Denne protokol præsenterer almindeligt anvendte cytotoksicitetsassays (Alamar Blue [AB], CFDA-AM, Neutral Red og MTT-assays) tilpasset til vurdering af cytotoksicitet i zebrafiskembryo (ZEM2S) og lever (ZFL) cellelinjer i 96-brøndplader.
Fiskecellelinjer er i stigende grad blevet anvendt i økotoksicitetsundersøgelser, og cytotoksicitetsanalyser er blevet foreslået som metoder til at forudsige akut toksicitet hos fisk. Således præsenterer denne protokol cytotoksicitetsassays modificeret til evaluering af cellelevedygtighed i zebrafisk (Danio rerio), embryo (ZEM2S) og lever (ZFL) cellelinjer i 96-brøndplader. De evaluerede cytotoksicitetsendepunkter er mitokondrieintegritet (Alamar Blue [AB] og MTT-assays), membranintegritet via esteraseaktivitet (CFDA-AM-assay) og lysosomal membranintegritet (Neutral Red [NR] assay). Efter eksponering af teststofferne i en plade med 96 huller udføres cytotoksicitetsassays her udføres AB og CFDA-AM samtidigt, efterfulgt af NR på samme plade, mens MTT-analysen udføres på en separat plade. Udlæsningerne for disse assays foretages ved fluorescens for AB og CFDA-AM og absorbans for MTT og NR. De cytotoksiske assays udført med disse fiskecellelinjer kan anvendes til at undersøge den akutte toksicitet af kemiske stoffer på fisk.
Kemiske stoffer skal testes med hensyn til deres sikkerhed for menneskers sundhed og miljøet. Molekylære og cellulære biomarkører er i stigende grad blevet taget i betragtning i sikkerhedsvurderinger for at forudsige virkninger på levende organismer af regulerende organer og/eller lovgivning (f.eks. REACH, OECD, US EPA)1,2, da de kan gå forud for in vivo-bivirkningen (f.eks. hormonforstyrrende virkninger, immunologisk respons, akut toksicitet, fototoksicitet)3,4,5,6,7 . I denne sammenhæng er cytotoksicitet blevet anvendt som en måling til forudsigelse af akut toksicitet for fisk 5,8; Det kan dog have mange andre anvendelser i økotoksicitetsundersøgelser, såsom definition af subcytotoksiske koncentrationer af kemiske stoffer for at studere deres mest forskelligartede sæt virkninger på fisk (f.eks. hormonforstyrrende virkninger).
I cellekultursystemer (in vitro-systemer ) kan cytotoksiciteten af kemiske stoffer bestemmes ved metoder, der er forskellige i typerne af endepunkter. For eksempel kan en cytotoksicitetsmetode baseres på et endepunkt relateret til specifik morfologi observeret under celledødsprocessen, mens en anden kan bestemme cytotoksicitet ved måling af celledød, levedygtighed og funktionalitet, morfologi, energimetabolisme og cellebinding og -proliferation. Kemiske stoffer kan påvirke cellernes levedygtighed gennem forskellige mekanismer, og derfor er det nødvendigt at foretage en cytotoksicitetsvurdering, der dækker forskellige endepunkter for cellelevedygtighed, for at forudsige kemiske virkninger9.
MTT og Alamar Blue (AB) er assays, der bestemmer effekter på cellelevedygtighed baseret på cellemetabolisk aktivitet. MTT-analysen evaluerer aktiviteten af mitokondrieenzymet succinatdehydrogenase10. Reduktionen af gullig 3-[4,5-dimethylthiazol-2yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) til formazanblåt forekommer kun i levedygtige celler, og dens optiske densitet er direkte proportional med antallet af levedygtige celler10. AB-analysen er en følsom oxidationsreduktionsindikator, medieret af mitokondrieenzymer, der fluorescerer og ændrer farve ved reduktion af resazurin til resorufin af levende celler11; cytosoliske og mikrosomale enzymer bidrager imidlertid også til reduktionen af AB og MTT12. Disse enzymer kan omfatte flere reduktaser, såsom alkohol og aldehydoxidoreduktaser, NAD (p) H: quinonoxidoreduktase, flavinreduktase, NADH-dehydrogenase og cytokromer11.
Det neutrale røde (NR) assay er et cellelevedygtighedsassay baseret på inkorporeringen af dette farvestof i lysosomerne i levedygtige celler13. Optagelsen af NR afhænger af cellernes evne til at opretholde pH-gradienter. Protongradienten inde i lysosomerne opretholder en pH, der er lavere end cytoplasmaet. Ved normal fysiologisk pH præsenterer NR en nettoladning på ca. nul, hvilket gør det muligt at trænge ind i cellemembraner. Således bliver farvestoffet ladet og bevares inde i lysosomerne. Jo større mængden af tilbageholdt NR er, desto større er antallet af levedygtige celler14. Kemiske stoffer, der beskadiger celleoverfladen eller lysosomale membraner, forringer optagelsen af dette farvestof.
CFDA-AM-analysen er et fluorometrisk cellelevedygtighedsassay baseret på tilbageholdelse af 5-carboxyfluoresceindiacetatacetoxymethylester (CFDA-AM)15. 5-CFDA-AM, et esterasesubstrat, omdannes til carboxyfluorescein, et fluorescerende stof, der er polært og ikke-permeabelt af membraner i levende celler15; Således bevares den i indersiden af en intakt cellemembran, hvilket indikerer levedygtige celler.
For nylig blev tre cytotoksicitetsassays (CFDA-AM-, NR- og AB-assays) kombineret i en valideret ISO (International Organization for Standardization) retningslinje (ISO 21115: 2019)16 og OECD (Organization for Economic Co-operation and Development) testmetode (OECD TG 249) for at evaluere akut toksicitet for fisk ved hjælp af RTgill-W1-cellelinjen (permanent cellelinje fra regnbueørred [Oncorhynchus mykiss] gill) i 24-brøndplader17 . Selvom der findes en cellebaseret metode til at forudsige akut toksicitet for fisk, er der investeret i at udvikle lignende metoder med andre fiskearter og øge metodens gennemstrømning. Nogle eksempler omfatter udvikling af ZFL-cellelinjer transfekteret med reportergener for specifikke toksicitetsveje18,19, fototoksicitetstest i RTgill-W1-cellelinje 20 og anvendelse af ZFL- og ZF4-cellelinjer (zebrafisk fibroblastisk afledt af 1 dag gamle embryoner) til vurdering af toksicitet ved flere cytotoksicitetsassays21.
Danio rerio (zebrafisk) er en af de vigtigste fiskearter, der anvendes i akvatiske toksicitetsundersøgelser. Således kan cellebaserede metoder med zebrafiskcellelinjer til test af fisketoksicitet være yderst nyttige. ZFL-cellelinjen er en zebrafiskepitelhepatocytcellelinje, der præsenterer de vigtigste egenskaber ved leverparenkymale celler og kan metabolisere xenobiotika 7,22,23,24,25. I mellemtiden er ZEM2S-cellelinjen en embryonal zebrafisk fibroblastisk cellelinje afledt af blastula-stadiet, der kan bruges til at undersøge udviklingseffekter på fisk26,27. Således beskriver denne protokol fire cytotoksicitetsassays (MTT-, AB-, NR- og CFDA-AM-assays) med modifikationer, der skal udføres med ZFL- og ZEM2S-cellelinjer i 96-brøndplader.
Cytotoksicitetsanalyser anvendes i vid udstrækning til in vitro-toksicitetsevaluering, og denne protokolartikel præsenterer fire almindeligt anvendte cytotoksicitetsassays, der er modificeret til at blive udført i zebrafiskcellelinjer (dvs. celletæthed for 96-brøndplade, inkubationstid i MTT-assayet, FBS-udtømning under den kemiske eksponeringstilstand og maksimal acceptabel koncentration for SC). Da disse analyser kvantificerer cytotoksicitet ved hjælp af forskellige endepunkter for cellelevedygtighed (m…
The authors have nothing to disclose.
Til minde om Dr. Márcio Lorencini, medforfatter af dette arbejde, en fremragende forsker inden for kosmetik og dedikeret til at fremme kosmetisk forskning i Brasilien. Forfatterne er taknemmelige for flerbrugerlaboratoriet i fysiologiafdelingen (UFPR) for tilgængelighed af udstyr og for den økonomiske støtte fra koordineringen til forbedring af personale på videregående uddannelser (CAPES, Brasilien) (finanskode 001) og Grupo Boticario.
5-CFDA, AM (5-Carboxyfluorescein Diacetate, Acetoxymethyl Ester) | Invitrogen | C1345 | |
Cell culture plate, 96 well plate | Sarstedt | 83.3924 | Surface: Standard, flat base |
DMEM | Gibco | 12800-017 | Powder, high glucose, pyruvate |
Ham's F-12 Nutrient Mix, powder | Gibco | 21700026 | Powder |
HEPES (1 M) | Gibco | 15630080 | |
Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 41300021 | Powder |
Neutral red | Sigma-Aldrich | N4638 | Powder, BioReagent, suitable for cell culture |
Orbital shaker | Warmnest | KLD-350-BI | 22 mm rotation diameter |
Dulbeccos PBS (10X) with calcium and magnesium | Invitrogen | 14080055 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
Resazurin sodium salt | Sigma-Aldrich | R7017 | Powder, BioReagent, suitable for cell culture |
RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-014 | Powder |
SFB – Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | Gibco | 12657-029 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Powder, bioreagent for molecular biology |
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide 98% | Sigma-Aldrich | M2128 | |
Trypan blue stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 | |
ZEM2S cell line | ATCC | CRL-2147 | This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J. Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA) |
ZFL cell line | BCRJ | 256 |