5. Bland begge 3 ml rør i et rør på ~ 6,4 ml transfektionsblanding, og inkuber i 20 minutter ved RT.
    6. I mellemtiden optø den tetracyklinaktiverede, selvhæmmende hjælpervektor RepCap6 fra -80 °C fryseren i et 37 °C vandbad. For at transducere 293AAV-cellerne tilsættes hjælpervektoren ved en multiplicitet af infektion (MOI) på 25 ved hjælp af medianvævskulturens infektiøse dosis (TCID 50) og forudsat 1,15 x10 7 celler / skål; typisk anvendes 2-10 μL pr. 15 cm skål. Rock og hvirvl opvasken forsigtigt for at fordele.
    7. Efter inkubationen af transfektionsblandingen tilsættes 1,6 ml af den dråbevis over hver af de fire 15 cm skåle. Der inkuberes ved 37 °C og 5% CO2 natten over.
      BEMÆRK: Alternativt, hvis rAAV6-vektorerne af interesse allerede er tilgængelige, kan disse vektorer bruges til at tilvejebringe det virale genom, der skal pakkes, hvilket negerer behovet for plasmider med dette system og giver sammenlignelige rAAV6-titere. Til denne fremgangsmåde transduceres 293AAV-cellerne sammen med den ønskede rAAV6 ved en MOI på 50 (baseret på rAAV6-genomkopier [GC] / ml) sammen med hjælpevektoren.
    8. Den næste dag skal du forsigtigt aspirere og kassere kulturmediet og erstatte med 30 ml forvarmet produktionsmedium. Inkuber i yderligere 96 timer før høst. Ingen yderligere medium ændring anbefales for at maksimere udbyttet.
  3. Høst og oprensning af den rekombinante AAV6 fra mediet
    1. Uden at løsne cellerne fra skålen samles al cellesupernatanten i en filterenhed med en 0,2 μm PES-membran, der er mindst 50 % større end det medium, der skal filtreres. Derefter filtreres supernatanten.
      BEMÆRK: Hvis der ønskes højere udbytter af rAAV6, kan cellerne høstes og rAAV ekstraheres fra cellepillen ved hjælp af kommercielle sæt eller etablerede protokoller34,35. Da AAV6 for det meste udskilles i medium36, blev der kun brugt supernatant, hvilket reducerede arbejdskraft, omkostninger og tid.
    2. Der tilsættes 5x PEG/NaCl-opløsning til den filtrerede supernatant ved 25 % af det opsamlede rumfang. dette er typisk 30 ml, hvis der anvendes fire 15 cm skåle på 30 ml.
    3. Bland godt ved at invertere, og inkuber derefter natten over ved 4 ° C for at udfælde viruspartiklerne.
      BEMÆRK: AAV-partikler er stabile i op til 2 dage i denne opløsning.
    4. Forafkøl en svingspandcentrifuge med 250 ml rørindsatser til 4 °C. Forbered en 4 ml centrifugalfilterenhed med en 100 kDa afskæring og et 0,22 μm hydrofilt PES-sprøjtefilter ved at forbehandle hver membran med 2 ml 10% Pluronic F-68 i mindst 1 time ved RT.
    5. AAV-PEG/NaCl-blandingen overføres til et 250 ml glas, centrifugeres ved 2,500 x g i 1 time ved 4 °C, hvorefter hele supernatanten forsigtigt fjernes ved aspiration.
    6. Resuspender den beige til hvide virale pellet ved hvirvelstrøm i 4 ml 1 M HEPES, indtil den er helt resuspenderet. Lad det om nødvendigt stå i 5 minutter og hvirvel igen. Resuspender med en 5 ml serologisk pipette, og overfør det samlede volumen til et 15 ml rør.
    7. I en damphætte tilsættes en lige så stor mængde chloroform til virussuspensionen - typisk 4 ml.
    8. Vortex kraftigt i 2 min, og centrifuger derefter ved 1.000 x g i 5 minutter ved RT.
    9. Det øverste lag (AAV-holdig supernatant) samles i et nyt 50 ml glas, og det nederste lag (chloroform) kasseres.
      FORSIGTIG: Chloroformholdige opløsninger er farligt affald. Følg institutionelle retningslinjer for bortskaffelse.
    10. Den AAV-holdige supernatant anbringes under en stinkhætte, og den resterende chloroform fordampes i 30 minutter.
    11. I mellemtiden vaskes den forbehandlede centrifugalfilterenhed og sprøjtefilteret.
    12. Der tilsættes 1,5 ml formuleringsbuffer til den forbehandlede centrifugalfilterenhed. Der centrifugeres ved 3.500 x g i 10 minutter ved 15 °C i en svingende skovlrotor. Gentag dette trin med 4 ml formuleringsbuffer for at vaske membranen.
    13. Skyl sprøjtefilteret to gange med 5 ml formuleringsbuffer ved hjælp af en 5 ml sprøjte.
    14. Læg ~4 ml AAV-holdig supernatant fra chloroformekstraktionen i en 5 ml sprøjte, fastgør det vaskede sprøjtefilter og filtrer direkte ind i centrifugalfilterenheden.
    15. Der centrifugeres ved 3.500 x g i 25 minutter ved 15 °C, og kontrollér derefter, at AAV-opløsningen i filteret ligger mellem 50-100 μL. Hvis opløsningens volumen er >100 μL, fortsættes centrifugeringen.
    16. Efter fjernelse af filtratet tilsættes 4 ml formuleringsbuffer inde i koppen i centrifugalfilterenheden, og opløsningen blandes ensartet ved pipettering. Der centrifugeres ved 3.500 x g i 25 minutter ved 15 °C, og kontrollér derefter, at AAV-opløsningen i filteret er mellem 50-100 μL. Hvis opløsningens volumen er >100 μL, fortsættes centrifugeringen. Gentag dette trin for en anden vask.
    17. Efter den endelige centrifugering bekræftes opløsningens volumen er 50-70 μL; Hvis ikke, fortsæt med at centrifugere. Overfør præparatet til et 1,5 ml rør. Aliquot, hvis det ønskes, og opbevares ved -80 °C.
  4. Rekombinant AAV6-titerbestemmelse ved qPCR
    BEMÆRK: qPCR-primerne anneal i ITR-regionen og bør således være egnet til alle konstruktioner, der klones til pAAV.
    1. Der optøs en delprøve af den rAAV6, der skal titeres, og en delprøve af AAV6-referencematerialet. AAV6-referencematerialet skal være tæt på 4 x 1011 GC/ml. Ellers justeres fortyndingerne i overensstemmelse hermed.
    2. Der udføres en DNase I-fordøjelse for at fjerne eventuelt resterende frit plasmid-DNA i rAAV6-præparatet ved at kombinere 2,0 μL af prøven eller AAV6-referencematerialet med 15,6 μL nukleasefri H 2 O,2,0μL 10x DNase I-buffer og 0,4 μL DNase I.
    3. Bland forsigtigt og inkuber i 30 minutter ved 37 °C, og overfør derefter til is. Dette er fortynding 1 (se tabel 3).
    4. Der fremstilles femfoldige seriefortyndinger af alle prøverne og AAV6-referencematerialet som vist i tabel 3 nedenfor med vand.
    5. Forbered en SYBR Green qPCR master mix. Pr. brønd blandes 4,7 μL nukleasefrit vand med 10 μL SYBR Green mastermix, 0,15 μL ITR-primer fremad ved 100 μM og 0,15 μL ITR-primer omvendt ved 100 μM.
      BEMÆRK: Hver prøve måles i to eksemplarer med 16 huller til referencestandarden, 8 brønde pr. prøve og 2 brønde til en kontrol uden skabelon. Forbered 10 % mere masterblanding for at tage højde for pipetteringsfejl.
    6. I en optisk 96-brønds eller 384-brønds reaktionsplade fyldes 15 μL/brønd af SYBR Green qPCR-masterblandingen.
    7. Derefter fyldes 5 μL prøver og AAV6-referencemateriale eller nukleasefrit vand til kontrol uden skabelon. For AAV6-referencestandarden fyldes fortynding 2 til fortynding 9. For prøver fyldes fortynding 5 til fortynding 8. Hver fortynding måles i to eksemplarer. Undgå bobler.
    8. Forsegl den belagte plade med optisk gennemsigtig film, centrifuger ved 800 x g i 1 min ved RT, og læg pladen i qPCR-instrumentet med den relevante 96-brønd eller 384-brøndopsætning.
    9. Opsæt og kør qPCR-instrumentet ved hjælp af SYBR-detektion under følgende cyklusbetingelser: 98 °C i 3 minutter, derefter 40 cyklusser med 98 °C i 15 s og 58 °C i 30 sekunder efterfulgt af en smeltekurve.
    10. Analysér dataene med instrumentets software ved hjælp af AAV6-referencematerialets koncentration i genomkopier pr. millimeter (GC/ml) som standardkurve (se tabel 3). Prøvens endelige koncentration beregnes ved at gange med fortyndingsfaktoren.
    11. Sørg for, at standardkurven R2 er tæt på 1,0, PCR-effektiviteten er 90% -110%, basislinjen er fjernet, smeltekurven viser en enkelt top, Ct -værdierne ændres i overensstemmelse med fortyndingerne, og duplikaterne er inden for 0,5 Ct; Ellers skal du udelukke afvigende værdier. Forvent udbytter som i figur 2.

2. Forberedelse af B-cellemedier og stimuli

  1. Forbered optøningsmedium: Kombiner RPMI-1640 med 20% FCS. Sterilfilter gennem en 0,2 μm PES-membranfilterenhed. Opbevares ved 4 °C.
  2. Forbered B-cellekulturmedium: Kombiner reagenserne i tabel 4, og filtrer derefter sterilt gennem en 0,2 μm PES-membranfilterenhed. Opbevares ved 4 °C.
  3. Hvert af B-cellestimulerende midler i tabel 5 resuspenderes ved stamkoncentrationer i B-cellekulturmedium, undtagen CpG ODN, som skal resuspenderes i nukleasefrit vand. Opbevares ved -80 °C.
  4. Hvis du udfører ikke-B-celle negativ udtømning (valgfrit trin 4), skal du forberede DPBS (ingen calcium, ingen magnesium) med 2% FCS (DPBS 2% FCS). Sterilfilter gennem en 0,2 μm PES-membranfilterenhed. Opbevares ved 4 °C.

3. Forberedelse og dyrkning af rhesus makak B-celler

BEMÆRK: Kryopræserverede rhesusmakak-PBMC'er eller splenocytter bruges til at oprette cellekulturen30,31.

  1. Forvarm optøningsmediet og B-cellekulturmediet i et 37 °C vandbad. Optø B-cellestimulerende midler fra tabel 5 på is.
  2. Forbered et rør af passende størrelse indeholdende forvarmet optøningsmedium. Dette bør ideelt set være mere end 10 gange volumenet af de optøede celler.
  3. Der optøs en til to kryoialer af PBMC'er eller splenocytter ad gangen i et 37 °C vandbad, og dekanteres i det forberedte rør med forvarmet medium. Skyl kryorørene for at samle alle cellerne.
  4. Centrifuger cellerne ved 200 x g i 10 minutter ved RT.
    BEMÆRK: Disse centrifugeringsindstillinger reducerer blodpladekontamineringen, samtidig med at PBMC-udbytterne bevares. Højere hastigheder såsom 350 x g i 5 min kan anvendes.
  5. Resuspender cellerne i 10 ml optøningsmedium til vask.
  6. Gentag trin 3.4 og trin 3.5 for i alt tre centrifugeringer for at fjerne frysemediet. Efter den sidste centrifugering resuspenderes cellerne ved en anslået ~ 5 x 106 celler / ml i B-cellekulturmedium.
    BEMÆRK: Ovennævnte protokol dyrker hele PBMC- eller splenocytpræparater med forurening med andre celler. Hvis renere B-cellekulturer er påkrævet, omend ved signifikant reducerede samlede B-celleudbytter, skal du fortsætte med trin 4. Der er ikke observeret forskelle i redigeringseffektiviteten mellem de to metoder.
  7. En prøve på 10 μL celler fortyndes om nødvendigt med B-cellekulturmedium til tælling. Tæl ved hjælp af et hæmocytometer og trypanblå farvning, der kombinerer lige store mængder resuspenderede celler og trypanblå 0,4% opløsning.
  8. Juster cellekoncentrationen til 3 x 106 celler / ml med B-cellekulturmedium i henhold til celleantallet. Derefter tilsættes B-cellestimulerende midler til deres endelige koncentrationer i henhold til tabel 5, og blandes.
  9. Overfør cellerne til en passende cellekulturskål. Samlet set anbefales 0,6 x 10 6-0,7 x 106 celler/cm2. Cellerne inkuberes ved 37 °C med 5% CO 2 i 48 timer ±2 timer.

4. Valgfri negativ nedbrydning af ikke-B-celler

BEMÆRK: Udbytte og renhed afhænger af inputprocenten af B-celler blandt PBMC'erne, som kan variere drastisk blandt individuelle rhesusmakaker27. Forvent 80% -95% renhed, 60% effektivitet og 1 x 10 6-1,5 x 106 celler fra 1 x 107 PBMC'er.

  1. Efter den sidste vask (trin 3.6) resuspenderes cellerne ved 1 x 108 celler/ml i DPBS 2% FCS og human Fc-blok fortyndet 1:200. Celletællingerne er baseret på antallet af optøede celler.
  2. Der inkuberes i 15 minutter på is for at blokere Fc-receptorerne, og derefter tilsættes de biotinylerede antistoffer i tabel 6. Inkuber i yderligere 20 minutter på is.
  3. Fyld røret op med DPBS 2% FCS, og drej ved 200 x g i 10 minutter ved 4 °C.
  4. Resuspender cellerne i DPBS 2% FCS ved 80% af lydstyrken fra trin 4.1 (dvs. 80 μL pr. 1 x 107 celler).
  5. Der tilsættes magnetiske streptavidinperler til cellesuspensionen ved 20% af volumenet fra trin 4.1 (dvs. 20 μL perler pr. 1 x 107 celler).
  6. Inkuber cellerne i 15 minutter på is, og omrør lejlighedsvis.
  7. I mellemtiden skal du pr. 1 x 108 celler forberede en magnetisk separator med en stor magnetisk udtømningskolonne og et forseparationsfilter. Skyl forseparationsfilteret og søjlen med 2 ml DPBS 2% FCS efter tyngdekraftsflow, og kassér gennemstrømningen. Installer et 15 ml opsamlingsrør.
    BEMÆRK: Brug af andre kolonner såsom positive markeringskolonner eller andre magnetiske perlerensningssystemer kan drastisk reducere renheden.
  8. Efter inkubation fyldes cellerne op til 0,5 ml med DPBS 2% FCS, hvis volumenet er <0,5 ml. Hvis lydstyrken er ≥0,5 ml, skal du blot fortsætte.
  9. Hæld cellesuspensionen i forseparationsfilteret på den forberedte søjle, og opsaml gennemstrømningen i 15 ml røret.
  10. De ubundne berigede B-celler elueres to gange ved at tilføje 1 ml DPBS 2 % FCS i filteret før separation. Saml de ubundne celler i det samme rør ved tyngdekraftsstrøm.
    BEMÆRK: Yderligere eluering kan øge udbyttet marginalt. Renheden og effektiviteten kan evalueres ved flowcytometrien af inputcellerne, berigede celler og celler, der tilbageholdes på kolonnen. For at opnå cellerne tilbageholdt på søjlen skal du fjerne søjlen fra magneten og skylle med 3 ml DPBS 2% FCS ved hjælp af det medfølgende stempel. Hvis det ønskes, evalueres renheden ved flowcytometri som i figur 3 ved hjælp af reagenserne i tabel 7.
  11. De berigede B-celler centrifugeres ved 200 x g i 10 minutter ved 4 °C.
  12. Resuspender cellerne ved en estimeret ~ 5 x 106 celler / ml i B-cellekulturmedium, og fortsæt ved trin 3.7.

5. Primær rhesus makak B-celle genredigering

  1. Efter aktivering af rhesusmakakken B-celler i 48 timer ± 2 timer fremstilles reagenserne til elektroporation og transduktion.
    1. Forvarm DMSO, nukleasefri duplexbuffer, buffer T og buffer E (10 μL elektroporationssæt) eller E2 (100 μL elektroporationssæt) fra elektroporationssættet til RT.
    2. Optø rAAV6 HDRT- og B-cellestimulerende midler fra tabel 5 på is.
  2. Resuspender CRISPR-Cas9 sgRNA'erne ved 100 μM i duplexbuffer. Rekonstituer i 10 minutter ved RT, og bland ved hvirvelstrøm og svirp. Opbevar de rekonstituerede sgRNA'er på is indtil brug. Opbevares ved -80 °C.
    BEMÆRK: CRISPR-Cas9 sgRNA'er kan designes med forskellige onlineværktøjer (se 1.1.1) og kan variere drastisk i deres skæreeffektivitet. Empirisk test af skæreeffektiviteten anbefales ved hjælp af analyser som TIDE37 eller ICE38.
  3. Pr. 10 μL elektroporation fremstilles 550 μL B-cellekulturmedium med alle stimulanser fra tabel 5, og der tilsættes 1% DMSO. Volumenerne skaleres 10 gange til 100 μL elektroporationer. Eventuelt kan 10% af dette medium fremstilles uden antibiotika-antimykotikum, hvilket øger cellelevedygtigheden lidt efter transfektion.
  4. Pr. 10 μL elektroporation fremstilles en brønd med en 48-brønds cellekulturplade med 50 μL B-cellekulturmedium med stimulanter og uden antibiotika-antimykotikum, hvis det anvendes. For 100 μL elektroporationer, pipette 500 μL i hullerne på en 6-brønds plade.
  5. Tilføj rAAV6 HDRT til mediet i brøndene, op til 20% af lydstyrken i brønden. Sigt efter MOI'er fra 1 x 10 5-1 x 10 6 baseret på antallet af celler pr. Transfektion (10 μL elektroporation: 5 x 10 5 celler; 100 μL elektroporation:5 x 106 celler) og GC i rAAV6-præparatet. Høje rAAV6-stamkoncentrationer på 5 x 1013 GC/ml til 5 x 1014 GC/ml anbefales for at opnå høje MOI'er med lave volumener.
    BEMÆRK: Lavere MOI'er kan føre til reduceret redigeringseffektivitet, og MOI'er på 5 x 105 er generelt tæt på den maksimale redigeringseffektivitet, vi har set. Der er ikke observeret en indflydelse af varierende MOI'er på B-cellelevedygtigheden. Det anbefales at inkludere kontroller uden rAAV6 HDRT, uden RNP-transfektion og uden begge.
  6. Forvarm de tilberedte retter og det resterende medium ved at overføre dem til en inkubator ved 37 °C med 5% CO2.
  7. Pr. 10 μL elektroporation fremstilles 1,15 μL ribonukleoprotein (RNP): Bland 0,4 μL 61 μM Cas9 med 0,75 μL 100 μM sgRNA i duplexbuffer. Forbered ekstra (30% mere for en enkelt elektroporation anbefales) på grund af pipetteringsfejl og for at undgå bobler, når elektroporationsspidserne ifyldes. Skaler 10 gange til 100 μL spidser.
  8. RNP inkuberes i mindst 15 minutter ved RT, før det blandes med cellerne. Efter inkubation kan flere RNP'er kombineres, hvis mere end et locus skal målrettes samtidigt. Der er ikke observeret signifikante forskelle i effektivitet med op til tre loci på samme tid.
  9. I mellemtiden forberede cellerne til elektroporation. Hold cellerne på RT hele tiden for at undgå temperaturstød. Høst cellerne efter 48 timer ± 2 timers kultur i en passende beholder. Skyl opvasken med DPBS for at samle det maksimale antal celler.
  10. Cellerne centrifugeres ved 200 x g i 10 minutter ved RT. Supernatanten kasseres, og cellerne resuspenderes i DPBS ved ~2 x 106 celler/ml.
  11. Kombiner 10 μL trypanblå 0,4% opløsning med 10 μL af cellesuspensionen, og tæl ved hjælp af et hæmocytometer.
    BEMÆRK: På dette tidspunkt, på grund af tab under høst og vask, forventer ca. 60% af cellerne, der blev sat i kultur 48 timer ± 2 timer tidligere.
  12. I mellemtiden centrifugeres cellerne ved 200 x g i 10 minutter ved RT. Supernatanten kasseres, og sørg for at minimere eventuel resterende DPBS. Resuspender cellerne i forvarmet (RT) buffer T ved 5,55 x 107 celler/ml baseret på ovenstående celletal.
  13. Indstil transfektionssystemet ved at tænde maskinen og indstille den til 1.350 V, 15 ms og 1 puls. Placer pipettestationen inde i laminar strømningshætte
  14. For hvert sæt af 10 elektroporationer fremstilles et transfektionsrør med 3 ml buffer E (til 10 μL transfektioner) eller E2 (til 100 μL transfektioner). Sæt røret i pipettestationen.
  15. Pr. 10 μL elektroporation kombineres 1,15 μL RNP med 9 μL celler. Sørg for at have et tilstrækkeligt volumen (+ 30%) for at undgå at opsuge luft ind i elektroporationsspidsen. Inkuber ved RT i 1-2 minutter før elektroporation.
  16. Der suges 10 μL eller 100 μL RNP og celleblanding ind i elektroporationsspidsen af passende størrelse på en elektroporationspipette, den ifyldte pipette indsættes i pipettestationen, og elektroporationen startes. Sørg for, at spidserne er helt fri for luftbobler for at forhindre buedannelse. Hold øje under elektroporation for at kontrollere, at der ikke forekommer buedannelse.
  17. Skub straks de elektroporerede celler ud i det tilberedte, forvarmede, lille volumen medium med eller uden rAAV6 inde i 48-brønden (10 μL transfektioner) eller 6-brøndpladen (100 μL transfektioner). Gentag trin 5.15-5.17 med de resterende prøver. Tilsæt kontrolprøver uden transfektion til kulturbrøndene.
  18. Inkuber cellerne ved 37 °C med 5% CO 2 i 4 timer ±2 timer, og tilsæt derefter det tilberedte, forvarmede B-cellekulturmedium indeholdende stimulanser, DMSO og antibiotika / antimykotikum: 450 μL til 10 μL transfektioner eller 4,5 ml til 100 μL transfektioner.
  19. Inkubationen fortsættes ved 37 °C med 5% CO2 i 12-24 timer. Skift derefter mediet til B-cellekulturmediet indeholdende stimulanter og antibiotikum/antimykotisk uden DMSO, hvis der ønskes langvarig dyrkning. Analyse af det genomiske DNA kan udføres efter 24 timer. Digital dråbe-PCR ved hjælp af en primer uden for homologiarmen og en primer inde i indsatsen kan bruges til at kvantificere redigeringseffektiviteten39. Udfør PCR'er for at forstærke indsættelsesstedet og Sanger-sekventering for at bekræfte korrekt redigering.
  20. Til analyse af proteinniveauerne dyrkes cellerne i 40-48 timer efter elektroporation for at tillade proteinekspressionsændringer, og der udføres en analyse ved flowcytometri ved hjælp af reagenserne i tabel 7.

Representative Results

Produktionen af rAAV6 ved brug af den tetracyklinaktiverede, selvhæmmende adenovirale hjælper resulterede i produktion af 4 x10 10 GC / ml cellekulturmedium i gennemsnit og overgik således produktionen ved hjælp af en standard, hjælperfri tredobbelt transfektion med 30-40 gange (figur 2).

Den valgfri oprensning af rhesus makak B-celler resulterede i eliminering af langt størstedelen af CD3 + T-cellerne og CD14 + og / eller CD16 + myeloide celler, med renheder på 80% -95% CD20 + B-celler, der rutinemæssigt blev opnået (figur 3). Baseret på vores tidligere design i murine B-celler7 udviklede vi en metode til at redigere B-cellereceptorspecificiteten af rhesus macaque B-celler, samtidig med at allelisk udelukkelse opretholdes i langt de fleste B-celler ved at slette endogene antistoflyskæder gennem forstyrrelse af deres konstante region. Vi konstruerede en promotorfri HDRT, der skulle indsættes i IGH-locus mellem det sidste IGHJ-gen og Eμ-forstærkeren af rhesusmakak B-celler (figur 4). Denne konstruktion udnytter den endogene V H-promotor af den naturligt omarrangerede opstrøms VDJ-region i modne B-celler og udtrykkes således ikke af episomale AAV-genomer. Desuden kræver denne konstruktion splejsning i nedstrøms antistoftunge kædekonstante regioner, der skal udtrykkes på celleoverfladen. Derfor indikerer specifik antigenbinding på celleoverfladen vist ved flowcytometri korrekt mållocusintegration, og at den indsatte sekvens er funktionel.

Vi pakkede et sådant konstruktionskodende antistof Ab1485, et rhesusmakakafledt anti-HIV bNAb40, ind i rAAV6 og brugte det til at redigere aktiverede primære rhesusmakaksplenocyt- eller PBMC-kulturer som beskrevet ovenfor (figur 5A). Protokollen opretholdt høj cellelevedygtighed (~ 90%), samtidig med at lyskædeekspressionen blev slettet i ~ 80% af B-celler. Størstedelen af B-cellerne udtrykte stadig isotypen IgM (figur 5B). Tilføjelsen af rAAV6, der koder for Ab1485 HDRT, resulterede i genredigering og Ab1485-overfladeekspression i 16% -21% af B-cellerne (figur 5A), omend ved en lavere fluorescensintensitet for antistofkæder end på uredigerede B-celler (figur 5A højre panel, figur 5C). Dette kan være resultatet af epitopkonkurrence mellem antigenpletten og de monoklonale stoffer, der anvendes til at detektere overfladen BCR i flowcytometri, samt faktisk reduceret proteinekspression på grund af HDRT's polycistroniske karakter og mindre effektiv splejsning. Tilføjelsen af 1% DMSO og forlængede, koncentrerede inkubationer med rAAV6 HDRT øgede generelt redigeringseffektiviteten (figur 6A-C). Ved hjælp af denne specifikke metode, typisk 5% -20% og op til 40%, opnås redigeringseffektivitet afhængigt af den enkelte rhesusmakak (figur 5A, figur 6A-E) og kvaliteten af rAAV6 HDRT-batchen (figur 6E). Samlet set præsenterer vi protokoller for effektiv rAAV6-produktion samt kultur, oprensning og genredigering af rhesusmakak B-celler.

Reagenser Lydstyrke Lager Endelig koncentration
DMEM, høj glukose 500 ml 1 x ~ 88,5%
FCS, varmeinaktiveret 50 ml 1 x ~ 8,85%
Antibiotikum/Antimykotisk 5 ml 100 x 1 x
Glutamin 5 ml 200 mM 2 mM
Natriumpyruvat 5 ml 100 mM 1 mM

Tabel 1: 293AAV-cellekulturmediet.

Reagenser Lydstyrke Lager Endelig koncentration
DMEM, høj glukose 500 ml 1 x ~ 95,2%
FCS, varmeinaktiveret 10 ml 1 x ~ 1,9%
Antibiotikum/Antimykotisk 5 ml 100 x 1 x
Glutamin 5 ml 200 mM 2 mM
Natriumpyruvat 5 ml 100 mM 1 mM

Tabel 2: 293AAV-celleproduktionsmediet.

Fortynding serie Prøvevolumen (μL) Fortyndingsmiddel og volumen Fortyndingsfaktor Total fortynding Henvisning AAV6
GC/ml
Fortynding 1 2 μL prøve eller AAV referencestandard ved 4,1 x 1011 GC/ml 18 μL DNAseI buffer og enzym 10 x 10 x 4,1 x 1010
Fortynding 2 15 μL dil. 1 60 μLH2O 5 x 50 x 8,2 x 109
Fortynding 3 20 μL dil. 2 80 μLH2O 5 x 250 x 1,6 x 109
Fortynding 4 20 μL Dil. 3 80 μLH2O 5 x 1250 x 3,3 x 108
Fortynding 5 20 μL Dil. 4 80 μLH2O 5 x 6250x 6,6 x 107
Fortynding 6 20 μL Dil. 5 80 μLH2O 5 x 31250 x 1,3 x 107
Fortynding 7 20 μL dil. 6 80 μLH2O 5 x 156250 x 2,6 x 106
Fortynding 8 20 μL dil. 6 80 μLH2O 5 x 781250 x 5,24 x 105
Fortynding 9 20 μL Dil. 7 80 μLH2O 5 x 3906250 x 1,05 x 105

Tabel 3: qPCR-fortyndingstabel.

Reagens Lydstyrke Lager Endelig koncentration
RPMI-1640 420 ml 1 x 84%
FCS, varmeinaktiveret 50 ml 1 x 10%
Antibiotikum/Antimykotisk 5 ml 100 x 1 x
Glutamin 5 ml 200 mM 2 mM
Natriumpyruvat 5 ml 100 mM 1 mM
HEPES 5 ml 1 m 10 mM
2-B-mercapto-ethanol 550 μL 55 mM 55 μM
Ikke-essentielle aminosyrer 5 ml 100 x 1 x
Insulin-Transferin-Selen 5 ml 100 x 1 x

Tabel 4: B-cellekulturmedium.

Reagens Fortynding Lager Endelig koncentration
MegaCD40L 1:1000 100 μg/ml 100 ng/ml
CpG ODN 1:300 1 mg/ml 3,33 μg/ml
Menneskelig BAFF 1:1000 40 μg/ml 40 ng/ml
Humant IL-2 1:1000 50 μg/ml 50 ng/ml
Humant IL-10 1:1000 50 μg/ml 50 ng/ml

Tabel 5: B-cellestimulerende midler.

Antistof Klon Fortynding Endelig konc.
anti-human CD3 FN-18 1:40 2,5 μg/ml
anti-human CD8a RPA-T8 1:200 2,5 μg/ml
anti-human CD14 M5E2 1:200 2,5 μg/ml
anti-human CD16 3G8 1:200 2,5 μg/ml
anti-human CD33 AC104.3E3 1:50 1 prøve
anti-human CD64 10.1 1:800 0,625 μg/ml
anti-human CD66 TET2 1:11 1 prøve
anti-human CD89 A59 1:800 0,625 μg/ml

Tabel 6: Antistoffer til valgfri nedbrydning af ikke-B-celler.

Reagens Type/klon Fortynding/koncentration under arbejde
anti-human CD14 AlexaFluor647 M5E2 1:50
anti-menneskelige CD16 AlexaFluor700 3G8 1:50
anti-human CD20 PECy7 2H7 1:50
anti-human CD3 PE SP34-2 1:50
Zombie-NIR - 1:500
anti-human HLA-DR BV605 L243 1:200
anti-human Ig lyskæde lambda APC MHL-38 1:50
anti-human Kappa Light Chain FITC polyklonal 1:500
anti-human IgM BV421 MHM-88 1:50
RC1-antigen, tilfældigt biotinyleret - 5 μg/ml
Streptavidin-PE - 1:500

Tabel 7: Flowcytometriske reagenser til analyse.

Figure 1
Figur 1: Skematisk oversigt over rAAV6-produktion og genredigering af primære rhesusmakak-B-celler. Protokollerne er opdelt i rAAV6-produktion (trin 1) og genredigering af rhesusmakakke B-celler (trin 2-5), herunder et valgfrit trin til udtømning af ikke-B-celler (trin 4). Trin i protokollerne er angivet med røde cirkler. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Høje rAAV6-udbytter ved hjælp af en selvhæmmende adenoviral hjælper. rAAV6 blev fremstillet ved hjælp af de her beskrevne metoder (pAAV-transfektion [TF] + selvhæmmende hjælper RepCap6, selvhæmmende adenoviral hjælper) eller typisk hjælperfri tredobbelt transfektion af pAAV, pHelper og pRepCap6 (pRC6). rAAV6 blev kun renset fra cellesupernatanten. Metoderne, der anvendte de selvhæmmende adenovirale hjælpervektorer, producerede 30-40 gange mere rAAV titeret af qPCR, som beskrevet ovenfor. Hver prik repræsenterer en individuel rAAV-produktion ved hjælp af forskellige pAAV-konstruktioner fra 2 til 20 uafhængige eksperimenter. Middelværdien ± SEM er plottet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: B-celleberigelse ved negativ udtømning af ikke-B-celler. Rhesus makak B-celler blev beriget fra PBMC'er ved hjælp af den beskrevne protokol og beriget til 90% renhed. Input og output før berigelse efter tilsætning vises. Gated på live, singlet PBMC'er. Repræsentant for fem uafhængige eksperimenter. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Målretningsstrategi anvendt til redigering af B-cellereceptorspecificiteten af rhesusmakakke B-celler. rAAV6 blev produceret indeholdende HDRT afbildet. HDRT består af en 266 bp 5' homologiarm, efterfulgt af 111 bp rhesusmakak IGHM exon 1 splejsningsacceptor, derefter en GSG-linker med en Thosea asigna-virus selvspaltende 2A-peptidsekvens (T2A), efterfulgt af en ledersekvens og den komplette lyskæde af rhesusmakakantistof Ab1485 som rhesusmakak IGLC1. Dette efterfølges af et furinspaltningssted, en GSG-linker og en svineteschovirus selvspaltende 2A-peptidsekvens (Furin-P2A) efterfulgt af en anden ledersekvens og Ab1485-tungkædevariablen efterfulgt af 52 bp rhesusmakak IGHJ4-splejsningsdonorsekvens for at tillade splejsning i nedstrøms antistoftunge kædekonstante regioner og en 514 bp homologiarm. Denne konstruktion blev målrettet mod IGH-locus mellem det sidste IGHJ-gen og Eμ-forstærkeren ved hjælp af sgRNA-målsekvensen GAGATGCCAGAGCAAACCAG. Begge homologiarme blev designet til at ende på skærestedet for dette sgRNA, hvilket fjernede målsekvensen og muliggjorde optimal integrationseffektivitet. For at opretholde allelisk udelukkelse og ekspression af en enkelt B-cellereceptor slettede vi samtidig endogene lyskæder ved hjælp af sgRNA'er rettet mod rhesusmakakken IGKC med målsekvensen GGCGGGAAGATGAAGACAGA og IGLC1, IGLC2, IGLC3, IGLC6 og IGLC7S ved hjælp af målsekvensen CTGATCAGTGACTTCTACCC. HDRT omfattede tavse mutationer, der forhindrede spaltningen af IGLC1-sekvensen af dette sgRNA. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Genredigering af primære rhesusmakakke B-celler. (A) Primære splenocytter (toppanel) eller PBMC'er (nederste panel) fra samme rhesusmakak blev dyrket uden udtømning af ikke-B-celler og redigeret som beskrevet ovenfor. Målretningsstrategien var som vist i figur 4. To dage efter elektroporation blev cellerne høstet og overfladefarvet til flowcytometrisk analyse. Den venstre kolonne blev lukket på singletceller, og de andre kolonner blev derefter gated, som angivet i øverste række. Cellernes levedygtighed, renheden af B-cellerne, deletionseffektiviteten af lyskæderne og Ab1485's knock-in-effektivitet ved farvning med det specifikke antigen RC141 er indikeret i ubehandlet, RNP-transfekterede eller RNP-transfekterede + rAAV6-transducerede prøver (MOI = 5 x 105). Repræsentant for seks uafhængige eksperimenter med celler fra forskellige rhesusmakakaber. (B) IgM-ekspression på dyrkede rhesusmakak-B-cellekontroller eller efter redigering og (C) geometrisk gennemsnitlig fluorescensintensitet (gMFI) af IgM på B-celler, der ikke har mistet Ig-ekspression på grund af IgLC- og IgKC-målretning (uredigeret) eller B-celler, der binder det forventede antigen (redigeret). Den røde prik angiver gMFI for dyrkede utransfekterede kontrol-B-celler. angiver p < 0,0001 i en parret t-test. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Effekter af DMSO, langvarig koncentreret inkubation med rAAV6 HDRT, rAAV-batchkvalitet og reproducerbarhed blandt forskellige donor-NHP'er på genredigeringseffektivitet i primære rhesusmakakke B-celler . (A) Splenocytter blev dyrket og redigeret som beskrevet. Efter elektroporation blev 5 x 105 celler dyrket i medium med eller uden 1% DMSO og inkuberet i 50 μL medium indeholdende rAAV6 HDRT ved en MOI på 5 x 10 5 i enten 2 timer eller5 timer før tilsætning af yderligere 450 μL medium. Cellerne blev analyseret 2 dage efter elektroporation ved flowcytometri, som i figur 5. Repræsentant for fire uafhængige eksperimenter. (B) Kvantificering af (A) over fire uafhængige forsøg. Prikkerne angiver tekniske replikationer med transfektionsindstillinger på 1.350 V, 10-20 ms og 1 pulselektroporationsvarighed og DMSO-koncentrationer fra 0,75% -1,25%. (C) Gennemsnitlig foldændring i redigeringseffektivitet fra (B). * p > 0,05 i Mann-Whitney U test. (D) Redigering af effektivitet i forhold til uafhængige eksperimenter med forskellige makaker ved hjælp af en kommerciel rAAV6-batch med lavere effektivitet. (E) Redigeringseffektivitet ved hjælp af to forskellige kommercielle batcher af rAAV6, hvori den samme konstruktion blev pakket i B-cellerne i to forskellige NHP'er i det samme eksperiment. Prikkerne angiver tekniske replikater med transfektionsindstillinger på 1.350 V, 10-20 ms og 1 pulselektroporation. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

De protokoller, der præsenteres her, giver en hurtig og effektiv metode til at generere høje udbytter og titere af rAAV6'er som HDRT'er og nye metoder til effektivt at genredigere primære rhesusmakakke B-celler in vitro.

rAAV6-produktionsprotokollen er forholdsvis enkel og hurtig, hvilket muliggør produktion og test af mange forskellige konstruktioner samtidigt uden overdreven arbejdskraft. Hvis det ønskes, kan rAAV6 renses yderligere ved hjælp af etablerede protokoller såsom iodixanol gradient ultracentrifugering34 eller vandig tofasedeling35 før bufferudveksling og koncentration.

Selvom det reducerede det samlede udbytte, valgte vi kun at bruge serumreduceret cellekulturmedium til rAAV6-oprensning i stedet for oprensning fra cellepellet, da størstedelen af rAAV6 frigives i mediet36, og oprensning fra cellepillen tilføjer flere omkostninger og arbejdskraft. Anvendelsen af den selvinaktiverende adenovirale hjælper øgede udbyttet 30-40 gange i gennemsnit, hvilket gjorde det muligt at teste konstruktioner pakket i AAV6 i en enkelt 15 cm skål. Selvom vores oprensningsmetode er grundlæggende, opnår vi ved hjælp af denne metode relativt lidt batch-til-batch-variation i genredigeringseffektivitet eller cellelevedygtighed efter transduktion ved hjælp af forskellige cellelinjer eller andre primære celler (data ikke vist).

Vi udviklede en rhesus macaque B-cellerensningsprotokol for at opnå uberørte primære B-celler ved hjælp af den negative udtømning af uønskede populationer. Selvom det ikke er nødvendigt for genredigering af disse celler, giver det en måde at opnå en relativt ren population af primære rhesusmakakke B-celler til denne eller andre applikationer, hvis andre celletyper forstyrrer de eksperimentelle mål. Imidlertid kommer renhed på bekostning af reducerede samlede B-celleudbytter. Især for både de berigede og ikke-berigede B-cellekulturer er fraktionen af B-celler i de indledende PBMC- eller splenocytpræparater afgørende. Især for PBMC'er anbefaler vi at screene forskellige makaker for personer med en høj procentdel af B-celler i perifert blod for at opnå et stort antal B-celler til forsøg, da denne værdi kan variere dramatisk mellem individer27. PBMC'er kan opnås ved regelmæssig blødning eller leukaferese42.

Genredigeringsprotokollen fører til effektiv genredigering, typisk mellem 60%-80% af knock-out og 5%-20% af knock-in B-celler, selvom vi har opnået op til 90% BCR knock-out og 40% BCR knock-in B-celler (figur 5 og figur 6).

De vigtigste parametre for effektiv redigering af rhesusmakakke B-celler er skæreeffektiviteten af sgRNA'et, elektroporationsparametrene, MOI og kvaliteten af rAAV6-præparatet. Skæreeffektiviteten af kandidat-sgRNA'er bør bestemmes empirisk for at muliggøre optimal redigering og design af HDRT. De elektroporationsparametre, der præsenteres her, balancerer effektivitet med levedygtighed for at opnå det maksimale samlede antal redigerede B-celler snarere end den højeste procentdel af redigerede B-celler. Hvis der kræves en højere procentdel af redigerede celler, anbefales øgede spændinger (op til 1.750 V) eller ændrede pulslængder (10-30 ms), selvom der kan observeres mere celledød. Vi bemærkede også lidt højere redigeringseffektivitet i milt-B-celler sammenlignet med B-celler fra PBMC'er fra samme person (figur 5); Den underliggende årsag til dette er dog i øjeblikket ukendt.

Vi fandt, at tilsætningen af 1% DMSO efter elektroporation signifikant øgede genredigeringseffektiviteten med ~ 40% i rhesus macaque B-celler uden at påvirke cellelevedygtigheden (figur 6A-C), i overensstemmelse med rapporter i andre celler43. Imidlertid bør udvidet dyrkning i 1% DMSO undgås og kan påvirke cellelevedygtigheden. DMSO kan udelades helt, hvis det ønskes.

Kulturen af cellerne i et lille volumen efter elektroporation i flere timer sammen med rAAV6 fører til højere redigeringseffektivitet, sandsynligvis på grund af den bedre transduktion af HDRT af rAAV6 og dermed den højere intracellulære koncentration af HDRT på det relevante tidspunkt, hvor Cas9 er aktiv. Vi fandt ud af, at dyrkning af cellerne på denne måde i op til 8 timer ikke påvirkede cellelevedygtigheden, men redigeringseffektiviteten steg ikke dramatisk ud over 5 timer (figur 6). Hvis der kun kræves knock-out i stedet for knock-in, kan dette trin udelades.

Afslutningsvis præsenterer vi omfattende protokoller til genredigering af rhesus macaque B-celler in vitro og produktion af rAAV6 HDRT, der er nødvendig for effektiv knock-in af ønskede konstruktioner. Disse protokoller muliggør hurtig, omkostningseffektiv testning af mange konstruktioner pakket som rAAV6 og muliggør præklinisk test af gennemførligheden og skalerbarheden af B-celleterapier i en mere relevant ikke-human primatmodel.

Disclosures

Der erklæres ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Harry B. Gristick og Pamela Bjorkman for at levere RC1-antigenet og hele Nussenzweig- og Martin-laboratorierne til kritisk diskussion. Dette arbejde blev støttet af The Bill and Melinda Gates Foundation-tilskud INV-002777 (til M.C.N.) og det intramurale forskningsprogram fra National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health. (R.G. og M.A.M). M.C.N. er en HHMI efterforsker.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL tube sterile, Dnase, Rnase and purogen free Stellar Scientific T17-125 or similar
10 mL serological pipette, polystyrene, sterile, nonpyrogenic, DNase-/RNase-free, and Human DNA-free Corning 4488 or similar
15 cm tissue culture dish Falcon 353025 or similar
15 mL polypropylene conical tybe Falcon 352097 or similar
25 mL serological pipette, polystyrene, sterile, nonpyrogenic, DNase-/RNase-free, and Human DNA-free Corning 4489 or similar
250 mL polypropylene conical tybe Corning 430776 or similar
293AAV cell line Cell Biolabs AAV-100
2-B-mercapto-ethanol, 55mM (1000x) Gibco 21985-023
48-well tissue culture plate Corning 3548 or similar
5 mL serological pipette, polystyrene, sterile, nonpyrogenic, DNase-/RNase-free, and Human DNA-free Corning 4487 or similar
5 mL syringes with Luer-Lok Tip BD 309646 or similar
50 mL polypropylene conical tybe Falcon 352070 or similar
50 mL serological pipette, polystyrene, sterile, nonpyrogenic, DNase-/RNase-free, and Human DNA-free Corning 4490 or similar
6-well tissue culture plate Falcon 353046 or similar
AAV-6 Packaging System (plasmids) Cell Biolabs VPK-406
AAV6 Reference Materials (full capsids) Charles River RS-AAV6-FL
Accu-jet S Pipette Controller Brand 26350 or similar pipette controller
Antibiotic/Antimycotic 100x Gibco 15260-062
anti-human CD14 AlexaFluor647 Biolegend 301812
anti-human CD14 biotin BioLegend 301826
anti-human CD16 AlexaFluor700 BD Biosciences 557920
anti-human CD16 biotin BioLegend 302004
anti-human CD20 PECy7 Biolegend 302312
anti-human CD3 biotin Thermo Fisher APS0309
anti-human CD3 PE BD Biosciences 552127
anti-human CD33 biotin Miltenyi 130-113-347
anti-human CD64 biotin BioLegend 305004
anti-human CD66 biotin Miltenyi 130-100-143
anti-human CD89 biotin BioLegend 354112
anti-human CD8a biotin BioLegend 301004
anti-human HLA-DR BV605 Biolegend 307640
anti-human Ig light chain lambda APC Biolegend 316610
anti-human IgM BV421 Biolegend 314516
anti-Human Kappa Light Chain FITC Fisher Scientific A18854
Autoclave Steris Amsco Lab 250 or similar
Cell culture CO2 incubator Fisher Scientific 51026331 or similar
Centrifugal Filter Unit (Amicon Ultra - 4, 100 kDa) Millipore UFC810024
Centrifuge 5920 R Eppendorf EP022628188 or any other, coolable swinging bucket centrifuge with inserts for 96-well plates, 15, 50 and 250 mL size tubes
Chloroform Fisher Scientific C298SK-4
Cpg ODN Invivogen tlrl-2395
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich 34869-500ML
DMEM, High Glucose Gibco 11965092
DNaseI (RNase-free) New England Biolabs M0303L
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco 14190144
Electroporation kit (Neon Transfection System 10 µL) Fisher Scientific MPK1096 or other sizes or 100 uL transfection kit MPK 10096
Electroporation system (Neon Transfection System) Fisher Scientific MPK5000
FCS Hyclone SH30910.03*
Ficoll-PM400 (Ficoll-Paque PLUS) Cytiva 17144002 or similar
Fume Hood Fisher Scientific FH3943810244 or similar
Glutamine 200 mM Gibco 25030-081
Graduated Cylinder 1L Corning 3022-1L or similar
Hemocytometer Sigma-Aldrich Z375357-1EA or similar
HEPES 1M Gibco 15630-080
HEPES 1M Gibco 15630-080
Hot Plate Magnetic Stirrer Fisher Scientific SP88857200 or similar
Human BAFF Peprotech  310-13
Human BD Fc Block BD 564220
Human IL-10 Peprotech  200-10
Human IL-2 Peprotech  200-02
Hydrochloric acid Fisher Scientific A144S-500
Hydrophilic Polyethersulfone Syringe Filters, (Supor membrane), Sterile - 0.2 µm, 25 mm  Pall 4612
Insulin-Transferin-Selenium, 100x Gibco 41400-045
ITR primer forward: GGAACCCCTAGTGATGGAGTT Integrated DNA Technologies custom
ITR primer reverse: CGGCCTCAGTGAGCGA Integrated DNA Technologies custom
Laminar flow biosafety cabinet The Baker Company SG403A or similar
Large magnetic depletion (LD) Column Miltenyi Biotec 130-042-901
Magentic seperator (MidiMACS separator and multistand) Miltenyi Biotec 130-090-329
Magnetic stir bar Fisher Scientific 14-512-127 or similar
Magnetic streptavidin beads (Streptavidin MicroBeads) Miltenyi Biotec 130-048-101
Maxiprep kit Machery-Nagel 740414.5 or similar
Media Bottles 2L with cap Cole-Parmer UX-34514-26 or similar
MegaCD40L Enzo ALX-522-110-C010
MicroAmp Optical 384-well Reaction Plate Fisher Scientific 4309849
MicroAmp Optical Adhesive Film Fisher Scientific 4311971
Microcentrifuge 5424 R Eppendorf 5404000014 or any other table top centrifuge for 1.5 mL tubes
Microwave oven Panasonic NN-SD987SA or similar
Nikon TMS Inverted Phase Contrast Microscope Nikon TMS or any other Inverted phase-contrast microscope for cell culture
Non-essential amino acids, 100x Gibco 11140-050
Nuclease-free Duplex buffer Integrated DNA Technologies 11-01-03-01
Nuclease-free Water Qiagen 129115
pH meter Mettler Toledo 30019028 or similar
Pipetman Classic Starter Kit, 4 Pipette Kit, P2, P20, P200, P1000 and tips Gilson F167380 or similar set of pipettes and tips
Pluronic F-68 10 % Gibco 24040-032
Polyethylene Glycol 8000 Fisher Scientific BP233-1
Polyethylenimine, Linear, MW 25000, Transfection Grade (PEI 25K Polysciences 23966-100
Precision Balance Mettler Toledo ME4001TE or similar
Pre-Separation Filters (30 µm) Miltenyi Biotec 130-041-407
Pyrex glass beaker 2 L Cole-Parmer UX-34502-13 or similar
Pyrex glass beaker 250 mL Millipore Sigma CLS1000250 or similar
qPCR Instrument Fisher Scientific 4485691 or similar
RC1 antigen randomly biotinylated Bjorkman lab, CalTech in house
RPMI-1640 Gibco 11875-093
S.p. Cas9 Nuclease Integrated DNA Technologies 1081059
Scientific 1203 Water Bath VWR 24118 or any water bath set to  37 °C
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653-5KG
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S8045-500G
Sodium Pyruvate 100 mM Gibco 11360-070
Sterile Disposable Filter Units with PES Membranes Thermo Scientific Nalgene  567-0020 
Streptavidin-PE BD Biosciences 554061
SYBR Green Master Mix  Fisher Scientific A25742
Tetracycline-enabled, self-silencing adenoviral vector RepCap6  Oxgene TESSA-RepCap6
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250061
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300054
Water Purification System Millipore Sigma ZEQ7000TR or similar
Zombie-NIR Biolegend 423106

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Victora, G. D., Nussenzweig, M. C. Germinal centers. Annual Review of Immunology. 40, 413-442 (2022).
  2. Plotkin, S. A. Correlates of protection induced by vaccination. Clinical and Vaccine Immunology. 17 (7), 1055-1065 (2010).
  3. Brinkmann, V., Heusser, C. H. T cell-dependent differentiation of human B cells into IgM, IgG, IgA, or IgE plasma cells: High rate of antibody production by IgE plasma cells, but limited clonal expansion of IgE precursors. Cellular Immunology. 152 (2), 323-332 (1993).
  4. Chernecky, C. C., Berger, B. J. Protein Electrophoresis - Serum., 6th edition. , Elsevier Saunders. St Louis, MO. 917-920 (2013).
  5. Balazs, A. B., et al. Antibody-based protection against HIV infection by vectored immunoprophylaxis. Nature. 481 (7379), 81-84 (2011).
  6. Greiner, V., et al. CRISPR-mediated editing of the B cell receptor in primary human B cells. iScience. 12, 369-378 (2019).
  7. Hartweger, H., et al. HIV-specific humoral immune responses by CRISPR/Cas9-edited B cells. Journal of Experimental Medicine. 216 (6), 1301-1310 (2019).
  8. Huang, D., et al. Vaccine elicitation of HIV broadly neutralizing antibodies from engineered B cells. Nature Communications. 11, 5850 (2020).
  9. Jeske, A. M., Boucher, P., Curiel, D. T., Voss, J. E. Vector strategies to actualize B cell-based gene therapies. Journal of Immunology. 207 (3), 755-764 (2021).
  10. Nahmad, A. D., et al. In vivo engineered B cells secrete high titers of broadly neutralizing anti-HIV antibodies in mice. Nature Biotechnology. 40 (8), 1241-1249 (2022).
  11. Nahmad, A. D., et al. Engineered B cells expressing an anti-HIV antibody enable memory retention, isotype switching and clonal expansion. Nature Communications. 11, 5851 (2020).
  12. Voss, J. E., et al. Reprogramming the antigen specificity of B cells using genome-editing technologies. eLife. 8, 42995 (2019).
  13. Pesch, T., et al. Molecular design, optimization, and genomic integration of chimeric B cell receptors in murine B cells. Frontiers in Immunology. 10, 2630 (2019).
  14. Cheong, T. C., Compagno, M., Chiarle, R. Editing of mouse and human immunoglobulin genes by CRISPR-Cas9 system. Nature Communications. 7, 10934 (2016).
  15. Rogers, G. L., Cannon, P. M. Genome edited B cells: A new frontier in immune cell therapies. Molecular Therapy. 29 (11), 3192-3204 (2021).
  16. Hung, K. L., et al. Engineering protein-secreting plasma cells by homology-directed repair in primary human B cells. Molecular Therapy. 26 (2), 456-467 (2018).
  17. Johnson, M. J., Laoharawee, K., Lahr, W. S., Webber, B. R., Moriarity, B. S. Engineering of primary human B cells with CRISPR/Cas9 targeted nuclease. Scientific Reports. 8, 12144 (2018).
  18. Wu, C. M., et al. Genetic engineering in primary human B cells with CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins. Journal of Immunological Methods. 457, 33-40 (2018).
  19. Luo, B., et al. Engineering of alpha-PD-1 antibody-expressing long-lived plasma cells by CRISPR/Cas9-mediated targeted gene integration. Cell Death and Disease. 11 (11), 973 (2020).
  20. Laoharawee, K., et al. Genome engineering of primary human B cells using CRISPR/Cas9. Journal of Visualized Experiments. (165), e61855 (2020).
  21. Laoharawee, K., Johnson, M. J., Moriarity, B. S. CRISPR/Cas9-mediated genome engineering of primary human B cells. Methods in Molecular Biology. 2115, 435-444 (2020).
  22. Moffett, H. F., et al. B cells engineered to express pathogen-specific antibodies protect against infection. Science Immunology. 4 (35), (2019).
  23. Hartweger, H., Nussenzweig, M. C. CRISPR comes a-knock-in to reprogram antibodies in vivo. Nature Biotechnology. 40 (8), 1183-1184 (2022).
  24. Nishimura, Y., Martin, M. A. Of mice, macaques, and men: Broadly neutralizing antibody immunotherapy for HIV-1. Cell Host & Microbe. 22 (2), 207-216 (2017).
  25. Shedlock, D. J., Silvestri, G., Weiner, D. B. Monkeying around with HIV vaccines: Using rhesus macaques to define 'gatekeepers' for clinical trials. Nature Reviews Immunology. 9 (10), 717-728 (2009).
  26. Kreuser, S., et al. Efficient methods for generation and expansion of, and gene delivery to rhesus macaque plasma B cells. bioRxiv. , (2021).
  27. Gujer, C., Sundling, C., Seder, R. A., Karlsson Hedestam, G. B., Lore, K. Human and rhesus plasmacytoid dendritic cell and B-cell responses to Toll-like receptor stimulation. Immunology. 134 (3), 257-269 (2011).
  28. Kim, J. S., et al. Cell enrichment-free massive ex-vivo expansion of peripheral CD20(+) B cells via CD40-CD40L signals in non-human primates. Biochemical and Biophysical Research Communications. 473 (1), 92-98 (2016).
  29. Su, W., et al. Self-attenuating adenovirus enables production of recombinant adeno-associated virus for high manufacturing yield without contamination. Nature Communications. 13, 1182 (2022).
  30. Endo, Y., et al. Short- and long-term clinical outcomes in rhesus monkeys inoculated with a highly pathogenic chimeric simian/human immunodeficiency virus. Journal of Virology. 74 (15), 6935-6945 (2000).
  31. Balaphas, A., Buchs, N. C., Meyer, J., Hagen, M. E., Morel, P. Partial splenectomy in the era of minimally invasive surgery: The current laparoscopic and robotic experiences. Surgical Endoscopy. 29 (12), 3618-3627 (2015).
  32. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  33. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: Expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
  34. Strobel, B., Miller, F. D., Rist, W., Lamla, T. Comparative analysis of cesium chloride- and iodixanol-based purification of recombinant adeno-associated viral vectors for preclinical applications. Human Gene Therapy Methods. 26 (4), 147-157 (2015).
  35. Guo, P., et al. Rapid and simplified purification of recombinant adeno-associated virus. Journal of Virological Methods. 183 (2), 139-146 (2012).
  36. Vandenberghe, L. H., et al. Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing. Human Gene Therapy. 21 (10), 1251-1257 (2010).
  37. Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
  38. Conant, D., et al. Inference of CRISPR edits from Sanger trace data. The CRISPR Journal. 5 (1), 123-130 (2022).
  39. Wilkinson, A. C., et al. Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice. Nature Communications. 12, 686 (2021).
  40. Wang, Z., et al. A broadly neutralizing macaque monoclonal antibody against the HIV-1 V3-Glycan patch. eLife. 9, 61991 (2020).
  41. Escolano, A., et al. Immunization expands B cells specific to HIV-1 V3 glycan in mice and macaques. Nature. 570 (7762), 468-473 (2019).
  42. Pathiraja, V., Matar, A. J., Gusha, A., Huang, C. A., Duran-Struuck, R. Leukapheresis protocol for nonhuman primates weighing less than 10 kg. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 52 (1), 70-77 (2013).
  43. Stratigopoulos, G., De Rosa, M. C., LeDuc, C. A., Leibel, R. L., Doege, C. A. DMSO increases efficiency of genome editing at two non-coding loci. PLoS One. 13 (6), 0198637 (2018).

Tags

Denne måned i JoVE udgave 192 B-celler genredigering genomteknik CRISPR / Cas9 adeno-associeret virus rhesusmakak ikke-menneskelig primat celleterapi
Genredigering af primære Rhesus Macaque B-celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hartweger, H., Gautam, R.,… More

Hartweger, H., Gautam, R., Nishimura, Y., Schmidt, F., Yao, K. H., Escolano, A., Jankovic, M., Martin, M. A., Nussenzweig, M. C. Gene Editing of Primary Rhesus Macaque B Cells. J. Vis. Exp. (192), e64858, doi:10.3791/64858 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter