Summary
Burada, iki zebra balığı (Danio rerio) hücre hattının sferoidlerinin oluşumu için etkili, kolay ve hızlı bir 3D kültür protokolü sunuyoruz: ZEM2S (embriyo) ve ZFL (normal hepatosit).
Abstract
Balık hücre hatları, ekotoksisite değerlendirmesi için in vitro modeller vaat etmektedir; Bununla birlikte, geleneksel tek katmanlı kültür sistemlerinin (2D kültür) iyi bilinen sınırlamaları vardır (örneğin, kültürün uzun ömürlülüğü ve bazı in vivo hücresel fonksiyonların bakımı). Bu nedenle, sferoidler gibi 3D kültürler önerilmiştir, çünkü bu modeller doku benzeri yapıları yeniden üretebilir ve in vivo koşulları daha iyi yeniden yakalayabilir. Bu makalede, iki zebra balığı (Danio rerio) hücre hattına sahip sferoidlerin oluşumu için etkili, kolay ve hızlı bir 3D kültür protokolü açıklanmaktadır: ZEM2S (embriyo) ve ZFL (normal hepatosit). Protokol, hücrelerin yuvarlak tabanlı, ultra düşük bir ataşman, 96 delikli bir plaka ile kaplanmasından oluşur. Orbital sarsıntı altında 5 gün sonra (70 rpm), kuyu başına tek bir sferoid oluşur. Oluşan sferoidler kararlı boyut ve şekil sunar ve bu yöntem bir kuyuda çoklu sferoidlerin oluşumunu önler; Bu nedenle, benzer boyutlardaki sferoidleri elle seçmek gerekli değildir. Bu sferoid yöntemin kolaylığı, hızı ve tekrarlanabilirliği, yüksek verimli in vitro testler için kullanışlı olmasını sağlar.
Introduction
Sferoidler, 3D kültürde hücreler yakın hücreden hücreye temasta kültürlendiğinde oluşan küçük hücre küreleridir. Sferoidlerin in vivo doku ortamını taklit etme kapasitesi, çeşitli hücre hatlarında ve birincil hücrelerde zaten incelenmiştir 1,2. Bununla birlikte, sferoidler memeli toksisitesi çalışmaları için iyi geliştirilmiş olmasına rağmen, memeli olmayan omurgalılarla (örneğin balık) toksisite çalışmaları için sferoidlerin geliştirilmesi hala devam etmektedir3. Balık hücre hatları için, sferoidler, farklı tipte kuyu plakaları 3,4,5,6,7 kullanan yörüngesel sallama (OS) ve manyetik nanopartiküller 8 kullanılarak manyetik kaldırma yöntemi gibi çeşitli farklı yöntemlerle geliştirilmiştir. Bununla birlikte, sferoidler için bu kültür yöntemlerinden bazıları diğerlerinden daha fazla dezavantaja sahip olabilir.
Örneğin, büyük mikroplakalardaki (24 kuyucuklu plakalar) girdat yöntemleri, boyut ve şekil bakımından farklılık gösteren çok sayıda sferoid üretebilir; Gerçekten de multi-sferoid yapı oluşumu gösterilmiştir7. Bu, bir deney için benzer boyut ve şekle sahip sferoidleri elle seçmek için yoğun çaba gerektirir. Asılı damla 3D kültür yöntemi, 1,2,9,10,11 memelihücre hatlarının sferoidlerini üretmek için yaygın olarak kullanılır, böylece damla başına tek küre üretilebilir ve yukarıda açıklanan sorunlardan kaçınılabilir. Bununla birlikte, modifiye edilmiş bir asılı damla yöntemi (asılı damla + yörüngesel sallama) ucuz bir yöntem kullanarak ZFL sferoidleri üretebilse de, dezavantajları vardır12. Oluşan hücresel agregalar damlalarda uzun süre muhafaza edilemez; Bu nedenle, kuyu plakalarına aktarılmaları gerekir. Bu işlem, laminer akış davlumbazında yoğun kullanım ve uzun süreli çalışma gerektirir, çünkü bir mikropipet12 kullanılarak damla damla gerçekleştirilir. Ek olarak, bu yöntem ZFL sferoidlerini tam olarak oluşturmak için 10 gün gerektirir (asılı damlada 5 gün + işletim sisteminde 5 gün)12. Bu dezavantajlar, özellikle kimyasal önceliklendirme ve ürün sürdürülebilirliği için potansiyel uygulamalar göz önüne alındığında, toksisite testi için 3D balık sferoidlerinin uygulanmasını sınırlayabilir.
Bu nedenle, bu makalede, 96 kuyulu, ultra düşük bağlantı plakalarının (ULA-plakaları) ve bir orbital çalkalayıcının (22 mm dönme çapı) kombine kullanımına dayanan ZFL (D. rerio normal hepatosit) ve ZEM2S (D. rerio blastula faz embriyosu) hücre hatlarının tek kürelerini üretebilen bir 3D kültür protokolü açıklanmaktadır. Uygulanan yöntem basit ve tekrarlanabilir ve kısa sürede (5 gün) benzer boyut ve şekilde çok sayıda sferoid üretebilir. Bu yöntemin avantajları, hem endüstride hem de akademide sucul toksisite çalışmaları için balık 3D modellerinin uygulanmasını ve ayrıca ekotoksisite testi için alternatif yöntemlerin uygulanmasındaki ilerlemeyi destekleyebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ZFL ve ZEM2S hücre hatlarının 3D sferoidlerini yuvarlak tabanlı 96 delikli bir plakada üretmek için temel adımlar Şekil 1'de sunulmuştur.
NOT: Bu protokolde kullanılan tüm malzemelerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na ve bu protokolde kullanılan çözümler ve kültür ortamları için Tablo 1'e bakınız.
1. Hücre kültürü ortamı ve tek katmanlı kültürler
- Her iki hücre hattını da (ZFL, ZEM2S) CO2 olmadan 28 ° C'de bir inkübatörde tek katmanlı olarak büyütün ve ~% 80 birleşmeye ulaştıklarında 1: 3'lük bir alt yetiştirme oranında alt kültüre alın.
- Zebra balığı hücrelerinin T75 şişesi ile ~% 80 birleşimde, yukarıda tarif edildiği gibi kültürlenmiş olarak başlayın.
- Ortamın tamamını çıkarın ve bir pipet yardımıyla kültür şişesine 1x fosfat tamponlu salin (PBS) (0,01 M) ekleyerek hücreleri yıkayın.
- Bir pipet yardımıyla, kültür şişelerine 3 mL 1x tripsin-0,5 mM EDTA (% 0,05 [v / v]) ekleyin ve hücrelerin şişeden ayrılması için 3 dakika boyunca 28 ° C'de inkübe edin.
- Hücreleri serbest bırakmak için şişeye hafifçe dokunun ve ardından şişeye 3 mL tam kültür ortamı ekleyerek tripsin sindirimini durdurun.
- Bir pipet kullanarak, hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir konik santrifüj tüpüne aktarın ve 5 dakika boyunca 100 × g'da santrifüjleyin.
- Pelet oluşumundan sonra, süpernatanı dikkatlice çıkarın, kullanımdaki ilgili hücre hattı (ZFL veya ZEM2S) için 1 mL komple ortam ekleyin ve bir mikropipet kullanarak yeniden askıya alın. Hücre sayımı için bir aliquot alın.
2. Tripan mavisi boya dışlama testi ile hücre sayımı
- Hücreleri saymak ve canlılıklarını değerlendirmek için bir mikrotüpe 10 μL hücre süspansiyonu ve 10 μL tripan mavisi boya ekleyin. Hücre süspansiyonunu karıştırın ve bir pipet kullanarak boyayın.
- Daha sonra, bu karışımın 10 μL'sini (hücre süspansiyonu + tripan mavisi) bir Neubauer odasına aktarın ve tripan mavisini almayan hücreleri uygun olarak göz önünde bulundurarak, odanın köşelerine yerleştirilen dört büyük karedeki (kadran: Q) hücreleri sayın. Denklemi (1) kullanarak uygulanabilir hücrelerin sayısını hesaplayın:
(1) - Hücre süspansiyonundaki son hücre sayısını hesaplamak için, denklem (1) kullanılarak belirlenen hücre numarasını 2 ile çarpın (tripan mavisi kullanımından kaynaklanan seyreltme faktörü).
NOT: Alternatif olarak, otomatik bir hücre sayma sistemi kullanılabilir.
(1)3. Ula plakalarında hücre kaplaması
- Hücre numarasını hesapladıktan sonra, hücre süspansiyonunu, aşağıda belirtildiği gibi, her hücre hattı için gereken hücre sayısıyla, 96 delikli yuvarlak tabanlı bir Ula plakasının kuyucuğu başına bu süspansiyonun 200 μL'sini plakaya ayarlayın:
- Plaka 7.000 canlı ZFL hücresi / kuyusu; Bu nedenle, tüm Ula plakası için, 20 mL tam ortamda 700.000 hücre kullanın.
- Plaka 3.500 canlı ZEM2S hücresi / kuyusu; Bu nedenle, tüm Ula plakası için, 20 mL tam ortamda 350.000 hücre kullanın.
- Hücre süspansiyonunu, orta bir rezervuardaki ayarlanmış hücre konsantrasyonuyla hazırlayın ve köpük veya kabarcık oluşturmamaya dikkat ederek çok kanallı bir mikropipet kullanarak karıştırın. Çok kanallı mikropipeti kullanarak, Ula plakasının her bir kuyucuğuna 200 μL ayarlanmış hücre süspansiyonu ekleyin.
NOT: 96 delikli plakadan kültür ortamının buharlaşmasını önlemek için plaka parafilm veya yapışkan sızdırmazlık folyosu ile kapatılmalıdır.
4. Küresel oluşum
- Ula plakasını 28 ° C'lik bir inkübatörde 5 gün boyunca 70 rpm'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde inkübe edin. Sferoidlerin 5 gün boyunca orbital sallanma oluşturmasına izin verin (Şekil 2), ortalama ~225 μm çapında (ZFL sferoidler) ve ~226 μm çapında (ZEM2S sferoidler)12 boyuta ulaşın.
NOT: 5 günlük inkübasyondan sonra (maksimum dairesellik), sferoidler kullanıma hazırdır. - Sferoidleri kültürde 5 günden fazla tutmak için, harcanan ortamın 100 μL'sini her 5 günde bir çıkarın ve çok kanallı bir mikropipet kullanarak 100 μL taze tam kültür ortamı ekleyin.
NOT: Bu işlem sırasında sferoidleri aspire etmemeye dikkat edin.
5. Sferoidlerin boyut (çap) ve şeklinin (dairesellik indeksi) ölçülmesi
- Görüntüleri alın.
- Bir görüntüleme yakalama sistemine sahip ters çevrilmiş bir ışık mikroskobu altında, tanımlanmış bir ölçekte bir görüntü elde edin.
NOT: Teraziyi elde etmek için mikroskop aşaması kalibrasyon slaydı veya Neubauer slaydını (kadran boyutlarının bilindiği) kullanın. - Mikroskop altında ve ölçeğin resmini elde etmek için kullanılan aynı objektif lensi kullanarak, tam olarak oluşturulmuş sferoidlerin (yani, 5 günlük sferoidlerin) görüntülerini elde edin.
NOT: Tüm görüntüler aynı görüntüleme yakalama sistemi kullanılarak çekilmelidir, çünkü görüntü çözünürlüğü sferoidlerin boyutunu ve şeklini belirlemek için önemlidir ve sistem türleri arasında farklılık gösterebilir.
- Bir görüntüleme yakalama sistemine sahip ters çevrilmiş bir ışık mikroskobu altında, tanımlanmış bir ölçekte bir görüntü elde edin.
- Ölçeği ayarlayın.
- ImageJ yazılımını kullanarak, tanımlanan ölçeğin görüntüsünü açın ( Dosya | aç'a tıklayın).
- Araç çubuğundan düz çizgi seçiciyi seçin ve fareyi kullanarak görüntüdeki tanımlı ölçeğin uzantısı boyunca bir çizgiyi sürükleyin.
- Analiz | Ölçeği ayarlayın ve Ölçeği Ayarla penceresinin açılmasını bekleyin.
- Ölçeği Ayarla penceresinde, Bilinen mesafe boşluğunu düz çizgiye karşılık gelen bilinen mesafe (μm) ile doldurun; μm için Uzunluk birimini um ile doldurun.
NOT: Piksel/μm cinsinden ölçek pencerenin alt kısmında görüntülenir.
- Ölçüm parametrelerini ayarlayın.
- ImageJ yazılımında Analiz | Ölçüleri ayarla penceresini açmak için ölçüleri ayarlayın .
- Ölçümleri ayarla penceresinde, istenen ölçümler için kutuları seçin (örneğin, Alan ve Şekil tanımlayıcıları). Tamam'ı tıklatın.
- Sferoidlerin çapını ve daireselliğini elde edin.
- Bir kürenin resmini açın (Dosya | Açık).
- Araç çubuğunda serbest seçim aracını seçin ve fareyi kullanarak Şekil 3A'da gösterildiği gibi kürenin dış tarafını seçin.
NOT: Görüntüyü yakınlaştırmak veya uzaklaştırmak için, Ctrl tuşuna basın ve fareyi kullanarak aşağı veya yukarı kaydırın veya Ctrl tuşuna basın ve klavyedeki yukarı veya aşağı ok tuşlarını kullanın. - Analiz Et'i seçin | Ölçü Ölçüm, ölçülen değerlerin görüntülendiği Sonuçlar penceresini açmak için kullanılır.
- Alan değerini kullanarak, denklemi (2) kullanarak kürelerin boyutunu (çapını) hesaplayın:
(2) - Dairesellik indeksi, Sonuçlar penceresinde "Dairesel" olarak verilir ve yazılım tarafından denklem (3) kullanılarak otomatik olarak hesaplanır:
(3)
NOT: 1.0'ın dairesellik indeksi mükemmel bir küresel şekli temsil ederken, 0.0'a yakın bir değer uzatılmış bir şekil13'ü gösterir.
(2)
(3)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu yöntemle sabit bir boyut ve şekle sahip kuyu başına tek küre başı kullanılır. Şekil 2, ZFL ve ZEM2S hücrelerinin tek sferoidlerinin yörüngesel sarsıntı (70 rpm) altında bir Ula plakasının bir kuyucuğunda oluşum sürecini göstermektedir. ZFL ve ZEM2S hücre hatları 3D kültürde farklı davranışlara sahiptir. ZEM2S hücre hattı, orbital sarsıntının ilk gününden itibaren kolayca küresel bir şekil oluşturma yeteneği veren özellikler sunarken (Şekil 2E), ZFL hücre hattının istenen küresel şekle ulaşması 5 gün sürer (Şekil 2A-C). Bu yöntemle üretilen sferoidler, Şekil 2D (16 günlük ZFL sferoid) ve Şekil 2H'de (10 günlük-ZEM2S sferoid) gösterildiği gibi, daha uzun kültür dönemlerinde (periyotlar >5 gün) şekil açısından stabilite göstermiştir. Sferoidlerin çapı ve daireselliği, bilimsel görüntülerin işlenmesi ve analiz edilmesi için yazılım kullanılarak elde edilen görüntülerde öngörülen alanlarının ölçülmesiyle belirlenmiştir13 (Şekil 3). Malzeme Tablosu, görüntü işleme ve analiz için kullanılan yazılımı gösterir. ZFL hücreleri, orbital sarsıntının ilk gününde büyük hücre agregaları (ortalama boyut 319 ± 23.33 μm) oluşturma eğilimindedir, bu da zamanla 5. güne (225.62 ± 19.20 μm) kadar azalır (Şekil 4A), kültürde zaman içinde daireselliği arttırır (Şekil 4B). ZFL hücrelerinden farklı olarak, ZEM2S hücre hattı ilk günden itibaren (202.64 ± 5.78 μm) 5. güne (226.63 ± 4.80 μm) kadar kademeli olarak artan küçük sferoidler oluşturur (Şekil 4C). Şekil 4E, 3D kültürde ZFL ve ZEM2S hücre hatlarındaki farklı büyüme modellerini göstermektedir. ZFL ve ZEM2S sferoidlerini beşinci günde kullanmanızı öneririz, çünkü daha yüksek bir küresel şekle ulaşırlar (sırasıyla 0.80 ± 0.01 ve 0.83 ± 0.00 dairesellik indeksi) (Şekil 4B, D), bu da bu 3B modelin daha büyük bir kararlılığını gösterir.
Şekil 1: ZFL ve ZEM2S hücre hatlarının 3D sferoidlerini yuvarlak tabanlı 96 delikli bir plakada oluşturmak için temel adımlar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 2: ZFL ve ZEM2S hücre hatlarının tek küreleri, yörüngesel sarsıntı altında yuvarlak tabanlı 96 kuyucuklu ULA-plakalarında oluşmuştur. İşletim sisteminin (A) ilk gününde bir ZFL hücre agregası oluşur. Hücre agregası üçüncü günde (B) daireselliğini arttırır ve 5. günde (C) yeterli bir küresel şekle ulaşır. (D) Ula plakasında 16 günlük bir ZFL sferoidi. ZEM2S hücre hattı, işletim sisteminin (E) ilk gününden itibaren küreselleri oluşturur. ZEM2S sferoidi şeklini korur ve üçüncü günde (F) boyut olarak artar ve maksimum daireselliğine 5. günde (G) ulaşılır. (H) Ula plakasında 10 günlük bir ZEM2S sferoidi. Ölçek çubukları = 100 μm. Kısaltmalar: OS = yörüngesel sallama; ULA = ultra düşük bağlantı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Bilimsel görüntülerin işlenmesi ve analiz edilmesi için yazılım kullanarak küresellerin boyutlarının ve daireselliklerinin belirlenmesi. Yazılımı seçilen bir alanı bilinen bir ölçeğe göre ölçecek şekilde ayarladıktan sonra, alanını ve daireselliğini (A) belirlemek için kürenin dış tarafını seçin. Sferoidin alanı, d çapını hesaplayarak boyutunu belirlemek için kullanılır ve yazılım, seçilen alanı ve çevreyi (B) kullanan bir formülle sferoidin daireselliğini sağlar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Tek tip boyutlu sferoidler (çap) ve dairesellik (küresel şekil) ile gösterilen 3D sferoid yönteminin tekrarlanabilirliği. ZFL (A) ve ZEM2S (B) hücre hatlarının sferoidlerinin ölçülen boyutu. ZFL (C) ve ZEM2S (D) sferoidlerinin ölçülen dairesellik indeksi. ZFL ve ZEM2S sferoidlerinin (E) büyüme paterni. Veriler, farklı hücre gruplarından üç teknik çoğaltmayı temsil eder. Her noktanın üzerindeki sayılar, 1, 3 ve 5. günler için üçlülerin ortalamasını gösterir. Veriler ortalama ± standart sapma olarak gösterilmiştir (n = 10). Bu rakam Souza ve ark.12'den değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: İki dönme hızında (70 ve 100 rpm) gerçekleştirilen ZFL ve ZEM2S sferoidlerinin oluşumu arasındaki karşılaştırma. Bir ZFL sferoid (A) ve ZEM2S sferoid (B), 100 rpm'de 5 günlük yörüngesel sarsıntıdan sonra oluşmuştur (ölçek çubukları 100 μm'yi temsil eder). ZFL sferoidlerinin (C) ve ZEM2S sferoidlerinin (D) büyüme paterni 70 ve 100 rpm'de oluşmuştur. ZFL sferoidlerinin (E) ve ZEM2S sferoidlerinin (F) dairesellik indeksi 70 ve 100 rpm'de oluşmuştur. Veriler ortalama ± standart sapma (n=10) olarak gösterilir. *istatistiksel anlamlılığı gösterir (p < 0.05). N.S.: 5. günde 70 ve 100 rpm'de oluşan sferoidler arasında anlamlı olmayan fark (t-testi). Bu rakam Souza ve ark.12'den değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: ZFL ve ZEM2S sferoidlerinin (5 günlük) yuvarlak tabanlı ultra düşük ataşman kuyu plakasında orbital sallanma ile oluşan hücresel bütünlüğü ve canlılığı. Hücre zarlarının Lectin Alexa Fluor 594 (kırmızı) ve çekirdeklerin DAPI (mavi) ile boyanması, bir ZEM2S sferoidinin (A) ve ZFL sferoidinin (B) çekirdeğindeki hücresel bütünlüğü gösterir. Alamarblue'nun indirgenmesiyle oluşan resorufinin (kırmızı) floresansı, hem ZEM2S (C) hem de ZFL (D) sferoidlerinin çekirdeğinde canlı hücreler gösterir. Görüntüler, konfokal mikroskop kullanılarak yakalanan ortogonal düzlemleri temsil etmektedir. ZEM2S (E) ve ZFL hücre hattının (F) 3D kültüründe (sferoidler) ve 2D kültüründe MTT canlılık testi. Veriler, standart sapma ± 570 nm'de ölçülen absorbans ortalaması olarak gösterildi. ns: Welch'in t-testine göre anlamlı olmayan fark. Bu rakam Souza et al. (2021)12'den değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: ZFL ve ZEM2S yetiştiriciliği için çözümler. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 2: Tek ZFL sferoidleri oluşturmak için kullanılan 3D sferoid yöntemlerin karşılaştırılması. * Test edilmiş bir parametre için en iyi sonuç. a Geleneksel asılı damla yönteminde doğrulanan en iyi sonuçlardan seçilen parametre. b Baron ve ark.3'ten yörüngesel sallanma ile bir balık küresi oluşturmak için seçilen parametre. c Test edilen bir parametreye eşit derecede uygun varyasyonlar. Kısaltmalar: HD = asılı damla; OS = yörüngesel sarsıntı; ULA = ultra düşük bağlanma; poli-HEMA = poli(2-hidroksietil metakrilat). Bu tablo Souza ve ark.12'den değiştirilmiştir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu, zebra balığı karaciğer ve embriyo hücre hatlarının kürelerini üretmek için basit, kolay ve hızlı bir yöntemdir. Bu yöntem, bu grup tarafından, küresel oluşum ile ilgili bilimsel çalışmalarda bildirilen sorunların üstesinden gelmek için mevcut 3D sferoid yöntemlerin modifikasyonlarına ve 3D sferoid tahlillerden elde edilen veri doğruluğundaki belirsizliklere dayanarak geliştirilmiştir. Örneğin, bildirilen sorunlar, sferoidlerin üretilmesinin zaman alıcı doğası, bir tahlil yapmak için benzer boyut ve şekildeki sferoidlerin seçilmesi gerekliliğinin yanı sıra, asılı damla yöntemi 3,7,12'de sferoidlerin damlalardan mikroplakalara aktarılması sürecindeki zorluklardan kaynaklanmaktadır. Ayrıca, bu protokol ZFL ve ZEM2S hücre hatlarının CO2 içermeyen bir durumda kültürlenmesini önerir. Her iki hücre hattı için bu protokolde önerilen kültür ortamı kompozisyonu ve CO2 içermeyen ortam literatürde yaygın olarak bildirilmiştir. ZFL hücre hattı genellikle sodyum bikarbonat ilavesi olsun veya olmasın ve CO2 14,15,16,17,18,19,20 olmadan L-15 ve RPMI ortamlarında kültürlenir. ZEM2S hücre hattı, biyokaynak merkezinin talimatlarına göre kültürlenir ve kültür ortamı CO2 içermeyen kültürler için formüle edilmiştir; Bu nedenle, CO2 ve hava karışımı, bu tür kültür ortamları21 kullanıldığında hücrelere zararlı olabilir.
Mevcut balık küresel protokolü, ZFL sferoidlerini oluşturmak için en iyi parametreleri belirlemek için çeşitli parametrelerin (yani, farklı hücre yoğunlukları, yörüngesel sallanma hızı [70 veya 100 rpm] ve farklı 96 delikli plakaların [düz taban veya yuvarlak taban]) kullanılmasından sonra geliştirilmiştir. Ek olarak, diğer 3D kültür yöntemleriyle (yani, asılı damla yöntemi ve yörüngesel sallama yöntemiyle birleştirilmiş asılı damla yöntemi) bir karşılaştırma yapılarak, yuvarlak tabanlı ULA-plakalarının yörüngesel sallanmasının en iyi performansa (yani, kolay, hızlı ve tekrarlanabilir yöntem) sahip olduğunu göstermiştir. Tablo 2 , ZFL sferoidlerini oluşturmak için değerlendirilen diğer 3D kültür yöntemlerinin parametrelerini ve performansını göstermektedir.
Yuvarlak tabanlı ULA-plakalarının, insan hücrelerinin tek kürelerini oluşturduğu, ardından santrifüjleme22 veya orbital sallanma23,24 olduğu bildirilmiştir. Bu protokolde, zebra balığı hücre hatlarının tek küresellerini (yani, 96 delikli bir plakanın kuyusu başına bir küresel) üretmek için yörüngesel sallanma dışında, aynı plakanın kullanılmasını öneriyoruz. Bu özellikle avantajlıdır, çünkü kolayca ve hızlı bir şekilde iyi miktarda sferoid oluşturabilir ve oluşan sferoidler kültürde aynı plaka üzerinde tutulabilir. Böylece, kimyasal maruziyet, farklı toksisite testleri yapmak için doğrudan Ula plakası üzerinde yapılabilir.
ZFL ve ZEM2S sferoidlerini oluşturmak için yeterli orbital sarsıntı hızını belirlemek için, sferoidlerin oluşumunu 70 ve 100 rpm'de karşılaştırdık. Sonuçlar, bu yöntemin 70 rpm'de daha iyi performans gösterdiğini ve daha yüksek bir dönme hızının ZEM2S sferoidlerinin boyutunu ve şeklini önemli ölçüde etkileyebileceğini göstermektedir (Şekil 5D, F). ZFL sferoidleri bu dönme hızlarında boyut ve şekil bakımından önemli farklılıklar göstermedi; Bununla birlikte, 100 rpm'de daha düşük dairesellik indeksleri elde edildi ve daha yüksek bir dönme hızında küresel şekilde olumsuz bir etki gösterdi (Şekil 5C, E).
3.500 ZEM2S hücresinin ve 7.000 ZFL hücresinin başlangıç hücre yoğunluğu, kültürün beşinci gününde benzer boyutlarda sferoidler üretir (sırasıyla 226.63 ve 225.62 μm). Oksijen ve besin maddelerinin sferoidlerde difüzyon yoluyla taşındığı göz önüne alındığında25, çapları sferoidlerin çekirdeğindeki beslenmeyi ve hücresel bütünlüğü güçlü bir şekilde etkileyebilir; Genel olarak, nekrotik çekirdek26'yı önlemek için 100 μm'ye kadar sferoidler önerilir. Sferoidlerin çekirdeğindeki hücresel bütünlüğü doğrulamak için, konfokal mikroskopi ile DAPI ve Lektin Alexa Fluor 594 ile immün boyama yaparak nükleer ve membran bütünlüğünü değerlendirdik (Şekil 6A, B) ve sferoidlerin bütünlüğü gösterildi. Sferoidlerin çekirdeğindeki hücresel canlılık, onları resazurine (Alamarblue) maruz bırakarak ve resorufinin floresansını konfokal bir mikroskopla analiz ederek de doğrulandı (Şekil 6C, D). Hücreler canlı olduğunda, resazurin hücresel metabolik fonksiyon ile resorufin'e (floresan madde) indirgenir. MTT testinin performansı ayrıca ZFL ve ZEM2S sferoidlerini tek katmanlı kültürle (2D kültür) karşılaştıran hücre canlılığında anlamlı bir fark göstermemiştir (Şekil 6E, F). Sferoidler 100 μm'den büyük olmasına rağmen, sonuçlar bu protokolün ZFL ve ZEM2S hücre hatlarının canlı sferoidlerini iç kısımlarında bile yeterli beslenmeyle ürettiğini göstermektedir.
ZFL ve ZEM2S hücrelerinin hücre yoğunlukları ve bu protokolde uygulanan orbital sallanma hızı, kuyucuklar arasında düşük değişkenliğe sahip, boyut ve şekil olarak çok kararlı sferoidlerin oluşumuna izin verdi (Şekil 4), bir tahlil yapmanın önceki adımı olarak yeterli sferoidlerin seçilmesi ihtiyacını ortadan kaldırdı. Tahlil prosedürü sferoidlerin diğer plakalara veya tüp / mikrotüplere aktarılmasını gerektiriyorsa, ayrıştırma problemleri olmadan bir mikropipet ile kolayca aktarılabilirler.
Burada, uygulanabilir ZFL ve ZEM2S sferoidleri oluşturmak için en iyi parametrelere dayanarak geliştirilen bir protokol gösterdik. ZFL ve ZEM2S hücre hatları, balıklar üzerindeki kimyasal etkileri tahmin etmek için sucul toksisite testinde yararlı olabilir 23,24,27,28,29,30. Ek olarak, gelişimsel sonlanım noktaları, bir dereceye kadar pluripotens28'i koruyan ZEM2S hücre hattı (blastula fazının fibroblast hücreleri) gibi balık embriyosu hücre hatları kullanılarak da incelenebilir. Bunlar, bu zebra balığı sferoidlerini balık toksisitesi testi için potansiyel olarak yararlı kılar. Ayrıca, kolay bir balık küre yöntemi olarak, endüstri ve akademideki uygulamasını destekleyen yüksek verimli ekotoksisite testinde kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışmanın ortak yazarı Dr. Márcio Lorencini'nin anısına, kozmetik alanında mükemmel bir araştırmacı ve Brezilya'da kozmetik araştırmaları teşvik etmeye adanmıştır. Yazarlar, ekipman kullanılabilirliği ve Yüksek Öğrenim Personelinin İyileştirilmesi Koordinasyonu (CAPES, Brezilya) (Finans Kodu 001) ve Grupo Boticário'nun finansal desteği için Fizyoloji Bölümü'ndeki (UFPR) Çok Kullanıcılı Laboratuvara minnettardır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate, Individually Wrapped, with Lid, Sterile | Corning | 7007 | |
| DMEM, powder, high glucose, pyruvate | Gibco | 12800-017 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, powder | Gibco | 21700026 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| Image Processing and analysis in Java (ImageJ) 1.52p software | National Institutes of Health, USA |
Available at: https://imagej.nih.gov/ij/index.html | |
| Leibovitz's L-15 Medium, powder | Gibco | 41300021 | |
| Orbital shaker | Warmnest | KLD-350-BI | 22 mm rotation diameter |
| Dulbeccos PBS (10x) with calcium and magnesium | Invitrogen | 14080055 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-014 | |
| FBS - Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | Gibco | 12657-029 | |
| Sodium bicarbonate, powder, bioreagent for molecular biology | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Trypan blue stain (0,4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 | |
| ZEM2S cell line | ATCC | CRL-2147 | This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J. Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA) |
| ZFL cell line | BCRJ | 256 |
References
- Elje, E., et al. The comet assay applied to HepG2 liver spheroids. Mutation Research. Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 845, 403033 (2019).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, N. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnology and Bioengineering. 83 (2), 173-180 (2003).
- Baron, M. G., Purcell, W. M., Jackson, S. K., Owen, S. F., Jha, A. N. Towards a more representative in vitro method for fish ecotoxicology: morphological and biochemical characterisation of three-dimensional spheroidal hepatocytes. Ecotoxicology. 21 (8), 2419-2429 (2012).
- Alves, R. F., Rocha, E., Madureira, T. V. Fish hepatocyte spheroids - A powerful (though underexplored) alternative in vitro model to study hepatotoxicity. Comparative Biochemistry and Physiology. Toxicology & Pharmacology. 262, 109470 (2022).
- Baron, M. G., et al. Pharmaceutical metabolism in fish: using a 3-D hepatic in vitro model to assess clearance. PloS One. 12 (1), 0168837 (2017).
- Langan, L. M., et al. Spheroid size does not impact metabolism of the β-blocker propranolol in 3D intestinal fish model. Frontiers in Pharmacology. 9, 947 (2018).
- Lammel, T., Tsoukatou, G., Jellinek, J., Sturve, J. Development of three-dimensional (3D) spheroid cultures of the continuous rainbow trout liver cell line RTL-W1. Ecotoxicology and Environmental Safety. 167, 250-258 (2019).
- Jeong, Y., et al. Differential effects of CBZ-induced catalysis and cytochrome gene expression in three dimensional zebrafish liver cellculture. Journal of Environmental and Analytical Toxicology. 6, 2161 (2016).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. (51), e2720 (2011).
- Lee, W. G., Ortmann, D., Hancock, M. J., Bae, H., Khademhosseini, A. A hollow sphere soft lithography approach for long-term hanging drop methods. Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (2), 249-259 (2010).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods in Molecular Medicine. 140, 141-151 (2007).
- de Souza, I. R., et al. Development of 3D cultures of zebrafish liver and embryo cell lines: a comparison of different spheroid formation methods. Ecotoxicology. 30 (9), 1893-1909 (2021).
- Ferreira, T., Rasband, W.
- Guidony, N. S., et al. ABC proteins activity and cytotoxicity in zebrafish hepatocytes exposed to triclosan. Environmental Pollution. 271, 116368 (2021).
- da Silva, N. D. G., et al. Interference of goethite in the effects of glyphosate and Roundup® on ZFL cell line. Toxicology In Vitro. 65, 104755 (2020).
- Yang, Y., et al. Temperature is a key factor influencing the invasion and proliferation of Toxoplasma gondii in fish cells. Experimental Parasitology. 217, 107966 (2020).
- Lopes, F. M., Sandrini, J. Z., Souza, M. M. Toxicity induced by glyphosate and glyphosate-based herbicides in the zebrafish hepatocyte cell line (ZF-L). Ecotoxicology and Environmental Safety. 162, 201-207 (2018).
- Lachner, D., Oliveira, L. F., Martinez, C. B. R. Effects of the water soluble fraction of gasoline on ZFL cell line: Cytotoxicity, genotoxicity and oxidative stress. Toxicology In Vitro. 30, 225-230 (2015).
- Morozesk, M., et al. Effects of multiwalled carbon nanotubes co-exposure with cadmium on zebrafish cell line: Metal uptake and accumulation, oxidative stress, genotoxicity and cell cycle. Ecotoxicology and Environmental Safety. 202, 110892 (2020).
- Dognani, G., et al. Nanofibrous membranes for low-concentration Cr VI adsorption: kinetic, thermodynamic and the influence on ZFL cells viability. Materials Research. , 24 (2021).
- ZEM2S (ATCC®CRL-2147™). American Type Culture Collection. , Available from: https://www.atcc.org/products/crl-2147 (2022).
- Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease. Scientific Reports. 6, 25187 (2016).
- Gajski, G., et al. Genotoxic potential of selected cytostatic drugs in human and zebrafish cells. Environmental Science and Pollution Research International. 23 (15), 14739-14750 (2016).
- Meng, Q., Yeung, K., Chan, K. M. Toxic effects of octocrylene on zebrafish larvae and liver cell line (ZFL). Aquatic Toxicology. 236, 105843 (2021).
- Mueller-Klieser, W. Method for the determination of oxygen consumption rates and diffusion coefficients in multicellular spheroids. Biophysical Journal. 46 (3), 343-348 (1984).
- Glicklis, R., Merchuk, J. C., Cohen, S. Modeling mass transfer in hepatocyte spheroids via cell viability, spheroid size, and hepatocellular functions. Biotechnology and Bioengineering. 86 (6), 672-680 (2004).
- Ho, R. K., Kimmel, C. B. Commitment of cell fate in the early zebrafish embryo. Science. 261 (5117), 109-111 (1993).
- Biswas, S., Emond, M. R., Jontes, J. D. Protocadherin-19 and N-cadherin interact to control cell movements during anterior neurulation. The Journal of Cell Biology. 191 (5), 1029-1041 (2010).
- Bradford, C. S., Sun, L., Collodi, P., Barnes, D. W. Cell cultures from zebrafish embryos and adult tissues. Journal of Tissue Culture Methods. 16 (2), 99-107 (1994).
- He, S., et al. Genetic and transcriptome characterization of model zebrafish cell lines. Zebrafish. 3 (4), 441-453 (2006).
