Summary
Hier stellen wir ein effektives, einfaches und schnelles 3D-Kulturprotokoll für die Bildung von Sphäroiden von zwei Zebrafisch-Zelllinien (Danio rerio) vor: ZEM2S (Embryo) und ZFL (normaler Hepatozyten).
Abstract
Fischzelllinien sind vielversprechende In-vitro-Modelle für die Ökotoxizitätsbewertung; Herkömmliche Monolayer-Kultursysteme (2D-Kulturen) haben jedoch bekannte Einschränkungen (z. B. die Langlebigkeit der Kultur und die Aufrechterhaltung einiger in vivo zellulärer Funktionen). Daher wurden 3D-Kulturen, wie z. B. Sphäroide, vorgeschlagen, da diese Modelle gewebeähnliche Strukturen reproduzieren und die In-vivo-Bedingungen besser erfassen können. Dieser Artikel beschreibt ein effektives, einfaches und schnelles 3D-Kulturprotokoll für die Bildung von Sphäroiden mit zwei Zebrafisch-Zelllinien (Danio rerio): ZEM2S (Embryo) und ZFL (normaler Hepatozyten). Das Protokoll besteht darin, die Zellen in einer 96-Well-Platte mit rundem Boden und extrem niedriger Befestigung zu plattieren. Nach 5 Tagen unter orbitalem Schütteln (70 U/min) bildet sich ein einzelnes Sphäroid pro Well. Die gebildeten Sphäroide weisen eine stabile Größe und Form auf, und diese Methode vermeidet die Bildung mehrerer Sphäroide in einer Vertiefung. Daher ist es nicht notwendig, Sphäroide ähnlicher Größe von Hand auszuwählen. Die Einfachheit, Geschwindigkeit und Reproduzierbarkeit dieser Sphäroidmethode machen sie für In-vitro-Tests mit hohem Durchsatz nützlich.
Introduction
Sphäroide sind kleine Zellkügelchen, die entstehen, wenn Zellen in engem Zell-zu-Zell-Kontakt in 3D-Kultur kultiviert werden. Die Fähigkeit von Sphäroiden, die in vivo Gewebeumgebung nachzuahmen, wurde bereits in einer Vielzahl von Zelllinien und Primärzellen untersucht 1,2. Obwohl Sphäroide für Toxizitätsstudien an Säugetieren gut entwickelt sind, ist die Entwicklung von Sphäroiden für Toxizitätsstudien mit Nicht-Säugetieren (z. B. Fischen) noch im Gange3. Für Fischzelllinien wurden Sphäroide durch eine Vielzahl verschiedener Methoden entwickelt, wie z. B. orbitales Schütteln (OS) unter Verwendung verschiedener Arten von Well-Platten 3,4,5,6,7 und die Methode der Magnetschwebetechnik unter Verwendung magnetischer Nanopartikel 8. Einige dieser Kulturmethoden für Sphäroide können jedoch mehr Nachteile haben als andere.
Beispielsweise können Kreiselmethoden in großen Mikrotiterplatten (24-Well-Platten) eine große Anzahl von Sphäroiden erzeugen, die sich in Größe und Form unterscheiden. In der Tat wurde die Bildung von Multi-Sphäroid-Strukturen nachgewiesen7. Dies erfordert intensive Bemühungen, Sphäroide mit ähnlicher Größe und Form für ein Experiment auszuwählen. Die 3D-Hängetropfen-Kulturmethode wird üblicherweise zur Erzeugung von Sphäroiden der Säugetierzelllinien 1,2,9,10,11 verwendet, wobei einzelne Sphäroide pro Tropfen erzeugt werden können, wodurch die oben beschriebenen Probleme vermieden werden. Eine modifizierte Hanging-Drop-Methode (Hanging Drop + Orbital Shaking) ist zwar in der Lage, mit einem kostengünstigen Verfahren ZFL-Sphäroide zu erzeugen, hat aber ihre Nachteile12. Die gebildeten zellulären Aggregate können in den Tropfen nicht über längere Zeiträume aufrechterhalten werden; Daher müssen sie auf Well-Platten übertragen werden. Dieser Prozess erfordert eine intensive Handhabung und lange Arbeitszeiten in einer Laminar-Flow-Haube, da er unter Verwendung einer Mikropipette12 tropfenweise durchgeführt wird. Darüber hinaus benötigt diese Methode 10 Tage, um die ZFL-Sphäroide vollständig zu bilden (5 Tage im hängenden Tropfen + 5 Tage im Betriebssystem)12. Diese Nachteile können die Anwendung von 3D-Fischsphäroiden für Toxizitätstests einschränken, insbesondere im Hinblick auf potenzielle Anwendungen für die Priorisierung von Chemikalien und die Nachhaltigkeit von Produkten.
Daher beschreibt dieser Artikel ein 3D-Kulturprotokoll, das in der Lage ist, einzelne Sphäroide von ZFL (D. rerio normal hepatozyten) und ZEM2S (D. rerio blastula phase embryo) Zelllinien zu erzeugen, basierend auf der kombinierten Verwendung von 96-Well-Ultra-Low-Attachment-Platten (ULA-Platten) und einem Orbitalschüttler (22 mm Rotationsdurchmesser). Die angewandte Methode ist einfach und reproduzierbar und kann in kurzer Zeit (5 Tage) eine große Anzahl von Sphäroiden ähnlicher Größe und Form erzeugen. Die Vorteile dieser Methode können die Anwendung von Fisch-3D-Modellen für aquatische Toxizitätsstudien sowohl in der Industrie als auch in der Wissenschaft sowie den Fortschritt bei der Implementierung alternativer Methoden für Ökotoxizitätstests unterstützen.
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Protocol
Die wichtigsten Schritte zur Erzeugung von 3D-Sphäroiden von ZFL- und ZEM2S-Zelllinien in einer 96-Well-Platte mit rundem Boden sind in Abbildung 1 dargestellt.
Anmerkungen: Einzelheiten zu allen in diesem Protokoll verwendeten Materialien finden Sie in der Materialtabelle und in Tabelle 1 zu den in diesem Protokoll verwendeten Lösungen und Nährmedien.
1. Zellkulturmedium und Monolayerkulturen
- Beide Zelllinien (ZFL, ZEM2S) werden als Monolayer in einem Inkubator bei 28 °C ohne CO2 gezüchtet und in einem Subkultivierungsverhältnis von 1:3 subkultiviert, wenn sie ~80% Konfluenz erreichen.
- Beginnen Sie mit einem T75-Kolben mit Zebrafischzellen bei ~80% Konfluenz, die wie oben beschrieben kultiviert wurden.
- Entfernen Sie das gesamte Medium und waschen Sie die Zellen, indem Sie 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) (0,01 M) mit Hilfe einer Pipette in den Kulturkolben geben.
- Mit Hilfe einer Pipette 3 mL 1x Trypsin-0,5 mM EDTA (0,05 % [v/v]) in die Kulturkolben geben und 3 min bei 28 °C inkubieren, um die Zellen aus dem Kolben zu lösen.
- Klopfen Sie vorsichtig auf den Kolben, um die Zellen freizusetzen, und stoppen Sie dann den Trypsinaufschluss, indem Sie 3 ml des vollständigen Nährmediums in den Kolben geben.
- Die Zellsuspension wird mit einer Pipette in ein konisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführt und 5 Minuten lang bei 100 × g zentrifugiert.
- Nach der Pelletbildung den Überstand vorsichtig entfernen, 1 ml des kompletten Mediums für die jeweils verwendete Zelllinie (ZFL oder ZEM2S) zugeben und mit einer Mikropipette resuspendieren. Nehmen Sie ein Aliquot für die Zellzählung.
2. Zellzählung mit Trypanblau-Farbstoff-Ausschlusstest
- Geben Sie 10 μl der Zellsuspension und 10 μl Trypanblau-Farbstoff in ein Mikroröhrchen, um die Zellen zu zählen und ihre Lebensfähigkeit zu bewerten. Mischen Sie die Zellsuspension und den Farbstoff mit einer Pipette.
- Übertragen Sie dann 10 μL dieser Mischung (Zellsuspension + Trypanblau) in eine Neubauer-Kammer und zählen Sie die Zellen in den vier großen Quadraten (Quadranten: Q), die an den Ecken der Kammer platziert sind, wobei Zellen, die kein Trypanblau aufnehmen, als lebensfähig betrachtet werden. Berechnen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen mit Gleichung (1):
(1) - Um die endgültige Zellzahl in der Zellsuspension zu berechnen, multiplizieren Sie die mit Gleichung (1) ermittelte Zellzahl mit 2 (der Verdünnungsfaktor aufgrund der Verwendung von Trypanblau).
HINWEIS: Alternativ kann ein automatisiertes Zellzählsystem verwendet werden.
(1)3. Zellbeschichtung in ULA-Platten
- Nachdem Sie die Zellzahl berechnet haben, stellen Sie die Zellsuspension auf die Platte 200 μL dieser Suspension pro Vertiefung einer 96-Well-ULA-Platte mit rundem Boden mit der Anzahl der Zellen ein, die für jede Zelllinie erforderlich ist, wie unten angegeben:
- Platte 7.000 brauchbare ZFL-Zellen /Bohrung; Verwenden Sie daher für die gesamte ULA-Platte 700.000 Zellen in 20 ml vollständigem Medium.
- Platte 3.500 lebensfähige ZEM2S-Zellen /Well; Verwenden Sie daher für die gesamte ULA-Platte 350.000 Zellen in 20 ml vollständigem Medium.
- Bereiten Sie die Zellsuspension mit der eingestellten Zellkonzentration in einem Mediumreservoir vor und mischen Sie sie mit einer Mehrkanal-Mikropipette, wobei darauf zu achten ist, dass sich kein Schaum oder Blasen bilden. Geben Sie mit der Mehrkanal-Mikropipette 200 μL der eingestellten Zellsuspension in jede Vertiefung der ULA-Platte.
Anmerkungen: Die Platte muss mit Parafilm oder selbstklebender Siegelfolie versiegelt werden, um eine Verdunstung des Nährmediums von der 96-Well-Platte zu vermeiden.
4. Sphäroidbildung
- Die ULA-Platte wird auf einem Orbitalschüttler bei 70 U/min für 5 Tage in einem 28 °C Inkubator inkubiert. Lassen Sie die Sphäroide über 5 Tage Orbitalschütteln entstehen (Abbildung 2) und erreichen Sie eine durchschnittliche Größe von ~225 μm Durchmesser (ZFL-Sphäroide) und ~226 μm Durchmesser (ZEM2S-Sphäroide)12.
HINWEIS: Nach 5 Tagen Inkubation (maximale Zirkularität) sind die Sphäroide gebrauchsfertig. - Um die Sphäroide länger als 5 Tage in Kultur zu halten, entfernen Sie alle 5 Tage 100 μl des verbrauchten Mediums und fügen Sie 100 μl frisches komplettes Nährmedium mit einer Mehrkanal-Mikropipette hinzu.
Anmerkungen: Achten Sie darauf, die Sphäroide während dieses Vorgangs nicht anzusaugen.
5. Messung der Größe (Durchmesser) und Form (Zirkularitätsindex) von Sphäroiden
- Erfassen Sie die Bilder.
- Unter einem Inverslichtmikroskop mit einem bildgebenden Erfassungssystem erhalten Sie ein Bild in einem definierten Maßstab.
HINWEIS: Verwenden Sie einen Mikroskoptisch-Kalibrierobjektträger oder einen Neubauer-Objektträger (bei dem die Quadrantengrößen bekannt sind), um die Skala zu erhalten. - Unter dem Mikroskop und mit der gleichen Objektivlinse, mit der das Bild der Skala aufgenommen wurde, erhalten Sie Bilder der vollständig ausgebildeten Sphäroide (d. h. 5 Tage alte Sphäroide).
HINWEIS: Alle Bilder müssen mit demselben Imaging-Erfassungssystem aufgenommen werden, da die Bildauflösung wichtig ist, um die Größe und Form der Sphäroide zu bestimmen, und sie kann sich je nach Systemtyp unterscheiden.
- Unter einem Inverslichtmikroskop mit einem bildgebenden Erfassungssystem erhalten Sie ein Bild in einem definierten Maßstab.
- Legen Sie die Skala fest.
- Öffnen Sie mit der ImageJ-Software das Bild des definierten Maßstabs (klicken Sie auf Datei | Öffnen).
- Wählen Sie den Geradenselektor aus der Symbolleiste aus und ziehen Sie mit der Maus eine Linie über die Verlängerung des definierten Maßstabs im Bild.
- Legen Sie den Maßstab fest, indem Sie Analysieren | Legen Sie die Skalierung fest und warten Sie, bis das Fenster " Skalierung festlegen" geöffnet wird.
- Füllen Sie im Fenster Skalierung festlegen das Leerzeichen von Bekannte Entfernung mit der bekannten Entfernung (μm), die der Geraden entspricht. Füllen Sie die Längeneinheit mit um für μm aus. Klicken Sie auf OK.
HINWEIS: Die Skalierung in Pixeln/μm wird am unteren Rand des Fensters angezeigt.
- Stellen Sie die Messparameter ein.
- Wählen Sie in der ImageJ-Software die Option Analysieren | Messungen festlegen, um das Fenster Messungen festlegen zu öffnen.
- Aktivieren Sie im Fenster Messungen festlegen die Kontrollkästchen für die gewünschten Messungen (d. h. Flächen- und Formdeskriptoren). Klicken Sie auf OK.
- Ermitteln Sie den Durchmesser und die Kreisförmigkeit der Sphäroide.
- Öffnen Sie das Bild eines Sphäroids (Menüpunkt Datei | Öffnen).
- Wählen Sie das Freihandauswahlwerkzeug in der Symbolleiste aus, und wählen Sie mit der Maus die Außenseite des Sphäroids aus, wie in Abbildung 3A dargestellt.
HINWEIS: Um das Bild zu vergrößern oder zu verkleinern, drücken Sie die Strg-Taste und scrollen Sie mit der Maus nach unten oder oben, oder drücken Sie die Strg-Taste und verwenden Sie die Aufwärts- oder Abwärtspfeiltasten auf der Tastatur. - Wählen Sie Analysieren | Messen , um das Ergebnisfenster zu öffnen, in dem die Messwerte angezeigt werden.
- Berechnen Sie mit dem Flächenwert die Größe (Durchmesser) der Sphäroide mit Gleichung (2):
(2) - Der Zirkularitätsindex wird im Ergebnisfenster als "Circ." angegeben und von der Software automatisch mit Gleichung (3) berechnet:
(3)
Anmerkungen: Der Zirkularitätsindex von 1,0 steht für eine perfekte Kugelform, während ein Wert nahe 0,0 für eine längliche Form13 steht.
(2)
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Representative Results
Auf diese Weise werden einzelne Sphäroide pro Vertiefung mit stabiler Größe und Form gebildet. Abbildung 2 zeigt den Entstehungsprozess einzelner Sphäroide von ZFL- und ZEM2S-Zellen in einer Vertiefung einer ULA-Platte unter orbitalem Schütteln (70 rpm). Die ZFL- und ZEM2S-Zelllinien verhalten sich in der 3D-Kultur unterschiedlich. Die ZEM2S-Zelllinie weist Merkmale auf, die die Fähigkeit verleihen, seit dem ersten Tag des Orbitaschüttelns leicht eine kugelförmige Form zu bilden (Abbildung 2E), während die ZFL-Zelllinie 5 Tage benötigt, um die gewünschte kugelförmige Form zu erreichen (Abbildung 2A-C). Die mit dieser Methode erzeugten Sphäroide zeigten auch in längeren Kulturperioden (Perioden >5 Tage) Formstabilität, wie in Abbildung 2D (16 Tage altes ZFL-Sphäroid) und Abbildung 2H (10 Tage altes ZEM2S-Sphäroid) gezeigt. Der Durchmesser und die Zirkularität der Sphäroide wurden durch Messung ihrer projizierten Fläche in den erhaltenen Bildern mit Hilfe einer Software zur Verarbeitung und Analyse wissenschaftlicher Bilderbestimmt 13 (Abbildung 3). Die Materialtabelle gibt an, welche Software für die Bildverarbeitung und -analyse verwendet wird. ZFL-Zellen neigen dazu, am ersten Tag des orbitalen Schüttelns große Zellaggregate (durchschnittliche Größe 319 ± 23,33 μm) zu bilden, die im Laufe der Zeit bis zum Tag 5 (225,62 ± 19,20 μm) abnehmen (Abbildung 4A), wodurch die Zirkularität im Laufe der Zeit in Kultur verbessert wird (Abbildung 4B). Im Gegensatz zu ZFL-Zellen bildet die ZEM2S-Zelllinie ab dem ersten Tag kleine Sphäroide (202,64 ± 5,78 μm), die bis zum 5. Tag (226,63 ± 4,80 μm) progressiv zunehmen (Abbildung 4C). Abbildung 4E zeigt die unterschiedlichen Wachstumsmuster in den ZFL- und ZEM2S-Zelllinien in 3D-Kultur. Wir empfehlen die Verwendung der ZFL- und ZEM2S-Sphäroide am fünften Tag, da sie eine höhere Kugelform erreichen (Zirkularitätsindex von 0,80 ± 0,01 bzw. 0,83 ± 0,00) (Abbildung 4B,D), was auf eine größere Stabilität dieses 3D-Modells hinweist.
Abbildung 1: Die wichtigsten Schritte zur Erzeugung von 3D-Sphäroiden von ZFL- und ZEM2S-Zelllinien in einer 96-Well-Platte mit rundem Boden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Einzelne Sphäroide von ZFL- und ZEM2S-Zelllinien, die in 96-Well-ULA-Platten mit rundem Boden unter orbitalem Schütteln gebildet wurden. Ein ZZL-Zellaggregat wird am ersten Tag des OS (A) gebildet. Das Zellaggregat erhöht seine Zirkularität am dritten Tag (B) und erreicht am 5. Tag (C) eine adäquate Kugelform. (D) Ein 16 Tage altes ZFL-Sphäroid in ULA-Platte. Die ZEM2S-Zelllinie bildet ab dem ersten Tag des OS (E) Sphäroide. Das ZEM2S-Sphäroid behält seine Form bei und nimmt am dritten Tag zu (F), und seine maximale Kreisförmigkeit wird am 5. Tag (G) erreicht. (H) Ein 10 Tage altes ZEM2S-Sphäroid in einer ULA-Platte. Maßstabsbalken = 100 μm. Abkürzungen: OS = orbital shakering; ULA = Ultra-Low-Attachment. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Bestimmung der Größe und Zirkularität von Sphäroiden mit Hilfe von Software zur Verarbeitung und Analyse wissenschaftlicher Bilder. Nachdem Sie die Software so eingestellt haben, dass sie einen ausgewählten Bereich basierend auf einer bekannten Skala misst, wählen Sie die Außenseite des Sphäroids aus, um seine Fläche und Kreisförmigkeit (A) zu bestimmen. Die Fläche des Sphäroids wird verwendet, um seine Größe zu bestimmen, indem der Durchmesser d berechnet wird, und die Software liefert die Zirkularität des Sphäroids durch eine Formel, die die ausgewählte Fläche und den Umfang (B) verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Reproduzierbarkeit der 3D-Sphäroid-Methode dargestellt durch Sphäroide einheitlicher Größe (Durchmesser) und Zirkularität (Kugelform). Die gemessene Größe von Sphäroiden der ZFL (A) und ZEM2S (B) Zelllinien. Der gemessene Zirkularitätsindex von ZFL (C) und ZEM2S (D) Sphäroide. Das Wachstumsmuster von ZFL- und ZEM2S-Sphäroiden (E). Die Daten sind repräsentativ für drei technische Replikate aus verschiedenen Zellchargen. Die Zahlen über jedem Punkt geben den Mittelwert der Triplikate für die Tage 1, 3 und 5 an. Die Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 10) angezeigt. Diese Abbildung wurde von Souza et al.12 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Vergleich zwischen der Bildung von ZFL- und ZEM2S-Sphäroid bei zwei Drehzahlen (70 und 100 U/min). Ein ZFL-Sphäroid (A) und ein ZEM2S-Sphäroid (B) bildeten sich nach 5 Tagen orbitalem Schütteln bei 100 U/min (Maßstabsbalken repräsentieren 100 μm). Das Wachstumsmuster der ZFL-Sphäroide (C) und ZEM2S-Sphäroide (D) bildete sich bei 70 und 100 U/min. Der Zirkularitätsindex der ZFL-Sphäroide (E) und ZEM2S-Sphäroide (F) bildete sich bei 70 und 100 U/min. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 10) angezeigt. *zeigt die statistische Signifikanz an (p < 0,05). N.S.: Nicht signifikanter Unterschied (t-Test) zwischen Sphäroiden, die sich an Tag 5 bei 70 und 100 U/min gebildet haben. Diese Abbildung wurde von Souza et al.12 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Die zelluläre Integrität und Viabilität von ZFL- und ZEM2S-Sphäroiden (5 Tage alt), die durch orbitales Schütteln in einer Well-Platte mit rundem Boden und extrem niedriger Bindung gebildet wurden. Die Färbung von Zellmembranen mit Lectin Alexa Fluor 594 (rot) und Zellkernen mit DAPI (blau) zeigt die zelluläre Integrität im Kern eines ZEM2S-Sphäroids (A) und ZFL-Sphäroids (B). Die Fluoreszenz von Resorufin (rot), die durch eine Reduktion von Alamarblue gebildet wird, zeigt lebensfähige Zellen im Kern sowohl der ZEM2S (C) als auch der ZFL (D) Sphäroide. Die Bilder stellen orthogonale Ebenen dar, die mit einem konfokalen Mikroskop aufgenommen wurden. MTT-Viabilitätstest in 3D-Kultur (Sphäroide) und 2D-Kultur der ZEM2S- (E) und ZFL-Zelllinie (F). Die Daten wurden als Mittelwert der Absorption bei 570 nm ± Standardabweichung gemessen. ns: nicht signifikanter Unterschied durch Welchs t-Test. Diese Zahl wurde von Souza et al. (2021)12 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Tabelle 1: Lösungen für die ZFL- und ZEM2S-Kultivierung. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 2: Vergleich der 3D-Sphäroid-Methoden, die zur Bildung einzelner ZFL-Sphäroide verwendet werden. * Das beste Ergebnis für einen getesteten Parameter. ein Der ausgewählte Parameter aus den besten Ergebnissen, die in der konventionellen Hängetropfenmethode überprüft wurden. b Der ausgewählte Parameter von Baron et al.3 für die Bildung eines Fischsphäroids mit orbitalem Schütteln. c Variationen, die für einen getesteten Parameter gleichermaßen geeignet sind. Abkürzungen: HD = hängender Tropfen; OS = orbitales Schütteln; ULA = Ultra-Low-Attachment; Poly-HEMA = Poly(2-hydroxyethylmethacrylat). Diese Tabelle wurde von Souza et al.12 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
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Discussion
Dies ist eine einfache, leichte und schnelle Methode zur Erzeugung von Sphäroiden aus Leber- und Embryozelllinien von Zebrafischen. Diese Methode wurde von dieser Gruppe auf der Grundlage von Modifikationen bestehender 3D-Sphäroidmethoden entwickelt, um Probleme zu überwinden, die in wissenschaftlichen Studien im Zusammenhang mit der Sphäroidbildung berichtet wurden, sowie Unsicherheiten in der Datengenauigkeit von 3D-Sphäroid-Assays. Die berichteten Probleme liegen beispielsweise in Schwierigkeiten bei der Handhabung, dem zeitaufwändigen Erzeugen von Sphäroiden, der Notwendigkeit, Sphäroide ähnlicher Größe und Form für die Durchführung eines Assays auszuwählen, sowie in Schwierigkeiten bei der Übertragung von Sphäroiden aus den Tropfen auf Mikrotiterplatten bei der Methode des hängenden Tropfens 3,7,12. Darüber hinaus empfiehlt dieses Protokoll die Kultivierung von ZFL- und ZEM2S-Zelllinien in einem CO2 -freien Zustand. Die Zusammensetzung des Nährmediums und die in diesem Protokoll vorgeschlagene CO2 -freie Umgebung für beide Zelllinien sind in der Literatur weit verbreitet. Die ZFL-Zelllinie wird in der Regel in L-15- und RPMI-Medien mit oder ohne Zusatz von Natriumbicarbonat und ohne CO2 14,15,16,17,18,19,20 kultiviert. Die ZEM2S-Zelllinie wird nach den Anweisungen des Bioressourcenzentrums kultiviert, und ihre Nährmedien wurden für CO2-freie Kulturen formuliert; Somit können CO2 und Luft bei Verwendung dieser Art von Nährmedien21 nachteilig für Zellen sein.
Das vorliegende Fisch-Sphäroid-Protokoll wurde nach Auswertung mehrerer Parameter (d.h. unterschiedliche Zelldichten, Geschwindigkeit des orbitalen Schüttelns [70 oder 100 U/min] und die Verwendung verschiedener 96-Well-Platten [flacher Boden oder runder Boden]) entwickelt, um die besten Parameter für die Bildung von ZFL-Sphäroiden zu bestimmen. Zusätzlich wurde ein Vergleich mit anderen 3D-Kulturmethoden (d.h. Hanging-Drop-Methode und Hanging-Drop-Methode in Kombination mit der Orbital-Shaking-Methode) durchgeführt, was darauf hindeutet, dass das orbitale Schütteln von ULA-Platten mit rundem Boden die beste Leistung aufweist (d.h. einfache, schnelle und reproduzierbare Methode). Tabelle 2 zeigt die Parameter und die Leistung anderer 3D-Kulturmethoden, die zur Bildung von ZFL-Sphäroiden evaluiert wurden.
Es wurde bereits berichtet, dass ULA-Platten mit rundem Boden einzelne Sphäroide menschlicher Zellen bilden, gefolgt von Zentrifugation22 oder orbitalem Schütteln23,24. In diesem Protokoll schlagen wir die Verwendung derselben Platte vor, außer unter orbitalem Schütteln, um einzelne Sphäroide von Zebrafischzelllinien zu erzeugen (d.h. ein Sphäroid pro Vertiefung einer 96-Well-Platte). Dies ist besonders vorteilhaft, da es leicht und schnell eine gute Menge an Sphäroiden bilden kann und die gebildeten Sphäroide in Kultur auf derselben Platte aufbewahrt werden können. So kann die chemische Exposition direkt auf der ULA-Platte erfolgen, um verschiedene Arten von Toxizitätstests durchzuführen.
Um die geeignete orbitale Erschütterungsgeschwindigkeit für die Bildung von ZFL- und ZEM2S-Sphäroiden zu bestimmen, verglichen wir die Formation der Sphäroide bei 70 und 100 U/min. Die Ergebnisse zeigen, dass diese Methode bei 70 U/min besser funktioniert und eine höhere Drehzahl die Größe und Form der ZEM2S-Sphäroide erheblich beeinflussen kann (Abbildung 5D,F). ZFL-Sphäroide zeigten bei diesen Drehzahlen keine signifikanten Unterschiede in Größe und Form; Bei 100 U/min wurden jedoch niedrigere Zirkularitätsindizes erzielt, die sich bei einer höheren Drehzahl negativ auf die Kugelform auswirkten (Abbildung 5C, E).
Die anfängliche Zelldichte von 3.500 ZEM2S-Zellen und 7.000 ZFL-Zellen erzeugt am fünften Tag in Kultur Sphäroide mit ähnlicher Größe (226,63 bzw. 225,62 μm). Da Sauerstoff und Nährstoffe durch Diffusion in Sphäroidetransportiert werden 25, kann ihr Durchmesser die Ernährung und zelluläre Integrität im Kern der Sphäroide stark beeinflussen. Im Allgemeinen werden Sphäroide bis zu 100 μm empfohlen, um einen nekrotischen Kern26 zu vermeiden. Um die zelluläre Integrität im Kern der Sphäroide zu verifizieren, untersuchten wir die Kern- und Membranintegrität durch Immunfärbung mit DAPI und Lectin Alexa Fluor 594 mittels konfokaler Mikroskopie (Abbildung 6A,B), und die Integrität der Sphäroide wurde nachgewiesen. Die zelluläre Lebensfähigkeit im Kern der Sphäroide wurde ebenfalls überprüft, indem sie Resazurin (Alamarblue) ausgesetzt und die Fluoreszenz von Resorufin mit einem konfokalen Mikroskop analysiert wurde (Abbildung 6C, D). Wenn die Zellen lebensfähig sind, wird das Resazurin durch die zelluläre Stoffwechselfunktion zu Resorufin (fluoreszierende Substanz) reduziert. Die Leistung des MTT-Assays zeigte auch keinen signifikanten Unterschied in der Zellviabilität im Vergleich zu ZFL- und ZEM2S-Sphäroiden mit Monolayerkultur (2D-Kultur) (Abbildung 6E,F). Obwohl die Sphäroide größer als 100 μm sind, zeigen die Ergebnisse, dass dieses Protokoll lebensfähige Sphäroide von ZFL- und ZEM2S-Zelllinien erzeugt, die auch in ihrem inneren Teil ausreichend ernährt werden.
Die Zelldichten von ZFL- und ZEM2S-Zellen und die in diesem Protokoll angewandte Geschwindigkeit des orbitalen Schüttelns ermöglichten die Bildung sehr stabiler Sphäroide in Größe und Form mit geringer Variabilität zwischen den Vertiefungen (Abbildung 4), wodurch die Auswahl geeigneter Sphäroide als vorheriger Schritt der Durchführung eines Assays vermieden wurde. Wenn das Assay-Verfahren eine Übertragung der Sphäroide auf andere Platten oder Röhrchen/Mikroröhrchen erfordert, können sie einfach mit einer Mikropipette ohne Disaggregationsprobleme übertragen werden.
Hier haben wir ein Protokoll demonstriert, das auf der Grundlage der besten Parameter entwickelt wurde, um lebensfähige ZFL- und ZEM2S-Sphäroide zu bilden. Die ZFL- und ZEM2S-Zelllinien können bei aquatischen Toxizitätstests nützlich sein, um chemische Auswirkungen auf Fische abzuschätzen 23,24,27,28,29,30. Darüber hinaus können Entwicklungsendpunkte auch anhand von Fischembryozelllinien untersucht werden, wie z. B. der ZEM2S-Zelllinie (Fibroblastenzellen der Blastula-Phase), die ein gewisses Maß an Pluripotenz aufweisen28. Diese machen diese Zebrafisch-Sphäroide potenziell nützlich für die Prüfung der Fischtoxizität. Darüber hinaus kann es als einfache Fischsphäroidmethode in Hochdurchsatz-Ökotoxizitätstests eingesetzt werden, was seine Anwendung in Industrie und Wissenschaft unterstützt.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.
Acknowledgments
In Gedenken an Dr. Márcio Lorencini, einen Mitautor dieser Arbeit, einen exzellenten Forscher auf dem Gebiet der Kosmetik, der sich der Förderung der kosmetischen Forschung in Brasilien verschrieben hat. Die Autoren danken dem Multi-User-Labor in der Abteilung für Physiologie (UFPR) für die Verfügbarkeit von Geräten und für die finanzielle Unterstützung der Koordination zur Verbesserung des Hochschulpersonals (CAPES, Brasilien) (Finance Code 001) und der Grupo Boticário.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate, Individually Wrapped, with Lid, Sterile | Corning | 7007 | |
| DMEM, powder, high glucose, pyruvate | Gibco | 12800-017 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, powder | Gibco | 21700026 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| Image Processing and analysis in Java (ImageJ) 1.52p software | National Institutes of Health, USA |
Available at: https://imagej.nih.gov/ij/index.html | |
| Leibovitz's L-15 Medium, powder | Gibco | 41300021 | |
| Orbital shaker | Warmnest | KLD-350-BI | 22 mm rotation diameter |
| Dulbeccos PBS (10x) with calcium and magnesium | Invitrogen | 14080055 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-014 | |
| FBS - Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | Gibco | 12657-029 | |
| Sodium bicarbonate, powder, bioreagent for molecular biology | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Trypan blue stain (0,4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 | |
| ZEM2S cell line | ATCC | CRL-2147 | This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J. Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA) |
| ZFL cell line | BCRJ | 256 |
References
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- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, N. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnology and Bioengineering. 83 (2), 173-180 (2003).
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