Summary
Her præsenterer vi en effektiv, nem og hurtig 3D-kulturprotokol til dannelse af sfæroider af to zebrafisk (Danio rerio) cellelinjer: ZEM2S (embryo) og ZFL (normal hepatocyt).
Abstract
Fiskecellelinjer er lovende in vitro-modeller til økotoksicitetsvurdering; konventionelle enkeltlagskultursystemer (2D-kultur) har imidlertid velkendte begrænsninger (f.eks. Kulturlevetid og vedligeholdelse af nogle in vivo-cellulære funktioner). Således er 3D-kulturer, såsom sfæroider, blevet foreslået, da disse modeller kan reproducere vævslignende strukturer og bedre genvinde in vivo-betingelserne . Denne artikel beskriver en effektiv, nem og hurtig 3D-kulturprotokol til dannelse af sfæroider med to zebrafisk (Danio rerio) cellelinjer: ZEM2S (embryo) og ZFL (normal hepatocyt). Protokollen består i at platte cellerne i en rundbundet, ultra-lav vedhæftning, 96-brøndplade. Efter 5 dage under orbital omrystning (70 o / min) dannes en enkelt sfærisk pr. Brønd. De dannede sfæroider præsenterer stabil størrelse og form, og denne metode undgår dannelsen af flere sfæroider i en brønd; Det er således ikke nødvendigt at håndplukke sfæroider af lignende størrelser. Letheden, hastigheden og reproducerbarheden af denne sfæroidmetode gør den nyttig til in vitro-test med høj kapacitet.
Introduction
Sfæroider er små kugler af celler, der dannes, når celler dyrkes i tæt celle-til-celle-kontakt i 3D-kultur. Sfæroiders evne til at efterligne in vivo-vævsmiljøet er allerede blevet undersøgt i en række cellelinjer og primære celler 1,2. Selv om kuglesfæroider er veludviklede til toksicitetsundersøgelser af pattedyr, er udviklingen af sfæroider til toksicitetsundersøgelser med hvirveldyr uden for pattedyr (f.eks. fisk) stadig i gang3. For fiskecellelinjer er sfæroider blevet udviklet ved en række forskellige metoder, såsom orbital shaking (OS) ved hjælp af forskellige typer brøndplader 3,4,5,6,7 og metoden til magnetisk levitation ved hjælp af magnetiske nanopartikler 8. Imidlertid kan nogle af disse dyrkningsmetoder til sfæroider have flere ulemper end andre.
For eksempel kan gyratoriske metoder i store mikroplader (plader med 24 brønde) generere et stort antal sfæroider, der varierer i størrelse og form; Faktisk er multi-sfærisk strukturdannelse blevet demonstreret7. Dette kræver en intens indsats for at håndplukke sfæroider med en lignende størrelse og form til et eksperiment. Den hængende dråbe 3D-kulturmetode bruges almindeligvis til at generere sfæroider af pattedyrcellelinjer 1,2,9,10,11, hvorved der kan genereres enkelte sfæroider pr. dråbe, hvilket undgår de ovenfor beskrevne problemer. Men selvom en modificeret hængende dråbemetode (hængende dråbe + orbital rystning) er i stand til at generere ZFL-sfæroider ved hjælp af en billig metode, har den sine ulemper12. De dannede cellulære aggregater kan ikke opretholdes i lange perioder i dråberne; Således skal de overføres til brøndplader. Denne proces kræver intens håndtering og lange perioder med arbejde i en laminær strømningshætte, da den udføres dråbevis ved hjælp af en mikropipette12. Derudover kræver denne metode 10 dage for fuldt ud at danne ZFL-sfæroider (5 dage i hængende dråbe + 5 dage i OS)12. Disse ulemper kan begrænse anvendelsen af 3D-fiskesfæroider til toksicitetstest, især i betragtning af potentielle anvendelser til kemisk prioritering og produktbæredygtighed.
Således beskriver denne artikel en 3D-kulturprotokol, der er i stand til at generere enkeltsfæroider af ZFL (D. rerio normal hepatocyt) og ZEM2S (D. rerio blastula fase embryo) cellelinjer baseret på den kombinerede anvendelse af 96-brønds, ultra-lave fastgørelsesplader (ULA-plader) og en orbital shaker (22 mm rotationsdiameter). Den anvendte metode er enkel og reproducerbar og kan generere et stort antal sfæroider af samme størrelse og form på kort tid (5 dage). Fordelene ved denne metode kan understøtte anvendelsen af fisk 3D-modeller til akvatiske toksicitetsundersøgelser i både industrien og den akademiske verden samt fremskridt med at implementere alternative metoder til økotoksicitetstest.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De vigtigste trin til generering af 3D-sfæroider af ZFL- og ZEM2S-cellelinjer i en rundbundet plade med 96 brønde er vist i figur 1.
BEMÆRK: Se materialetabellen for detaljer vedrørende alle materialer, der anvendes i denne protokol, og tabel 1 for opløsninger og kulturmedier, der anvendes i denne protokol.
1. Cellekulturmedium og enkeltlagskulturer
- Dyrk begge cellelinjer (ZFL, ZEM2S) som monolag i en inkubator ved 28 ° C uden CO2, og subkultur dem i et subkultiveringsforhold på 1: 3, når de når ~ 80% sammenløb.
- Start med en T75-kolbe zebrafiskceller ved ~80% sammenløb, dyrket som beskrevet ovenfor.
- Hele substratet fjernes, og cellerne vaskes ved at tilsætte 1x fosfatbufret saltvand (PBS) (0,01 M) til dyrkningskolben ved hjælp af en pipette.
- Ved hjælp af en pipette tilsættes 3 ml 1x trypsin-0,5 mM EDTA (0,05% [v/v]) til dyrkningskolberne, og der inkuberes ved 28 °C i 3 minutter for at frigøre celler fra kolben.
- Bank let på kolben for at frigøre cellerne, og stop derefter trypsinfordøjelsen ved at tilsætte 3 ml komplet dyrkningsmedium til kolben.
- Brug en pipette til at overføre cellesuspensionen til et 15 ml konisk centrifugeglas og centrifuger ved 100 × g i 5 minutter.
- Efter pelletsdannelsen fjernes supernatanten forsigtigt, der tilsættes 1 ml af hele substratet til den anvendte cellelinje (ZFL eller ZEM2S), og opslæmmes igen med en mikropipette. Tag en prøve til celletælling.
2. Celletælling med prøvepanblå farvestofudelukkelsestest
- Tilsæt 10 μL af cellesuspensionen og 10 μL trypanblåt farvestof til et mikrorør for at tælle cellerne og evaluere deres levedygtighed. Bland cellesuspensionen og farvestoffet ved hjælp af en pipette.
- Overfør derefter 10 μL af denne blanding (cellesuspension + trypanblå) til et Neubauer-kammer og tæl cellerne i de fire store firkanter (kvadranter: Q), der er placeret i hjørnerne af kammeret, idet celler, der ikke optager trypanblå, betragtes som levedygtige. Beregn antallet af levedygtige celler ved hjælp af ligning (1):
(1) - For at beregne det endelige celletal i cellesuspensionen multipliceres celletallet bestemt ved ligning (1) med 2 (fortyndingsfaktoren som følge af anvendelse af trypanblåt).
BEMÆRK: Alternativt kan et automatiseret celletællingssystem bruges.
(1)3. Cellebelægning i ULA-plader
- Efter beregning af celletallet justeres celleopslæmningen til plade 200 μL af denne suspension pr. hul i en 96-brønds rundbundet ULA-plade med det antal celler, der kræves til hver cellelinje, som angivet nedenfor:
- Plade 7.000 levedygtige ZFL-celler / brønd; Brug således 700.000 celler i 20 ml komplet medium til hele ULA-pladen.
- Plade 3.500 levedygtige ZEM2S-celler / brønd; Brug således 350.000 celler i 20 ml komplet medium til hele ULA-pladen.
- Forbered cellesuspensionen med den justerede koncentration af celler i et medium reservoir og bland det ved hjælp af en multikanals mikropipette, pas på ikke at danne skum eller bobler. Ved hjælp af multikanalmikropipetten tilsættes 200 μL af den justerede cellesuspension til hvert hul i ULA-pladen.
BEMÆRK: Pladen skal forsegles med parafilm eller klæbende forseglingsfolie for at undgå fordampning af dyrkningsmediet fra 96-brøndpladen.
4. Sfærisk dannelse
- ULA-pladen inkuberes på en orbitalryster ved 70 o/min i 5 dage i en 28 °C inkubator. Lad sfæroiderne dannes over 5 dages orbitalrystning (figur 2) og nå en gennemsnitlig størrelse på ~ 225 μm i diameter (ZFL-sfæroider) og ~ 226 μm i diameter (ZEM2S-sfæroider)12.
BEMÆRK: Efter 5 dages inkubation (maksimal cirkularitet) er sfæroiderne klar til brug. - For at opretholde sfæroider i kultur i mere end 5 dage fjernes 100 μL af det brugte medium hver 5. dag, og der tilsættes 100 μL frisk komplet dyrkningsmedium ved hjælp af en multikanalmikropipette.
BEMÆRK: Pas på ikke at aspirere sfæroiderne under denne proces.
5. Måling af størrelse (diameter) og form (cirkularitetsindeks) af sfæroider
- Hent billederne.
- Under et omvendt lysmikroskop med et billedoptagelsessystem opnås et billede af en defineret skala.
BEMÆRK: Brug et mikroskoptrinkalibreringsglas eller et Neubauer-dias (hvor kvadrantstørrelserne er kendt) for at opnå skalaen. - Under mikroskopet og ved hjælp af den samme objektive linse, der bruges til at opnå skalaens billede, få billeder af de fuldt dannede sfæroider (dvs. 5 dage gamle sfæroider).
BEMÆRK: Alle billeder skal tages ved hjælp af det samme billedoptagelsessystem, da billedopløsning er vigtig for at bestemme sfæroidernes størrelse og form, og det kan variere mellem systemtyper.
- Under et omvendt lysmikroskop med et billedoptagelsessystem opnås et billede af en defineret skala.
- Indstil skalaen.
- Brug ImageJ-software til at åbne billedet af den definerede skala (klik på Filer | åben).
- Vælg den lige linjevælger på værktøjslinjen, og træk med musen en linje ud over udvidelsen af den definerede skala i billedet.
- Indstil skalaen ved at vælge Analysér | Indstil skala, og vent på, at vinduet Indstil skala åbnes.
- I vinduet Indstil skala skal du udfylde det tomme felt for Kendt afstand med den kendte afstand (μm), der svarer til den rette linje; fyld længdeenheden med um for μm. Klik på OK.
BEMÆRK: Skalaen i pixels/μm vises nederst i vinduet.
- Indstil måleparametrene.
- I ImageJ-softwaren skal du vælge Analysér | Indstil målinger for at åbne vinduet Indstil mål .
- I vinduet Indstil mål skal du markere felterne for de ønskede mål (dvs. areal- og formbeskrivelser). Klik på OK.
- Få sfæroidernes diameter og cirkularitet.
- Åbn billedet af en sfærisk (Filer | Åben).
- Vælg frihåndsmarkeringsværktøjet i værktøjslinjen, og vælg med musen ydersiden af kugleformen, som vist i figur 3A.
BEMÆRK: For at zoome ind eller ud på billedet skal du trykke på Ctrl-tasten og bruge musen til at rulle ned eller op eller trykke på Ctrl-tasten og bruge pil op eller pil ned på tastaturet. - Vælg Analysér | Mål for at åbne vinduet Resultater , hvor de målte værdier vises.
- Brug arealværdien til at beregne sfæroidernes størrelse (diameter) ved hjælp af ligning (2):
(2) - Cirkularitetsindekset angives i resultatvinduet som "Circ.", og beregnes automatisk af softwaren ved hjælp af ligning (3):
(3)
BEMÆRK: Cirkularitetsindekset på 1,0 repræsenterer en perfekt kugleform, mens en værdi tæt på 0,0 angiver en langstrakt form13.
(2)
(3)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Brønd med stabil størrelse og form dannes ved denne metode. Figur 2 illustrerer dannelsesprocessen af enkelte sfæroider af ZFL- og ZEM2S-celler i en brønd i en ULA-plade under orbitalomrystning (70 omdr./min.). ZFL- og ZEM2S-cellelinjerne har forskellig adfærd i 3D-kultur. ZEM2S-cellelinjen præsenterer funktioner, der giver evnen til let at danne en sfærisk form siden den første dag i orbitalrystningen (figur 2E), mens ZFL-cellelinjen kræver 5 dage for at nå den ønskelige sfæroidale form (figur 2A-C). De sfæroider, der genereres ved denne metode, viste også stabilitet med hensyn til form i længere dyrkningsperioder (perioder >5 dage), som vist i figur 2D (16 dage gammel ZFL-sfæroide) og figur 2H (10 dage gammel ZEM2S-sfæroide). Sfæroidernes diameter og cirkularitet blev bestemt ved at måle deres projicerede areal i de opnåede billeder ved hjælp af software til behandling og analyse af videnskabelige billeder13 (figur 3). Materialefortegnelsen angiver den software, der bruges til billedbehandling og analyse. ZFL-celler har tendens til at danne store celleaggregater (gennemsnitlig størrelse 319 ± 23,33 μm) på den første dag med orbital rystelse, som falder over tid indtil dag 5 (225,62 ± 19,20 μm) (figur 4A), hvilket forbedrer cirkulariteten over tid i kultur (figur 4B). I modsætning til ZFL-celler danner ZEM2S-cellelinjen små sfæroider fra den første dag (202,64 ± 5,78 μm), som gradvist stiger indtil dag 5 (226,63 ± 4,80 μm) (figur 4C). Figur 4E viser de forskellige vækstmønstre i ZFL- og ZEM2S-cellelinjerne i 3D-kultur. Vi anbefaler at bruge ZFL- og ZEM2S-sfæroiderne på den femte dag, fordi de når en højere sfærisk form (cirkularitetsindeks på henholdsvis 0,80 ± 0,01 og 0,83 ± 0,00) (figur 4B, D), hvilket indikerer en større stabilitet af denne 3D-model.
Figur 1: De vigtigste trin til generering af 3D-sfæroider af ZFL- og ZEM2S-cellelinjer i en rundbundet plade med 96 brønde. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Enkeltsfæroider af ZFL- og ZEM2S-cellelinjer dannet i rundbundede 96-brønds ULA-plader under orbitalrystning. Et ZFL-celleaggregat dannes på den første dag i OS (A). Celleaggregatet øger sin cirkularitet på den tredje dag (B) og når en passende sfærisk form på dag 5 (C). D) En 16 dage gammel ZFL-kugleformet i ULA-plade. ZEM2S-cellelinjen danner sfæroider fra den første dag i OS (E). ZEM2S-sfæroiden bevarer sin form og øges i størrelse på den tredje dag (F), og dens maksimale cirkularitet nås på dag 5 (G). (H) En 10 dage gammel ZEM2S-kugleformet i en ULA-plade. Skalastænger = 100 μm. Forkortelser: OS = orbital rystelse; ULA = ultra-lav vedhæftning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Bestemmelse af sfæroiders størrelse og cirkularitet ved hjælp af software til behandling og analyse af videnskabelige billeder. Når du har indstillet softwaren til at måle et valgt område baseret på en kendt skala, skal du vælge ydersiden af sfæroiden for at bestemme dens areal og cirkularitet (A). Sfæroidens areal bruges til at bestemme dens størrelse ved at beregne diameteren d, og softwaren giver sfæroidens cirkularitet ved hjælp af en formel, der bruger det valgte areal og omkreds (B). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Reproducerbarhed af 3D-sfæroidmetoden vist ved sfæroider af ensartet størrelse (diameter) og cirkularitet (sfærisk form). Den målte størrelse af sfæroider af ZFL (A) og ZEM2S (B) cellelinjerne. Det målte cirkularitetsindeks for ZFL (C) og ZEM2S (D) sfæroider. Vækstmønsteret for ZFL og ZEM2S sfæroider (E). Data er repræsentative for tre tekniske replikater fra forskellige cellebatcher. Tallene over hvert punkt angiver gennemsnittet af triplicaterne for dag 1, 3 og 5. Data viste som gennemsnit ± standardafvigelse (n = 10). Dette tal er blevet ændret fra Souza et al.12. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Sammenligning mellem dannelsen af ZFL- og ZEM2S-sfæroider udført ved to rotationshastigheder (70 og 100 omdr./min.). En ZFL-sfærisk (A) og ZEM2S-sfærisk (B) dannet efter 5 dages orbitalomrystning ved 100 o / min (skalastænger repræsenterer 100 μm). Vækstmønsteret af ZFL-sfæroider (C) og ZEM2S-sfæroider (D) dannet ved 70 og 100 o / min. Cirkularitetsindekset for ZFL-sfæroider (E) og ZEM2S-sfæroider (F) dannet ved 70 og 100 omdr./min. Data vises som gennemsnit ± standardafvigelse (n = 10). *angiver statistisk signifikans (p < 0,05). N.S.: Ikke-signifikant forskel (T-test) mellem sfæroider dannet på dag 5 ved 70 og 100 o / min. Dette tal er blevet ændret fra Souza et al.12. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Den cellulære integritet og levedygtighed af ZFL- og ZEM2S-sfæroider (5 dage gamle) dannet ved orbitalrystning i rundbundet ultra-lav fastgørelsesbrøndplade. Farvning af cellemembraner af Lectin Alexa Fluor 594 (rød) og kerner af DAPI (blå) demonstrerer den cellulære integritet i kernen af en ZEM2S sfærisk (A) og ZFL sfærisk (B). Fluorescens af resorufin (rød) dannet ved en reduktion af Alamarblue demonstrerer levedygtige celler i kernen af både ZEM2S (C) og ZFL (D) sfæroider. Billederne repræsenterer ortogonale planer fanget ved hjælp af et konfokalmikroskop. MTT-levedygtighedsanalyse i 3D-kultur (sfæroider) og 2D-kultur af ZEM2S (E) og ZFL-cellelinjen (F). Data viste som gennemsnit af absorbansen målt ved 570 nm ± standardafvigelse. ns: ikke-signifikant forskel ved Welchs t-test. Dette tal er ændret fra Souza et al. (2021)12. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Løsninger til dyrkning af ZFL og ZEM2S. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 2: Sammenligning af de 3D-sfæroidmetoder, der anvendes til dannelse af enkelte ZFL-sfæroider. * Det bedste resultat for en testet parameter. en Den valgte parameter fra de bedste resultater verificeret i den konventionelle hængende dråbemetode. b Den valgte parameter fra Baron et al.3 til dannelse af en fiskesfæroid med orbital rystelse. c Variationer, der er lige så egnede til en testet parameter. Forkortelser: HD = hængende dråbe; OS = orbital rystelse; ULA = ultra-lav vedhæftning; poly-HEMA = poly(2-hydroxyethylmethacrylat). Denne tabel er ændret fra Souza et al.12. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette er en enkel, nem og hurtig metode til generering af sfæroider af zebrafiskelever og embryocellelinjer. Denne metode blev udviklet af denne gruppe baseret på modifikationer af eksisterende 3D-sfæroidmetoder til at overvinde problemer rapporteret i videnskabelige undersøgelser relateret til sfærisk dannelse samt usikkerheder i datanøjagtighed fra 3D-sfæroidassays. De rapporterede problemer ligger f.eks. i vanskeligheder med håndtering, den tidskrævende karakter af generering af sfæroider, nødvendigheden af at udvælge sfæroider af samme størrelse og form til at udføre et assay samt vanskeligheder i processen med at overføre sfæroider fra dråberne til mikropladerne i hængende dråbemetode 3,7,12. Endvidere anbefaler denne protokol dyrkning af ZFL- og ZEM2S-cellelinjer i en CO2 -fri tilstand. Dyrkningsmediets sammensætning og det CO2 -frie miljø, der foreslås i denne protokol for begge cellelinjer, er bredt rapporteret i litteraturen. ZFL-cellelinjen dyrkes normalt i L-15- og RPMI-medier med eller uden tilsætning af natriumbicarbonat og uden CO2 14,15,16,17,18,19,20. ZEM2S-cellelinjen dyrkes i henhold til instruktioner fra bioressourcecentret, og dets kulturmedier blev formuleret til CO2 -frie kulturer; således kan CO2 og luftblanding være skadelige for celler, når der anvendes denne type kulturmedier21.
Den nuværende fiskesfæroidprotokol blev udviklet efter evaluering af flere parametre (dvs. forskellige celletætheder, hastighed for orbital rystelse [70 eller 100 o / min] og brugen af forskellige 96-brøndplader [flad bund eller rundbund]) for at bestemme de bedste parametre til dannelse af ZFL-sfæroider. Derudover blev der foretaget en sammenligning med andre 3D-kulturmetoder (dvs. hængende dråbemetode og hængende dråbemetode kombineret med orbital rystningsmetode), hvilket indikerer, at orbital rystning af rundbundede ULA-plader havde den bedste ydeevne (dvs. let, hurtig og reproducerbar metode). Tabel 2 viser parametrene og ydeevnen for andre 3D-kulturmetoder, der evalueres til dannelse af ZFL-sfæroider.
Rundbundede ULA-plader er allerede rapporteret at danne enkelte sfæroider af humane celler efterfulgt af centrifugering22 eller orbitalrystning23,24. I denne protokol foreslår vi brugen af den samme plade, undtagen under orbital rystning for at generere enkelte sfæroider af zebrafiskcellelinjer (dvs. en sfæroid pr. Brønd på en 96-brøndplade). Dette er især fordelagtigt, fordi det let og hurtigt kan danne en god mængde sfæroider, og de dannede sfæroider kan opretholdes i kultur på samme plade. Således kan kemisk eksponering udføres direkte på ULA-pladen for at udføre forskellige typer toksicitetsanalyser.
For at bestemme den tilstrækkelige orbitale rystehastighed til dannelse af ZFL- og ZEM2S-sfæroider sammenlignede vi sfæroidernes dannelse ved 70 og 100 o / min. Resultaterne viser, at denne metode fungerer bedre ved 70 o / min, og en højere rotationshastighed kan påvirke ZEM2S sfæroiders størrelse og form betydeligt (figur 5D, F). ZFL-sfæroider viste ikke signifikante forskelle i størrelse og form ved disse rotationshastigheder; Der blev imidlertid opnået lavere cirkularitetsindekser ved 100 omdr./min., hvilket viste en negativ indvirkning i kugleform ved en højere rotationshastighed (figur 5C,E).
Den indledende celletæthed på 3.500 ZEM2S-celler og 7.000 ZFL-celler genererer sfæroider med lignende størrelser på den femte dag i kultur (henholdsvis 226,63 og 225,62 μm). I betragtning af at ilt og næringsstoffer transporteres ved diffusion i sfæroider25, kan deres diameter stærkt påvirke ernæringen og den cellulære integritet i sfæroidernes kerne; Generelt anbefales sfæroider op til 100 μm for at undgå nekrotisk kerne26. For at verificere den cellulære integritet i sfæroidernes kerne evaluerede vi kerne- og membranintegriteten ved immunfarvning med DAPI og Lectin Alexa Fluor 594 ved konfokal mikroskopi (figur 6A, B), og sfæroidernes integritet blev demonstreret. Den cellulære levedygtighed i sfæroidernes kerne blev også verificeret ved at udsætte dem for resazurin (Alamarblue) og analysere fluorescensen af resorufin ved hjælp af et konfokalmikroskop (figur 6C, D). Når cellerne er levedygtige, reduceres resazurin til resorufin (fluorescerende stof) ved cellulær metabolisk funktion. MTT-analysens ydeevne viste heller ingen signifikant forskel i cellelevedygtighed, der sammenlignede ZFL- og ZEM2S-sfæroider med monolagskultur (2D-kultur) (figur 6E, F). Selvom sfæroider er større end 100 μm, viser resultaterne, at denne protokol genererer levedygtige sfæroider af ZFL- og ZEM2S-cellelinjer med tilstrækkelig ernæring selv i deres indre del.
Celletæthederne af ZFL- og ZEM2S-celler og hastigheden af orbitalrystning anvendt i denne protokol tillod dannelsen af meget stabile sfæroider i størrelse og form med lav variabilitet blandt brøndene (figur 4), idet man undgik behovet for at vælge passende sfæroider som et tidligere trin i udførelsen af et assay. Hvis analyseproceduren kræver overførsel af sfæroider til andre plader eller rør / mikrorør, kan de let overføres med en mikropipette uden disaggregeringsproblemer.
Her demonstrerede vi en protokol udviklet baseret på de bedste parametre til dannelse af levedygtige ZFL- og ZEM2S-sfæroider. ZFL- og ZEM2S-cellelinjerne kan være nyttige i test af akvatisk toksicitet for at estimere kemiske virkninger på fisk 23,24,27,28,29,30. Derudover kan udviklingsendepunkter også undersøges ved hjælp af fiskeembryocellelinjer, såsom ZEM2S-cellelinjen (fibroblastceller i blastulafasen), som bevarer en grad af pluripotens28. Disse gør disse zebrafisksfæroider potentielt nyttige til test af fisketoksicitet. Desuden kan den som en nem fiskesfærisk metode bruges i økotoksicitetstest med høj kapacitet, hvilket understøtter dens anvendelse i industrien og den akademiske verden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Til minde om Dr. Márcio Lorencini, medforfatter af dette arbejde, en fremragende forsker inden for kosmetik og dedikeret til at fremme kosmetisk forskning i Brasilien. Forfatterne er taknemmelige for multibrugerlaboratoriet i fysiologiafdelingen (UFPR) for tilgængelighed af udstyr og for den økonomiske støtte fra koordineringen til forbedring af personale på videregående uddannelser (CAPES, Brasilien) (finanskode 001) og Grupo Boticário.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate, Individually Wrapped, with Lid, Sterile | Corning | 7007 | |
| DMEM, powder, high glucose, pyruvate | Gibco | 12800-017 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, powder | Gibco | 21700026 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| Image Processing and analysis in Java (ImageJ) 1.52p software | National Institutes of Health, USA |
Available at: https://imagej.nih.gov/ij/index.html | |
| Leibovitz's L-15 Medium, powder | Gibco | 41300021 | |
| Orbital shaker | Warmnest | KLD-350-BI | 22 mm rotation diameter |
| Dulbeccos PBS (10x) with calcium and magnesium | Invitrogen | 14080055 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-014 | |
| FBS - Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | Gibco | 12657-029 | |
| Sodium bicarbonate, powder, bioreagent for molecular biology | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Trypan blue stain (0,4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 | |
| ZEM2S cell line | ATCC | CRL-2147 | This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J. Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA) |
| ZFL cell line | BCRJ | 256 |
References
- Elje, E., et al. The comet assay applied to HepG2 liver spheroids. Mutation Research. Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 845, 403033 (2019).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, N. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnology and Bioengineering. 83 (2), 173-180 (2003).
- Baron, M. G., Purcell, W. M., Jackson, S. K., Owen, S. F., Jha, A. N. Towards a more representative in vitro method for fish ecotoxicology: morphological and biochemical characterisation of three-dimensional spheroidal hepatocytes. Ecotoxicology. 21 (8), 2419-2429 (2012).
- Alves, R. F., Rocha, E., Madureira, T. V. Fish hepatocyte spheroids - A powerful (though underexplored) alternative in vitro model to study hepatotoxicity. Comparative Biochemistry and Physiology. Toxicology & Pharmacology. 262, 109470 (2022).
- Baron, M. G., et al. Pharmaceutical metabolism in fish: using a 3-D hepatic in vitro model to assess clearance. PloS One. 12 (1), 0168837 (2017).
- Langan, L. M., et al. Spheroid size does not impact metabolism of the β-blocker propranolol in 3D intestinal fish model. Frontiers in Pharmacology. 9, 947 (2018).
- Lammel, T., Tsoukatou, G., Jellinek, J., Sturve, J. Development of three-dimensional (3D) spheroid cultures of the continuous rainbow trout liver cell line RTL-W1. Ecotoxicology and Environmental Safety. 167, 250-258 (2019).
- Jeong, Y., et al. Differential effects of CBZ-induced catalysis and cytochrome gene expression in three dimensional zebrafish liver cellculture. Journal of Environmental and Analytical Toxicology. 6, 2161 (2016).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. (51), e2720 (2011).
- Lee, W. G., Ortmann, D., Hancock, M. J., Bae, H., Khademhosseini, A. A hollow sphere soft lithography approach for long-term hanging drop methods. Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (2), 249-259 (2010).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods in Molecular Medicine. 140, 141-151 (2007).
- de Souza, I. R., et al. Development of 3D cultures of zebrafish liver and embryo cell lines: a comparison of different spheroid formation methods. Ecotoxicology. 30 (9), 1893-1909 (2021).
- Ferreira, T., Rasband, W.
- Guidony, N. S., et al. ABC proteins activity and cytotoxicity in zebrafish hepatocytes exposed to triclosan. Environmental Pollution. 271, 116368 (2021).
- da Silva, N. D. G., et al. Interference of goethite in the effects of glyphosate and Roundup® on ZFL cell line. Toxicology In Vitro. 65, 104755 (2020).
- Yang, Y., et al. Temperature is a key factor influencing the invasion and proliferation of Toxoplasma gondii in fish cells. Experimental Parasitology. 217, 107966 (2020).
- Lopes, F. M., Sandrini, J. Z., Souza, M. M. Toxicity induced by glyphosate and glyphosate-based herbicides in the zebrafish hepatocyte cell line (ZF-L). Ecotoxicology and Environmental Safety. 162, 201-207 (2018).
- Lachner, D., Oliveira, L. F., Martinez, C. B. R. Effects of the water soluble fraction of gasoline on ZFL cell line: Cytotoxicity, genotoxicity and oxidative stress. Toxicology In Vitro. 30, 225-230 (2015).
- Morozesk, M., et al. Effects of multiwalled carbon nanotubes co-exposure with cadmium on zebrafish cell line: Metal uptake and accumulation, oxidative stress, genotoxicity and cell cycle. Ecotoxicology and Environmental Safety. 202, 110892 (2020).
- Dognani, G., et al. Nanofibrous membranes for low-concentration Cr VI adsorption: kinetic, thermodynamic and the influence on ZFL cells viability. Materials Research. , 24 (2021).
- ZEM2S (ATCC®CRL-2147™). American Type Culture Collection. , Available from: https://www.atcc.org/products/crl-2147 (2022).
- Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease. Scientific Reports. 6, 25187 (2016).
- Gajski, G., et al. Genotoxic potential of selected cytostatic drugs in human and zebrafish cells. Environmental Science and Pollution Research International. 23 (15), 14739-14750 (2016).
- Meng, Q., Yeung, K., Chan, K. M. Toxic effects of octocrylene on zebrafish larvae and liver cell line (ZFL). Aquatic Toxicology. 236, 105843 (2021).
- Mueller-Klieser, W. Method for the determination of oxygen consumption rates and diffusion coefficients in multicellular spheroids. Biophysical Journal. 46 (3), 343-348 (1984).
- Glicklis, R., Merchuk, J. C., Cohen, S. Modeling mass transfer in hepatocyte spheroids via cell viability, spheroid size, and hepatocellular functions. Biotechnology and Bioengineering. 86 (6), 672-680 (2004).
- Ho, R. K., Kimmel, C. B. Commitment of cell fate in the early zebrafish embryo. Science. 261 (5117), 109-111 (1993).
- Biswas, S., Emond, M. R., Jontes, J. D. Protocadherin-19 and N-cadherin interact to control cell movements during anterior neurulation. The Journal of Cell Biology. 191 (5), 1029-1041 (2010).
- Bradford, C. S., Sun, L., Collodi, P., Barnes, D. W. Cell cultures from zebrafish embryos and adult tissues. Journal of Tissue Culture Methods. 16 (2), 99-107 (1994).
- He, S., et al. Genetic and transcriptome characterization of model zebrafish cell lines. Zebrafish. 3 (4), 441-453 (2006).
