Summary
ここでは、2つのゼブラフィッシュ(ダニオレリオ)細胞株、ZEM2S(胚)とZFL(正常肝細胞)のスフェロイドを形成するための効果的で簡単かつ高速な3D培養プロトコルを紹介します。
Abstract
魚細胞株は、生態毒性評価のための 有望なin vitro モデルです。しかしながら、従来の単層培養系(2D培養)には周知の制限(例えば、培養寿命およびいくつかの in vivo 細胞機能の維持)がある。したがって、スフェロイドなどの3D培養物が提案されており、これらのモデルは組織様構造を再現できるため、 in vivo 条件をよりよく再キャプチャできます。この記事では、2つのゼブラフィッシュ(Danio rerio)細胞株であるZEM2S(胚)とZFL(正常肝細胞)を使用してスフェロイドを形成するための効果的、簡単、高速の3D培養プロトコルについて説明します。このプロトコルは、丸底の超低アタッチメント96ウェルプレートに細胞をプレーティングすることで構成されています。軌道振盪(70rpm)下で5日後、ウェル当たり単一のスフェロイドが形成される。形成されたスフェロイドは安定したサイズと形状を示し、この方法はウェル内で複数のスフェロイドが形成されるのを回避します。したがって、同様のサイズのスフェロイドを手で選ぶ必要はありません。このスフェロイド法の容易さ、速度、再現性により、ハイスループット のin vitro 試験に役立ちます。
Introduction
スフェロイドは、細胞を3D培養で細胞間密接な接触で培養するときに形成される細胞の小さな球体です。インビボ組織環境を模倣するスフェロイドの能力は、様々な細胞株および初代細胞において既に研究されている1,2。しかし、スフェロイドは哺乳類毒性試験用に十分に開発されていますが、非哺乳類脊椎動物(魚類など)での毒性試験用のスフェロイドの開発はまだ進行中です3。魚類細胞株の場合、スフェロイドは、異なるタイプのウェルプレート3、4、5、6、7を用いた軌道振動(OS)や、磁性ナノ粒子8を用いた磁気浮上法など、さまざまな方法で開発されてきました。ただし、スフェロイドのこれらの培養方法のいくつかは、他の方法よりも不利な点がある可能性があります。
例えば、大型マイクロプレート(24ウェルプレート)での旋回法では、サイズと形状が異なる多数のスフェロイドが生成される可能性があります。実際、多重スフェロイド構造形成が実証されている7。これには、実験のために同じサイズと形状の回転楕円体を厳選するための多大な努力が必要です。ハンギングドロップ3D培養法は、哺乳類細胞株1,2,9,10,11のスフェロイドを生成するために一般的に使用され、それによって、ドロップあたり単一のスフェロイドを生成することができ、上記の問題を回避することができる。しかしながら、修正されたハンギングドロップ法(ハンギングドロップ+軌道振動)は、安価な方法を用いてZFLスフェロイドを生成することができるが、欠点がある12。形成された細胞凝集体は、滴内で長期間維持することはできません。したがって、それらはウェルプレートに移される必要があります。このプロセスは、マイクロピペット12を用いて滴下して行われるため、層流フード内での激しい取り扱いおよび長時間の作業を必要とする。また、この方法では、ZFLスフェロイドを完全に形成するのに10日(ハンギングドロップで5日+OSで5日)12を要します。これらの欠点は、特に化学物質の優先順位付けと製品の持続可能性のための潜在的なアプリケーションを考慮すると、毒性試験のための3D魚スフェロイドの適用を制限する可能性があります。
したがって、この記事では、96ウェルの超低接着プレート(ULAプレート)とオービタルシェーカー(回転直径22 mm)の併用に基づいて、ZFL(D.レリオ 正常肝細胞)およびZEM2S(D.レリオ 胞胚期胚)細胞株の単一スフェロイドを生成できる3D培養プロトコルについて説明します。適用された方法は簡単で再現性があり、短期間(5日間)で同様のサイズと形状のスフェロイドを大量に生成できます。この方法の利点は、産業界と学界の両方での水生毒性研究への魚の3Dモデルの適用、および生態毒性試験の代替方法の実装の進歩をサポートすることができます。
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Protocol
丸底96ウェルプレートでZFLおよびZEM2S細胞株の3Dスフェロイドを生成するための重要なステップを 図1に示します。
注:このプロトコルで使用されるすべての材料に関連する詳細については、 材料の 表を、このプロトコルで使用される溶液と培地については 表1 を参照してください。
1. 細胞培養培地および単層培養
- 両方の細胞株(ZFL、ZEM2S)をCO2を含まない28°Cのインキュベーターで単層として増殖させ、~80%のコンフルエントに達したら継代培養比1:3で継代培養します。
- ゼブラフィッシュ細胞のT75フラスコを~80%のコンフルエントで開始し、上記のように培養する。
- 完全な培地を除去し、ピペットを使用して培養フラスコに1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(0.01 M)を加えて細胞を洗浄します。
- ピペットを使用して、1 mLの1xトリプシン-0.5 mM EDTA(0.05% [v/v])を培養フラスコに加え、28°Cで3分間インキュベートしてフラスコから細胞を剥離します。
- フラスコを軽くたたいて細胞を放出し、3 mLの完全培養培地をフラスコに加えてトリプシン消化を停止します。
- ピペットを使用して、細胞懸濁液を15 mLのコニカル遠沈管に移し、100 × g で5分間遠心分離します。
- ペレット形成後、上清を注意深く除去し、使用中の各細胞株(ZFLまたはZEM2S)の完全培地を1 mL加え、マイクロピペットを使用して再懸濁します。細胞カウントのためにアリコートを取ります。
2.トリパンブルー色素排除試験による細胞カウント
- 10 μLの細胞懸濁液と10 μLのトリパンブルー色素をマイクロチューブに加え、細胞をカウントし、生存率を評価します。ピペットを使用して細胞懸濁液と染料を混合します。
- 次に、この混合物(細胞懸濁液+トリパンブルー)10 μLをノイバウアーチャンバーに移し、トリパンブルーを取り込まない細胞を生菌と見なして、チャンバーの角に配置された4つの大きな正方形(象限:Q)の細胞をカウントします。式 (1) を使用して生細胞数を計算します。
(1) - 細胞懸濁液中の最終細胞数を計算するには、式(1)を用いて求めた細胞数に2(トリパンブルーの使用による希釈倍率)を乗じる。
注:あるいは、自動細胞計数システムを使用することもできます。
(1)3. ULAプレートのセルプレーティング
- 細胞数を計算した後、以下に示すように、96ウェル丸底ULAプレートのウェルあたり200 μLのこの懸濁液を各細胞株に必要な細胞数でプレートするように細胞懸濁液を調整します。
- 7,000個の生存可能な ZFL 細胞/ウェルをプレート化します。したがって、ULAプレート全体に対して、20 mLの完全な培地で700,000細胞を使用します。
- 3,500個の生存可能な ZEM2S 細胞/ウェルをプレート化します。したがって、ULAプレート全体に対して、20 mLの完全培地で350,000細胞を使用します。
- 培地リザーバー内の細胞濃度を調整した細胞懸濁液を調製し、泡や泡を形成しないように注意しながら、マルチチャンネルマイクロピペットを使用して混合します。マルチチャンネルマイクロピペットを使用して、調整した細胞懸濁液をULAプレートの各ウェルに200 μL加えます。
注:プレートは、96ウェルプレートからの培地の蒸発を防ぐために、パラフィルムまたは接着剤シーリングフォイルでシールする必要があります。
4.回転楕円体形成
- ULAプレートをオービタルシェーカーで70rpmで28°Cのインキュベーター内で5日間インキュベートします。スフェロイドを5日間の軌道振盪で形成し(図2)、直径~225 μm(ZFLスフェロイド)および直径~226 μm(ZEM2Sスフェロイド)の平均サイズに達します12。
注:5日間のインキュベーション(最大円形度)後、スフェロイドを使用する準備が整います。 - スフェロイドを培養中に5日以上維持するには、5日ごとに100 μLの使用済み培地を除去し、マルチチャンネルマイクロピペットを使用して100 μLの新鮮な完全培養培地を追加します。
注意: このプロセス中は、回転楕円体を吸引しないように注意してください。
5. 回転楕円体のサイズ(直径)と形状(円形度指数)の測定
- 画像を取得します。
- イメージングキャプチャシステムを備えた倒立光学顕微鏡の下で、定義されたスケールの画像を取得します。
注意: 顕微鏡ステージキャリブレーションスライドまたはノイバウアースライド(象限サイズがわかっている)を使用して、スケールを取得します。 - 顕微鏡下で、スケールの画像を取得するために使用したのと同じ対物レンズを使用して、完全に形成されたスフェロイド(すなわち、5日齢のスフェロイド)の画像を取得します。
注:スフェロイドのサイズと形状を決定するには画像の解像度が重要であり、システムの種類によって異なる可能性があるため、すべての画像は同じイメージングキャプチャシステムを使用して撮影する必要があります。
- イメージングキャプチャシステムを備えた倒立光学顕微鏡の下で、定義されたスケールの画像を取得します。
- 縮尺を設定します。
- ImageJソフトウェアを使用して、定義したスケールの画像を開きます( [ファイル]、[開く]の順にクリックします)。
- ツールバーから 直線セレクター を選択し、マウスを使用して、画像内の定義された縮尺の延長を横切る線をドラッグします。
- [ 分析 |縮尺を設定し、[ 縮尺の設定] ウィンドウが開くのを待ちます。
- [ スケールの設定] ウィンドウで、[既知の距離]の空白に、直線に対応する 既知の距離 (μm)を入力します。長さの 単位 にμmの um を入力します 。 OK をクリックします。
メモ: ピクセル/μm単位のスケールは、ウィンドウの下部に表示されます。
- 測定パラメータを設定します。
- ImageJ ソフトウェアで、[ 分析 |[測定値の設定 ] をクリックして、[ 測定値の設定 ] ウィンドウを開きます。
- [測定値 の設定 ]ウィンドウで、目的の測定値のボックス( つまり、面積 記述子と 形状 記述子)を選択します。 OK をクリックします。
- 回転楕円体の直径と真円度を取得します。
- 回転楕円体の画像を開く (ファイル |開く)。
- ツールバーで フリーハンド選択ツール を選択し、マウスを使用して回転楕円体の外側を選択します( 図3Aを参照)。
メモ: 画像をズームインまたはズームアウトするには、Ctrl キーを押しながらマウスを使用して上下にスクロールするか、 Ctrl キーを押しながらキーボードの上矢印キーまたは下矢印キーを使用します。 - [ 分析] を選択します。 |[測定] : [結果 ] ウィンドウが開き、測定値が表示されます。
- 面積の値を使用して、式 (2) を使用して回転楕円体のサイズ (直径) を計算します。
(2) - 円形度指数は、結果ウィンドウに「円形」として与えられ、式 (3) を使用してソフトウェアによって自動的に計算されます。
(3)
注: 真円度指数 1.0 は完全な回転楕円体形状を表し、0.0 に近い値は細長い形状13 を示します。
(2)
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Representative Results
安定したサイズおよび形状を有するウェル当たり単一のスフェロイドがこの方法によって形成される。図2は、軌道振とう(70rpm)下でのULAプレートのウェルにおけるZFLおよびZEM2S細胞の単一スフェロイドの形成過程を示す。ZFL細胞株とZEM2S細胞株は、3D培養において異なる挙動を示します。ZEM2S細胞株は、眼窩振盪の初日からスフェロイド形状を容易に形成する能力を付与する特徴を示しますが(図2E)、ZFL細胞株は望ましいスフェロイド形状に到達するまでに5日かかります(図2A-C)。この方法で生成されたスフェロイドは、図2D(16日齢のZFLスフェロイド)および図2H(10日齢のZF2Sスフェロイド)に示すように、より長い培養期間(期間>5日)でも形状の点で安定性を示しました。スフェロイドの直径と円形度は、科学画像を処理および分析するためのソフトウェアを使用して、得られた画像の投影面積を測定することによって決定されました13(図3)。 材料表は、画像処理と分析に使用されるソフトウェアを示しています。ZFL細胞は、軌道振盪の初日に大きな細胞凝集体(平均サイズ319 ± 23.33 μm)を形成する傾向があり、5日目(225.62 ± 19.20 μm)まで時間とともに減少し(図4A)、培養中の円形度が経時的に向上します(図4B)。ZFL細胞とは異なり、ZEM2S細胞株は初日(202.64 ± 5.78 μm)から小さなスフェロイドを形成し、5日目(226.63 ± 4.80 μm)まで徐々に増加します(図4C)。図4Eは、3D培養におけるZFLおよびZEM2S細胞株における異なる増殖パターンを示す。ZFLスフェロイドとZEM2Sスフェロイドは、より高い回転楕円体形状(円形度指数0.80 ± 0.01および0.83 ± 0.00)に達するため(図4B、D)、この3Dモデルの安定性が高いことを示すため、5日目に使用することをお勧めします。
図1:丸底96ウェルプレートでZFLおよびZEM2S細胞株の3Dスフェロイドを生成するための重要なステップ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:軌道振とう下で丸底96ウェルULAプレートに形成されたZFLおよびZEM2S細胞株の単一スフェロイド。 ZFL細胞凝集体は、OS(A)の初日に形成される。細胞凝集体は3日目に円形度を高め(B)、5日目(C)に適切な回転楕円体形状に達します。(D)ULAプレートの16日齢のZFLスフェロイド。ZEM2S細胞株は、OS(E)の初日からスフェロイドを形成します。ZEM2Sスフェロイドは3日目にその形状を維持し、サイズが大きくなり(F)、5日目(G)に最大円形度に達します。(H)ULAプレート中の10日齢のZEM2Sスフェロイド。スケールバー= 100μm。略語:OS =軌道振動;ULA =超低アタッチメント。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:科学画像を処理および分析するためのソフトウェアを使用したスフェロイドのサイズと円形度の決定。 既知のスケールに基づいて選択した領域を測定するようにソフトウェアを設定した後、回転楕円体の外側を選択して、その面積と円形度を決定します(A)。回転楕円体の面積は、直径 dを計算することによってそのサイズを決定するために使用され、ソフトウェアは、選択された面積と周長を使用する式によって回転楕円体の円形度を提供します(B)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:3次元スフェロイド法の再現性を均一な大きさの回転楕円体(直径)と円形度(回転楕円体形状)で示した。 ZFL(A)およびZEM2S(B)細胞株のスフェロイドのサイズを測定した。ZFL(C)およびZEM2S(D)スフェロイドの円形度指数を測定した。ZFLおよびZEM2Sスフェロイドの成長パターン(E)。データは、異なる細胞バッチからの3つの技術的複製を代表するものである。各点の上の数字は、1、3、および5日目の三重の平均を示しています。データは平均値±標準偏差(n=10)として示した。この図はSouza et al.12から修正されたものである。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:2つの回転速度(70rpmと100rpm)で行われたZFLスフェロイドとZEM2Sスフェロイドの形成の比較。 ZFLスフェロイド(A)とZEM2Sスフェロイド(B)は、100rpmで5日間の軌道振動の後に形成されました(スケールバーは100μmを表します)。ZFLスフェロイド(C)およびZEM2Sスフェロイド(D)の成長パターンは、70および100rpmで形成された。ZFLスフェロイド(E)およびZEM2Sスフェロイド(F)の円形度指数は、70および100rpmで形成された。データは平均値±標準偏差(n = 10)として示されます。 *は統計的有意性を示す(p < 0.05)。N.S.:70rpmと100rpmで5日目に形成されたスフェロイド間の非有意差(t検定)。この図はSouza et al.12から修正されたものである。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:丸底超低付着ウェルプレートでの軌道振とうによって形成されたZFLおよびZEM2Sスフェロイド(5日齢)の細胞完全性と生存率。レクチンAlexa Fluor 594(赤)による細胞膜の染色とDAPI(青)による核の染色は、ZEM2Sスフェロイド(A)とZFLスフェロイド(B)のコアにおける細胞の完全性を示しています。アラマーブルーの還元によって形成されたレゾルフィン(赤色)の蛍光は、ZEM2S(C)およびZFL(D)スフェロイドの両方のコアに生細胞を示します。画像は、共焦点顕微鏡を使用してキャプチャされた直交平面を表します。ZEM2S(E)およびZFL細胞株(F)の3D培養(スフェロイド)および2D培養におけるMTT生存率アッセイ。データは、標準偏差±570nmで測定した吸光度の平均として示した。ns: ウェルチのt検定による有意差ではない。この図は、Souza et al. (2021)12から修正されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表1:ZFLおよびZEM2S培養のためのソリューション。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表2:単一のZFLスフェロイドを形成するために使用された3Dスフェロイド法の比較。 *テストされたパラメータの最良の結果。 ある 最良の結果から選択されたパラメータを従来のハンギングドロップ法で検証した。 b 軌道振盪を有する魚類回転楕円体を形成するためのBaronら3 から選択されたパラメータ。 c テストされたパラメータに等しく適したバリエーション。略語:HD =ハンギングドロップ。OS =軌道振動;ULA =超低アタッチメント。ポリ-HEMA =ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)。この表はSouza et al.12から修正されたものである。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
これは、ゼブラフィッシュの肝臓および胚細胞株のスフェロイドを生成するための簡単、簡単、かつ迅速な方法です。この方法は、スフェロイド形成に関連する科学的研究で報告された問題、および3Dスフェロイドアッセイからのデータ精度の不確実性を克服するために、既存の3Dスフェロイド法の修正に基づいてこのグループによって開発されました。例えば、報告された問題は、取り扱いの難しさ、スフェロイドを生成するのに時間がかかる性質、アッセイを実行するために同様のサイズと形状のスフェロイドを選択する必要性、およびハンギングドロップ法でスフェロイドをドロップからマイクロプレートに移すプロセスの困難さにあります3,7,12。さらに、このプロトコルは、CO2フリー条件でのZFLおよびZEM2S細胞株の培養を推奨する。両方の細胞株についてこのプロトコルで提案されている培地組成およびCO2フリー環境は、文献において広く報告されている。ZFL細胞株は通常、重炭酸ナトリウムの添加の有無にかかわらず、CO2 14、15、16、17、18、19、20を含まないL-15およびRPMI培地で培養されます。ZEM2S細胞株は、バイオリソースセンターの指示に従って培養され、その培地はCO2フリー培養用に処方されました。したがって、CO2および空気混合物は、このタイプの培養培地21を使用する場合に細胞にとって有害であり得る。
現在の魚類スフェロイドプロトコルは、ZFLスフェロイドを形成するための最良のパラメータを決定するために、いくつかのパラメータ(すなわち、異なる細胞密度、軌道振盪の速度[70または100 rpm]、および異なる96ウェルプレートの使用[平底または丸底])を評価した後に開発されました。また、他の3次元培養法(ハンギングドロップ法、ハンギングドロップ法とオービタルシェイキング法の組み合わせ)との比較を行ったところ、丸底ULAプレートの軌道振とうが最高の性能(簡便、迅速、再現性のある方法)であることが示された。 表2 は、ZFLスフェロイドを形成するために評価された他の3D培養方法のパラメータと性能を示しています。
丸底ULAプレートは、ヒト細胞の単一のスフェロイドを形成し、その後遠心分離22または軌道振とう23,24を行うことがすでに報告されています。このプロトコルでは、ゼブラフィッシュ細胞株の単一スフェロイド(すなわち、96ウェルプレートのウェルあたり1つのスフェロイド)を生成するための軌道振とうを除いて、同じプレートの使用を提案しています。これは、良好な量のスフェロイドを容易かつ迅速に形成することができ、形成されたスフェロイドを同じプレート上で培養中に維持することができるので、特に有利である。したがって、化学物質への曝露をULAプレート上で直接行い、さまざまな種類の毒性アッセイを実行できます。
ZFLとZEM2Sのスフェロイド形成に適した軌道振動速度を決定するために、70rpmと100rpmでのスフェロイドの形成を比較しました。結果は、この方法が70rpmでより優れた性能を発揮し、より高い回転速度がZEM2Sスフェロイドのサイズと形状に大きな影響を与える可能性があることを示しています(図5D、F)。ZFLスフェロイドは、これらの回転速度でサイズと形状に大きな違いを示さなかった。しかし、100rpmではより低い円形度指数が得られ、より高い回転速度で回転楕円体形状に悪影響が見られました(図5C、E)。
3,500個のZEM2S細胞と7,000個のZFL細胞の初期細胞密度は、培養5日目に同様のサイズのスフェロイドを生成します(それぞれ226.63および225.62 μm)。酸素と栄養素がスフェロイド25の拡散によって輸送されることを考えると、それらの直径はスフェロイドのコアの栄養と細胞の完全性に強く影響する可能性があります。一般に、壊死性コア26を避けるために、100μmまでのスフェロイドが推奨されます。スフェロイドコアの細胞完全性を検証するために、共焦点顕微鏡によるDAPIおよびレクチンAlexa Fluor 594による免疫染色によって核および膜の完全性を評価し(図6A、B)、スフェロイドの完全性を実証しました。スフェロイドコアの細胞生存率は、スフェロイドをレサズリン(Alamarblue)に曝露し、共焦点顕微鏡でレゾルフィンの蛍光を分析することによっても検証されました(図6C、D)。細胞が生存可能であるとき、レサズリンは細胞の代謝機能によってレゾルフィン(蛍光物質)に還元される。MTTアッセイの性能は、ZFLおよびZEM2Sスフェロイドを単層培養(2D培養)と比較して細胞生存率に有意差がないことも示しました(図6E、F)。スフェロイドは100μmを超えていますが、結果は、このプロトコルがZFLおよびZEM2S細胞株の生存可能なスフェロイドを生成し、それらの内部部分でも十分な栄養を有することを示しています。
ZFLおよびZEM2S細胞の細胞密度とこのプロトコルで適用された軌道振とうの速度により、サイズと形状が非常に安定したスフェロイドの形成が可能になり、ウェル間のばらつきが少なく(図4)、アッセイを実行する前のステップとして適切なスフェロイドを選択する必要がなくなりました。アッセイ手順でスフェロイドを他のプレートまたはチューブ/マイクロチューブに移す必要がある場合は、マイクロピペットで分解の問題なしに簡単に移すことができます。
ここでは、実行可能なZFLおよびZEM2Sスフェロイドを形成するための最良のパラメータに基づいて開発されたプロトコルを実証しました。ZFLおよびZEM2S細胞株は、魚に対する化学的影響を推定するための水生毒性試験に有用である可能性があります23、24、27、28、29、30。さらに、発生エンドポイントは、ある程度の多能性を保持するZEM2S細胞株(胞胚期の線維芽細胞)などの魚胚細胞株を使用して研究することもできます28。これらにより、これらのゼブラフィッシュスフェロイドは魚の毒性試験に役立つ可能性があります。さらに、簡易魚類スフェロイド法として、ハイスループット生態毒性試験に使用でき、産業界や学界での応用をサポートします。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
この作品の共著者であり、化粧品の分野で優れた研究者であり、ブラジルでの化粧品研究の促進に専念しているマルシオ・ロレンチーニ博士を記念して。著者らは、生理学部(UFPR)のマルチユーザーラボに、機器の入手可能性と、高等教育要員の改善のための調整(CAPES、ブラジル)(財務コード001)およびGrupo Boticárioの財政的支援に感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate, Individually Wrapped, with Lid, Sterile | Corning | 7007 | |
| DMEM, powder, high glucose, pyruvate | Gibco | 12800-017 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, powder | Gibco | 21700026 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| Image Processing and analysis in Java (ImageJ) 1.52p software | National Institutes of Health, USA |
Available at: https://imagej.nih.gov/ij/index.html | |
| Leibovitz's L-15 Medium, powder | Gibco | 41300021 | |
| Orbital shaker | Warmnest | KLD-350-BI | 22 mm rotation diameter |
| Dulbeccos PBS (10x) with calcium and magnesium | Invitrogen | 14080055 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-014 | |
| FBS - Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | Gibco | 12657-029 | |
| Sodium bicarbonate, powder, bioreagent for molecular biology | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Trypan blue stain (0,4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 | |
| ZEM2S cell line | ATCC | CRL-2147 | This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J. Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA) |
| ZFL cell line | BCRJ | 256 |
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