Summary
Aquí, presentamos un protocolo de cultivo 3D efectivo, fácil y rápido para la formación de esferoides de dos líneas celulares de pez cebra (Danio rerio): ZEM2S (embrión) y ZFL (hepatocito normal).
Abstract
Las líneas celulares de peces son modelos in vitro prometedores para la evaluación de la ecotoxicidad; sin embargo, los sistemas convencionales de cultivo monocapa (cultivo 2D) tienen limitaciones bien conocidas (por ejemplo, la longevidad del cultivo y el mantenimiento de algunas funciones celulares in vivo ). Así, se han propuesto cultivos 3D, como los esferoides, ya que estos modelos pueden reproducir estructuras similares a tejidos, recapturando mejor las condiciones in vivo . Este artículo describe un protocolo de cultivo 3D efectivo, fácil y rápido para la formación de esferoides con dos líneas celulares de pez cebra (Danio rerio): ZEM2S (embrión) y ZFL (hepatocito normal). El protocolo consiste en enchapar las celdas en una placa de 96 pocillos de fondo redondo, de fijación ultrabaja. Después de 5 días bajo agitación orbital (70 rpm), se forma un solo esferoide por pocillo. Los esferoides formados presentan tamaño y forma estables, y este método evita la formación de múltiples esferooides en un pozo; Por lo tanto, no es necesario seleccionar esferoides de tamaños similares. La facilidad, velocidad y reproducibilidad de este método esferoide lo hacen útil para pruebas in vitro de alto rendimiento.
Introduction
Los esferoides son pequeñas esferas de células que se forman cuando las células se cultivan en estrecho contacto de célula a célula en cultivo 3D. La capacidad de los esferoides para imitar el entorno tisular in vivo ya ha sido estudiada en una variedad de líneas celulares y células primarias 1,2. Sin embargo, aunque los esferoides están bien desarrollados para estudios de toxicidad en mamíferos, el desarrollo de esferoides para estudios de toxicidad con vertebrados no mamíferos (por ejemplo, peces) todavía está en curso3. Para las líneas celulares de peces, los esferoides se han desarrollado mediante una variedad de métodos diferentes, como la agitación orbital (OS) utilizando diferentes tipos de placas de pozo 3,4,5,6,7, y el método de levitación magnética utilizando nanopartículas magnéticas8. Sin embargo, algunos de estos métodos de cultivo para esferoides pueden tener más desventajas que otros.
Por ejemplo, los métodos giratorios en microplacas grandes (placas de 24 pocillos) pueden generar un gran número de esferoides que difieren en tamaño y forma; De hecho, se ha demostrado la formación de estructuras multiesferoides7. Esto requiere intensos esfuerzos para seleccionar esferoides con un tamaño y forma similares para un experimento. El método de cultivo 3D de gota colgante se utiliza comúnmente para generar esferoides de líneas celulares de mamíferos 1,2,9,10,11, por lo que se pueden generar esferoides individuales por gota, evitando los problemas descritos anteriormente. Sin embargo, aunque un método modificado de gota colgante (gota colgante + agitación orbital) es capaz de generar esferoides ZFL utilizando un método económico, tiene sus desventajas12. Los agregados celulares formados no pueden mantenerse durante largos períodos en las gotas; Por lo tanto, deben transferirse a placas de pozo. Este proceso requiere una manipulación intensa y largos períodos de trabajo en una campana de flujo laminar, ya que se realiza gota a gota utilizando una micropipeta12. Además, este método requiere 10 días para formar completamente los esferoides ZFL (5 días en gota colgante + 5 días en SG)12. Estas desventajas pueden limitar la aplicación de esferoides de peces 3D para pruebas de toxicidad, especialmente teniendo en cuenta las posibles aplicaciones para la priorización química y la sostenibilidad del producto.
Por lo tanto, este artículo describe un protocolo de cultivo 3D capaz de generar esferoides individuales de líneas celulares ZFL (D. rerio hepatocito normal) y ZEM2S (embrión en fase blastula de D. rerio) basado en el uso combinado de placas de fijación ultra bajas de 96 pocillos (placas ULA) y un agitador orbital (22 mm de diámetro rotacional). El método aplicado es simple y reproducible, y puede generar un gran número de esferoides de tamaño y forma similares en un corto período de tiempo (5 días). Las ventajas de este método pueden apoyar la aplicación de modelos 3D de peces para estudios de toxicidad acuática tanto en la industria como en la academia, así como el progreso de la implementación de métodos alternativos para pruebas de ecotoxicidad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Los pasos clave para generar esferoides 3D de líneas celulares ZFL y ZEM2S en una placa de fondo redondo de 96 pocillos se presentan en la Figura 1.
NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales utilizados en este protocolo y la Tabla 1 para ver las soluciones y los medios de cultivo utilizados en este protocolo.
1. Medio de cultivo celular y cultivos monocapa
- Cultivar ambas líneas celulares (ZFL, ZEM2S) como monocapas en una incubadora a 28 °C sinCO2, y subcultivarlas a una relación de subcultivo de 1:3 cuando alcancen ~80% de confluencia.
- Comience con un matraz T75 de células de pez cebra en ~80% de confluencia, cultivado como se describió anteriormente.
- Retirar el medio completo y lavar las células añadiendo 1 solución salina tamponada con fosfato (PBS) (0,01 M) al matraz de cultivo con la ayuda de una pipeta.
- Con la ayuda de una pipeta, añadir 3 ml de 1x tripsina-0,5 mM EDTA (0,05% [v/v]) a los matraces de cultivo e incubar a 28 °C durante 3 min para separar las células del matraz.
- Golpee suavemente el matraz para liberar las células y luego detenga la digestión de tripsina agregando 3 ml de medio de cultivo completo al matraz.
- Con una pipeta, transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga cónica de 15 ml y centrifugar a 100 × g durante 5 min.
- Después de la formación del pellet, retire con cuidado el sobrenadante, agregue 1 ml del medio completo para la línea celular respectiva en uso (ZFL o ZEM2S) y vuelva a suspender con una micropipeta. Tome una alícuota para el conteo de células.
2. Conteo celular con prueba de exclusión de colorante azul de tripano
- Agregue 10 μL de la suspensión celular y 10 μL de colorante azul de tripano a un microtubo para contar las células y evaluar su viabilidad. Mezclar la suspensión celular y el tinte con una pipeta.
- Luego, transfiera 10 μL de esta mezcla (suspensión celular + azul de tripano) a una cámara de Neubauer y cuente las celdas en los cuatro cuadrados grandes (cuadrantes: Q) colocados en las esquinas de la cámara, considerando viables las células que no absorben azul de tripano. Calcula el número de celdas viables usando la ecuación (1):
(1) - Para calcular el número de células final en la suspensión celular, multiplique el número de células determinado mediante la ecuación (1) por 2 (el factor de dilución debido al uso de azul de tripano).
NOTA: Alternativamente, se puede utilizar un sistema automatizado de conteo de células.
(1)3. Recubrimiento celular en placas ULA
- Después de calcular el número de celdas, ajuste la suspensión celular a la placa 200 μL de esta suspensión por pocillo de una placa ULA de fondo redondo de 96 pocillos con el número de celdas requeridas para cada línea celular, como se indica a continuación:
- Placa 7.000 células ZFL viables/pocillo; por lo tanto, para toda la placa ULA, use 700,000 células en 20 ml de medio completo.
- Placa 3.500 células ZEM2S viables /pocillo; por lo tanto, para toda la placa ULA, use 350,000 células en 20 ml de medio completo.
- Preparar la suspensión celular con la concentración ajustada de células en un depósito medio y mezclarla con una micropipeta multicanal, teniendo cuidado de no formar espuma ni burbujas. Utilizando la micropipeta multicanal, añadir 200 μL de la suspensión celular ajustada a cada pocillo de la placa ULA.
NOTA: La placa debe sellarse con parafilm o lámina de sellado adhesiva para evitar la evaporación del medio de cultivo de la placa de 96 pocillos.
4. Formación de esferoides
- Incubar la placa ULA en un agitador orbital a 70 rpm durante 5 días en una incubadora de 28 °C. Permitir que los esferoides se formen durante 5 días de agitación orbital (Figura 2), alcanzando un tamaño promedio de ~225 μm de diámetro (esferoides ZFL) y ~226 μm de diámetro (esferoides ZEM2S)12.
NOTA: Después de 5 días de incubación (circularidad máxima), los esferoides están listos para ser utilizados. - Para mantener los esferoides en cultivo durante más de 5 días, retire 100 μL del medio gastado cada 5 días y agregue 100 μL de medio de cultivo completo fresco utilizando una micropipeta multicanal.
NOTA: Tenga cuidado de no aspirar los esferoides durante este proceso.
5. Medición del tamaño (diámetro) y la forma (índice de circularidad) de los esferoides
- Adquiere las imágenes.
- Bajo un microscopio de luz invertida con un sistema de captura de imágenes, obtenga una imagen de una escala definida.
NOTA: Utilice un portaobjetos de calibración de etapa de microscopio o un portaobjetos Neubauer (en el que se conocen los tamaños de cuadrante) para obtener la escala. - Bajo el microscopio y utilizando la misma lente objetiva utilizada para obtener la imagen de la escala, obtenga imágenes de los esferoides completamente formados (es decir, esferoides de 5 días de edad).
NOTA: Todas las imágenes deben tomarse utilizando el mismo sistema de captura de imágenes, ya que la resolución de la imagen es importante para determinar el tamaño y la forma de los esferoides, y puede diferir entre los tipos de sistemas.
- Bajo un microscopio de luz invertida con un sistema de captura de imágenes, obtenga una imagen de una escala definida.
- Establece la escala.
- Con el software ImageJ, abra la imagen de la escala definida (haga clic en Archivo | abrir).
- Seleccione el selector de línea recta de la barra de herramientas y, con el ratón, arrastre una línea a través de la extensión de la escala definida en la imagen.
- Establezca la escala seleccionando Analizar | Defina la escala y espere a que se abra la ventana Definir escala .
- En la ventana Definir escala, rellene el espacio en blanco de Distancia conocida con la distancia conocida (μm) correspondiente a la línea recta; rellene la unidad de longitud con mmm para μm. Haga clic en Aceptar.
NOTA: La escala en píxeles/μm se muestra en la parte inferior de la ventana.
- Establezca los parámetros de medición.
- En el software ImageJ, seleccione Analizar | Defina medidas para abrir la ventana Definir medidas .
- En la ventana Establecer medidas, seleccione las casillas para las mediciones deseadas (es decir, descriptores de área y forma). Haga clic en Aceptar.
- Obtener el diámetro y la circularidad de los esferoides.
- Abrir la imagen de un esferoide (Archivo | Abierto).
- Seleccione la herramienta de selección a mano alzada en la barra de herramientas y, con el ratón, seleccione el lado exterior del esferoide, como se muestra en la figura 3A.
NOTA: Para acercar o alejar la imagen, presione la tecla Ctrl y use el mouse para desplazarse hacia abajo o hacia arriba, o presione la tecla Ctrl y use las teclas de flecha arriba o abajo en el teclado. - Seleccione Analizar | Medida para abrir la ventana Resultados , en la que se muestran los valores medidos.
- Usando el valor de Área , calcule el tamaño (diámetro) de los esferoides usando la ecuación (2):
(2) - El índice de circularidad se da en la ventana Resultados como "Circ.", y es calculado automáticamente por el software utilizando la ecuación (3):
(3)
NOTA: El índice de circularidad de 1.0 representa una forma esferoidal perfecta, mientras que un valor cercano a 0.0 indica una forma alargada13.
(2)
(3)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Los esferoides individuales por pozo con un tamaño y forma estables se forman por este método. La Figura 2 ilustra el proceso de formación de esferoides individuales de células ZFL y ZEM2S en un pocillo de una placa ULA bajo agitación orbital (70 rpm). Las líneas celulares ZFL y ZEM2S tienen diferentes comportamientos en la cultura 3D. La línea celular ZEM2S presenta características que confieren la capacidad de formar fácilmente una forma esferoidal desde el primer día de la sacudida orbital (Figura 2E), mientras que la línea celular ZFL requiere 5 días para alcanzar la forma esferoidal deseable (Figura 2A-C). Los esferoides generados por este método también mostraron estabilidad en términos de forma en períodos más largos de cultivo (períodos >5 días), como se demuestra en la Figura 2D (esferoide ZFL de 16 días) y la Figura 2H (esferoide ZEM2S de 10 días de edad). El diámetro y la circularidad de los esferoideos se determinaron midiendo su área proyectada en las imágenes obtenidas utilizando un software para el procesamiento y análisis de imágenes científicas13 (Figura 3). La Tabla de materiales indica el software utilizado para el procesamiento y análisis de imágenes. Las células ZFL tienden a formar agregados celulares grandes (tamaño promedio 319 ± 23.33 μm) en el primer día de agitación orbital, que disminuye con el tiempo hasta el día 5 (225.62 ± 19.20 μm) (Figura 4A), mejorando la circularidad con el tiempo en cultivo (Figura 4B). A diferencia de las células ZFL, la línea celular ZEM2S forma pequeños esferoides desde el primer día (202,64 ± 5,78 μm), que aumentan progresivamente hasta el día 5 (226,63 ± 4,80 μm) (Figura 4C). La Figura 4E muestra los diferentes patrones de crecimiento en las líneas celulares ZFL y ZEM2S en cultivo 3D. Recomendamos utilizar los esferoides ZFL y ZEM2S en el quinto día porque alcanzan una forma esferoidal más alta (índice de circularidad de 0,80 ± 0,01 y 0,83 ± 0,00, respectivamente) (Figura 4B,D), lo que indica una mayor estabilidad de este modelo 3D.
Figura 1: Los pasos clave para generar esferoides 3D de líneas celulares ZFL y ZEM2S en una placa de fondo redondo de 96 pocillos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Esferoides individuales de líneas celulares ZFL y ZEM2S formadas en placas ULA de fondo redondo de 96 pocillos bajo agitación orbital. Un agregado de celda ZFL se forma el primer día de OS (A). El agregado celular aumenta su circularidad al tercer día (B) y alcanza una forma esferoidal adecuada en el día 5 (C). (D) Un esferoide ZFL de 16 días de edad en placa ULA. La línea celular ZEM2S forma esferoides desde el primer día de OS (E). El esferoide ZEM2S mantiene su forma y aumenta de tamaño al tercer día (F), y su máxima circularidad se alcanza el día 5 (G). (H) Un esferoide ZEM2S de 10 días de edad en una placa ULA. Barras de escala = 100 μm. Abreviaturas: OS = temblor orbital; ULA = fijación ultrabaja. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Determinación del tamaño y circularidad de los esferoides utilizando software para procesar y analizar imágenes científicas. Después de configurar el software para medir un área seleccionada en función de una escala conocida, seleccione el lado exterior del esferoide para determinar su área y circularidad (A). El área del esferoide se utiliza para determinar su tamaño calculando el diámetro d, y el software proporciona la circularidad del esferoide mediante una fórmula que utiliza el área y el perímetro seleccionados (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Reproducibilidad del método de esferoide 3D mostrada por esferoides de tamaño uniforme (diámetro) y circularidad (forma esferoidal). Tamaño medido de los esferoides de las líneas celulares ZFL (A) y ZEM2S (B). El índice de circularidad medido de los esferoides ZFL (C) y ZEM2S (D). El patrón de crecimiento de los esferoides ZFL y ZEM2S (E). Los datos son representativos de tres réplicas técnicas de diferentes lotes de células. Los números sobre cada punto indican la media de los triplicados para los días 1, 3 y 5. Los datos mostraron como media ± desviación estándar (n = 10). Esta cifra ha sido modificada de Souza et al.12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Comparación entre la formación de esferoides ZFL y ZEM2S realizada a dos velocidades de rotación (70 y 100 rpm). Un esferoide ZFL (A) y un esferoide ZEM2S (B) formados después de 5 días de agitación orbital a 100 rpm (las barras de escala representan 100 μm). El patrón de crecimiento de los esferoides ZFL (C) y ZEM2S (D) se formó a 70 y 100 rpm. El índice de circularidad de los esferoides ZFL (E) y ZEM2S (F) se formó a 70 y 100 rpm. Los datos se muestran como media ± desviación estándar (n = 10). *indica significación estadística (p < 0,05). N.S.: diferencia no significativa (prueba T) entre los esferoides formados el día 5 a 70 y 100 rpm. Esta cifra ha sido modificada de Souza et al.12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: La integridad celular y la viabilidad de los esferoides ZFL y ZEM2S (5 días de edad) formados por sacudidas orbitales en la placa de pozo de unión ultra baja de fondo redondo. La tinción de las membranas celulares por Lectina Alexa Fluor 594 (rojo) y núcleos por DAPI (azul) demuestra la integridad celular en el núcleo de un esferoide ZEM2S (A) y un esferoide ZFL (B). La fluorescencia de resorufina (rojo) formada por una reducción de Alamarblue demuestra células viables en el núcleo de los esferoides ZEM2S (C) y ZFL (D). Las imágenes representan planos ortogonales capturados con un microscopio confocal. Ensayo de viabilidad MTT en cultivo 3D (esferoides) y cultivo 2D de la línea celular ZEM2S (E) y ZFL (F). Los datos mostraron como media de absorbancia medida a 570 nm ± desviación estándar. ns: diferencia no significativa por la prueba t de Welch. Esta cifra ha sido modificada de Souza et al. (2021)12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Soluciones para el cultivo de ZFL y ZEM2S. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 2: Comparación de los métodos de esferoides 3D utilizados para formar esferoides ZFL individuales. * El mejor resultado para un parámetro probado. un El parámetro seleccionado entre los mejores resultados verificados en el método convencional de gota colgante. b El parámetro seleccionado de Baron et al.3 para formar un esferoide de pez con agitación orbital. c Variaciones igualmente adecuadas para un parámetro probado. Abreviaturas: HD = gota colgante; OS = temblor orbital; ULA = fijación ultrabaja; poli-HEMA = poli(metacrilato de 2-hidroxietilo). Esta tabla ha sido modificada de Souza et al.12. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este es un método simple, fácil y rápido para generar esferoides de hígado de pez cebra y líneas celulares embrionarias. Este método fue desarrollado por este grupo basado en modificaciones de los métodos de esferoides 3D existentes para superar los problemas reportados en estudios científicos relacionados con la formación de esferoides, así como las incertidumbres en la precisión de los datos de los ensayos de esferoides 3D. Por ejemplo, los problemas reportados radican en las dificultades de manejo, la naturaleza lenta de la generación de esferoides, la necesidad de seleccionar esferoides de un tamaño y forma similares para realizar un ensayo, así como dificultades en el proceso de transferencia de esferoides de las gotas a microplacas en el método de gota colgante 3,7,12. Además, este protocolo recomienda el cultivo de líneas celulares ZFL y ZEM2S en una condición libre deCO2. La composición del medio de cultivo y el ambiente libre deCO2 propuestos en este protocolo para ambas líneas celulares están ampliamente reportados en la literatura. La línea celular ZFL generalmente se cultiva en medios L-15 y RPMI con o sin la adición de bicarbonato de sodio y sin CO2 14,15,16,17,18,19,20. La línea celular ZEM2S se cultiva de acuerdo con las instrucciones del centro de recursos biológicos, y sus medios de cultivo se formularon para cultivos libres deCO2; por lo tanto, la mezcla deCO2 y aire puede ser perjudicial para las células cuando se utiliza este tipo de medios de cultivo21.
El presente protocolo de esferoide de peces se desarrolló después de evaluar varios parámetros (es decir, diferentes densidades celulares, velocidad de sacudida orbital [70 o 100 rpm] y el uso de diferentes placas de 96 pocillos [fondo plano o fondo redondo]) para determinar los mejores parámetros para formar esferoides ZFL. Además, se realizó una comparación con otros métodos de cultivo 3D (es decir, el método de caída colgante y el método de gota colgante combinados con el método de agitación orbital), lo que indica que la agitación orbital de las placas ULA de fondo redondo tuvo el mejor rendimiento (es decir, método fácil, rápido y reproducible). La Tabla 2 muestra los parámetros y el rendimiento de otros métodos de cultivo 3D evaluados para formar esferoides ZFL.
Ya se ha informado que las placas de ULA de fondo redondo forman esferoides individuales de células humanas seguidas de centrifugación22 o agitación orbital23,24. En este protocolo, proponemos el uso de la misma placa, excepto bajo agitación orbital para generar esferoides individuales de líneas celulares de pez cebra (es decir, un esferoide por pocillo de una placa de 96 pocillos). Esto es particularmente ventajoso porque puede formar fácil y rápidamente una buena cantidad de esferoides, y los esferoides formados se pueden mantener en cultivo en la misma placa. Por lo tanto, la exposición química se puede hacer directamente en la placa ULA para realizar diferentes tipos de ensayos de toxicidad.
Para determinar la velocidad de agitación orbital adecuada para formar esferoides ZFL y ZEM2S, comparamos la formación de los esferoides a 70 y 100 rpm. Los resultados muestran que este método funciona mejor a 70 rpm, y una mayor velocidad de rotación puede afectar significativamente el tamaño y la forma de los esferoides ZEM2S (Figura 5D, F). Los esferoides ZFL no mostraron diferencias significativas en tamaño y forma a estas velocidades de rotación; sin embargo, se obtuvieron índices de circularidad más bajos a 100 rpm, mostrando un impacto negativo en la forma esferoidal a una mayor velocidad de rotación (Figura 5C, E).
La densidad celular inicial de 3.500 células ZEM2S y 7.000 células ZFL generan esferoides con tamaños similares en el quinto día en cultivo (226,63 y 225,62 μm, respectivamente). Dado que el oxígeno y los nutrientes son transportados por difusión en los esferoides25, su diámetro puede influir fuertemente en la nutrición y la integridad celular en el núcleo de los esferoides; En general, se recomiendan esferoides de hasta 100 μm para evitar el núcleo necrótico26. Para verificar la integridad celular en el núcleo de los esferoides, evaluamos la integridad nuclear y de membrana mediante inmunotinción con DAPI y Lectina Alexa Fluor 594 por microscopía confocal (Figura 6A, B), y se demostró la integridad de los esferoides. La viabilidad celular en el núcleo de los esferoides también se verificó exponiéndolos a resazurina (Alamarblue) y analizando la fluorescencia de resorufin por un microscopio confocal (Figura 6C, D). Cuando las células son viables, la resazurina se reduce a resorufina (sustancia fluorescente) por la función metabólica celular. El rendimiento del ensayo MTT tampoco demostró diferencias significativas en la viabilidad celular comparando los esferoides ZFL y ZEM2S con el cultivo monocapa (cultivo 2D) (Figura 6E, F). Aunque los esferoides son mayores de 100 μm, los resultados muestran que este protocolo genera esferoides viables de líneas celulares ZFL y ZEM2S con una nutrición adecuada incluso en su porción interna.
Las densidades celulares de las células ZFL y ZEM2S y la velocidad de agitación orbital aplicada en este protocolo permitieron la formación de esferoides muy estables en tamaño y forma, con baja variabilidad entre los pocillos (Figura 4), evitando la necesidad de seleccionar esferoides adecuados como paso previo a la realización de un ensayo. Si el procedimiento de ensayo requiere la transferencia de los esferoides a otras placas o tubos/microtubos, se pueden transferir fácilmente con una micropipeta sin problemas de desagregación.
Aquí, demostramos un protocolo desarrollado basado en los mejores parámetros para formar esferoides ZFL y ZEM2S viables. Las líneas celulares ZFL y ZEM2S pueden ser útiles en ensayos de toxicidad acuática para estimar los efectos químicos en los peces 23,24,27,28,29,30. Además, los criterios de valoración del desarrollo también pueden estudiarse utilizando líneas celulares de embriones de peces, como la línea celular ZEM2S (células de fibroblastos de la fase blástula), que conservan un grado de pluripotencia28. Esto hace que estos esferoides de pez cebra sean potencialmente útiles para las pruebas de toxicidad de peces. Además, como método de esferoide de peces fácil, se puede utilizar en pruebas de ecotoxicidad de alto rendimiento, lo que respalda su aplicación en la industria y el mundo académico.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Acknowledgments
En memoria del Dr. Márcio Lorencini, coautor de este trabajo, excelente investigador en el campo de la cosmética y dedicado a promover la investigación cosmética en Brasil. Los autores agradecen al Laboratorio Multiusuario del Departamento de Fisiología (UFPR) por la disponibilidad de equipos y por el apoyo financiero de la Coordinación para el Perfeccionamiento del Personal de Enseñanza Superior (CAPES, Brasil) (Código de Finanzas 001) y del Grupo Boticário.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate, Individually Wrapped, with Lid, Sterile | Corning | 7007 | |
| DMEM, powder, high glucose, pyruvate | Gibco | 12800-017 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, powder | Gibco | 21700026 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| Image Processing and analysis in Java (ImageJ) 1.52p software | National Institutes of Health, USA |
Available at: https://imagej.nih.gov/ij/index.html | |
| Leibovitz's L-15 Medium, powder | Gibco | 41300021 | |
| Orbital shaker | Warmnest | KLD-350-BI | 22 mm rotation diameter |
| Dulbeccos PBS (10x) with calcium and magnesium | Invitrogen | 14080055 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-014 | |
| FBS - Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | Gibco | 12657-029 | |
| Sodium bicarbonate, powder, bioreagent for molecular biology | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Trypan blue stain (0,4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 | |
| ZEM2S cell line | ATCC | CRL-2147 | This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J. Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA) |
| ZFL cell line | BCRJ | 256 |
References
- Elje, E., et al. The comet assay applied to HepG2 liver spheroids. Mutation Research. Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 845, 403033 (2019).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, N. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnology and Bioengineering. 83 (2), 173-180 (2003).
- Baron, M. G., Purcell, W. M., Jackson, S. K., Owen, S. F., Jha, A. N. Towards a more representative in vitro method for fish ecotoxicology: morphological and biochemical characterisation of three-dimensional spheroidal hepatocytes. Ecotoxicology. 21 (8), 2419-2429 (2012).
- Alves, R. F., Rocha, E., Madureira, T. V. Fish hepatocyte spheroids - A powerful (though underexplored) alternative in vitro model to study hepatotoxicity. Comparative Biochemistry and Physiology. Toxicology & Pharmacology. 262, 109470 (2022).
- Baron, M. G., et al. Pharmaceutical metabolism in fish: using a 3-D hepatic in vitro model to assess clearance. PloS One. 12 (1), 0168837 (2017).
- Langan, L. M., et al. Spheroid size does not impact metabolism of the β-blocker propranolol in 3D intestinal fish model. Frontiers in Pharmacology. 9, 947 (2018).
- Lammel, T., Tsoukatou, G., Jellinek, J., Sturve, J. Development of three-dimensional (3D) spheroid cultures of the continuous rainbow trout liver cell line RTL-W1. Ecotoxicology and Environmental Safety. 167, 250-258 (2019).
- Jeong, Y., et al. Differential effects of CBZ-induced catalysis and cytochrome gene expression in three dimensional zebrafish liver cellculture. Journal of Environmental and Analytical Toxicology. 6, 2161 (2016).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. (51), e2720 (2011).
- Lee, W. G., Ortmann, D., Hancock, M. J., Bae, H., Khademhosseini, A. A hollow sphere soft lithography approach for long-term hanging drop methods. Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (2), 249-259 (2010).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods in Molecular Medicine. 140, 141-151 (2007).
- de Souza, I. R., et al. Development of 3D cultures of zebrafish liver and embryo cell lines: a comparison of different spheroid formation methods. Ecotoxicology. 30 (9), 1893-1909 (2021).
- Ferreira, T., Rasband, W.
- Guidony, N. S., et al. ABC proteins activity and cytotoxicity in zebrafish hepatocytes exposed to triclosan. Environmental Pollution. 271, 116368 (2021).
- da Silva, N. D. G., et al. Interference of goethite in the effects of glyphosate and Roundup® on ZFL cell line. Toxicology In Vitro. 65, 104755 (2020).
- Yang, Y., et al. Temperature is a key factor influencing the invasion and proliferation of Toxoplasma gondii in fish cells. Experimental Parasitology. 217, 107966 (2020).
- Lopes, F. M., Sandrini, J. Z., Souza, M. M. Toxicity induced by glyphosate and glyphosate-based herbicides in the zebrafish hepatocyte cell line (ZF-L). Ecotoxicology and Environmental Safety. 162, 201-207 (2018).
- Lachner, D., Oliveira, L. F., Martinez, C. B. R. Effects of the water soluble fraction of gasoline on ZFL cell line: Cytotoxicity, genotoxicity and oxidative stress. Toxicology In Vitro. 30, 225-230 (2015).
- Morozesk, M., et al. Effects of multiwalled carbon nanotubes co-exposure with cadmium on zebrafish cell line: Metal uptake and accumulation, oxidative stress, genotoxicity and cell cycle. Ecotoxicology and Environmental Safety. 202, 110892 (2020).
- Dognani, G., et al. Nanofibrous membranes for low-concentration Cr VI adsorption: kinetic, thermodynamic and the influence on ZFL cells viability. Materials Research. , 24 (2021).
- ZEM2S (ATCC®CRL-2147™). American Type Culture Collection. , Available from: https://www.atcc.org/products/crl-2147 (2022).
- Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease. Scientific Reports. 6, 25187 (2016).
- Gajski, G., et al. Genotoxic potential of selected cytostatic drugs in human and zebrafish cells. Environmental Science and Pollution Research International. 23 (15), 14739-14750 (2016).
- Meng, Q., Yeung, K., Chan, K. M. Toxic effects of octocrylene on zebrafish larvae and liver cell line (ZFL). Aquatic Toxicology. 236, 105843 (2021).
- Mueller-Klieser, W. Method for the determination of oxygen consumption rates and diffusion coefficients in multicellular spheroids. Biophysical Journal. 46 (3), 343-348 (1984).
- Glicklis, R., Merchuk, J. C., Cohen, S. Modeling mass transfer in hepatocyte spheroids via cell viability, spheroid size, and hepatocellular functions. Biotechnology and Bioengineering. 86 (6), 672-680 (2004).
- Ho, R. K., Kimmel, C. B. Commitment of cell fate in the early zebrafish embryo. Science. 261 (5117), 109-111 (1993).
- Biswas, S., Emond, M. R., Jontes, J. D. Protocadherin-19 and N-cadherin interact to control cell movements during anterior neurulation. The Journal of Cell Biology. 191 (5), 1029-1041 (2010).
- Bradford, C. S., Sun, L., Collodi, P., Barnes, D. W. Cell cultures from zebrafish embryos and adult tissues. Journal of Tissue Culture Methods. 16 (2), 99-107 (1994).
- He, S., et al. Genetic and transcriptome characterization of model zebrafish cell lines. Zebrafish. 3 (4), 441-453 (2006).
