Summary
Ici, nous présentons un protocole de culture 3D efficace, facile et rapide pour la formation de sphéroïdes de deux lignées cellulaires de poisson zèbre (Danio rerio): ZEM2S (embryon) et ZFL (hépatocytes normaux).
Abstract
Les lignées cellulaires de poissons sont des modèles in vitro prometteurs pour l’évaluation de l’écotoxicité; cependant, les systèmes de culture monocouche conventionnels (culture 2D) ont des limites bien connues (p. ex. longévité de la culture et maintien de certaines fonctions cellulaires in vivo ). Ainsi, des cultures 3D, telles que des sphéroïdes, ont été proposées, car ces modèles peuvent reproduire des structures tissulaires, mieux recapturer les conditions in vivo . Cet article décrit un protocole de culture 3D efficace, facile et rapide pour la formation de sphéroïdes avec deux lignées cellulaires de poisson zèbre (Danio rerio) : ZEM2S (embryon) et ZFL (hépatocytes normaux). Le protocole consiste à plaquer les cellules dans une plaque à fond rond, à fixation ultra-basse, à 96 puits. Après 5 jours sous agitation orbitale (70 rpm), un seul sphéroïde par puits est formé. Les sphéroïdes formés présentent une taille et une forme stables, et cette méthode évite la formation de plusieurs sphéroïdes dans un puits; Ainsi, il n’est pas nécessaire de choisir à la main des sphéroïdes de tailles similaires. La facilité, la rapidité et la reproductibilité de cette méthode sphéroïde la rendent utile pour les tests in vitro à haut débit.
Introduction
Les sphéroïdes sont de petites sphères de cellules formées lorsque les cellules sont cultivées en contact étroit de cellule à cellule en culture 3D. La capacité des sphéroïdes à imiter l’environnement tissulaire in vivo a déjà été étudiée dans une variété de lignées cellulaires et de cellules primaires 1,2. Cependant, bien que les sphéroïdes soient bien développés pour les études de toxicité chez les mammifères, le développement de sphéroïdes pour les études de toxicité avec des vertébrés non mammifères (p. ex. poissons) est toujours en cours3. Pour les lignées cellulaires de poissons, les sphéroïdes ont été développés par une variété de méthodes différentes, telles que l’agitation orbitale (OS) en utilisant différents types de plaques de puits 3,4,5,6,7, et la méthode de lévitation magnétique utilisant des nanoparticules magnétiques8. Cependant, certaines de ces méthodes de culture pour les sphéroïdes peuvent avoir plus d’inconvénients que d’autres.
Par exemple, les méthodes giratoires dans de grandes microplaques (plaques à 24 puits) peuvent générer un nombre élevé de sphéroïdes de taille et de forme différentes; En effet, la formation de structures multi-sphéroïdes a été démontrée7. Cela nécessite des efforts intenses pour sélectionner des sphéroïdes de taille et de forme similaires pour une expérience. La méthode de culture 3D à gouttes suspendues est couramment utilisée pour générer des sphéroïdes de lignées cellulaires de mammifères 1,2,9,10,11, ce qui permet de générer des sphéroïdes uniques par goutte, évitant ainsi les problèmes décrits ci-dessus. Cependant, bien qu’une méthode de goutte suspendue modifiée (goutte suspendue + secousse orbitale) soit capable de générer des sphéroïdes ZFL en utilisant une méthode peu coûteuse, elle présente ses inconvénients12. Les agrégats cellulaires formés ne peuvent pas être maintenus pendant de longues périodes dans les gouttes; Ainsi, ils doivent être transférés sur des plaques de puits. Ce processus nécessite une manipulation intense et de longues périodes de travail dans une hotte à flux laminaire, car il est effectué goutte à goutte à l’aide d’une micropipette12. De plus, cette méthode nécessite 10 jours pour former complètement les sphéroïdes ZFL (5 jours en goutte suspendue + 5 jours en SG)12. Ces inconvénients peuvent limiter l’application de sphéroïdes de poissons 3D pour les tests de toxicité, en particulier compte tenu des applications potentielles pour la priorisation des produits chimiques et la durabilité des produits.
Ainsi, cet article décrit un protocole de culture 3D capable de générer des sphéroïdes uniques de lignées cellulaires ZFL (hépatocytes normaux de D. rerio) et ZEM2S (embryon en phase blastula de D. rerio) basés sur l’utilisation combinée de plaques de fixation ultra-basses à 96 puits (plaques ULA) et d’un agitateur orbital (diamètre de rotation de 22 mm). La méthode appliquée est simple et reproductible, et peut générer un grand nombre de sphéroïdes de taille et de forme similaires en peu de temps (5 jours). Les avantages de cette méthode peuvent soutenir l’application de modèles 3D de poissons pour les études de toxicité aquatique dans l’industrie et le milieu universitaire, ainsi que les progrès de la mise en œuvre de méthodes alternatives pour les essais d’écotoxicité.
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Protocol
Les étapes clés pour générer des sphéroïdes 3D de lignées cellulaires ZFL et ZEM2S dans une plaque à fond rond de 96 puits sont présentées à la figure 1.
REMARQUE : Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux utilisés dans ce protocole et le tableau 1 pour les solutions et les milieux de culture utilisés dans ce protocole.
1. Milieu de culture cellulaire et cultures monocouches
- Cultiver les deux lignées cellulaires (ZFL, ZEM2S) en monocouches dans un incubateur à 28 °C sans CO2, et les sous-cultiver à un rapport de sous-culture de 1:3 lorsqu’elles atteignent ~80% de confluence.
- Commencez avec une fiole T75 de cellules de poisson zèbre à ~80% de confluence, cultivées comme décrit ci-dessus.
- Retirer le milieu complet et laver les cellules en ajoutant 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (0,01 M) dans la fiole de culture à l’aide d’une pipette.
- À l’aide d’une pipette, ajouter 3 mL de 1x trypsine-0,5 mM EDTA (0,05 % [v/v]) dans les fioles de culture et incuber à 28 °C pendant 3 min pour détacher les cellules de la fiole.
- Tapoter doucement la fiole pour libérer les cellules, puis arrêter la digestion de la trypsine en ajoutant 3 mL de milieu de culture complet dans la fiole.
- À l’aide d’une pipette, transférer la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger conique de 15 mL et centrifuger à 100 × g pendant 5 min.
- Après la formation de la pastille, retirez soigneusement le surnageant, ajoutez 1 mL du milieu complet pour la lignée cellulaire respective utilisée (ZFL ou ZEM2S) et remettez en suspension à l’aide d’une micropipette. Prenez une partie aliquote pour le comptage cellulaire.
2. Comptage des cellules avec test d’exclusion du colorant bleu trypan
- Ajouter 10 μL de suspension cellulaire et 10 μL de colorant bleu de trypan à un microtube pour compter les cellules et évaluer leur viabilité. Mélanger la suspension cellulaire et le colorant à l’aide d’une pipette.
- Ensuite, transférez 10 μL de ce mélange (suspension cellulaire + bleu de trypan) dans une chambre de Neubauer et comptez les cellules dans les quatre grands carrés (quadrants: Q) placés aux coins de la chambre, en considérant les cellules qui n’absorbent pas le bleu de trypan comme viables. Calculer le nombre de cellules viables à l’aide de l’équation (1) :
(1) - Pour calculer le nombre final de cellules dans la suspension cellulaire, multipliez le nombre de cellules déterminé à l’aide de l’équation (1) par 2 (le facteur de dilution dû à l’utilisation du bleu de trypan).
REMARQUE: Alternativement, un système automatisé de comptage de cellules peut être utilisé.
(1)3. Placage cellulaire dans les plaques ULA
- Après avoir calculé le nombre de cellules, ajuster la suspension de la cellule à la plaque de 200 μL de cette suspension par puits d’une plaque ULA à fond rond de 96 puits avec le nombre de cellules requis pour chaque lignée cellulaire, comme indiqué ci-dessous:
- Plaque 7 000 cellules ZFL viables/puits; ainsi, pour l’ensemble de la plaque ULA, utiliser 700 000 cellules dans 20 mL de milieu complet.
- Plaque 3 500 cellules ZEM2S viables/puits; ainsi, pour l’ensemble de la plaque ULA, utiliser 350 000 cellules dans 20 mL de milieu complet.
- Préparez la suspension cellulaire avec la concentration ajustée de cellules dans un réservoir de milieu et mélangez-la à l’aide d’une micropipette multicanal, en prenant soin de ne pas former de mousse ou de bulles. À l’aide de la micropipette multicanaux, ajouter 200 μL de la suspension cellulaire ajustée à chaque puits de la plaque ULA.
REMARQUE : La plaque doit être scellée avec un parafilm ou une feuille d’étanchéité adhésive pour éviter l’évaporation du milieu de culture de la plaque de 96 puits.
4. Formation sphéroïde
- Incuber la plaque ULA sur un agitateur orbital à 70 tr/min pendant 5 jours dans un incubateur à 28 °C. Laisser les sphéroïdes se former au cours de 5 jours d’agitation orbitale (Figure 2), atteignant une taille moyenne de ~225 μm de diamètre (sphéroïdes ZFL) et ~226 μm de diamètre (sphéroïdes ZEM2S)12.
NOTE: Après 5 jours d’incubation (circularité maximale), les sphéroïdes sont prêts à être utilisés. - Pour maintenir les sphéroïdes en culture pendant plus de 5 jours, retirer 100 μL du milieu épuisé tous les 5 jours et ajouter 100 μL de milieu de culture complet frais à l’aide d’une micropipette multicanal.
REMARQUE: Veillez à ne pas aspirer les sphéroïdes pendant ce processus.
5. Mesure de la taille (diamètre) et de la forme (indice de circularité) des sphéroïdes
- Acquérir les images.
- Sous un microscope à lumière inversée avec un système de capture d’imagerie, obtenir une image d’une échelle définie.
REMARQUE : Utilisez une lame d’étalonnage de l’étage du microscope ou une lame de Neubauer (dans laquelle les tailles des quadrants sont connues) pour obtenir l’échelle. - Au microscope et en utilisant la même lentille d’objectif que celle utilisée pour obtenir l’image de l’échelle, obtenir des images des sphéroïdes entièrement formés (c.-à-d. des sphéroïdes âgés de 5 jours).
REMARQUE: Toutes les images doivent être prises à l’aide du même système de capture d’imagerie, car la résolution de l’image est importante pour déterminer la taille et la forme des sphéroïdes, et elle peut différer selon les types de systèmes.
- Sous un microscope à lumière inversée avec un système de capture d’imagerie, obtenir une image d’une échelle définie.
- Définissez l’échelle.
- À l’aide du logiciel ImageJ, ouvrez l’image de l’échelle définie (cliquez sur Fichier | ouvrir).
- Sélectionnez le sélecteur de ligne droite dans la barre d’outils et, à l’aide de la souris, faites glisser une ligne sur l’extension de l’échelle définie dans l’image.
- Définissez l’échelle en sélectionnant Analyser | Définissez l’échelle et attendez que la fenêtre Définir l’échelle s’ouvre.
- Dans la fenêtre Set Scale (Définir l’échelle), remplissez le blanc de Distance connue par la distance connue (μm) correspondant à la ligne droite ; Remplissez l’unité de longueur avec um pour μm. Cliquez sur OK.
REMARQUE : L’échelle en pixels/μm est affichée en bas de la fenêtre.
- Réglez les paramètres de mesure.
- Dans le logiciel ImageJ, sélectionnez Analyser | Définir les mesures pour ouvrir la fenêtre Définir les mesures .
- Dans la fenêtre Définir les mesures, cochez les cases correspondant aux mesures souhaitées (c’est-à-dire les descripteurs de zone et de forme). Cliquez sur OK.
- Obtenir le diamètre et la circularité des sphéroïdes.
- Ouvrez l’image d’un sphéroïde (Fichier | Ouvert).
- Sélectionnez l’outil de sélection à main levée dans la barre d’outils et, à l’aide de la souris, sélectionnez le côté extérieur du sphéroïde, comme illustré à la figure 3A.
REMARQUE: Pour effectuer un zoom avant ou arrière sur l’image, appuyez sur la touche Ctrl et utilisez la souris pour faire défiler vers le bas ou vers le haut, ou appuyez sur la touche Ctrl et utilisez les touches fléchées haut ou bas du clavier. - Sélectionnez Analyser | Mesure pour ouvrir la fenêtre Résultats dans laquelle les valeurs mesurées sont affichées.
- À l’aide de la valeur Surface , calculez la taille (diamètre) des sphéroïdes à l’aide de l’équation (2) :
(2) - L’indice de circularité est indiqué dans la fenêtre Résultats sous la forme « Circ. », et est calculé automatiquement par le logiciel à l’aide de l’équation (3):
(3)
REMARQUE: L’indice de circularité de 1,0 représente une forme sphéroïdale parfaite, tandis qu’une valeur proche de 0,0 indique une forme allongée13.
(2)
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Representative Results
Des sphéroïdes simples par puits avec une taille et une forme stables sont formés par cette méthode. La figure 2 illustre le processus de formation de sphéroïdes simples de cellules ZFL et ZEM2S dans un puits d’une plaque ULA sous agitation orbitale (70 tr/min). Les lignées cellulaires ZFL et ZEM2S ont des comportements différents en culture 3D. La lignée cellulaire ZEM2S présente des caractéristiques qui confèrent la capacité de former facilement une forme sphéroïdale dès le premier jour de l’agitation orbitale (Figure 2E), tandis que la lignée cellulaire ZFL nécessite 5 jours pour atteindre la forme sphéroïdale souhaitable (Figure 2A-C). Les sphéroïdes générés par cette méthode ont également montré une stabilité en termes de forme dans des périodes de culture plus longues (périodes >5 jours), comme le montrent la figure 2D (sphéroïde ZFL de 16 jours) et la figure 2H (sphéroïde ZEM2S âgé de 10 jours). Le diamètre et la circularité des sphéroïdes ont été déterminés en mesurant leur surface projetée dans les images obtenues à l’aide d’un logiciel de traitement et d’analyse d’images scientifiques13 (Figure 3). Le tableau des matériaux indique le logiciel utilisé pour le traitement et l’analyse d’images. Les cellules ZFL ont tendance à former de grands agrégats cellulaires (taille moyenne de 319 ± 23,33 μm) le premier jour de l’agitation orbitale, qui diminue au fil du temps jusqu’au jour 5 (225,62 ± 19,20 μm) (Figure 4A), améliorant la circularité au fil du temps en culture (Figure 4B). Contrairement aux cellules ZFL, la lignée cellulaire ZEM2S forme de petits sphéroïdes dès le premier jour (202,64 ± 5,78 μm), qui augmentent progressivement jusqu’au jour 5 (226,63 ± 4,80 μm) (Figure 4C). La figure 4E montre les différents schémas de croissance dans les lignées cellulaires ZFL et ZEM2S en culture 3D. Nous recommandons d’utiliser les sphéroïdes ZFL et ZEM2S le cinquième jour car ils atteignent une forme sphéroïdale plus élevée (indice de circularité de 0,80 ± 0,01 et 0,83 ± 0,00, respectivement) (Figure 4B,D), ce qui indique une plus grande stabilité de ce modèle 3D.
Figure 1: Les étapes clés pour générer des sphéroïdes 3D de lignées cellulaires ZFL et ZEM2S dans une plaque à fond rond de 96 puits. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Sphéroïdes simples de lignées cellulaires ZFL et ZEM2S formées dans des plaques ULA à fond rond à 96 puits sous agitation orbitale. Un agrégat de cellules ZFL est formé le premier jour de la SG (A). L’agrégat cellulaire augmente sa circularité le troisième jour (B) et atteint une forme sphéroïdale adéquate le jour 5 (C). (D) Un sphéroïde ZFL âgé de 16 jours dans une plaque ULA. La lignée cellulaire ZEM2S forme des sphéroïdes dès le premier jour de la SG (E). Le sphéroïde ZEM2S conserve sa forme et augmente de taille le troisième jour (F), et sa circularité maximale est atteinte le jour 5 (G). (H) Un sphéroïde ZEM2S âgé de 10 jours dans une plaque ULA. Barres d’échelle = 100 μm. Abréviations : OS = secousse orbitale; ULA = attachement ultra-faible. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Détermination de la taille et de la circularité des sphéroïdes à l’aide d’un logiciel de traitement et d’analyse d’images scientifiques. Après avoir configuré le logiciel pour mesurer une zone sélectionnée en fonction d’une échelle connue, sélectionnez la face externe du sphéroïde pour déterminer sa surface et sa circularité (A). L’aire du sphéroïde est utilisée pour déterminer sa taille en calculant le diamètre d, et le logiciel fournit la circularité du sphéroïde par une formule qui utilise l’aire et le périmètre sélectionnés (B). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Reproductibilité de la méthode sphéroïde 3D démontrée par des sphéroïdes de taille uniforme (diamètre) et circularité (forme sphéroïdale). Taille mesurée des sphéroïdes des lignées cellulaires ZFL (A) et ZEM2S (B). Indice de circularité mesuré des sphéroïdes ZFL (C) et ZEM2S (D). Le schéma de croissance des sphéroïdes ZFL et ZEM2S (E). Les données sont représentatives de trois réplications techniques provenant de différents lots cellulaires. Les nombres au-dessus de chaque point indiquent la moyenne des triplats pour les jours 1, 3 et 5. Les données ont montré comme moyenne ±écart type (n = 10). Cette figure a été modifiée à partir de Souza et al.12. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Comparaison entre la formation des sphéroïdes ZFL et ZEM2S réalisée à deux vitesses de rotation (70 et 100 tr/min). Un sphéroïde ZFL (A) et un sphéroïde ZEM2S (B) se sont formés après 5 jours de secousses orbitales à 100 tr/min (les barres d’échelle représentent 100 μm). Le schéma de croissance des sphéroïdes ZFL (C) et ZEM2S sphéroïdes (D) s’est formé à 70 et 100 tr / min. L’indice de circularité des sphéroïdes ZFL (E) et ZEM2S sphéroïdes (F) s’est formé à 70 et 100 tr/min. Les données sont présentées sous forme d’écart type moyen ± (n = 10). *indique une signification statistique (p < 0,05). N.S. : Différence non significative (test T) entre les sphéroïdes formés au jour 5 à 70 et 100 tr/min. Cette figure a été modifiée à partir de Souza et al.12. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Intégrité cellulaire et viabilité des sphéroïdes ZFL et ZEM2S (âgés de 5 jours) formés par agitation orbitale dans la plaque de puits de fixation à fond rond ultra-basse. La coloration des membranes cellulaires par la lectine Alexa Fluor 594 (rouge) et des noyaux par DAPI (bleu) démontre l’intégrité cellulaire dans le noyau d’un sphéroïde ZEM2S (A) et d’un sphéroïde ZFL (B). La fluorescence de la résoruurine (rouge) formée par une réduction d’Alamarblue démontre des cellules viables dans le noyau des sphéroïdes ZEM2S (C) et ZFL (D). Les images représentent des plans orthogonaux capturés à l’aide d’un microscope confocal. Test de viabilité MTT en culture 3D (sphéroïdes) et culture 2D de la lignée cellulaire ZEM2S (E) et ZFL (F). Les données ont montré que la moyenne de l’absorbance mesurée était de 570 nm ± écart type. ns: différence non significative par le test t de Welch. Cette figure a été modifiée à partir de Souza et al. (2021)12. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Tableau 1: Solutions pour la culture ZFL et ZEM2S. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 2 : Comparaison des méthodes de sphéroïdes 3D utilisées pour former des sphéroïdes ZFL uniques. * Le meilleur résultat pour un paramètre testé. un Le paramètre sélectionné parmi les meilleurs résultats vérifiés dans la méthode conventionnelle de la suspension de la goutte. b Paramètre choisi par Baron et al.3 pour former un sphéroïde de poisson avec agitation orbitale. c Variations correspondant également à un paramètre testé. Abréviations : HD = goutte suspendue; OS = secousse orbitale; ULA = attachement ultra-faible; poly-HEMA = poly(2-hydroxyéthylméthacrylate). Ce tableau a été modifié à partir de Souza et al.12. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
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Discussion
Il s’agit d’une méthode simple, facile et rapide pour générer des sphéroïdes de lignées cellulaires de foie et d’embryons de poisson zèbre. Cette méthode a été développée par ce groupe sur la base des modifications apportées aux méthodes sphéroïdes 3D existantes pour surmonter les problèmes signalés dans les études scientifiques liées à la formation de sphéroïdes, ainsi que les incertitudes dans la précision des données des tests 3D sphéroïdes. Par exemple, les problèmes signalés résident dans les difficultés de manipulation, le caractère long de la génération de sphéroïdes, la nécessité de sélectionner des sphéroïdes de taille et de forme similaires pour effectuer un essai, ainsi que les difficultés dans le processus de transfert des sphéroïdes des gouttes aux microplaques dans la méthode de la goutte suspendue 3,7,12. De plus, ce protocole recommande la culture de lignées cellulaires ZFL et ZEM2S dans un état exempt de CO2. La composition du milieu de culture et l’environnement exempt de CO2 proposés dans ce protocole pour les deux lignées cellulaires sont largement rapportés dans la littérature. La lignée cellulaire ZFL est généralement cultivée dans des milieux L-15 et RPMI avec ou sans ajout de bicarbonate de sodium et sans CO2 14,15,16,17,18,19,20. La lignée cellulaire ZEM2S est cultivée conformément aux instructions du centre de bioressources et son milieu de culture a été formulé pour des cultures exemptes de CO2; ainsi, le CO2 et le mélange d’air peuvent être préjudiciables aux cellules lors de l’utilisation de ce type de milieu de culture21.
Le protocole sphéroïde actuel des poissons a été développé après avoir évalué plusieurs paramètres (c.-à-d. différentes densités cellulaires, vitesse de secousse orbitale [70 ou 100 tr/min] et utilisation de différentes plaques à 96 puits [fond plat ou fond rond]) pour déterminer les meilleurs paramètres pour former des sphéroïdes ZFL. De plus, une comparaison avec d’autres méthodes de culture 3D (c.-à-d. méthode de goutte suspendue et méthode de goutte suspendue combinée à la méthode d’agitation orbitale) a été faite, indiquant que l’agitation orbitale des plaques ULA à fond rond avait les meilleures performances (c.-à-d. méthode facile, rapide et reproductible). Le tableau 2 montre les paramètres et les performances d’autres méthodes de culture 3D évaluées pour former des sphéroïdes ZFL.
Des plaques ULA à fond rond ont déjà été signalées pour former des sphéroïdes uniques de cellules humaines suivies d’une centrifugation22 ou d’une secousse orbitale23,24. Dans ce protocole, nous proposons l’utilisation de la même plaque, sauf sous agitation orbitale pour générer des sphéroïdes uniques de lignées cellulaires de poisson zèbre (c.-à-d. un sphéroïde par puits d’une plaque de 96 puits). Ceci est particulièrement avantageux car il peut facilement et rapidement former une bonne quantité de sphéroïdes, et les sphéroïdes formés peuvent être maintenus en culture sur la même plaque. Ainsi, l’exposition chimique peut être effectuée directement sur la plaque ULA pour effectuer différents types d’essais de toxicité.
Afin de déterminer la vitesse de secousse orbitale adéquate pour former les sphéroïdes ZFL et ZEM2S, nous avons comparé la formation des sphéroïdes à 70 et 100 tr / min. Les résultats montrent que cette méthode fonctionne mieux à 70 tr/min, et qu’une vitesse de rotation plus élevée peut avoir un impact significatif sur la taille et la forme des sphéroïdes ZEM2S (Figure 5D,F). Les sphéroïdes ZFL n’ont pas montré de différences significatives de taille et de forme à ces vitesses de rotation; cependant, des indices de circularité plus faibles ont été obtenus à 100 tr/min, montrant un impact négatif sur la forme sphéroïdale à une vitesse de rotation plus élevée (figure 5C,E).
La densité cellulaire initiale de 3 500 cellules ZEM2S et de 7 000 cellules ZFL génère des sphéroïdes de taille similaire le cinquième jour de culture (226,63 et 225,62 μm, respectivement). Étant donné que l’oxygène et les nutriments sont transportés par diffusion dans les sphéroïdes25, leur diamètre peut fortement influencer la nutrition et l’intégrité cellulaire dans le noyau des sphéroïdes; Généralement, des sphéroïdes jusqu’à 100 μm sont recommandés pour éviter le noyaunécrotique 26. Pour vérifier l’intégrité cellulaire dans le noyau des sphéroïdes, nous avons évalué l’intégrité nucléaire et membranaire par immunomarquage avec DAPI et lectine Alexa Fluor 594 par microscopie confocale (Figure 6A, B), et l’intégrité des sphéroïdes a été démontrée. La viabilité cellulaire dans le noyau des sphéroïdes a également été vérifiée en les exposant à la résazurine (Alamarblue) et en analysant la fluorescence de la résoruurine au microscope confocal (Figure 6C,D). Lorsque les cellules sont viables, la résazurine est réduite en résorunine (substance fluorescente) par la fonction métabolique cellulaire. La performance du test MTT n’a pas non plus démontré de différence significative dans la viabilité cellulaire comparant les sphéroïdes ZFL et ZEM2S à la culture monocouche (culture 2D) (Figure 6E,F). Bien que les sphéroïdes soient supérieurs à 100 μm, les résultats montrent que ce protocole génère des sphéroïdes viables de lignées cellulaires ZFL et ZEM2S avec une nutrition adéquate même dans leur partie interne.
Les densités cellulaires des cellules ZFL et ZEM2S et la vitesse d’agitation orbitale appliquée dans ce protocole ont permis la formation de sphéroïdes très stables en taille et en forme, avec une faible variabilité entre les puits (Figure 4), évitant ainsi la nécessité de sélectionner des sphéroïdes adéquats comme étape préalable à la réalisation d’un essai. Si la procédure de dosage nécessite le transfert des sphéroïdes vers d’autres plaques ou tubes / microtubes, ils peuvent être facilement transférés avec une micropipette sans problèmes de désagrégation.
Ici, nous avons démontré un protocole développé basé sur les meilleurs paramètres pour former des sphéroïdes ZFL et ZEM2S viables. Les lignées cellulaires ZFL et ZEM2S peuvent être utiles dans les essais de toxicité aquatique pour estimer les effets chimiques sur les poissons 23,24,27,28,29,30. En outre, les paramètres de développement peuvent également être étudiés à l’aide de lignées cellulaires d’embryons de poissons, telles que la lignée cellulaire ZEM2S (cellules fibroblastiques de la phase blastule), qui conservent un degré de pluripotence28. Ceux-ci rendent ces sphéroïdes de poisson zèbre potentiellement utiles pour les tests de toxicité des poissons. En outre, en tant que méthode sphéroïde de poisson facile, il peut être utilisé dans les tests d’écotoxicité à haut débit, soutenant son application dans l’industrie et le milieu universitaire.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
En mémoire du Dr Márcio Lorencini, coauteur de cet ouvrage, excellent chercheur dans le domaine des cosmétiques et dévoué à la promotion de la recherche cosmétique au Brésil. Les auteurs remercient le Laboratoire multi-utilisateurs du Département de physiologie (UFPR) pour la disponibilité des équipements et pour le soutien financier de la Coordination pour l’amélioration du personnel de l’enseignement supérieur (CAPES, Brésil) (Code financier 001) et du Grupo Boticário.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate, Individually Wrapped, with Lid, Sterile | Corning | 7007 | |
| DMEM, powder, high glucose, pyruvate | Gibco | 12800-017 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, powder | Gibco | 21700026 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| Image Processing and analysis in Java (ImageJ) 1.52p software | National Institutes of Health, USA |
Available at: https://imagej.nih.gov/ij/index.html | |
| Leibovitz's L-15 Medium, powder | Gibco | 41300021 | |
| Orbital shaker | Warmnest | KLD-350-BI | 22 mm rotation diameter |
| Dulbeccos PBS (10x) with calcium and magnesium | Invitrogen | 14080055 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-014 | |
| FBS - Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | Gibco | 12657-029 | |
| Sodium bicarbonate, powder, bioreagent for molecular biology | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Trypan blue stain (0,4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 | |
| ZEM2S cell line | ATCC | CRL-2147 | This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J. Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA) |
| ZFL cell line | BCRJ | 256 |
References
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