Summary
Her presenterer vi en effektiv, enkel og rask 3D-kulturprotokoll for dannelse av sfæroider av to sebrafisk (Danio rerio) cellelinjer: ZEM2S (embryo) og ZFL (normal hepatocytt).
Abstract
Fiskecellelinjer er lovende in vitro-modeller for økotoksisitetsvurdering; Imidlertid har konvensjonelle monolagskultursystemer (2D-kultur) kjente begrensninger (f.eks. Kulturlevetid og vedlikehold av noen in vivo cellulære funksjoner). Dermed har 3D-kulturer, som sfæroider, blitt foreslått, siden disse modellene kan reprodusere vevlignende strukturer, bedre gjenvinne in vivo-forholdene . Denne artikkelen beskriver en effektiv, enkel og rask 3D-kulturprotokoll for dannelse av sfæroider med to sebrafisk (Danio rerio) cellelinjer: ZEM2S (embryo) og ZFL (normal hepatocytt). Protokollen består av plating av cellene i en rundbunn, ultra-lav vedlegg, 96-brønnsplate. Etter 5 dager under orbital risting (70 rpm) dannes en enkelt sfæroid per brønn. De dannede sfæroider presenterer stabil størrelse og form, og denne metoden unngår dannelsen av flere sfæroider i en brønn; Dermed er det ikke nødvendig å håndplukke sfæroider av lignende størrelser. Enkelheten, hastigheten og reproduserbarheten til denne sfæroidmetoden gjør den nyttig for høy gjennomstrømning in vitro-tester .
Introduction
Sfæroider er små kuler av celler dannet når celler dyrkes i nær celle-til-celle-kontakt i 3D-kultur. Sfæroiders evne til å etterligne in vivo vevsmiljøet har allerede blitt studert i en rekke cellelinjer og primære celler 1,2. Imidlertid, selv om sfæroider er godt utviklet for pattedyrtoksisitetsstudier, pågår utviklingen av sfæroider for toksisitetsstudier med ikke-pattedyrvirveldyr (f.eks. Fisk)fortsatt 3. For fiskecellelinjer har sfæroider blitt utviklet ved en rekke forskjellige metoder, for eksempel orbital risting (OS) ved bruk av forskjellige typer brønnplater 3,4,5,6,7, og metoden for magnetisk levitasjon ved bruk av magnetiske nanopartikler8. Noen av disse kulturmetodene for sfæroider kan imidlertid ha flere ulemper enn andre.
For eksempel kan gyratoriske metoder i store mikroplater (24-brønnplater) generere et høyt antall sfæroider som varierer i størrelse og form; Faktisk har multi-sfæroid strukturdannelse blitt demonstrert7. Dette krever intens innsats for å håndplukke sfæroider med lignende størrelse og form for et eksperiment. Den hengende dråpe 3D-kulturmetoden brukes ofte til å generere sfæroider av pattedyrcellelinjer 1,2,9,10,11, hvorved enkle sfæroider per dråpe kan genereres, og unngår problemene beskrevet ovenfor. Imidlertid, selv om en modifisert hengende dråpemetode (hengende dråpe + orbital risting) er i stand til å generere ZFL-sfæroider ved hjelp av en billig metode, har den sine ulemper12. De dannede cellulære aggregatene kan ikke opprettholdes i lange perioder i dråpene; Dermed må de overføres til brønnplater. Denne prosessen krever intens håndtering og lange perioder med arbeid i en avtrekkshette, siden den utføres dråpevis ved hjelp av en mikropipette12. I tillegg krever denne metoden 10 dager for å fullstendig danne ZFL-sfæroidene (5 dager i hengedråpe + 5 dager i OS)12. Disse ulempene kan begrense bruken av 3D-fisk sfæroider for toksisitetstesting, spesielt med tanke på potensielle bruksområder for kjemisk prioritering og produktbærekraft.
Dermed beskriver denne artikkelen en 3D-kulturprotokoll som er i stand til å generere enkle sfæroider av ZFL (D. rerio normal hepatocyte) og ZEM2S (D. rerio blastula phase embryo) cellelinjer basert på kombinert bruk av 96-brønns, ultra-lave festeplater (ULA-plater) og en orbital shaker (22 mm rotasjonsdiameter). Metoden som brukes er enkel og reproduserbar, og kan generere et høyt antall sfæroider av tilsvarende størrelse og form på kort tid (5 dager). Fordelene med denne metoden kan støtte anvendelsen av fisk 3D-modeller for akvatiske toksisitetsstudier i både industri og akademia, samt fremdriften i å implementere alternative metoder for økotoksisitetstesting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De viktigste trinnene for å generere 3D-sfæroider av ZFL- og ZEM2S-cellelinjer i en rundbunnsplate med 96 brønner er presentert i figur 1.
MERK: Se materialfortegnelsen for detaljer relatert til alle materialer som brukes i denne protokollen og tabell 1 for løsninger og kulturmedier som brukes i denne protokollen.
1. Cellekulturmedium og monolagskulturer
- Dyrk begge cellelinjene (ZFL, ZEM2S) som monolag i en inkubator ved 28 °C uten CO2, og subkultur dem i et subkultiveringsforhold på 1: 3 når de når ~ 80% samløp.
- Start med en T75-kolbe av sebrafiskceller ved ~ 80% samløp, dyrket som beskrevet ovenfor.
- Fjern hele mediet og vask cellene ved å tilsette 1x fosfatbufret saltvann (PBS) (0,01 M) til kulturkolben ved hjelp av en pipette.
- Ved hjelp av en pipette, tilsett 3 ml 1x trypsin-0,5 mM EDTA (0,05% [v / v]) til kulturkolber, og inkuber ved 28 ° C i 3 minutter for frigjøring av celler fra kolben.
- Trykk forsiktig på kolben for å frigjøre cellene, og stopp deretter trypsinfordøyelsen ved å tilsette 3 ml komplett kulturmedium til kolben.
- Bruk en pipette til å overføre cellesuspensjonen til et 15 ml konisk sentrifugerør og sentrifuger ved 100 × g i 5 minutter.
- Etter pelletsdannelsen, fjern supernatanten forsiktig, tilsett 1 ml av det komplette mediet for den respektive cellelinjen som er i bruk (ZFL eller ZEM2S), og resuspender ved hjelp av en mikropipette. Ta en aliquot for celletelling.
2. Celletelling med trypan blå fargestoff ekskluderingstest
- Tilsett 10 μL av cellesuspensjonen og 10 μL trypanblått fargestoff til et mikrorør for å telle cellene og evaluere deres levedyktighet. Bland cellesuspensjonen og fargestoffet ved hjelp av en pipette.
- Deretter overfører du 10 μL av denne blandingen (cellesuspensjon + trypanblå) til et Neubauer-kammer og teller cellene i de fire store firkantene (kvadranter: Q) plassert i hjørnene av kammeret, og vurderer celler som ikke tar opp trypanblå som levedyktige. Beregn antall levedyktige celler ved hjelp av ligning (1):
(1) - For å beregne det endelige cellenummeret i cellesuspensjonen, multipliser celletallet bestemt ved hjelp av ligning (1) med 2 (fortynningsfaktoren på grunn av bruk av trypanblått).
MERK: Alternativt kan et automatisert celletellingssystem brukes.
(1)3. Celleplettering i ULA-plater
- Etter å ha beregnet cellenummeret, juster cellesuspensjonen til plate 200 μL av denne suspensjonen per brønn på en 96-brønns rundbunns ULA-plate med antall celler som kreves for hver cellelinje, som angitt nedenfor:
- Plate 7,000 levedyktige ZFL-celler / brønn; For hele ULA-platen bruker du derfor 700 000 celler i 20 ml komplett medium.
- Plate 3,500 levedyktige ZEM2S-celler / brønn; For hele ULA-platen bruker du derfor 350 000 celler i 20 ml komplett medium.
- Forbered cellesuspensjonen med den justerte konsentrasjonen av celler i et middels reservoar og bland den med en flerkanals mikropipette, og pass på at det ikke dannes skum eller bobler. Bruk flerkanals mikropipetten til å tilsette 200 μL av den justerte cellesuspensjonen til hver brønn på ULA-platen.
MERK: Platen må forsegles med parafilm eller selvklebende tetningsfolie for å unngå fordampning av kulturmedium fra 96-brønnsplaten.
4. Sfæroid dannelse
- Inkuber ULA-platen på en orbital shaker ved 70 o / min i 5 dager i en 28 ° C inkubator. La sfæroidene dannes over 5 dager med orbital risting (figur 2), og når en gjennomsnittlig størrelse på ~ 225 μm i diameter (ZFL sfæroider) og ~ 226 μm i diameter (ZEM2S sfæroider) 12.
MERK: Etter 5 dager med inkubasjon (maksimal sirkularitet) er sfæroidene klare til bruk. - For å opprettholde sfæroider i kultur i mer enn 5 dager, fjern 100 μL av det brukte mediet hver 5. dag, og tilsett 100 μL friskt komplett kulturmedium ved hjelp av en flerkanals mikropipette.
MERK: Pass på at du ikke aspirerer sfæroidene under denne prosessen.
5. Måling av størrelse (diameter) og form (sirkularitetsindeks) av sfæroider
- Skaff deg bildene.
- Under et invertert lysmikroskop med et bildeopptakssystem, få et bilde av en definert skala.
MERK: Bruk et kalibreringslysbilde i mikroskop eller et Neubauer-lysbilde (der kvadrantstørrelsene er kjent) for å oppnå skalaen. - Under mikroskopet og ved hjelp av samme objektivlinse som brukes til å oppnå skalaens bilde, få bilder av de fullt dannede sfæroider (dvs. 5 dager gamle sfæroider).
MERK: Alle bilder må tas med samme bildeopptakssystem, da bildeoppløsning er viktig for å bestemme sfæroidenes størrelse og form, og det kan variere mellom typer systemer.
- Under et invertert lysmikroskop med et bildeopptakssystem, få et bilde av en definert skala.
- Angi skalaen.
- Bruk ImageJ-programvaren til å åpne bildet av den definerte skalaen (klikk File | open).
- Velg velgeren for rett linje fra verktøylinjen, og dra ut en linje over utvidelsen av den definerte skalaen i bildet med musen.
- Angi skalaen ved å velge Analyser | Angi skala, og vent til vinduet Set Scale åpnes.
- I vinduet Angi skala fyller du tomrommet for Kjent avstand med den kjente avstanden (μm) som tilsvarer den rette linjen; fyll Lengdeenhet med um for μm. Klikk OK.
MERK: Skalaen i piksler/μm vises nederst i vinduet.
- Angi måleparametrene.
- I ImageJ-programvaren velger du Analyser | Angi målinger for å åpne vinduet Angi målinger .
- I vinduet Angi mål velger du boksene for de ønskede målene (dvs. areal- og formbeskrivelser). Klikk OK.
- Få sfæroidenes diameter og sirkularitet.
- Åpne bildet av en sfæroid (Fil | Åpen).
- Velg frihåndsmarkeringsverktøyet på verktøylinjen, og bruk musen til å markere yttersiden av sfæroiden, som vist i figur 3A.
MERK: For å zoome inn eller ut på bildet, trykk Ctrl-tasten og bruk musen til å bla ned eller opp, eller trykk Ctrl-tasten og bruk pil opp eller pil ned på tastaturet. - Velg Analyser | Mål for å åpne resultatvinduet , der de målte verdiene vises.
- Bruk arealverdien , beregne sfæroidenes størrelse (diameter) ved hjelp av ligning (2):
(2) - Sirkularitetsindeksen er gitt i resultatvinduet som "Circ.", og beregnes automatisk av programvaren ved hjelp av ligning (3):
(3)
MERK: Sirkularitetsindeksen på 1,0 representerer en perfekt sfærisk form, mens en verdi nær 0,0 indikerer en langstrakt form13.
(2)
(3)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Enkelte sfæroider per brønn med stabil størrelse og form dannes ved denne metoden. Figur 2 illustrerer dannelsesprosessen av enkle sfæroider av ZFL- og ZEM2S-celler i en brønn av en ULA-plate under orbital risting (70 rpm). ZFL- og ZEM2S-cellelinjene har forskjellig oppførsel i 3D-kultur. ZEM2S-cellelinjen presenterer funksjoner som gir evnen til lett å danne en sfærisk form siden den første dagen av orbital risting (figur 2E), mens ZFL-cellelinjen krever 5 dager for å nå den ønskelige sfæriske formen (figur 2A-C). Sfæroidene generert av denne metoden viste også stabilitet når det gjelder form i lengre kulturperioder (perioder >5 dager), som vist i figur 2D (16 dager gammel ZFL sfæroid) og figur 2H (10 dager gammel-ZEM2S sfæroid). Sfæroidenes diameter og sirkularitet ble bestemt ved å måle deres projiserte areal i de oppnådde bildene ved hjelp av programvare for behandling og analyse av vitenskapelige bilder13 (figur 3). Materialfortegnelsen angir programvaren som brukes til bildebehandling og analyse. ZFL-celler har en tendens til å danne store celleaggregater (gjennomsnittlig størrelse 319 ± 23,33 μm) på den første dagen av orbital risting, som avtar over tid til dag 5 (225,62 ± 19,20 μm) (figur 4A), noe som øker sirkulariteten over tid i kultur (figur 4B). I motsetning til ZFL-celler danner ZEM2S-cellelinjen små sfæroider fra den første dagen (202,64 ± 5,78 μm), som gradvis øker til dag 5 (226,63 ± 4,80 μm) (figur 4C). Figur 4E viser de ulike vekstmønstrene i ZFL- og ZEM2S-cellelinjene i 3D-kultur. Vi anbefaler å bruke ZFL- og ZEM2S-sfæroidene på den femte dagen fordi de når en høyere sfæroidform (sirkularitetsindeks på henholdsvis 0,80 ± 0,01 og 0,83 ± 0,00) (figur 4B,D), som indikerer en større stabilitet for denne 3D-modellen.
Figur 1: De viktigste trinnene for å generere 3D-sfæroider av ZFL- og ZEM2S-cellelinjer i en rundbunnsplate med 96 brønner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Enkle sfæroider av ZFL- og ZEM2S-cellelinjer dannet i rundbunns 96-brønns ULA-plater under orbital risting. Et ZFL-celleaggregat dannes på den første dagen av OS (A). Celleaggregatet øker sin sirkularitet på den tredje dagen (B) og når en tilstrekkelig sfærisk form på dag 5 (C). (D) En 16 dager gammel ZFL sfæroid i ULA-plate. ZEM2S-cellelinjen danner sfæroider fra den første dagen i OS (E). ZEM2S sfæroid opprettholder sin form og øker i størrelse på den tredje dagen (F), og dens maksimale sirkularitet nås på dag 5 (G). (H) En 10 dager gammel ZEM2S sfæroid i en ULA-plate. Skalastenger = 100 μm. Forkortelser: OS = orbital risting; ULA = ultra-lav vedlegg. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Bestemme sfæroiders størrelse og sirkularitet ved hjelp av programvare for behandling og analyse av vitenskapelige bilder. Etter å ha satt programvaren til å måle et valgt område basert på en kjent skala, velg ytre side av sfæroid for å bestemme området og sirkulariteten (A). Sfæroidens område brukes til å bestemme størrelsen ved å beregne diameteren d, og programvaren gir sfæroidens sirkularitet med en formel som bruker det valgte området og omkretsen (B). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Reproduserbarhet av 3D-sfæroidmetoden vist ved ensartede sfæroider (diameter) og sirkularitet (sfærisk form). Den målte størrelsen på sfæroider av ZFL (A) og ZEM2S (B) cellelinjer. Den målte sirkularitetsindeksen for ZFL (C) og ZEM2S (D) sfæroider. Vekstmønsteret til ZFL og ZEM2S sfæroider (E). Data er representative for tre tekniske replikater fra forskjellige cellebatcher. Tallene over hvert punkt indikerer gjennomsnittet av triplikatene for dagene 1, 3 og 5. Data viste som gjennomsnitt ± standardavvik (n = 10). Denne figuren er modifisert fra Souza et al.12. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Sammenligning mellom dannelsen av ZFL og ZEM2S sfæroider utført ved to rotasjonshastigheter (70 og 100 rpm). En ZFL sfæroid (A) og ZEM2S sfæroid (B) dannet etter 5 dager med orbital risting ved 100 o / min (skalastenger representerer 100 μm). Vekstmønsteret til ZFL sfæroider (C) og ZEM2S sfæroider (D) dannet ved 70 og 100 o / min. Sirkularitetsindeksen for ZFL-sfæroider (E) og ZEM2S-sfæroider (F) dannet ved 70 og 100 o / min. Data vises som gjennomsnitt ± standardavvik (n = 10). *indikerer statistisk signifikans (p < 0,05). N.S.: Ikke-signifikant forskjell (T-test) mellom sfæroider dannet på dag 5 ved 70 og 100 o / min. Denne figuren er modifisert fra Souza et al.12. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Den cellulære integriteten og levedyktigheten til ZFL og ZEM2S sfæroider (5 dager gamle) dannet ved orbital risting i rundbunns ultra-lav vedleggsbrønnplate. Farging av cellemembraner av Lectin Alexa Fluor 594 (rød) og kjerner av DAPI (blå) demonstrerer den cellulære integriteten i kjernen av en ZEM2S sfæroid (A) og ZFL sfæroid (B). Fluorescens av resorufin (rød) dannet ved en reduksjon av Alamarblue demonstrerer levedyktige celler i kjernen av både ZEM2S (C) og ZFL (D) sfæroider. Bildene representerer ortogonale plan tatt med et konfokalmikroskop. MTT levedyktighetsanalyse i 3D-kultur (sfæroider) og 2D-kultur av ZEM2S (E) og ZFL-cellelinjen (F). Data viste som absorbansgjennomsnitt målt ved 570 nm ± standardavvik. ns: ikke-signifikant forskjell ved Welchs t-test. Denne figuren er modifisert fra Souza et al. (2021)12. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Løsninger for ZFL- og ZEM2S-dyrking. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 2: Sammenligning av 3D-sfæroidmetodene som brukes til å danne enkle ZFL-sfæroider. * Det beste resultatet for en testet parameter. en Den valgte parameteren fra de beste resultatene verifisert i den konvensjonelle hengende dråpemetoden. b Den valgte parameteren fra Baron et al.3 for å danne en fiskesfæroid med orbital risting. c Variasjoner som passer like godt til en testet parameter. Forkortelser: HD = hengende dråpe; OS = orbital risting; ULA = ultra-lav vedlegg; poly-HEMA = poly (2-hydroksyetylmetakrylat). Denne tabellen er modifisert fra Souza et al.12. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette er en enkel, enkel og rask metode for å generere sfæroider av sebrafisklever og embryocellelinjer. Denne metoden ble utviklet av denne gruppen basert på modifikasjoner av eksisterende 3D sfæroidmetoder for å overvinne problemer rapportert i vitenskapelige studier relatert til sfæroiddannelse, samt usikkerhet i datanøyaktighet fra 3D sfæroidanalyser. For eksempel ligger de rapporterte problemene i vanskeligheter med håndtering, den tidkrevende naturen til å generere sfæroider, nødvendigheten av å velge sfæroider av lignende størrelse og form for å utføre en analyse, samt vanskeligheter i prosessen med å overføre sfæroider fra dråpene til mikroplater i hengende dråpemetode 3,7,12. Videre anbefaler denne protokollen kulturen av ZFL- og ZEM2S-cellelinjer i en CO2-fri tilstand. Sammensetningen av kulturmediet og detCO2-frie miljøet som er foreslått i denne protokollen for begge cellelinjene, er bredt rapportert i litteraturen. ZFL-cellelinjen dyrkes vanligvis i L-15- og RPMI-medier med eller uten tilsetning av natriumbikarbonat og uten CO2 14,15,16,17,18,19,20. ZEM2S-cellelinjen dyrkes i henhold til instruksjonene fra bioressurssenteret, og kulturmediet ble formulert for CO2-frie kulturer; Dermed kan CO2 og luftblanding være skadelig for celler ved bruk av denne typen kulturmedier21.
Den nåværende fiskesfæroidprotokollen ble utviklet etter evaluering av flere parametere (dvs. forskjellige celletettheter, hastighet på orbital risting [70 eller 100 rpm], og bruk av forskjellige 96-brønnsplater [flat bunn eller rundbunn]) for å bestemme de beste parametrene for å danne ZFL-sfæroider. I tillegg ble det gjort en sammenligning med andre 3D-kulturmetoder (dvs. hengende dråpemetode og hengende dråpemetode kombinert med orbital ristingsmetode), noe som indikerer at orbital risting av rundbunns ULA-plater hadde den beste ytelsen (dvs. enkel, rask og reproduserbar metode). Tabell 2 viser parametrene og ytelsen til andre 3D-kulturmetoder evaluert for å danne ZFL-sfæroider.
Rundbunns ULA-plater har allerede blitt rapportert å danne enkle sfæroider av humane celler etterfulgt av sentrifugering22 eller orbital risting23,24. I denne protokollen foreslår vi bruk av samme plate, unntatt under orbital risting for å generere enkle sfæroider av sebrafiskcellelinjer (dvs. en sfæroid per brønn på en 96-brønnsplate). Dette er spesielt fordelaktig fordi det enkelt og raskt kan danne en god mengde sfæroider, og de dannede sfæroider kan opprettholdes i kultur på samme plate. Dermed kan kjemisk eksponering gjøres direkte på ULA-platen for å utføre forskjellige typer toksisitetsanalyser.
For å bestemme den tilstrekkelige orbitale ristehastigheten for å danne ZFL- og ZEM2S-sfæroider, sammenlignet vi sfæroidenes dannelse ved 70 og 100 o / min. Resultatene viser at denne metoden fungerer bedre ved 70 o / min, og en høyere rotasjonshastighet kan påvirke ZEM2S sfæroiders størrelse og form betydelig (figur 5D, F). ZFL sfæroider viste ikke signifikante forskjeller i størrelse og form ved disse rotasjonshastighetene; Imidlertid ble lavere sirkularitetsindekser oppnådd ved 100 o / min, som viste en negativ innvirkning på sfærisk form ved høyere rotasjonshastighet (figur 5C, E).
Den opprinnelige celletettheten til 3.500 ZEM2S-celler og 7.000 ZFL-celler genererer sfæroider med tilsvarende størrelser på den femte dagen i kultur (henholdsvis 226.63 og 225.62 μm). Gitt at oksygen og næringsstoffer transporteres ved diffusjon i sfæroider25, kan diameteren sterkt påvirke ernæringen og cellulær integritet i sfæroidens kjerne; Generelt anbefales sfæroider opptil 100 μm for å unngå nekrotisk kjerne26. For å verifisere den cellulære integriteten i sfæroidenes kjerne, evaluerte vi kjerne- og membranintegriteten ved immunfarging med DAPI og Lectin Alexa Fluor 594 ved konfokalmikroskopi (figur 6A, B), og sfæroidenes integritet ble demonstrert. Den cellulære levedyktigheten i sfæroidenes kjerne ble også verifisert ved å eksponere dem for resazurin (Alamarblue) og analysere fluorescensen av resorufin med et konfokalmikroskop (figur 6C,D). Når cellene er levedyktige, reduseres resazurin til resorufin (fluorescerende substans) ved cellulær metabolsk funksjon. Utførelsen av MTT-analysen viste heller ingen signifikant forskjell i cellelevedyktighet ved sammenligning av ZFL- og ZEM2S-sfæroider med monolagskultur (2D-kultur) (figur 6E,F). Selv om sfæroidene er større enn 100 μm, viser resultatene at denne protokollen genererer levedyktige sfæroider av ZFL- og ZEM2S-cellelinjer med tilstrekkelig ernæring selv i deres indre del.
Celletettheten til ZFL- og ZEM2S-celler og hastigheten på orbital risting anvendt i denne protokollen tillot dannelsen av meget stabile sfæroider i størrelse og form, med lav variabilitet blant brønnene (figur 4), og unngikk behovet for å velge tilstrekkelige sfæroider som et tidligere trinn for å utføre en analyse. Hvis analyseprosedyren krever overføring av sfæroidene til andre plater eller rør/mikrorør, kan de enkelt overføres med en mikropipette uten disaggregeringsproblemer.
Her demonstrerte vi en protokoll utviklet basert på de beste parametrene for å danne levedyktige ZFL- og ZEM2S-sfæroider. ZFL- og ZEM2S-cellelinjene kan være nyttige i akvatisk toksisitetstesting for å estimere kjemiske effekter på fisk 23,24,27,28,29,30. I tillegg kan utviklingsmessige endepunkter også studeres ved hjelp av fiskeembryocellelinjer, slik som ZEM2S-cellelinjen (fibroblastceller i blastulafasen), som beholder en grad av pluripotens28. Disse gjør disse sebrafisk sfæroider potensielt nyttig for fisk toksisitet testing. Videre, som en enkel fiskesfæroidmetode, kan den brukes i økotoksisitetstesting med høy gjennomstrømning, og støtter bruken i industri og akademia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Til minne om Dr. Márcio Lorencini, en medforfatter av dette arbeidet, en utmerket forsker innen kosmetikk og viet til å fremme kosmetisk forskning i Brasil. Forfatterne er takknemlige for flerbrukerlaboratoriet i fysiologisk avdeling (UFPR) for tilgjengelighet av utstyr og for økonomisk støtte fra koordineringen for forbedring av høyere utdanningspersonell (CAPES, Brasil) (finanskode 001) og Grupo Boticário.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate, Individually Wrapped, with Lid, Sterile | Corning | 7007 | |
| DMEM, powder, high glucose, pyruvate | Gibco | 12800-017 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, powder | Gibco | 21700026 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| Image Processing and analysis in Java (ImageJ) 1.52p software | National Institutes of Health, USA |
Available at: https://imagej.nih.gov/ij/index.html | |
| Leibovitz's L-15 Medium, powder | Gibco | 41300021 | |
| Orbital shaker | Warmnest | KLD-350-BI | 22 mm rotation diameter |
| Dulbeccos PBS (10x) with calcium and magnesium | Invitrogen | 14080055 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-014 | |
| FBS - Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | Gibco | 12657-029 | |
| Sodium bicarbonate, powder, bioreagent for molecular biology | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Trypan blue stain (0,4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 | |
| ZEM2S cell line | ATCC | CRL-2147 | This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J. Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA) |
| ZFL cell line | BCRJ | 256 |
References
- Elje, E., et al. The comet assay applied to HepG2 liver spheroids. Mutation Research. Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 845, 403033 (2019).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, N. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnology and Bioengineering. 83 (2), 173-180 (2003).
- Baron, M. G., Purcell, W. M., Jackson, S. K., Owen, S. F., Jha, A. N. Towards a more representative in vitro method for fish ecotoxicology: morphological and biochemical characterisation of three-dimensional spheroidal hepatocytes. Ecotoxicology. 21 (8), 2419-2429 (2012).
- Alves, R. F., Rocha, E., Madureira, T. V. Fish hepatocyte spheroids - A powerful (though underexplored) alternative in vitro model to study hepatotoxicity. Comparative Biochemistry and Physiology. Toxicology & Pharmacology. 262, 109470 (2022).
- Baron, M. G., et al. Pharmaceutical metabolism in fish: using a 3-D hepatic in vitro model to assess clearance. PloS One. 12 (1), 0168837 (2017).
- Langan, L. M., et al. Spheroid size does not impact metabolism of the β-blocker propranolol in 3D intestinal fish model. Frontiers in Pharmacology. 9, 947 (2018).
- Lammel, T., Tsoukatou, G., Jellinek, J., Sturve, J. Development of three-dimensional (3D) spheroid cultures of the continuous rainbow trout liver cell line RTL-W1. Ecotoxicology and Environmental Safety. 167, 250-258 (2019).
- Jeong, Y., et al. Differential effects of CBZ-induced catalysis and cytochrome gene expression in three dimensional zebrafish liver cellculture. Journal of Environmental and Analytical Toxicology. 6, 2161 (2016).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. (51), e2720 (2011).
- Lee, W. G., Ortmann, D., Hancock, M. J., Bae, H., Khademhosseini, A. A hollow sphere soft lithography approach for long-term hanging drop methods. Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (2), 249-259 (2010).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods in Molecular Medicine. 140, 141-151 (2007).
- de Souza, I. R., et al. Development of 3D cultures of zebrafish liver and embryo cell lines: a comparison of different spheroid formation methods. Ecotoxicology. 30 (9), 1893-1909 (2021).
- Ferreira, T., Rasband, W.
- Guidony, N. S., et al. ABC proteins activity and cytotoxicity in zebrafish hepatocytes exposed to triclosan. Environmental Pollution. 271, 116368 (2021).
- da Silva, N. D. G., et al. Interference of goethite in the effects of glyphosate and Roundup® on ZFL cell line. Toxicology In Vitro. 65, 104755 (2020).
- Yang, Y., et al. Temperature is a key factor influencing the invasion and proliferation of Toxoplasma gondii in fish cells. Experimental Parasitology. 217, 107966 (2020).
- Lopes, F. M., Sandrini, J. Z., Souza, M. M. Toxicity induced by glyphosate and glyphosate-based herbicides in the zebrafish hepatocyte cell line (ZF-L). Ecotoxicology and Environmental Safety. 162, 201-207 (2018).
- Lachner, D., Oliveira, L. F., Martinez, C. B. R. Effects of the water soluble fraction of gasoline on ZFL cell line: Cytotoxicity, genotoxicity and oxidative stress. Toxicology In Vitro. 30, 225-230 (2015).
- Morozesk, M., et al. Effects of multiwalled carbon nanotubes co-exposure with cadmium on zebrafish cell line: Metal uptake and accumulation, oxidative stress, genotoxicity and cell cycle. Ecotoxicology and Environmental Safety. 202, 110892 (2020).
- Dognani, G., et al. Nanofibrous membranes for low-concentration Cr VI adsorption: kinetic, thermodynamic and the influence on ZFL cells viability. Materials Research. , 24 (2021).
- ZEM2S (ATCC®CRL-2147™). American Type Culture Collection. , Available from: https://www.atcc.org/products/crl-2147 (2022).
- Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease. Scientific Reports. 6, 25187 (2016).
- Gajski, G., et al. Genotoxic potential of selected cytostatic drugs in human and zebrafish cells. Environmental Science and Pollution Research International. 23 (15), 14739-14750 (2016).
- Meng, Q., Yeung, K., Chan, K. M. Toxic effects of octocrylene on zebrafish larvae and liver cell line (ZFL). Aquatic Toxicology. 236, 105843 (2021).
- Mueller-Klieser, W. Method for the determination of oxygen consumption rates and diffusion coefficients in multicellular spheroids. Biophysical Journal. 46 (3), 343-348 (1984).
- Glicklis, R., Merchuk, J. C., Cohen, S. Modeling mass transfer in hepatocyte spheroids via cell viability, spheroid size, and hepatocellular functions. Biotechnology and Bioengineering. 86 (6), 672-680 (2004).
- Ho, R. K., Kimmel, C. B. Commitment of cell fate in the early zebrafish embryo. Science. 261 (5117), 109-111 (1993).
- Biswas, S., Emond, M. R., Jontes, J. D. Protocadherin-19 and N-cadherin interact to control cell movements during anterior neurulation. The Journal of Cell Biology. 191 (5), 1029-1041 (2010).
- Bradford, C. S., Sun, L., Collodi, P., Barnes, D. W. Cell cultures from zebrafish embryos and adult tissues. Journal of Tissue Culture Methods. 16 (2), 99-107 (1994).
- He, S., et al. Genetic and transcriptome characterization of model zebrafish cell lines. Zebrafish. 3 (4), 441-453 (2006).
