Summary
Här presenterar vi ett effektivt, enkelt och snabbt 3D-odlingsprotokoll för bildandet av sfäroider av två zebrafiskcellinjer (Danio rerio): ZEM2S (embryo) och ZFL (normal hepatocyt).
Abstract
Fiskcellinjer är lovande in vitro-modeller för ekotoxicitetsbedömning; konventionella monolagerkultursystem (2D-kultur) har dock välkända begränsningar (t.ex. kulturlivslängd och underhåll av vissa cellulära funktioner in vivo ). Således har 3D-kulturer, såsom sfäroider, föreslagits, eftersom dessa modeller kan reproducera vävnadsliknande strukturer, bättre återfånga in vivo-förhållandena . Denna artikel beskriver ett effektivt, enkelt och snabbt 3D-odlingsprotokoll för bildning av sfäroider med två zebrafiskcellinjer (Danio rerio): ZEM2S (embryo) och ZFL (normal hepatocyt). Protokollet består av plätering av cellerna i en rundbotten, ultralåg fastsättning, 96-brunnsplatta. Efter 5 dagar under orbital skakning (70 rpm) bildas en enda sfäroid per brunn. De bildade sfäroiderna presenterar stabil storlek och form, och denna metod undviker bildandet av flera sfäroider i en brunn; Således är det inte nödvändigt att handplocka sfäroider av liknande storlekar. Enkelheten, hastigheten och reproducerbarheten hos denna sfäroidmetod gör den användbar för in vitro-tester med hög genomströmning.
Introduction
Sfäroider är små sfärer av celler som bildas när celler odlas i nära cell-till-cell-kontakt i 3D-odling. Spheroids förmåga att efterlikna vävnadsmiljön in vivo har redan studerats i en mängd olika cellinjer och primära celler 1,2. Även om sfäroider är väl utvecklade för toxicitetsstudier på däggdjur pågår fortfarande utvecklingen av sfäroider för toxicitetsstudier med ryggradsdjur som inte är däggdjur (t.ex. fisk)3. För fiskcellinjer har sfäroider utvecklats med en mängd olika metoder, såsom orbital skakning (OS) med olika typer av brunnsplattor 3,4,5,6,7 och metoden för magnetisk levitation med magnetiska nanopartiklar 8. Vissa av dessa odlingsmetoder för sfäroider kan emellertid ha fler nackdelar än andra.
Till exempel kan gyratoriska metoder i stora mikroplattor (24-brunnsplattor) generera ett stort antal sfäroider som skiljer sig åt i storlek och form; Faktum är att multisfäroid strukturbildning har visats7. Detta kräver intensiva ansträngningar för att handplocka sfäroider med liknande storlek och form för ett experiment. Den hängande droppe 3D-odlingsmetoden används vanligtvis för att generera sfäroider av däggdjurscellinjer 1,2,9,10,11, varigenom enstaka sfäroider per droppe kan genereras, vilket undviker de problem som beskrivs ovan. Även om en modifierad hängande droppmetod (hängande droppe + orbital skakning) kan generera ZFL-sfäroider med en billig metod, har den sina nackdelar12. De bildade cellaggregaten kan inte bibehållas under långa perioder i dropparna; Således måste de överföras till brunnsplattor. Denna process kräver intensiv hantering och långa perioder av arbete i en laminär flödeshuv, eftersom den utförs droppvis med en mikropipett12. Dessutom kräver denna metod 10 dagar för att fullständigt bilda ZFL-sfäroiderna (5 dagar i hängande droppe + 5 dagar i OS)12. Dessa nackdelar kan begränsa tillämpningen av 3D-fisksfäroider för toxicitetstestning, särskilt med tanke på potentiella tillämpningar för kemisk prioritering och produkthållbarhet.
Således beskriver denna artikel ett 3D-odlingsprotokoll som kan generera enstaka sfäroider av ZFL (D. rerio normal hepatocyt) och ZEM2S (D. rerio blastula fas embryo) cellinjer baserat på kombinerad användning av 96-brunnar, ultralåga fästplattor (ULA-plattor) och en orbital shaker (22 mm rotationsdiameter). Metoden som används är enkel och reproducerbar och kan generera ett stort antal sfäroider av liknande storlek och form på kort tid (5 dagar). Fördelarna med denna metod kan stödja tillämpningen av fisk 3D-modeller för akvatiska toxicitetsstudier inom både industrin och den akademiska världen, liksom framstegen med att implementera alternativa metoder för ekotoxicitetstestning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De viktigaste stegen för att generera 3D-sfäroider av ZFL- och ZEM2S-cellinjer i en rundbottnad 96-brunnsplatta presenteras i figur 1.
OBS: Se materialtabellen för detaljer relaterade till alla material som används i detta protokoll och tabell 1 för lösningar och odlingsmedier som används i detta protokoll.
1. Cellodlingsmedium och monolagerkulturer
- Odla båda cellinjerna (ZFL, ZEM2S) som monolager i en inkubator vid 28 ° C utan CO2 och subkultur dem vid ett subodlingsförhållande på 1: 3 när de når ~ 80% sammanflöde.
- Börja med en T75-kolv zebrafiskceller vid ~ 80% sammanflöde, odlad enligt beskrivningen ovan.
- Ta bort hela mediet och tvätta cellerna genom att tillsätta 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (0,01 M) till odlingskolven med hjälp av en pipett.
- Tillsätt med hjälp av en pipett 3 ml 1x trypsin-0,5 mM EDTA (0,05 % [v/v]) till odlingskolvarna och inkubera vid 28 °C i 3 minuter så att cellerna avlägsnas från kolven.
- Knacka försiktigt på kolven för att frigöra cellerna och stoppa sedan trypsinuppslutningen genom att tillsätta 3 ml komplett odlingsmedium till kolven.
- Överför cellsuspensionen med pipett till ett 15 ml koniskt centrifugrör och centrifugera vid 100 × g i 5 minuter.
- Efter pelletsbildningen, avlägsna försiktigt supernatanten, tillsätt 1 ml av hela mediet för respektive cellinje som används (ZFL eller ZEM2S) och suspendera igen med en mikropipett. Ta en alikvot för cellräkning.
2. Cellräkning med trypanblått färguteslutningstest
- Tillsätt 10 μL av cellsuspensionen och 10 μL trypanblått färgämne till ett mikrorör för att räkna cellerna och utvärdera deras livskraft. Blanda cellsuspensionen och färgämnet med en pipett.
- Överför sedan 10 μL av denna blandning (cellsuspension + trypanblått) till en Neubauer-kammare och räkna cellerna i de fyra stora rutorna (kvadranter: Q) placerade i kammarens hörn, med tanke på celler som inte tar upp trypanblått som livskraftigt. Beräkna antalet livskraftiga celler med ekvation (1):
(1) - För att beräkna det slutliga cellnumret i cellsuspensionen, multiplicera cellnumret bestämt med ekvation (1) med 2 (utspädningsfaktorn på grund av användning av trypanblått).
OBS: Alternativt kan ett automatiserat cellräkningssystem användas.
(1)3. Cellplätering i ULA-plattor
- Efter beräkning av cellantalet, justera cellsuspensionen till platta 200 μL av denna suspension per brunn på en 96-brunns rundbottnad ULA-platta med det antal celler som krävs för varje cellinje, enligt nedan:
- Platta 7,000 livskraftiga ZFL-celler / brunn; Således, för hela ULA-plattan, använd 700 000 celler i 20 ml komplett medium.
- Platta 3 500 livskraftiga ZEM2S-celler /brunn; Således, för hela ULA-plattan, använd 350 000 celler i 20 ml komplett medium.
- Förbered cellsuspensionen med den justerade koncentrationen av celler i en medelstor behållare och blanda den med en flerkanalig mikropipett, var försiktig så att du inte bildar skum eller bubblor. Tillsätt med hjälp av flerkanalsmikropipetten 200 μL av den justerade cellsuspensionen till varje brunn på ULA-plattan.
OBS: Plattan måste förseglas med parafilm eller självhäftande tätningsfolie för att undvika avdunstning av odlingsmediet från 96-brunnsplattan.
4. Sfäroidbildning
- Inkubera ULA-plattan på en orbitalskakapparat vid 70 rpm i 5 dagar i en 28 °C inkubator. Låt sfäroiderna bildas under 5 dagars skakning i omloppsbana (figur 2) och nå en genomsnittlig storlek på ~225 μm i diameter (ZFL-sfäroider) och ~226 μm i diameter (ZEM2S-sfäroider)12.
OBS: Efter 5 dagars inkubation (maximal cirkularitet) är sfäroiderna redo att användas. - För att hålla sfäroiderna i kultur i mer än 5 dagar, avlägsna 100 μL av det förbrukade mediet var 5: e dag och tillsätt 100 μL färskt komplett odlingsmedium med en flerkanalig mikropipett.
OBS: Var försiktig så att du inte aspirerar sfäroiderna under denna process.
5. Mätning av storlek (diameter) och form (cirkularitetsindex) av sfäroider
- Hämta bilderna.
- Under ett inverterat ljusmikroskop med ett bildinspelningssystem, få en bild av en definierad skala.
OBS: Använd en kalibreringsglas i mikroskop eller en Neubauer-bild (där kvadrantstorlekarna är kända) för att få skalan. - Under mikroskopet och med samma objektivlins som används för att få skalans bild, få bilder av de fullbildade sfäroiderna (dvs 5 dagar gamla sfäroider).
OBS: Alla bilder måste tas med samma bildtagningssystem, eftersom bildupplösningen är viktig för att bestämma sfäroidernas storlek och form, och det kan skilja sig åt mellan olika typer av system.
- Under ett inverterat ljusmikroskop med ett bildinspelningssystem, få en bild av en definierad skala.
- Ställ in skalan.
- Använd programvaran ImageJ och öppna bilden av den definierade skalan (klicka på Arkiv | öppna).
- Välj raklinjeväljaren i verktygsfältet och dra med musen ut en linje över förlängningen av den definierade skalan i bilden.
- Ställ in skalan genom att välja Analysera | Ställ in skala och vänta tills fönstret Ange skala öppnas.
- I fönstret Ange skala fyller du tomrummet för Känt avstånd med det kända avståndet (μm) som motsvarar den raka linjen; fyll i längdenheten med um för μm. Klicka på OK.
OBS: Skalan i pixlar/μm visas längst ner i fönstret.
- Ställ in mätparametrarna.
- I ImageJ-programvaran väljer du Analysera | Ställ in mått för att öppna fönstret Ange mått .
- I fönstret Ange mått markerar du rutorna för önskade mått (dvs. Area- och Formbeskrivningar). Klicka på OK.
- Erhåll sfäroidernas diameter och cirkularitet.
- Öppna bilden av en sfäroid (Arkiv | Öppen).
- Välj markeringsverktyget för frihand i verktygsfältet och använd musen för att markera sfäroidens utsida, som visas i figur 3A.
Om du vill zooma in eller ut på bilden trycker du på Ctrl-tangenten och använder musen för att rulla nedåt eller uppåt, eller trycker på Ctrl-tangenten och använder upp- eller nedpilarna på tangentbordet. - Välj Analysera | Mät för att öppna fönstret Resultat där mätvärdena visas.
- Använd Area-värdet och beräkna sfäroidernas storlek (diameter) med hjälp av ekvation (2):
(2) - Cirkularitetsindexet anges i resultatfönstret som "Circ.", och beräknas automatiskt av programvaran med ekvation (3):
(3)
OBS: Cirkularitetsindexet på 1,0 representerar en perfekt sfäroidform, medan ett värde nära 0,0 indikerar en långsträckt form13.
(2)
(3)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Enstaka sfäroider per brunn med en stabil storlek och form bildas med denna metod. Figur 2 illustrerar bildningsprocessen av enskilda sfäroider av ZFL- och ZEM2S-celler i en brunn på en ULA-platta under orbitalskakning (70 rpm). ZFL- och ZEM2S-cellinjerna har olika beteenden i 3D-kulturen. ZEM2S-cellinjen presenterar funktioner som ger förmågan att lätt bilda en sfäroidform sedan den första dagen av orbitalskakningen (figur 2E), medan ZFL-cellinjen kräver 5 dagar för att nå den önskvärda sfäroidformen (figur 2A-C). De sfäroider som genererades med denna metod visade också stabilitet i form under längre perioder av odling (perioder >5 dagar), vilket visas i figur 2D (16 dagar gammal ZFL-sfäroid) och figur 2H (10 dagar gammal-ZEM2S sfäroid). Sfäroidernas diameter och cirkularitet bestämdes genom att mäta deras projicerade yta i de erhållna bilderna med hjälp av programvara för bearbetning och analys av vetenskapliga bilder13 (figur 3). Materialförteckningen anger den programvara som används för bildbehandling och analys. ZFL-celler tenderar att bilda stora cellaggregat (medelstorlek 319 ± 23,33 μm) den första dagen av orbitalskakning, vilket minskar med tiden fram till dag 5 (225,62 ± 19,20 μm) (figur 4A), vilket förbättrar cirkulariteten över tid i kulturen (figur 4B). Till skillnad från ZFL-celler bildar ZEM2S-cellinjen små sfäroider från den första dagen (202,64 ± 5,78 μm), som gradvis ökar fram till dag 5 (226,63 ± 4,80 μm) (figur 4C). Figur 4E visar de olika tillväxtmönstren i ZFL- och ZEM2S-cellinjerna i 3D-odling. Vi rekommenderar att du använder ZFL- och ZEM2S-sfäroiderna den femte dagen eftersom de når en högre sfäroidform (cirkularitetsindex på 0,80 ± 0,01 respektive 0,83 ± 0,00) (figur 4B, D), vilket indikerar en större stabilitet för denna 3D-modell.
Figur 1: De viktigaste stegen för att generera 3D-sfäroider av ZFL- och ZEM2S-cellinjer i en rundbottnad 96-brunnsplatta. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Enstaka sfäroider av ZFL- och ZEM2S-cellinjer bildade i rundbottnade 96-brunns ULA-plattor under orbitalskakning. Ett ZFL-cellaggregat bildas den första dagen av OS (A). Cellaggregatet ökar sin cirkularitet den tredje dagen (B) och når en adekvat sfäroidform på dag 5 (C). (D) En 16 dagar gammal ZFL-sfäroid i ULA-platta. ZEM2S-cellinjen bildar sfäroider från den första dagen av OS (E). ZEM2S-sfäroiden bibehåller sin form och ökar i storlek den tredje dagen (F), och dess maximala cirkularitet uppnås på dag 5 (G). (H) En 10 dagar gammal ZEM2S-sfäroid i en ULA-platta. Skalstänger = 100 μm. Förkortningar: OS = orbital skakning; ULA = ultralåg fastsättning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Bestämning av sfäroiders storlek och cirkularitet med hjälp av programvara för bearbetning och analys av vetenskapliga bilder. När du har ställt in programvaran för att mäta ett valt område baserat på en känd skala, välj sfäroidens yttre sida för att bestämma dess yta och cirkularitet (A). Sfäroidens yta används för att bestämma dess storlek genom att beräkna diametern d, och programvaran ger sfäroidens cirkularitet med en formel som använder det valda området och omkretsen (B). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Reproducerbarhet av 3D-sfäroidmetoden visad med sfäroider av enhetlig storlek (diameter) och cirkularitet (sfäroidform). Den uppmätta storleken på sfäroider i cellinjerna ZFL (A) och ZEM2S (B). Det uppmätta cirkularitetsindexet för ZFL (C) och ZEM2S (D) sfäroider. Tillväxtmönstret för ZFL och ZEM2S sfäroider (E). Data är representativa för tre tekniska replikat från olika cellsatser. Siffrorna ovanför varje punkt anger medelvärdet av triplikaten för dag 1, 3 och 5. Data visade som medelvärde ± standardavvikelse (n = 10). Denna siffra har modifierats från Souza et al.12. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Jämförelse mellan bildandet av ZFL- och ZEM2S-sfäroider utförda vid två rotationshastigheter (70 och 100 rpm). En ZFL-sfäroid (A) och ZEM2S-sfäroid (B) bildades efter 5 dagars orbitalskakning vid 100 rpm (skalstänger representerar 100 μm). Tillväxtmönstret för ZFL-sfäroider (C) och ZEM2S-sfäroider (D) bildades vid 70 och 100 rpm. Cirkularitetsindexet för ZFL-sfäroider (E) och ZEM2S-sfäroider (F) bildas vid 70 och 100 rpm. Data visas som medelvärde ± standardavvikelse (n = 10). *anger statistisk signifikans (p < 0,05). N.S.: Icke-signifikant skillnad (T-test) mellan sfäroider bildade dag 5 vid 70 och 100 rpm. Denna siffra har modifierats från Souza et al.12. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Den cellulära integriteten och livskraften hos ZFL- och ZEM2S-sfäroider (5 dagar gamla) bildade genom orbitalskakning i rundbottnad ultralåg fästbrunnsplatta. Färgning av cellmembran av Lectin Alexa Fluor 594 (röd) och kärnor av DAPI (blå) visar cellulär integritet i kärnan av en ZEM2S-sfäroid (A) och ZFL-sfäroid (B). Fluorescens av resorufin (röd) bildad genom en reduktion av Alamarblue visar livskraftiga celler i kärnan av både ZEM2S (C) och ZFL (D) sfäroider. Bilderna representerar ortogonala plan tagna med hjälp av ett konfokalmikroskop. MTT-viabilitetsanalys i 3D-kultur (sfäroider) och 2D-kultur av ZEM2S (E) och ZFL-cellinjen (F). Data visade som medelvärde av absorbans uppmätt vid 570 nm ± standardavvikelse. ns: icke-signifikant skillnad av Welchs t-test. Denna siffra har modifierats från Souza et al. (2021) 12. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Lösningar för ZFL- och ZEM2S-odling. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 2: Jämförelse av 3D-sfäroidmetoder som används för att bilda enskilda ZFL-sfäroider. * Det bästa resultatet för en testad parameter. a Den valda parametern från de bästa resultaten verifierade i den konventionella hängande droppmetoden. b Den valda parametern från Baron et al.3 för att bilda en fisksfäroid med orbitalskakning. c Variationer som är lika lämpliga för en testad parameter. Förkortningar: HD = hängande droppe; OS = orbital skakning; ULA = ultralåg fastsättning; poly-HEMA = poly(2-hydroxietylmetakrylat). Denna tabell har ändrats från Souza et al.12. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta är en enkel, enkel och snabb metod för att generera sfäroider av zebrafisklever och embryocellinjer. Denna metod utvecklades av denna grupp baserat på modifieringar av befintliga 3D-sfäroidmetoder för att övervinna problem som rapporterats i vetenskapliga studier relaterade till sfäroidbildning, liksom osäkerheter i datanoggrannhet från 3D-sfäroidanalyser. Till exempel ligger de rapporterade problemen i svårigheter att hantera, den tidskrävande karaktären att generera sfäroider, nödvändigheten av att välja sfäroider av liknande storlek och form för att utföra en analys, liksom svårigheter i processen att överföra sfäroider från dropparna till mikroplattor i hängande droppmetoden 3,7,12. Vidare rekommenderar detta protokoll odling av ZFL- och ZEM2S-cellinjer i ett CO2-fritt tillstånd. Odlingsmediets sammansättning och den CO2-fria miljö som föreslås i detta protokoll för båda cellinjerna rapporteras allmänt i litteraturen. ZFL-cellinjen odlas vanligtvis i L-15- och RPMI-medier med eller utan tillsats av natriumbikarbonat och utan CO2 14,15,16,17,18,19,20. ZEM2S-cellinjen odlas enligt instruktioner från bioresurscentret, och dess odlingsmedia formulerades för CO2-fria kulturer; Således kan CO2 och luftblandning vara skadliga för celler vid användning av denna typ av odlingsmedia21.
Det nuvarande fisksfäroidprotokollet utvecklades efter utvärdering av flera parametrar (dvs. olika celldensiteter, omloppshastighet [70 eller 100 rpm] och användning av olika 96-brunnsplattor [platt botten eller rund botten]) för att bestämma de bästa parametrarna för att bilda ZFL-sfäroider. Dessutom gjordes en jämförelse med andra 3D-odlingsmetoder (dvs. hängande droppmetod och hängande droppmetod kombinerad med orbitalskakningsmetod), vilket indikerar att orbitalskakningen av rundbottnade ULA-plattor hade den bästa prestandan (dvs. enkel, snabb och reproducerbar metod). Tabell 2 visar parametrar och prestanda för andra 3D-odlingsmetoder utvärderade för att bilda ZFL-sfäroider.
Rundbottnade ULA-plattor har redan rapporterats bilda enkla sfäroider av mänskliga celler följt av centrifugering22 eller orbitalskakning23,24. I detta protokoll föreslår vi användning av samma platta, förutom under orbital skakning för att generera enstaka sfäroider av zebrafiskcellinjer (dvs en sfäroid per brunn på en 96-brunnsplatta). Detta är särskilt fördelaktigt eftersom det lätt och snabbt kan bilda en bra mängd sfäroider, och de bildade sfäroiderna kan bibehållas i kultur på samma platta. Således kan kemisk exponering göras direkt på ULA-plattan för att utföra olika typer av toxicitetsanalyser.
För att bestämma den adekvata orbitalskakningshastigheten för att bilda ZFL- och ZEM2S-sfäroider jämförde vi sfäroidernas bildning vid 70 och 100 rpm. Resultaten visar att denna metod fungerar bättre vid 70 rpm, och en högre rotationshastighet kan avsevärt påverka ZEM2S sfäroiders storlek och form (figur 5D, F). ZFL-sfäroider visade inga signifikanta skillnader i storlek och form vid dessa rotationshastigheter; Lägre cirkularitetsindex erhölls dock vid 100 rpm, vilket visar en negativ inverkan i sfäroidform vid en högre rotationshastighet (figur 5C,E).
Den initiala celldensiteten hos 3 500 ZEM2S-celler och 7 000 ZFL-celler genererar sfäroider med liknande storlekar den femte dagen i odling (226,63 respektive 225,62 μm). Med tanke på att syre och näringsämnen transporteras genom diffusion i sfäroider25, kan deras diameter starkt påverka näring och cellulär integritet i sfäroidernas kärna; I allmänhet rekommenderas sfäroider upp till 100 μm för att undvika nekrotisk kärna26. För att verifiera den cellulära integriteten i sfäroidernas kärna utvärderade vi kärn- och membranintegriteten genom immunfärgning med DAPI och Lectin Alexa Fluor 594 genom konfokalmikroskopi (figur 6A, B), och sfäroidernas integritet visades. Den cellulära livskraften i sfäroidernas kärna verifierades också genom att exponera dem för resazurin (Alamarblue) och analysera fluorescensen av resorufin med ett konfokalmikroskop (figur 6C, D). När cellerna är livskraftiga reduceras resazurinet till resorufin (fluorescerande substans) genom cellulär metabolisk funktion. Prestandan hos MTT-analysen visade inte heller någon signifikant skillnad i cellviabilitet jämfört med ZFL- och ZEM2S-sfäroider med monolagerkultur (2D-kultur) (figur 6E,F). Även om sfäroiderna är större än 100 μm visar resultaten att detta protokoll genererar livskraftiga sfäroider av ZFL- och ZEM2S-cellinjer med tillräcklig näring även i deras inre del.
Celldensiteterna hos ZFL- och ZEM2S-celler och hastigheten för orbitalskakning som applicerades i detta protokoll möjliggjorde bildandet av mycket stabila sfäroider i storlek och form, med låg variabilitet bland brunnarna (figur 4), vilket undviker behovet av att välja adekvata sfäroider som ett tidigare steg för att utföra en analys. Om analysproceduren kräver överföring av sfäroiderna till andra plattor eller rör / mikrorör kan de enkelt överföras med en mikropipett utan disaggregeringsproblem.
Här demonstrerade vi ett protokoll utvecklat baserat på de bästa parametrarna för att bilda livskraftiga ZFL- och ZEM2S-sfäroider. Cellinjerna ZFL och ZEM2S kan vara användbara vid testning av toxicitet i vattenmiljö för att uppskatta kemiska effekter på fisk 23,24,27,28,29,30. Dessutom kan utvecklingsmässiga effektmått också studeras med hjälp av cellinjer från fiskembryon, såsom ZEM2S-cellinjen (fibroblastceller i blastulafasen), som bibehåller en grad av pluripotens28. Dessa gör dessa zebrafisksfäroider potentiellt användbara för testning av fisktoxicitet. Dessutom, som en enkel fisksfäroidmetod, kan den användas i ekotoxicitetstestning med hög kapacitet, vilket stöder dess tillämpning inom industrin och den akademiska världen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Till minne av Dr. Márcio Lorencini, medförfattare till detta arbete, en utmärkt forskare inom kosmetikområdet och ägnad åt att främja kosmetisk forskning i Brasilien. Författarna är tacksamma för Multi-user Laboratory i fysiologiavdelningen (UFPR) för tillgänglighet av utrustning och för ekonomiskt stöd från Coordination for the Improvement of Higher Education Personnel (CAPES, Brasilien) (Finance Code 001) och Grupo Boticário.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate, Individually Wrapped, with Lid, Sterile | Corning | 7007 | |
| DMEM, powder, high glucose, pyruvate | Gibco | 12800-017 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, powder | Gibco | 21700026 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| Image Processing and analysis in Java (ImageJ) 1.52p software | National Institutes of Health, USA |
Available at: https://imagej.nih.gov/ij/index.html | |
| Leibovitz's L-15 Medium, powder | Gibco | 41300021 | |
| Orbital shaker | Warmnest | KLD-350-BI | 22 mm rotation diameter |
| Dulbeccos PBS (10x) with calcium and magnesium | Invitrogen | 14080055 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-014 | |
| FBS - Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | Gibco | 12657-029 | |
| Sodium bicarbonate, powder, bioreagent for molecular biology | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Trypan blue stain (0,4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 | |
| ZEM2S cell line | ATCC | CRL-2147 | This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J. Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA) |
| ZFL cell line | BCRJ | 256 |
References
- Elje, E., et al. The comet assay applied to HepG2 liver spheroids. Mutation Research. Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 845, 403033 (2019).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, N. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnology and Bioengineering. 83 (2), 173-180 (2003).
- Baron, M. G., Purcell, W. M., Jackson, S. K., Owen, S. F., Jha, A. N. Towards a more representative in vitro method for fish ecotoxicology: morphological and biochemical characterisation of three-dimensional spheroidal hepatocytes. Ecotoxicology. 21 (8), 2419-2429 (2012).
- Alves, R. F., Rocha, E., Madureira, T. V. Fish hepatocyte spheroids - A powerful (though underexplored) alternative in vitro model to study hepatotoxicity. Comparative Biochemistry and Physiology. Toxicology & Pharmacology. 262, 109470 (2022).
- Baron, M. G., et al. Pharmaceutical metabolism in fish: using a 3-D hepatic in vitro model to assess clearance. PloS One. 12 (1), 0168837 (2017).
- Langan, L. M., et al. Spheroid size does not impact metabolism of the β-blocker propranolol in 3D intestinal fish model. Frontiers in Pharmacology. 9, 947 (2018).
- Lammel, T., Tsoukatou, G., Jellinek, J., Sturve, J. Development of three-dimensional (3D) spheroid cultures of the continuous rainbow trout liver cell line RTL-W1. Ecotoxicology and Environmental Safety. 167, 250-258 (2019).
- Jeong, Y., et al. Differential effects of CBZ-induced catalysis and cytochrome gene expression in three dimensional zebrafish liver cellculture. Journal of Environmental and Analytical Toxicology. 6, 2161 (2016).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. (51), e2720 (2011).
- Lee, W. G., Ortmann, D., Hancock, M. J., Bae, H., Khademhosseini, A. A hollow sphere soft lithography approach for long-term hanging drop methods. Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (2), 249-259 (2010).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods in Molecular Medicine. 140, 141-151 (2007).
- de Souza, I. R., et al. Development of 3D cultures of zebrafish liver and embryo cell lines: a comparison of different spheroid formation methods. Ecotoxicology. 30 (9), 1893-1909 (2021).
- Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ user guide. ImageJ/Fiji. 1, 151-161 (2012).
- Guidony, N. S., et al. ABC proteins activity and cytotoxicity in zebrafish hepatocytes exposed to triclosan. Environmental Pollution. 271, 116368 (2021).
- da Silva, N. D. G., et al. Interference of goethite in the effects of glyphosate and Roundup® on ZFL cell line. Toxicology In Vitro. 65, 104755 (2020).
- Yang, Y., et al. Temperature is a key factor influencing the invasion and proliferation of Toxoplasma gondii in fish cells. Experimental Parasitology. 217, 107966 (2020).
- Lopes, F. M., Sandrini, J. Z., Souza, M. M. Toxicity induced by glyphosate and glyphosate-based herbicides in the zebrafish hepatocyte cell line (ZF-L). Ecotoxicology and Environmental Safety. 162, 201-207 (2018).
- Lachner, D., Oliveira, L. F., Martinez, C. B. R. Effects of the water soluble fraction of gasoline on ZFL cell line: Cytotoxicity, genotoxicity and oxidative stress. Toxicology In Vitro. 30, 225-230 (2015).
- Morozesk, M., et al. Effects of multiwalled carbon nanotubes co-exposure with cadmium on zebrafish cell line: Metal uptake and accumulation, oxidative stress, genotoxicity and cell cycle. Ecotoxicology and Environmental Safety. 202, 110892 (2020).
- Dognani, G., et al. Nanofibrous membranes for low-concentration Cr VI adsorption: kinetic, thermodynamic and the influence on ZFL cells viability. Materials Research. , 24 (2021).
- ZEM2S (ATCC®CRL-2147™). American Type Culture Collection. , Available from: https://www.atcc.org/products/crl-2147 (2022).
- Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease. Scientific Reports. 6, 25187 (2016).
- Gajski, G., et al. Genotoxic potential of selected cytostatic drugs in human and zebrafish cells. Environmental Science and Pollution Research International. 23 (15), 14739-14750 (2016).
- Meng, Q., Yeung, K., Chan, K. M. Toxic effects of octocrylene on zebrafish larvae and liver cell line (ZFL). Aquatic Toxicology. 236, 105843 (2021).
- Mueller-Klieser, W. Method for the determination of oxygen consumption rates and diffusion coefficients in multicellular spheroids. Biophysical Journal. 46 (3), 343-348 (1984).
- Glicklis, R., Merchuk, J. C., Cohen, S. Modeling mass transfer in hepatocyte spheroids via cell viability, spheroid size, and hepatocellular functions. Biotechnology and Bioengineering. 86 (6), 672-680 (2004).
- Ho, R. K., Kimmel, C. B. Commitment of cell fate in the early zebrafish embryo. Science. 261 (5117), 109-111 (1993).
- Biswas, S., Emond, M. R., Jontes, J. D. Protocadherin-19 and N-cadherin interact to control cell movements during anterior neurulation. The Journal of Cell Biology. 191 (5), 1029-1041 (2010).
- Bradford, C. S., Sun, L., Collodi, P., Barnes, D. W. Cell cultures from zebrafish embryos and adult tissues. Journal of Tissue Culture Methods. 16 (2), 99-107 (1994).
- He, S., et al. Genetic and transcriptome characterization of model zebrafish cell lines. Zebrafish. 3 (4), 441-453 (2006).
