Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול תרבית תלת-ממדית יעיל, קל ומהיר ליצירת ספרואידים של שני קווי תאים של דגי זברה (Danio rerio): ZEM2S (עובר) ו-ZFL (הפטוציטים רגילים).
Abstract
קווי תאי דגים מבטיחים מודלים במבחנה להערכת רעילות אקולוגית; עם זאת, למערכות תרבית חד-שכבתיות קונבנציונליות (תרבית דו-ממדית) יש מגבלות ידועות (למשל, אריכות ימים בתרבית ותחזוקה של חלק מהתפקודים התאיים in vivo ). לפיכך, הוצעו תרביות תלת-ממדיות, כגון ספרואידים, שכן מודלים אלה יכולים לשחזר מבנים דמויי רקמות, וללכוד טוב יותר את תנאי in vivo . מאמר זה מתאר פרוטוקול תרבית תלת-ממדית יעיל, קל ומהיר ליצירת ספרואידים עם שני קווי תאים של דגי זברה (Danio rerio): ZEM2S (עובר) ו-ZFL (הפטוציטים רגילים). הפרוטוקול מורכב מציפוי התאים בצלחת בעלת תחתית עגולה, נמוכה במיוחד, בעלת 96 בארות. לאחר 5 ימים תחת רעידות מסלוליות (70 סל"ד), נוצר ספרואיד יחיד לכל באר. הספרואידים שנוצרו מציגים גודל וצורה יציבים, ושיטה זו מונעת היווצרות של ספרואידים מרובים בבאר; לכן, אין צורך לבחור ידנית ספרואידים בגדלים דומים. הקלות, המהירות ויכולת השחזור של שיטה ספרואידית זו הופכים אותה לשימושית עבור בדיקות מבחנה בעלות תפוקה גבוהה.
Introduction
ספרואידים הם כדורים קטנים של תאים הנוצרים כאשר תאים מתורבתים במגע קרוב בין תאים בתרבית תלת-ממדית. היכולת של ספרואידים לחקות את סביבת הרקמה in vivo כבר נחקרה במגוון קווי תאים ותאים ראשוניים 1,2. עם זאת, למרות שספרואידים מפותחים היטב עבור מחקרי רעילות יונקים, הפיתוח של ספרואידים למחקרי רעילות עם בעלי חוליות שאינם יונקים (למשל, דגים) עדיין בעיצומו3. עבור קווי תאי דגים, ספרואידים פותחו במגוון שיטות שונות, כגון טלטול אורביטלי (OS) באמצעות סוגים שונים של לוחות באר 3,4,5,6,7, ושיטת הריחוף המגנטי באמצעות ננו-חלקיקים מגנטיים 8. עם זאת, חלק משיטות התרבית הללו עבור ספרואידים עשויים להיות בעלי חסרונות רבים יותר מאחרים.
לדוגמה, שיטות גירטוריות במיקרו-צלחות גדולות (צלחות של 24 בארות) עשויות ליצור מספר גבוה של ספרואידים השונים זה מזה בגודל ובצורה; ואכן, הודגמה היווצרות מבנה רב-ספרואידי7. זה דורש מאמצים אינטנסיביים לבחור ספרואידים עם גודל וצורה דומים לניסוי. שיטת תרבית תלת ממדית של טיפה תלויה משמשת בדרך כלל ליצירת ספרואידים של קווי תאים של יונקים 1,2,9,10,11, לפיה ניתן ליצור ספרואידים בודדים בכל טיפה, תוך הימנעות מהבעיות שתוארו לעיל. עם זאת, למרות ששיטת נפילה תלויה שונה (טיפה תלויה + טלטול מסלולי) מסוגלת לייצר ספרואידים ZFL בשיטה זולה, יש לה חסרונות12. הצברים התאיים שנוצרו אינם יכולים להישמר לפרקי זמן ארוכים בטיפות; לכן, הם צריכים להיות מועברים צלחות היטב. תהליך זה דורש טיפול אינטנסיבי ופרקי זמן ארוכים של עבודה במכסה מנוע זרימה למינרית, שכן הוא מבוצע באמצעות מיקרופיפטה12. בנוסף, שיטה זו דורשת 10 ימים כדי ליצור באופן מלא את הספרואידים ZFL (5 ימים טיפה תלויה + 5 ימים במערכת ההפעלה)12. חסרונות אלה יכולים להגביל את היישום של כדורי דגים תלת-ממדיים לבדיקת רעילות, במיוחד בהתחשב ביישומים פוטנציאליים לתעדוף כימי וקיימות המוצר.
לפיכך, מאמר זה מתאר פרוטוקול תרבית תלת-ממדי המסוגל ליצור ספרואידים בודדים של קווי תאים ZFL (D. rerio normal hepatocyte) ו-ZEM2S (D. rerio blastula phase fetryo) בהתבסס על שימוש משולב של לוחות חיבור 96 באר ואולטרה-נמוכים (לוחות ULA) ושייקר אורביטלי (קוטר סיבוב של 22 מ"מ). השיטה המיושמת היא פשוטה וניתנת לשחזור, ויכולה ליצור מספר גבוה של ספרואידים בגודל וצורה דומים בתקופה קצרה (5 ימים). היתרונות של שיטה זו יכולים לתמוך ביישום מודלים תלת ממדיים של דגים למחקרי רעילות ימית הן בתעשייה והן באקדמיה, כמו גם בהתקדמות יישום שיטות חלופיות לבדיקת רעילות אקולוגית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
שלבי המפתח ליצירת ספרואידים תלת-ממדיים של קווי תאים ZFL ו-ZEM2S בלוח עגול בעל תחתית עגולה של 96 בארות מוצגים באיור 1.
הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים המשמשים בפרוטוקול זה ובטבלה 1 עבור פתרונות ומדיית תרבות המשמשים בפרוטוקול זה.
1. תרביות מדיום וחד-שכבתיות של תרביות תאים
- לגדל את שני קווי התאים (ZFL, ZEM2S) כחד-שכבות באינקובטור ב-28°C ללאCO2, ולגדל אותם בתת-גידול ביחס של 1:3 כאשר הם מגיעים למפגש ~80%.
- התחל עם בקבוק T75 של תאי דג זברה במפגש ~80%, בתרבית כמתואר לעיל.
- הסר את המדיום המלא ושטוף את התאים על ידי הוספת 1x פוספט buffered מלוחים (PBS) (0.01 M) לבקבוק תרבית בעזרת פיפטה.
- בעזרת פיפטה, להוסיף 3 מ"ל של 1x טריפסין-0.5 mM EDTA (0.05% [v/v]) לצלוחיות התרבית, ולדגור ב 28 ° C במשך 3 דקות לניתוק תאים מן הצלוחית.
- טפחו בעדינות על הבקבוק כדי לשחרר את התאים, ולאחר מכן עצרו את עיכול הטריפסין על ידי הוספת 3 מ"ל של מדיום תרבית שלם לצלוחית.
- באמצעות פיפטה, להעביר את תרחיף התא לצינור צנטריפוגה חרוטי 15 מ"ל, וצנטריפוגה ב 100 × גרם במשך 5 דקות.
- לאחר היווצרות הכדור, בזהירות להסיר את supernatant, להוסיף 1 מ"ל של המדיום המלא עבור קו התא המתאים בשימוש (ZFL או ZEM2S), ו resuspend באמצעות micropipette. קח aliquot עבור ספירת תאים.
2. ספירת תאים עם בדיקת אי הכללת צבע כחול טריפאן
- הוסף 10 μL של תרחיף התא ו 10 μL של צבע כחול טריפאן למיקרו-צינורית כדי לספור את התאים ולהעריך את הכדאיות שלהם. מערבבים את תרחיף התא וצובעים בעזרת פיפטה.
- לאחר מכן, העבירו 10 μL של תערובת זו (תרחיף תאים + טריפאן כחול) לתא נויבאואר וספרו את התאים בארבעת הריבועים הגדולים (רבעים: Q) הממוקמים בפינות התא, בהתחשב בתאים שאינם תופסים כחול טריפאן כבני קיימא. חשב את מספר התאים בני קיימא באמצעות משוואה (1):
(1) - כדי לחשב את מספר התא הסופי בתרחיף התא, הכפל את מספר התא שנקבע באמצעות משוואה (1) ב- 2 (גורם הדילול עקב השימוש בכחול טריפאן).
הערה: לחלופין, ניתן להשתמש במערכת ספירת תאים אוטומטית.
(1)3. ציפוי תאים בצלחות ULA
- לאחר חישוב מספר התא, התאם את מתלה התא ללוח 200 μL של תרחיף זה לכל באר של לוחית ULA בעלת תחתית עגולה של 96 בארות עם מספר התאים הדרוש לכל קו תא, כמפורט להלן:
- צלחת 7,000 תאי ZFL קיימא / באר; לכן, עבור צלחת ULA כולה, להשתמש 700,000 תאים ב 20 מ"ל של תווך שלם.
- צלחת 3,500 תאי ZEM2S קיימא / באר; לכן, עבור צלחת ULA כולה, להשתמש 350,000 תאים ב 20 מ"ל של מדיום שלם.
- מכינים את תרחיף התא עם ריכוז התאים המותאם במאגר בינוני ומערבבים אותו באמצעות מיקרופיפטה רב ערוצית, תוך הקפדה שלא ליצור קצף או בועות. באמצעות מיקרופיפטה רב ערוצית, להוסיף 200 μL של תרחיף התא מותאם לכל באר של צלחת ULA.
הערה: הצלחת חייבת להיות אטומה עם ציפוי פרפילם או נייר איטום דבק כדי למנוע אידוי בינוני של תרבית מהצלחת בעלת 96 הקידוחים.
4. היווצרות ספרואידים
- לדגור את צלחת ULA על שייקר מסלול ב 70 סל"ד במשך 5 ימים באינקובטור 28 מעלות צלזיוס. אפשרו לכדוריות להיווצר במשך 5 ימים של רעידות מסלוליות (איור 2), ולהגיע לגודל ממוצע של ~225 מיקרומטר בקוטר (ספרואידים ZFL) וקוטר ~226 מיקרומטר (ספרואידים ZEM2S)12.
הערה: לאחר 5 ימי דגירה (מעגליות מרבית), הספרואידים מוכנים לשימוש. - כדי לשמור על הספרואידים בתרבית במשך יותר מ -5 ימים, להסיר 100 μL של המדיום בילה כל 5 ימים, ולהוסיף 100 μL של מדיום תרבית שלמה טרי באמצעות micropipette רב ערוצי.
הערה: יש להיזהר שלא לשאוף את הספרואידים במהלך תהליך זה.
5. מדידת גודל (קוטר) וצורה (אינדקס מעגליות) של ספרואידים
- רכוש את התמונות.
- תחת מיקרוסקופ אור הפוך עם מערכת לכידת הדמיה, קבל תמונה בקנה מידה מוגדר.
הערה: השתמש בשקופית כיול שלב במיקרוסקופ או בשקופית נויבאואר (שבה ידועים גדלי הרביע) כדי לקבל את קנה המידה. - תחת המיקרוסקופ ובאמצעות אותה עדשה אובייקטיבית המשמשת לקבלת תמונת הסולם, קבל תמונות של הספרואידים שנוצרו במלואם (כלומר, ספרואידים בני 5 ימים).
הערה: יש לצלם את כל התמונות באמצעות אותה מערכת לכידת הדמיה, מכיוון שרזולוציית התמונה חשובה לקביעת הגודל והצורה של הספרואידים, והיא עשויה להשתנות בין סוגי המערכות.
- תחת מיקרוסקופ אור הפוך עם מערכת לכידת הדמיה, קבל תמונה בקנה מידה מוגדר.
- הגדר את קנה המידה.
- באמצעות תוכנת ImageJ, פתח את התמונה של קנה המידה המוגדר (לחץ על קובץ | פתוח).
- בחרו בבורר הקו הישר מסרגל הכלים וגררו קו החוצה באמצעות העכבר לאורך ההרחבה של קנה המידה שהוגדר בתמונה.
- הגדר את קנה המידה על-ידי בחירה באפשרות נתח | הגדר קנה מידה והמתן לפתיחת החלון הגדר קנה מידה .
- בחלון הגדרת קנה מידה , מלא את הריק של המרחק הידוע במרחק הידוע (μm) המתאים לקו הישר; מלא את יחידת האורך ב - um עבור μm. לחץ על אישור.
הערה: קנה המידה בפיקסלים/מיקרומטר מוצג בתחתית החלון.
- הגדר את פרמטרי המדידה.
- בתוכנת ImageJ, בחר נתח | הגדר מידות כדי לפתוח את החלון הגדרת מדידות .
- בחלון Set Measurements, בחרו בתיבות למדידות הרצויות (כלומר, מתארי שטח וצורה). לחץ על אישור.
- קבל את הקוטר והמעגליות של הספרואידים.
- פתח את התמונה של ספרואיד (קובץ | פתוח).
- בחרו בכלי הבחירה החופשית בסרגל הכלים ובעזרת העכבר בחרו את הצד החיצוני של הספרואיד, כפי שמודגם באיור 3A.
הערה: כדי להגדיל או להקטין את התצוגה של התמונה, הקש על מקש Ctrl והשתמש בעכבר כדי לגלול למטה או למעלה, או הקש על מקש Ctrl והשתמש במקשי החצים למעלה או למטה בלוח המקשים. - בחר נתח | מדידה כדי לפתוח את החלון 'תוצאות ', שבו מוצגים הערכים הנמדדים.
- באמצעות ערך השטח , חשב את הגודל (קוטר) של הספרואידים באמצעות משוואה (2):
(2) - מדד המעגליות ניתן בחלון התוצאות כ- "Circ.", ומחושב אוטומטית על ידי התוכנה באמצעות משוואה (3):
(3)
הערה: אינדקס המעגליות של 1.0 מייצג צורה כדורית מושלמת, בעוד שערך קרוב ל- 0.0 מציין צורה מוארכת13.
(2)
(3)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ספרואידים בודדים לכל באר עם גודל וצורה יציבים נוצרים בשיטה זו. איור 2 מדגים את תהליך ההיווצרות של ספרואידים בודדים של תאי ZFL ו-ZEM2S בבאר של צלחת ULA תחת טלטול אורביטלי (70 סל"ד). לקווי התאים ZFL ו-ZEM2S יש התנהגויות שונות בתרבית תלת-ממדית. קו התאים ZEM2S מציג תכונות שמעניקות את היכולת ליצור בקלות צורה ספרואידית מאז היום הראשון של הרעידה המסלולית (איור 2E), בעוד שקו תאי ZFL דורש 5 ימים כדי להגיע לצורה הכדורית הרצויה (איור 2A-C). הספרואידים שנוצרו בשיטה זו הראו גם יציבות במונחים של צורה בתקופות ארוכות יותר של תרבית (תקופות >5 ימים), כפי שהודגם באיור 2D (ספרואיד ZFL בן 16 יום) ובאיור 2H (ספרואיד ZEM2S בן 10 ימים). הקוטר והמעגליות של הספרואידים נקבעו על-ידי מדידת השטח המוקרן שלהם בתמונות שהתקבלו באמצעות תוכנה לעיבוד וניתוח תמונות מדעיות13 (איור 3). רשימת החומרים מציינת את התוכנה המשמשת לעיבוד וניתוח תמונה. תאי ZFL נוטים ליצור צברי תאים גדולים (גודל ממוצע 319 ± 23.33 מיקרומטר) ביום הראשון של הרעידה המסלולית, אשר פוחתת עם הזמן עד ליום 5 (225.62 ± 19.20 מיקרומטר) (איור 4A), מה שמשפר את המעגליות לאורך זמן בתרבית (איור 4B). שלא כמו תאי ZFL, קו תאי ZEM2S יוצר ספרואידים קטנים מהיום הראשון (202.64 ± 5.78 מיקרומטר), אשר גדלים בהדרגה עד יום 5 (226.63 ± 4.80 מיקרומטר) (איור 4C). איור 4E מראה את דפוסי הצמיחה השונים בקווי התאים ZFL ו-ZEM2S בתרבית תלת-ממדית. אנו ממליצים להשתמש בכדורואידים ZFL ו-ZEM2S ביום החמישי מאחר שהם מגיעים לצורה ספרואידית גבוהה יותר (מדד מעגליות של 0.80 ± 0.01 ו-0.83 ±-0.00, בהתאמה) (איור 4B,D), מה שמצביע על יציבות גדולה יותר של מודל תלת-ממדי זה.
איור 1: השלבים העיקריים ליצירת ספרואידים תלת-ממדיים של קווי תאים ZFL ו-ZEM2S בלוח עגול בעל תחתית עגולה של 96 בארות. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ספרואידים בודדים של קווי תאים ZFL ו-ZEM2S שנוצרו בלוחות ULA עגולים בעלי 96 בארות תחת טלטול מסלולי. צבירת תאי ZFL נוצרת ביום הראשון של מערכת ההפעלה (A). צבר התא מגביר את המעגליות שלו ביום השלישי (B) ומגיע לצורה כדורית נאותה ביום 5 (C). (D) ספרואיד ZFL בן 16 יום בצלחת ULA. קו התאים ZEM2S יוצר ספרואידים מהיום הראשון של מערכת ההפעלה (E). הספרואיד ZEM2S שומר על צורתו וגדל ביום השלישי (F), והמעגליות המקסימלית שלו מושגת ביום 5 (G). (H) ספרואיד ZEM2S בן 10 ימים בצלחת ULA. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצורים: OS = רעידות מסלוליות; ULA = חיבור נמוך במיוחד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: קביעת גודלם ומעגליותם של הספרואידים באמצעות תוכנה לעיבוד וניתוח תמונות מדעיות. לאחר הגדרת התוכנה למדידת אזור נבחר בהתבסס על קנה מידה ידוע, בחר את הצד החיצוני של הספרואיד כדי לקבוע את שטחו ואת מעגליותו (A). שטח הספרואיד משמש לקביעת גודלו על ידי חישוב הקוטר d, והתוכנה מספקת את המעגליות של הספרואיד על ידי נוסחה המשתמשת בשטח ובהיקף שנבחרו (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: יכולת השחזור של שיטת הספרואידים התלת-ממדית מוצגת על-ידי ספרואידים בגודל אחיד (קוטר) ומעגליות (צורה ספרואידית). הגודל הנמדד של ספרואידים של קווי התאים ZFL (A) ו- ZEM2S (B). מדד המעגליות הנמדד של ספרואידים ZFL (C) ו- ZEM2S (D). דפוס הצמיחה של ספרואידים ZFL ו- ZEM2S (E). הנתונים מייצגים שלושה עותקים משוכפלים טכניים מאצוות תאים שונות. המספרים מעל כל נקודה מציינים את ממוצע הטריפליקטים עבור ימים 1, 3 ו-5. הנתונים הראו כממוצע ± סטיית תקן (n = 10). נתון זה שונה מסוזה ואחרים 12. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: השוואה בין היווצרות ספרואידים ZFL ו-ZEM2S שבוצעו בשתי מהירויות סיבוב (70 ו-100 סל"ד). ספרואיד ZFL (A) וספרואיד ZEM2S (B) נוצרו לאחר 5 ימים של רעידות מסלוליות ב-100 סל"ד (פסי קנה מידה מייצגים 100 מיקרומטר). דפוס הצמיחה של ספרואידים ZFL (C) ו- ZEM2S ספרואידים (D) נוצר ב 70 ו 100 סל"ד. מדד המעגליות של ספרואידים ZFL (E) ו-ZEM2S (F) נוצר ב-70 ו-100 סל"ד. הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן (n = 10). *מציין מובהקות סטטיסטית (P < 0.05). נ.ס.: הבדל לא משמעותי (מבחן T) בין ספרואידים שנוצרו ביום 5 ב-70 ו-100 סל"ד. נתון זה שונה מסוזה ואחרים 12. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: שלמות התא ויכולת הקיום של ספרואידים ZFL ו-ZEM2S (בני 5 ימים) שנוצרו על-ידי רעידות מסלוליות בצלחת חיבור נמוכה במיוחד בעלת תחתית עגולה. צביעה של קרום התא על ידי Lectin Alexa Fluor 594 (אדום) וגרעינים על ידי DAPI (כחול) מדגימה את שלמות התא בליבה של ספרואיד ZEM2S (A) ו-ZFL spheroid (B). פלואורסצנטיות של resorufin (אדום) שנוצר על ידי הפחתה של Alamarblue מדגים תאים קיימא בליבה של שני ZEM2S (C) ו ZFL (D) spheroids. התמונות מייצגות מישורים אורתוגונליים שצולמו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. בדיקת כדאיות MTT בתרבית תלת-ממדית (ספרואידים) ובתרבית דו-ממדית של קו התאים ZEM2S (E) ו-ZFL (F). הנתונים הראו כממוצע ספיגה שנמדד ב 570 ננומטר ± סטיית תקן. ns: הבדל לא משמעותי לפי מבחן t של וולש. נתון זה שונה מ- Souza et al. (2021)12. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה 1: פתרונות לטיפוח ZFL ו-ZEM2S. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 2: השוואה בין שיטות הספרואידים התלת-ממדיות המשמשות ליצירת ספרואידים בודדים מסוג ZFL. * התוצאה הטובה ביותר עבור פרמטר נבדק. א הפרמטר שנבחר מהתוצאות הטובות ביותר מאומת בשיטת הטיפה התלויה הקונבנציונלית. b הפרמטר שנבחר מ- Baron et al.3 ליצירת ספרואיד דג עם טלטול מסלולי. ג וריאציות המתאימות באותה מידה לפרמטר שנבדק. קיצורים: HD = טיפה תלויה; OS = רעידות מסלוליות; ULA = חיבור נמוך במיוחד; poly-HEMA = poly(2-hydroxyethyl methacrylate). טבלה זו שונתה מ- Souza et al.12. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
זוהי שיטה פשוטה, קלה ומהירה ליצירת ספרואידים של קווי תאי כבד ועובר של דגי זברה. שיטה זו פותחה על ידי קבוצה זו בהתבסס על שינויים של שיטות ספרואידים תלת ממדיות קיימות כדי להתגבר על בעיות שדווחו במחקרים מדעיים הקשורים להיווצרות ספרואידים, כמו גם אי ודאויות בדיוק הנתונים מבדיקות ספרואידים תלת ממדיות. לדוגמה, הבעיות המדווחות נעוצות בקשיי טיפול, באופי הגוזל זמן של יצירת ספרואידים, בצורך לבחור ספרואידים בגודל ובצורה דומים לביצוע בדיקה, כמו גם קשיים בתהליך העברת הספרואידים מהטיפות למיקרו-צלחות בשיטת הטיפה התלויה 3,7,12. יתר על כן, פרוטוקול זה ממליץ על תרבית של קווי תאים ZFL ו- ZEM2S במצב נטול CO2. הרכב מדיום התרבית והסביבה נטולת CO2 המוצעים בפרוטוקול זה עבור שני קווי התאים מדווחים באופן נרחב בספרות. קו תאי ZFL הוא בדרך כלל בתרבית במדיה L-15 ו RPMI עם או בלי תוספת של סודיום ביקרבונט וללא CO2 14,15,16,17,18,19,20. קו תאי ZEM2S מתורבת על פי הוראות מרכז המשאבים הביולוגיים, ומצע התרבית שלו גובש עבור תרביות נטולותCO2; לכן, CO2 ותערובת אוויר יכול להיות מזיק לתאים בעת שימוש בסוג זה של מדיה תרבית21.
פרוטוקול ספרואיד הדגים הנוכחי פותח לאחר הערכת מספר פרמטרים (כלומר, צפיפות תאים שונה, מהירות טלטול מסלולית [70 או 100 סל"ד], ושימוש בלוחות שונים של 96 בארות [תחתית שטוחה או תחתית עגולה]) כדי לקבוע את הפרמטרים הטובים ביותר ליצירת ספרואידים ZFL. בנוסף, נערכה השוואה עם שיטות תרבית תלת-ממדיות אחרות (כלומר, שיטת הטיפה התלויה ושיטת הטיפה התלויה בשילוב עם שיטת ניעור מסלולי), מה שמצביע על כך שהניעור האורביטלי של לוחות ULA בעלי תחתית עגולה היה בעל הביצועים הטובים ביותר (כלומר, שיטה קלה, מהירה וניתנת לשחזור). טבלה 2 מציגה את הפרמטרים והביצועים של שיטות תרבית תלת-ממדיות אחרות שהוערכו ליצירת ספרואידים ZFL.
לוחות ULA בעלי תחתית עגולה כבר דווחו כיוצרים ספרואידים בודדים של תאים אנושיים ואחריהם צנטריפוגה22 או טלטול מסלולית23,24. בפרוטוקול זה, אנו מציעים להשתמש באותה לוחית, למעט תחת טלטול אורביטלי כדי ליצור ספרואידים בודדים של קווי תאים של דגי זברה (כלומר, ספרואיד אחד לכל באר של צלחת בת 96 בארות). זה יתרון במיוחד מכיוון שהוא יכול בקלות ובמהירות ליצור כמות טובה של ספרואידים, ואת הספרואידים שנוצרו ניתן לשמור בתרבית על אותה צלחת. לכן, חשיפה כימית יכולה להיעשות ישירות על צלחת ULA לבצע סוגים שונים של בדיקות רעילות.
על מנת לקבוע את מהירות הרעידה המסלולית המתאימה ליצירת ספרואידים ZFL ו-ZEM2S, השווינו את היווצרות הספרואידים ב-70 וב-100 סל"ד. התוצאות מראות כי שיטה זו מתפקדת טוב יותר ב-70 סל"ד, ומהירות סיבוב גבוהה יותר יכולה להשפיע באופן משמעותי על גודלם וצורתם של כדורי ZEM2S (איור 5D,F). ספרואידים ZFL לא הראו הבדלים משמעותיים בגודל ובצורה במהירויות סיבוב אלה; עם זאת, התקבלו מדדי מעגליות נמוכים יותר ב-100 סל"ד, שהראו השפעה שלילית בצורה ספרואידית במהירות סיבוב גבוהה יותר (איור 5C,E).
צפיפות התאים הראשונית של 3,500 תאי ZEM2S ו-7,000 תאי ZFL מייצרת ספרואידים בגדלים דומים ביום החמישי בתרבית (226.63 ו-225.62 מיקרומטר, בהתאמה). בהתחשב בכך שחמצן וחומרים מזינים מועברים על ידי דיפוזיה בספרואידים25, הקוטר שלהם עשוי להשפיע מאוד על התזונה ושלמות התא בליבת הספרואידים; באופן כללי, ספרואידים עד 100 מיקרומטר מומלץ למנוע ליבה נמקית26. כדי לאמת את שלמות התאים בליבת הספרואידים, הערכנו את שלמות הגרעין והממברנה על-ידי צביעה חיסונית עם DAPI ו-Lectin Alexa Fluor 594 באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי (איור 6A,B), והודגמה שלמות הספרואידים. הכדאיות התאית בליבת הספרואידים אומתה גם על-ידי חשיפתם לרזורין (Alamarblue) וניתוח הפלואורסצנטיות של רסורופין באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי (איור 6C,D). כאשר התאים הם קיימא, resazurin מופחת resorufin (חומר פלואורסצנטי) על ידי תפקוד מטבולי תאי. הביצועים של בדיקת MTT גם לא הדגימו הבדל משמעותי בכדאיות התא בהשוואה בין ספרואידים ZFL ו-ZEM2S לתרבית חד-שכבתית (תרבית דו-ממדית) (איור 6E,F). למרות הספרואידים גדולים מ -100 מיקרומטר, התוצאות מראות כי פרוטוקול זה מייצר ספרואידים קיימא של קווי תאים ZFL ו- ZEM2S עם תזונה נאותה אפילו בחלק הפנימי שלהם.
צפיפות התאים של תאי ZFL ו-ZEM2S ומהירות הרעידה המסלולית המיושמת בפרוטוקול זה אפשרו היווצרות של ספרואידים יציבים מאוד בגודל ובצורה, עם שונות נמוכה בין הבארות (איור 4), מה שנמנע מהצורך לבחור ספרואידים מתאימים כשלב קודם של ביצוע בדיקה. אם הליך הבדיקה דורש העברת הספרואידים לצלחות אחרות או צינור / מיקרו-צינורות, ניתן להעביר אותם בקלות עם מיקרופיפטה ללא בעיות דיסאגרגציה.
כאן, הדגמנו פרוטוקול שפותח על בסיס הפרמטרים הטובים ביותר ליצירת ספרואידים בני קיימא ZFL ו- ZEM2S. קווי התאים ZFL ו-ZEM2S עשויים להיות שימושיים בבדיקות רעילות ימית כדי להעריך השפעות כימיות על דגים 23,24,27,28,29,30. בנוסף, ניתן לחקור נקודות קצה התפתחותיות גם באמצעות קווי תאים עובריים של דגים, כגון קו תאי ZEM2S (תאים פיברובלסטים של שלב הבלסטולה), אשר שומרים על דרגת פלוריפוטנציה28. אלה הופכים את הספרואידים האלה לדגי זברה שעשויים להיות שימושיים לבדיקת רעילות דגים. יתר על כן, כשיטה קלה לכדורית דגים, ניתן להשתמש בה בבדיקות רעילות אקולוגית בתפוקה גבוהה, ולתמוך ביישומה בתעשייה ובאקדמיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.
Acknowledgments
לזכרו של ד"ר מרסיו לורנצ'יני, מחבר שותף של עבודה זו, חוקר מעולה בתחום הקוסמטיקה ומוקדש לקידום המחקר הקוסמטי בברזיל. המחברים אסירי תודה למעבדה מרובת המשתמשים במחלקה לפיזיולוגיה (UFPR) על זמינות הציוד ועל התמיכה הכספית של התיאום לשיפור כוח האדם להשכלה גבוהה (CAPES, ברזיל) (קוד האוצר 001) וה- Grupo Boticário.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate, Individually Wrapped, with Lid, Sterile | Corning | 7007 | |
| DMEM, powder, high glucose, pyruvate | Gibco | 12800-017 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, powder | Gibco | 21700026 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| Image Processing and analysis in Java (ImageJ) 1.52p software | National Institutes of Health, USA |
Available at: https://imagej.nih.gov/ij/index.html | |
| Leibovitz's L-15 Medium, powder | Gibco | 41300021 | |
| Orbital shaker | Warmnest | KLD-350-BI | 22 mm rotation diameter |
| Dulbeccos PBS (10x) with calcium and magnesium | Invitrogen | 14080055 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-014 | |
| FBS - Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | Gibco | 12657-029 | |
| Sodium bicarbonate, powder, bioreagent for molecular biology | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Trypan blue stain (0,4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 | |
| ZEM2S cell line | ATCC | CRL-2147 | This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J. Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA) |
| ZFL cell line | BCRJ | 256 |
References
- Elje, E., et al. The comet assay applied to HepG2 liver spheroids. Mutation Research. Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 845, 403033 (2019).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, N. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnology and Bioengineering. 83 (2), 173-180 (2003).
- Baron, M. G., Purcell, W. M., Jackson, S. K., Owen, S. F., Jha, A. N. Towards a more representative in vitro method for fish ecotoxicology: morphological and biochemical characterisation of three-dimensional spheroidal hepatocytes. Ecotoxicology. 21 (8), 2419-2429 (2012).
- Alves, R. F., Rocha, E., Madureira, T. V. Fish hepatocyte spheroids - A powerful (though underexplored) alternative in vitro model to study hepatotoxicity. Comparative Biochemistry and Physiology. Toxicology & Pharmacology. 262, 109470 (2022).
- Baron, M. G., et al. Pharmaceutical metabolism in fish: using a 3-D hepatic in vitro model to assess clearance. PloS One. 12 (1), 0168837 (2017).
- Langan, L. M., et al. Spheroid size does not impact metabolism of the β-blocker propranolol in 3D intestinal fish model. Frontiers in Pharmacology. 9, 947 (2018).
- Lammel, T., Tsoukatou, G., Jellinek, J., Sturve, J. Development of three-dimensional (3D) spheroid cultures of the continuous rainbow trout liver cell line RTL-W1. Ecotoxicology and Environmental Safety. 167, 250-258 (2019).
- Jeong, Y., et al. Differential effects of CBZ-induced catalysis and cytochrome gene expression in three dimensional zebrafish liver cellculture. Journal of Environmental and Analytical Toxicology. 6, 2161 (2016).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. (51), e2720 (2011).
- Lee, W. G., Ortmann, D., Hancock, M. J., Bae, H., Khademhosseini, A. A hollow sphere soft lithography approach for long-term hanging drop methods. Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (2), 249-259 (2010).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods in Molecular Medicine. 140, 141-151 (2007).
- de Souza, I. R., et al. Development of 3D cultures of zebrafish liver and embryo cell lines: a comparison of different spheroid formation methods. Ecotoxicology. 30 (9), 1893-1909 (2021).
- Ferreira, T., Rasband, W.
- Guidony, N. S., et al. ABC proteins activity and cytotoxicity in zebrafish hepatocytes exposed to triclosan. Environmental Pollution. 271, 116368 (2021).
- da Silva, N. D. G., et al. Interference of goethite in the effects of glyphosate and Roundup® on ZFL cell line. Toxicology In Vitro. 65, 104755 (2020).
- Yang, Y., et al. Temperature is a key factor influencing the invasion and proliferation of Toxoplasma gondii in fish cells. Experimental Parasitology. 217, 107966 (2020).
- Lopes, F. M., Sandrini, J. Z., Souza, M. M. Toxicity induced by glyphosate and glyphosate-based herbicides in the zebrafish hepatocyte cell line (ZF-L). Ecotoxicology and Environmental Safety. 162, 201-207 (2018).
- Lachner, D., Oliveira, L. F., Martinez, C. B. R. Effects of the water soluble fraction of gasoline on ZFL cell line: Cytotoxicity, genotoxicity and oxidative stress. Toxicology In Vitro. 30, 225-230 (2015).
- Morozesk, M., et al. Effects of multiwalled carbon nanotubes co-exposure with cadmium on zebrafish cell line: Metal uptake and accumulation, oxidative stress, genotoxicity and cell cycle. Ecotoxicology and Environmental Safety. 202, 110892 (2020).
- Dognani, G., et al. Nanofibrous membranes for low-concentration Cr VI adsorption: kinetic, thermodynamic and the influence on ZFL cells viability. Materials Research. , 24 (2021).
- ZEM2S (ATCC®CRL-2147™). American Type Culture Collection. , Available from: https://www.atcc.org/products/crl-2147 (2022).
- Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease. Scientific Reports. 6, 25187 (2016).
- Gajski, G., et al. Genotoxic potential of selected cytostatic drugs in human and zebrafish cells. Environmental Science and Pollution Research International. 23 (15), 14739-14750 (2016).
- Meng, Q., Yeung, K., Chan, K. M. Toxic effects of octocrylene on zebrafish larvae and liver cell line (ZFL). Aquatic Toxicology. 236, 105843 (2021).
- Mueller-Klieser, W. Method for the determination of oxygen consumption rates and diffusion coefficients in multicellular spheroids. Biophysical Journal. 46 (3), 343-348 (1984).
- Glicklis, R., Merchuk, J. C., Cohen, S. Modeling mass transfer in hepatocyte spheroids via cell viability, spheroid size, and hepatocellular functions. Biotechnology and Bioengineering. 86 (6), 672-680 (2004).
- Ho, R. K., Kimmel, C. B. Commitment of cell fate in the early zebrafish embryo. Science. 261 (5117), 109-111 (1993).
- Biswas, S., Emond, M. R., Jontes, J. D. Protocadherin-19 and N-cadherin interact to control cell movements during anterior neurulation. The Journal of Cell Biology. 191 (5), 1029-1041 (2010).
- Bradford, C. S., Sun, L., Collodi, P., Barnes, D. W. Cell cultures from zebrafish embryos and adult tissues. Journal of Tissue Culture Methods. 16 (2), 99-107 (1994).
- He, S., et al. Genetic and transcriptome characterization of model zebrafish cell lines. Zebrafish. 3 (4), 441-453 (2006).
