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Saggi di citotossicità con linee cellulari di zebrafish

Published: January 6, 2023 doi: 10.3791/64860
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 2, 1, 3, 2, 3
1Graduate Program in Genetics, Department of Genetics, Federal University of Paraná (UFPR), 2Safety of Product Department, Grupo Boticário, 3Department of Genetics, Federal University of Paraná (UFPR)

Summary

Questo protocollo presenta saggi di citotossicità comunemente usati (Alamar Blue [AB], CFDA-AM, Neutral Red, e MTT assays) adattati per la valutazione della citotossicità in linee cellulari di embrioni di zebrafish (ZEM2S) e fegato (ZFL) in piastre a 96 pozzetti.

Abstract

Le linee cellulari di pesce sono diventate sempre più utilizzate negli studi di ecotossicità e sono stati proposti saggi di citotossicità come metodi per prevedere la tossicità acuta dei pesci. Pertanto, questo protocollo presenta saggi di citotossicità modificati per valutare la vitalità cellulare in linee cellulari embrionali di zebrafish (Danio rerio) (ZEM2S) e fegato (ZFL) in piastre a 96 pozzetti. Gli endpoint di citotossicità valutati sono l'integrità mitocondriale (saggi Alamar Blue [AB] e MTT), l'integrità della membrana attraverso l'attività esterasi (test CFDA-AM) e l'integrità della membrana lisosomiale (saggio Neutral Red [NR]). Dopo l'esposizione delle sostanze in esame in una piastra a 96 pozzetti, vengono eseguiti i saggi di citotossicità; qui, AB e CFDA-AM vengono eseguiti contemporaneamente, seguiti da NR sulla stessa piastra, mentre il saggio MTT viene eseguito su una piastra separata. Le letture per questi test sono prese per fluorescenza per AB e CFDA-AM e assorbanza per MTT e NR. I saggi di citotossicità eseguiti con queste linee cellulari di pesce possono essere utilizzati per studiare la tossicità acuta delle sostanze chimiche sui pesci.

Introduction

Le sostanze chimiche devono essere testate per quanto riguarda la loro sicurezza per la salute umana e l'ambiente. I biomarcatori molecolari e cellulari sono stati sempre più considerati nelle valutazioni di sicurezza per prevedere gli effetti sugli organismi viventi da parte di agenzie e/o legislazioni regolatorie (ad esempio, REACH, OCSE, US EPA)1,2, poiché possono precedere l'esito avverso in vivo (ad esempio, interferenza endocrina, risposta immunologica, tossicità acuta, fototossicità)3,4,5,6,7 . In questo contesto, la citotossicità è stata presa come misura per prevedere la tossicità acuta dei pesci 5,8; Tuttavia, può avere molte altre applicazioni negli studi di ecotossicità, come la definizione di concentrazioni sub-citotossiche di sostanze chimiche per studiare il loro insieme più diversificato di effetti sui pesci (ad esempio, effetti di interferenza endocrina).

Nei sistemi di coltura cellulare (sistemi in vitro ), la citotossicità delle sostanze chimiche può essere determinata con metodi diversi nei tipi di endpoint. Ad esempio, un metodo di citotossicità può essere basato su un endpoint correlato alla morfologia specifica osservata durante il processo di morte cellulare, mentre un altro può determinare la citotossicità misurando la morte cellulare, la vitalità e la funzionalità, la morfologia, il metabolismo energetico e l'attaccamento e la proliferazione cellulare. Le sostanze chimiche possono influenzare la vitalità cellulare attraverso diversi meccanismi, pertanto la valutazione della citotossicità che copra diversi endpoint di vitalità cellulare è necessaria per prevedere gli effetti chimici9.

MTT e Alamar Blue (AB) sono saggi che determinano gli effetti sulla vitalità cellulare in base all'attività metabolica cellulare. Il test MTT valuta l'attività dell'enzima mitocondriale succinato deidrogenasi10. La riduzione del 3-[4,5-dimetiltiazol-2il]-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) giallastro al blu formazan si verifica solo nelle cellule vitali e la sua densità ottica è direttamente proporzionale al numero di cellule vitali10. Il saggio AB è un indicatore sensibile di ossido-riduzione, mediato da enzimi mitocondriali che fluoreggiano e cambiano colore dopo aver ridotto la resazurina a resorufin da parte delle cellule viventi11; tuttavia, anche gli enzimi citosolici e microsomiali contribuiscono alla riduzione di AB e MTT12. Questi enzimi possono includere diverse reduttasi, come alcol e aldeide ossidoreduttasi, NAD(P)H: chinone ossidoreduttasi, flavina reduttasi, NADH deidrogenasi e citocromi11.

Il test Neutral Red (NR) è un test di vitalità cellulare basato sull'incorporazione di questo colorante nei lisosomi delle cellule vitali13. L'assorbimento di NR dipende dalla capacità delle cellule di mantenere gradienti di pH. Il gradiente protonico all'interno dei lisosomi mantiene un pH inferiore al citoplasma. A pH fisiologico normale, il NR presenta una carica netta di circa zero, che gli consente di penetrare nelle membrane cellulari. Pertanto, il colorante si carica e viene trattenuto all'interno dei lisosomi. Di conseguenza, maggiore è la quantità di NR trattenuto, maggiore è il numero di cellule vitali14. Le sostanze chimiche che danneggiano la superficie cellulare o le membrane lisosomiali compromettono l'assorbimento di questo colorante.

Il test CFDA-AM è un test di vitalità cellulare fluorometrica basato sulla ritenzione di 5-carbossimetilestere diacetato di diacetato di 5-carbossimetile (CFDA-AM)15. 5-CFDA-AM, un substrato di esterasi, viene convertito in carbossifluoresceina, una sostanza fluorescente polare e non permeabile dalle membrane delle cellule viventi15; Pertanto, viene trattenuto nella parte interna di una membrana cellulare intatta, indicando cellule vitali.

Recentemente, tre saggi di citotossicità (saggi CFDA-AM, NR e AB) sono stati combinati in una linea guida ISO (International Organization for Standardization) convalidata (ISO 21115: 2019) 16 e un metodo di prova dell'OCSE (Organizzazione per la cooperazione e lo sviluppo economico) (OCSE TG 249) per valutare la tossicità acuta dei pesci utilizzando la linea cellulare RTgill-W1 (linea cellulare permanente dalla branchia della trota iridea [Oncorhynchus mykiss]) in piastre a 24 pozzetti17 . Sebbene esista un metodo basato su cellule per prevedere la tossicità acuta dei pesci, sono stati investiti sforzi nello sviluppo di metodi simili con altre specie ittiche e nell'aumento della produttività del metodo. Alcuni esempi includono lo sviluppo di linee cellulari ZFL trasfettate con geni reporter per specifiche vie di tossicità18,19, test di fototossicità nella linea cellulare RTgill-W1 20 e l'uso di linee cellulari ZFL e ZF4 (fibroblasti zebrafish derivati da embrioni di 1 giorno) per valutare la tossicità mediante diversi saggi di citotossicità21.

Danio rerio (zebrafish) è una delle principali specie ittiche utilizzate negli studi di tossicità acquatica; Pertanto, i metodi basati su cellule con linee cellulari di zebrafish per i test di tossicità dei pesci possono essere estremamente utili. La linea cellulare ZFL è una linea cellulare di epatociti epiteliali zebrafish che presenta le principali caratteristiche delle cellule parenchimali epatiche e può metabolizzare xenobiotici 7,22,23,24,25. Nel frattempo, la linea cellulare ZEM2S è una linea cellulare fibroblastica embrionale di zebrafish derivata dallo stadio di blastula che può essere utilizzata per studiare gli effetti sullo sviluppo sui pesci26,27. Pertanto, questo protocollo descrive quattro saggi di citotossicità (saggi MTT, AB, NR e CFDA-AM), con modifiche da eseguire con linee cellulari ZFL e ZEM2S in piastre a 96 pozzetti.

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Protocol

NOTA: vedere la Tabella dei materiali per l'elenco dei materiali utilizzati in questo protocollo e la Tabella 1 per la composizione delle soluzioni e dei supporti utilizzati in questo protocollo.

1. Preparazione delle celle ZFL e ZEM2S

  1. Iniziare con un matraccio T75 di cellule ZFL o ZEM2S con confluenza dell'80%, coltivate nel rispettivo mezzo completo a 28 °C senza CO2.
  2. Rimuovere il terreno di coltura dal matraccio e lavare le cellule aggiungendo 10 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 1x (0,01 M). Aggiungere 3 mL di 1x tripsina (0,05% v/v; 0,5 mM tripsina-EDTA) ai palloni di coltura. Incubare a 28 °C per 3 min.
  3. Picchiettare delicatamente il matraccio per rilasciare le cellule, quindi interrompere la digestione della tripsina aggiungendo 3 ml di terreno di coltura completo al pallone.
  4. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 mL e centrifugare a 100 × g per 5 minuti.
  5. Dopo la centrifugazione, rimuovere con cautela il surnatante, aggiungere 1 mL di mezzo completo per le celle ZFL o ZEM2S e risospendere il pellet utilizzando una micropipetta.

2. Conteggio delle cellule mediante esclusione del colorante blu tripano

  1. Aggiungere 10 μL della sospensione cellulare e 10 μL di colorante blu tripano a un microtubo per contare le cellule e valutarne la vitalità. Mescolare la sospensione cellulare e colorare usando una pipetta.
  2. Quindi, trasferire 10 μL di questa miscela (sospensione cellulare + blu tripano) in una camera di Neubauer e contare le cellule nei quattro grandi quadrati (quadranti Q) posti agli angoli della camera, considerando le cellule vitali quelle che non assorbono il blu tripano. Determinare il numero di celle vitali usando l'equazione (1):
    Equation 1 (1)
  3. Calcolare il numero finale di celle nella sospensione cellulare moltiplicando il numero di celle determinato utilizzando l'equazione (1) per due (il fattore di diluizione dovuto all'uso del blu di tripano).
    NOTA: In alternativa, è possibile utilizzare un sistema automatizzato di conteggio delle cellule (ad esempio, un citomero con funzione di conteggio delle cellule e vitalità).

3. Placcatura cellulare in piastre a 96 pozzetti

  1. Calcolare il volume di sospensione cellulare necessario per ottenere il numero di cellule necessarie per eseguire i saggi di citotossicità. Il numero di cellule vitali per ogni linea cellulare è indicato di seguito:
    1. Piastra 60.000 cellule vitali ZEM2S per pozzetto; quindi, per l'intera piastra, utilizzare sei milioni di cellule in 20 ml di mezzo completo (200 μL / pozzetto, piastra a 96 pozzetti).
    2. Piastra 40.000 celle ZFL vitali per pozzetto; quindi, per l'intera piastra, utilizzare quattro milioni di cellule in 20 ml di terreno completo (200 μL / pozzetto, piastra a 96 pozzetti).
  2. Successivamente, trasferire il rispettivo volume della sospensione cellulare in un serbatoio di reagente (sterile) e riempire con il terreno di coltura completo per ZFL o ZEM2S a 20 ml. Utilizzando una pipetta multicanale, mescolare delicatamente la soluzione su e giù.
    NOTA: Fare attenzione a non formare schiuma o bolle.
  3. Aggiungere 200 μL della sospensione cellulare a ciascun pozzetto di una piastra trasparente in polistirene a 96 pozzetti utilizzando la micropipetta multicanale. Incubare le piastre a 28 °C per 24 ore.
    NOTA: La piastra deve avere almeno tre pozzetti senza celle per il controllo del bianco e solo i mezzi completi devono essere aggiunti a questi pozzetti. L'effetto bordo (causato da una maggiore evaporazione nei pozzetti di bordo) si verifica comunemente nei saggi su piastre a 96 pozzetti e può influenzare la vitalità delle cellule nei pozzetti di bordo della piastra28. Questo effetto può essere superiore o inferiore a seconda della marca e del design della piastra a 96 pozzetti28. Sebbene non abbiamo notato alcun disturbo della crescita / vitalità cellulare per ZFL e ZEM2S nei pozzetti di bordo, suggeriamo di sigillare la piastra con parafilm o pellicola sigillante adesiva per prevenire questo effetto, o coltivare le cellule solo nei 60 pozzetti interni e riempire i pozzetti di bordo con PBS.

4. Esposizione delle cellule alla sostanza chimica in esame

  1. Scartare con attenzione i fluidi esausti dai pozzetti utilizzando una micropipetta multicanale.
  2. Esporre le cellule a testare sostanze chimiche a diverse concentrazioni. Preparare le soluzioni delle concentrazioni chimiche in esame nei terreni di coltura per ZFL o ZEM2S senza siero fetale bovino (FBS) (mezzi di esposizione). Quindi, aggiungere 100 μL per pozzetto di queste soluzioni in triplice copia tecnica (cioè tre pozzetti / concentrazione chimica di prova).
  3. Per i controlli, posizionare i gruppi di controllo sulla stessa piastra della sostanza chimica in esame in triplicati tecnici (tre pozzetti/gruppo di controllo). Pertanto, per il controllo in bianco (B), aggiungere 100 μL dei mezzi di esposizione nei pozzetti privi di celle, per il controllo negativo (NC), aggiungere 100 μL del mezzo di esposizione ai pozzetti con celle e per il controllo positivo (PC), esporre le cellule a una soluzione di Triton X-100 all'1% preparata nei mezzi di esposizione. In alcuni casi, un controllo del solvente (SC) dovrebbe essere incluso nella piastra, considerando una concentrazione chiaramente non citotossica come concentrazione finale di solvente.
    NOTA: Si consiglia di utilizzare lo 0,5% di DMSO come solvente; Il DMSO può essere utilizzato fino all'1% come solvente in queste linee cellulari senza superare la soglia di citotossicità del 10% correlata al controllo negativo.
  4. Incubare le piastre a 28 °C per 24 ore. Sigillare le piastre con parafilm o pellicola sigillante adesiva per evitare l'evaporazione del terreno di coltura.
    NOTA: Alcune sostanze chimiche possono avere assorbanza di fondo intrinseca o fluorescenza che può interferire con l'assorbanza o la fluorescenza del colorante indicatore (ad esempio, composti con colore possono influenzare l'assorbanza, albumina sierica29 e composti che interferiscono con gli enzimi di riduzione30,31). In questo caso, la piastra deve includere un controllo aggiuntivo aggiungendo soluzioni chimiche di prova nei pozzetti senza celle. Questo per verificare l'eventuale interferenza dell'autoassorbanza/autofluorescenza chimica con i coloranti. Se viene rilevata un'interferenza, si dovrebbe valutare se può essere esclusa per ottenere una corretta previsione della citotossicità.

5. Saggi di citotossicità

NOTA: preparare tutte le soluzioni secondo la Tabella 1. Tutte le fasi descritte di seguito (Figura 1) vengono eseguite in condizioni sterili. L'uso di una pipetta per scartare i supporti di esposizione non è raccomandato, perché le cellule possono facilmente staccarsi dai pozzetti dopo il trattamento chimico.

  1. Saggi AB e CFDA-AM
    1. Dopo 24 ore di esposizione alla sostanza chimica in esame, gettare con cautela il supporto di esposizione versando il contenuto in un vassoio di raccolta.
    2. Lavare la piastra con 200 μL di PBS. Rimuovere con cautela il PBS versandolo in un vassoio di raccolta per evitare di perdere cellule.
    3. Aggiungere 100 μL per pozzetto di soluzione AB/CFDA-AM. Incubare la piastra per 30 minuti al buio a 28 °C.
    4. Misurare la fluorescenza in un lettore di piastre a fluorescenza a 530 nm (eccitazione) e 595 nm (emissione) per AB, e a 493 nm (eccitazione) e 541 nm (emissione) per CFDA-AM.
  2. Saggio NR
    NOTA: Le fasi per il test NR vengono eseguite immediatamente dopo i test AB e CFDA-AM (Figura 1).
    1. Centrifugare la soluzione di lavoro NR (40 μg/ml) a 600 × g per 10 min.
      NOTA: La precipitazione di NR nel tubo non deve essere trasferita alle piastre. Pertanto, dopo la centrifugazione della soluzione di lavoro NR, raccogliere il surnatante utilizzando una pipetta senza aspirare i precipitati NR. Trasferire il surnatante in un serbatoio di reagenti.
    2. Rimuovere con cautela la soluzione AB/CFDA-AM versando il contenuto in un vassoio di raccolta.
    3. Aggiungere 100 μL per pozzetto della soluzione di lavoro NR utilizzando una micropipetta multicanale. Incubare la piastra a 28 °C per 3 ore.
      NOTA: Dopo l'incubazione di 3 ore, osservare se si è verificata una precipitazione NR nelle piastre usando un microscopio. I precipitati NR possono interferire con la quantificazione della vitalità cellulare, quindi non dovrebbero essere presenti.
    4. Rimuovere con cautela la soluzione NR versando il contenuto in un vassoio di raccolta. Lavare i pozzetti aggiungendo 150 μL di PBS per pozzetto.
    5. Aggiungere 150 μL per pozzetto della soluzione di estrazione NR e incubare la piastra su uno shaker per 10 minuti per agitare delicatamente. Misurare l'assorbanza a 540 nm in un lettore di piastre.
      NOTA: è necessario effettuare una seconda lettura a 690 nm per escludere qualsiasi assorbanza delle impronte digitali di fondo nella piastra.
  3. Saggio MTT
    NOTA: Il test MTT deve essere eseguito separatamente dai saggi sopra descritti (in una nuova piastra) (Figura 2).
    1. Rimuovere con cautela il supporto di esposizione versando il contenuto in un vassoio di raccolta.
    2. Aggiungere 100 μL di soluzione di lavoro MTT per pozzetto utilizzando una micropipetta multicanale. Incubare la piastra a 28 °C per 4 ore.
    3. Eliminare la soluzione MTT versando il contenuto in un vassoio di raccolta.
    4. Aggiungere 100 μL per pozzetto di DMSO per estrarre i cristalli di formazan, incubando la piastra su uno shaker per 10 minuti. Misurare l'assorbanza a 570 nm utilizzando un lettore di piastre.
      NOTA: è necessario effettuare una seconda lettura a 690 nm per escludere qualsiasi assorbanza delle impronte digitali di fondo nella piastra. È importante notare che le sostanze chimiche in esame possono interferire con l'MTT, che deve essere valutato per garantire la qualità dei dati generati32. Per questo, devono essere esposti pozzetti privi di cellule contenenti le concentrazioni di prova e MTT (0,5 mg / ml), seguiti da incubazione per osservare qualsiasi cambiamento di colore nei pozzetti che possa aumentare l'assorbanza e portare a risultati di falsa vitalità. Le sostanze chimiche che interagiscono con MTT devono essere evitate in questo test.

6. Calcolo della vitalità/citotossicità cellulare

NOTA: L'assorbanza grezza o la fluorescenza acquisita viene utilizzata per calcolare la vitalità cellulare come percentuale correlata al controllo negativo (per le sostanze chimiche in esame preparate direttamente nei mezzi di esposizione) o al controllo del solvente (per le sostanze chimiche in esame preparate utilizzando solventi, come il DMSO). Prima di determinare la percentuale di vitalità della cella, i dati grezzi devono essere normalizzati dal controllo vuoto.

  1. Calcolare l'assorbanza o la fluorescenza media per ciascuna concentrazione chimica in esame e gruppo di controllo (tre pozzetti/trattamento).
  2. Per determinare la percentuale di vitalità cellulare relativa al controllo (negativo o solvente), utilizzare l'equazione (2):
    Equation 2 (2)
    NOTA: Le unità di assorbanza (abs) o fluorescenza (fluo) rappresentano la media di assorbanza o fluorescenza misurata nei tre pozzetti per concentrazione; Blank rappresenta pozzi senza celle.

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Representative Results

La Figura 3 mostra le piastre dei saggi AB, CFDA-AM, NR e MTT. Per il saggio AB (Figura 3A), i pozzetti vuoti e i pozzetti con nessun o un numero ridotto di cellule vitali mostrano colore blu e bassa fluorescenza, mentre i pozzetti con un alto numero di cellule vitali sono rosati e presentano alti valori di fluorescenza a causa della trasformazione della resazurina (AB) in resorufin (sostanza rosata) da parte delle cellule vitali. Per il test CFDA-AM, non vi è alcuna differenza visibile nel colore dei pozzetti sulla piastra; tuttavia, la fluorescenza è maggiore nei pozzetti contenenti cellule vitali a causa della ritenzione di CFDA-AM e della successiva conversione in carbossifluoresceina (sostanza fluorescente).

Per il saggio NR (Figura 3B), i pozzetti bianchi devono essere trasparenti con valori di assorbanza molto bassi poiché non ci sono celle per trattenere il colorante NR. In alcuni casi, i pozzetti vuoti non sono trasparenti, indicando il verificarsi di precipitazioni NR sulla piastra; In questo caso, questo non dovrebbe essere considerato un esperimento valido. Le concentrazioni altamente citotossiche delle sostanze chimiche in esame e del PC sono trasparenti o presentano un colore rosa molto chiaro con bassi valori di assorbanza, mentre i pozzetti contenenti cellule vitali mantengono il colorante NR e presentano un colore rosa scuro e alti valori di assorbanza.

Per il saggio MTT (Figura 3C), i pozzetti vuoti devono essere trasparenti e con un'assorbanza molto bassa in quanto non ci sono cellule per convertire MTT in formazan. Le concentrazioni altamente citotossiche delle sostanze chimiche in esame e del PC sono trasparenti o presentano un colore viola molto chiaro con bassi valori di assorbanza, mentre i pozzetti contenenti cellule vitali trasformano l'MTT (giallo) in formazan (sostanza viola), presentando un colore viola più scuro con alti valori di assorbanza.

La figura 4A mostra un grafico rappresentativo della vitalità cellulare dopo il calcolo, utilizzando le medie dei valori di fluorescenza o assorbanza per gruppo. Il grafico può essere tracciato con l'input di valori percentuali di viabilità, calcolati dalla formula di calcolo della viabilità presentata nella sezione 6 del protocollo, utilizzando un software di analisi dei dati. La vitalità delle cellule esposte al SC non dovrebbe essere inferiore del 10% rispetto alla NC17. La percentuale di vitalità cellulare per le sostanze chimiche in esame viene calcolata in relazione al NC o al SC, a seconda della loro solubilità. In questo caso, diverse concentrazioni di DMSO sono utilizzate come sostanza in esame e la vitalità cellulare è correlata alla NC, che è definita come vitalità al 100%.

I dati di vitalità cellulare possono essere utilizzati per calcolare la metà della concentrazione inibitoria massima (IC50) delle sostanze chimiche in esame mediante trasformazione logaritmica e la curva standard interpolata mediante regressione non lineare dopo opportune repliche33,34,35. La figura 4B mostra l'IC50, calcolata in base alla percentuale di redditività mostrata nella figura 4A. L'IC50 è stato ottenuto con almeno tre repliche tecniche e tre repliche sperimentali utilizzando concentrazioni nominali nel saggio AB. Le analisi sono state eseguite con cinque diverse concentrazioni delle sostanze in esame; Tuttavia, può essere richiesto un numero maggiore di concentrazioni a seconda del tipo di esperimento. Ad esempio, otto concentrazioni di prova sono raccomandate per il test di range-finding, che di solito viene eseguito per determinare le concentrazioni finali di prova di una sostanza chimica per un esperimento. Poiché i saggi di vitalità hanno diversi endpoint di citotossicità, si consiglia di calcolare l'IC50 per ciascun test eseguito separatamente per identificare le differenze di sensibilità causate da diversi meccanismi d'azione delle sostanze chimiche o differenze di sensibilità tra le linee cellulari. Le differenze nei valori IC50 delle sostanze chimiche testate in diverse linee cellulari possono anche variare a seconda del tipo di terreno di coltura utilizzato, poiché le differenze nella composizione relative alle proteine e ai lipidi possono influire sulla biodisponibilità chimica36. Inoltre, la citotossicità di molte sostanze chimiche può essere valutata attraverso questi test. L'IC50 di altre sostanze chimiche valutate nelle linee cellulari ZFL e ZEM2S è mostrato nella Figura 4B-H.

Figure 1
Figura 1: Protocollo schematico dei saggi AB, CFDA-AM e NR eseguiti nella stessa piastra a 96 pozzetti. Abbreviazioni: AB = Alamar Blue; CFDA-AM = 5-carbossimetilfluoresceina diacetato estere acetossimetilico; NR = rosso neutro; PBS = soluzione salina tamponata con fosfato. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Protocollo schematico del saggio MTT eseguito in una piastra a 96 pozzetti. Abbreviazione: MTT = 3-[4,5-dimetiltiazol-2il]-2,5-difeniltetrazolium bromuro. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Risultati rappresentativi dei saggi AB, CFDA-AM, NR e MTT. Le immagini mostrano le differenze di colore nei pozzetti per i controlli e le concentrazioni di prova nei saggi (A) AB e CFDA-AM, (B) NR e (C) MTT. Abbreviazioni: AB = Alamar Blue; CFDA-AM = 5-carbossimetilfluoresceina diacetato estere acetossimetilico; NR = rosso neutro; PBS = soluzione salina tamponata fosfato; B = pozzi vuoti (pozzi privi di celle); SC = controllo del solvente (0,5% DMSO); NC = controllo negativo (cellule in terreno di coltura); PC = controllo positivo (1% Triton X-100). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Calcolo dei dati di vitalità e vitalità delle cellule per diverse sostanze chimiche in esame. Il calcolo della vitalità cellulare utilizzando i dati di lettura può essere espresso come percentuale (%) di vitalità cellulare correlata al NC o SC (A). La citotossicità di una sostanza chimica può essere valutata utilizzando i dati di vitalità per interpolare una curva standard mediante regressione non lineare per diverse sostanze chimiche in esame (B-H). I dati sono rappresentati come media di vitalità cellulare (punti) e deviazione standard (barre) di tre repliche tecniche e tre repliche sperimentali (saggio AB). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Saggio MTT eseguito in cellule ZFL e ZEM2S coltivate in presenza (10%) e assenza (0%, completamente privato di FBS) di FBS per 24 ore. (A) Le cellule ZFL allo 0% e al 10% di FBS non mostrano differenze significative nella vitalità cellulare secondo il test di Kruskall-Wallis (p = 0,2286). (B) Le cellule ZEM2S allo 0% e al 10% FBS non mostrano differenze significative nella vitalità cellulare con il test di Mann-Whitney (p = 0,3429). È stato considerato un livello di significatività di p < 0,05. I dati sono espressi come intervallo mediano e interquartile di tre repliche tecniche. Abbreviazioni: n.s. = nessuna differenza significativa; FBS = siero fetale bovino; MTT = 3-[4,5-dimetiltiazol-2il]-2,5-difeniltetrazolio bromuro. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Saggi MTT e NR eseguiti in cellule ZFL e ZEM2S trattate (24 ore) con DMSO a diverse concentrazioni (0,1%, 0,5% e 1%) e controllo negativo. Le cellule ZFL trattate con DMSO a qualsiasi concentrazione testata non hanno mostrato una differenza significativa nella vitalità cellulare correlata alla NC dal test (A) MTT (p = 0,074) e (B) NR (p = 0,216). Le cellule ZEM2S trattate con DMSO non hanno mostrato una differenza significativa nella vitalità cellulare correlata alla NC dal test (C) MTT (p = 0,422) e (D) NR (p = 0,287). È stato considerato un livello di significatività di p < 0,05 nel test di Kruskall-Wallis. I dati sono espressi come intervallo mediano e interquartile di tre repliche tecniche. Abbreviazioni: n.s. = nessuna differenza significativa; NC = controllo negativo; MTT = 3-[4,5-dimetiltiazol-2il]-2,5-difeniltetrazolio bromuro; NR = Rosso neutro. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Tabella 1: Soluzioni e supporti utilizzati in questo protocollo. Clicca qui per scaricare questa tabella.

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Discussion

I saggi di citotossicità sono ampiamente utilizzati per la valutazione della tossicità in vitro e questo articolo di protocollo presenta quattro saggi di citotossicità comunemente usati modificati per essere eseguiti in linee cellulari di zebrafish (cioè densità cellulare per piastra a 96 pozzetti, tempo di incubazione nel test MTT, deplezione di FBS durante la condizione di esposizione chimica e concentrazione massima accettabile per il SC). Poiché questi saggi quantificano la citotossicità in base a diversi endpoint di vitalità cellulare (funzione metabolica, integrità della membrana lisosomiale e integrità della membrana cellulare), la combinazione fornisce una valutazione accurata della citotossicità chimica nelle linee cellulari di zebrafish. Questo protocollo raccomanda anche la coltura di linee cellulari ZFL e ZEM2S in una condizione priva di CO2, grazie alla loro composizione di terreni di coltura che possono tamponare adeguatamente il sistema di coltura, mantenendo il pH a 7,4 (pH fisiologico). La composizione dei terreni di coltura e l'ambiente privo di CO2 proposti in questo protocollo per entrambe le linee cellulari sono ampiamente riportati in letteratura. La linea cellulare ZFL è solitamente coltivata in terreni L-15 e RPMI con o senza aggiunta di bicarbonato di sodio e senza CO2 37,38,39,40,41,42,43. Nel frattempo, la linea cellulare ZEM2S viene coltivata secondo le istruzioni del centro di biorisorse e i suoi terreni di coltura sono formulati per colture prive di CO2; pertanto, la miscela di CO2 e aria può essere dannosa per le cellule quando si utilizza questo tipo di terreno di coltura44.

L'esposizione chimica in un terreno di coltura senza aggiunta di FBS è stata eseguita sulla base di studi pubblicati, dimostrando che la biodisponibilità delle sostanze chimiche nei saggi in vitro è significativamente influenzata dal loro legame alle proteine del siero. Ad esempio, Chen et al.45 hanno dimostrato che la presenza di proteine sieriche nel test RTgill-W1 potrebbe ridurre la biodisponibilità di un tensioattivo cationico (C12-benzalconio) fino a tre volte e mezzo. La sostanza chimica legata all'FBS variava generalmente dal 47% al 90% nel terreno di coltura45. Pertanto, per evitare questo problema, abbiamo valutato la vitalità cellulare delle cellule ZFL e ZEM2S in colture completamente private di FBS per 24 ore utilizzando il test MTT. I risultati non hanno mostrato differenze significative nella vitalità cellulare da colture ZFL o ZEM2S con (10%) e senza (0%) FBS, indicando che queste linee cellulari di zebrafish possono essere soggette a trattamento chimico in terreni di coltura privi di FBS (Figura 5). È importante sottolineare che la diminuzione della quantità di FBS potrebbe causare altre conseguenze sulla biodisponibilità chimica. Ad esempio, le sostanze chimiche lipofile hanno un maggiore assorbimento di articoli da laboratorio e piastre di plastica, riducendo la biodisponibilità chimica36. Tuttavia, la presenza di FBS nel terreno di coltura può ridurre il legame plastico a causa dei costituenti sierici in competizione con la plastica per il legame alle sostanze chimiche46. La decisione migliore relativa alla percentuale di integrazione di FBS o alla sua completa privazione potrebbe dipendere dal tipo di sostanza chimica in esame. Ad esempio, Pomponio et al.46 hanno riferito che sebbene l'amiodarone chimico abbia un legame maggiore con la plastica in assenza di FBS, la sua biodisponibilità è ancora più bassa quando si utilizza il 10% di FBS. Per il mono-N-desetilamiodarone, quasi la stessa quantità è legata al mezzo sierico e alle pareti46.

I solventi organici (ad esempio, DMSO) sono generalmente raccomandati per essere utilizzati fino allo 0,5% nei saggi in vitro. Tuttavia, questa bassa concentrazione può compromettere il test di concentrazioni più elevate di sostanze chimiche scarsamente solubili in acqua. Per prevenire questo problema, abbiamo valutato se concentrazioni più elevate di DMSO fossero adatte per linee cellulari ZFL e ZEM2S non superiori alla soglia di citotossicità del 10%. Per questo, le cellule non trattate (NC) e le cellule trattate (24 ore) con diverse concentrazioni di DMSO (0,1%, 0,5% e 1%) sono state elaborate per i saggi MTT e NR. I risultati non hanno mostrato differenze significative nella vitalità cellulare rispetto al gruppo di trattamento rispetto alle NC (Figura 6), indicando che, in queste particolari condizioni, possono essere utilizzate concentrazioni di DMSO fino all'1%. Anche altre linee cellulari di pesce supportano concentrazioni di DMSO superiori allo 0,5%, che non è una particolarità delle linee cellulari ZFL e ZEM2S. Ad esempio, concentrazioni massime di solvente fino al 2% di DMSO (senza effetti citotossici osservati) sono state applicate in saggi di citotossicità utilizzando CHSE-214 (linea cellulare derivata dall'embrione di Oncorhynchus tshawytscha)47, RTG-2 (linea cellulare gonadica Oncorhynchus mykiss)48,49,50 e PLHC-1 (linea cellulare di carcinoma epatocellulare Poeciliopsis lucida)48 cellule. La concentrazione massima di solvente dell'1% di DMSO è stata utilizzata anche nei saggi di citotossicità utilizzando RTL-W1 (Oncorhynchus mykiss gonadal cell line)51 e CCO (Ictalurus punctatus ovary cell line)52 cellule. Secondo Mori e Wakabayashi47, le linee cellulari di pesce possono avere una minore sensibilità al DMSO rispetto alle linee cellulari di mammifero. Tuttavia, è importante sottolineare che la concentrazione massima accettabile dell'1% di DMSO è stata definita esclusivamente per la citotossicità, e questo dovrebbe essere attentamente valutato per altri endpoint (ad esempio, genotossicità, epigenetica, analisi dell'espressione genica codificante proteine) in linee cellulari ZFL e ZEM2S.

I test MTT e AB si basano sull'attività metabolica per determinare la vitalità cellulare. Sebbene il test MTT sia il test di vitalità più utilizzato, rispetto al test AB può essere leggermente meno sensibile, sovrastimando la vitalità cellulare in alcuni casi53. La maggiore sensibilità del saggio AB può essere correlata al metodo di misurazione, poiché la misurazione della fluorescenza è più sensibile della misurazione colorimetrica15. Tuttavia, sia i saggi AB che MTT sono saggi di alta qualità per identificare sostanze chimiche citotossiche e i loro dati generati sono stati utilizzati per classificare le sostanze chimiche pericolose in base al loro potenziale citotossico intrinseco53.

L'idea di eseguire i test AB, CFDA-AM e NR nella stessa piastra era basata sul TG 249 dell'OCSE (RTgill-W1 assay)17; Tuttavia, sono state apportate modifiche per eseguire questi test in piastre a 96 pozzetti, nonché per essere adatti per linee cellulari zebrafish. I saggi in piastre a 96 pozzetti, invece di piastre da 24 pozzetti, possono essere vantaggiosi per i test di citotossicità ad alto rendimento nelle linee cellulari di pesce. Inoltre, il test RTgill-W1 utilizza solo terreno di coltura L-15, mentre le linee cellulari ZFL e ZEM2S sono coltivate in un terreno contenente D-glucosio. Il terreno di coltura consente di eseguire il test MTT in queste linee cellulari, poiché le linee cellulari coltivate in terreno privo di glucosio (ad esempio, solo L-15) possono ridurre immediatamente la riduzione di MTT nelle cellule e compromettere le prestazioni di questo test54. Questo protocollo consente di eseguire facilmente quattro diversi test di vitalità in due linee cellulari di zebrafish.

Questo protocollo può essere utilizzato per studiare gli effetti delle sostanze chimiche sui pesci utilizzando modelli in vitro . Diverse linee cellulari possono avere sensibilità diverse per stimare gli effetti chimici, anche se provengono dallo stesso gruppo di vertebrati, come i pesci. Ad esempio, confrontando le linee cellulari ZFL e ZF4 con embrioni di pesce, Langu-Mitea et al.21 hanno dimostrato che ZFL è in grado di generare risultati simili rispetto al test di tossicità degli embrioni di pesce. Tanneberger et al.5 hanno dimostrato che le linee cellulari permanenti di pesce GSF, PLHC, RTG-2, RTgill-W1 e R1 hanno sensibilità diverse nel predire la tossicità chimica dei pesci rispetto a in vivo (pesci adulti). Sebbene RTgill-W1 (linea cellulare branchiale permanente dei pesci) sia stata recentemente convalidata come metodo alternativo per prevedere la tossicità acuta dei pesci, dovrebbe essere studiata l'applicabilità di altre linee cellulari negli studi di ecotossicità. Utilizzando linee cellulari di diverse specie ittiche e origini tissutali, nonché stadi di sviluppo (ZEM2S: embrione; ZFL: adult liver) può contribuire in modo significativo agli studi di ecotossicità, poiché può affrontare gli effetti relativi a specifici stadi dello sviluppo dei pesci e agli organi bersaglio. Pertanto, gli effetti chimici dovrebbero essere studiati utilizzando diverse colture cellulari che riflettono diversi siti bersaglio nei pesci (ad esempio, fegato, gonadi, branchia, cervello), e non solo in una singola linea cellulare55.

Questi protocolli possono avere diverse applicazioni negli studi di ecotossicità e il loro uso non è necessariamente limitato alla previsione della tossicità acuta dei pesci. Ad esempio, possono essere applicati per definire concentrazioni subcitotossiche per eseguire altri test di tossicità in vitro sui pesci, come la valutazione degli effetti di interferenza endocrina sui pesci. Inoltre, i dati sulla citotossicità in vitro possono anche aiutare a sviluppare e migliorare la modellazione tossicocinetica su base fisiologica (PBTK). Poiché PBTK si concentra sulla distribuzione di una sostanza chimica in un organismo considerando i diversi organi (come la branchia, il fegato o l'intestino)56, l'utilizzo di linee cellulari di diverse specie di pesci e origini tissutali può essere un'utile fonte di informazioni per questo modello. I risultati dei saggi biologici in vitro (ad esempio, saggi di citotossicità) forniscono dati di input che rappresentano i processi biologici nel modello PBTK e contribuiscono all'estrapolazione in vitro da vivo21,56.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Acknowledgments

In memoria del Dr. Márcio Lorencini, coautore di questo lavoro, eccellente ricercatore nel campo della cosmesi e dedito alla promozione della ricerca cosmetica in Brasile. Gli autori sono grati al Multi-user Laboratory del Dipartimento di Fisiologia (UFPR) per la disponibilità delle attrezzature e per il sostegno finanziario del Coordinamento per il miglioramento del personale dell'istruzione superiore (CAPES, Brasile) (Codice finanziario 001) e del Grupo Boticario.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-CFDA, AM (5-Carboxyfluorescein Diacetate, Acetoxymethyl Ester) Invitrogen C1345
Cell culture plate, 96 well plate Sarstedt 83.3924 Surface: Standard, flat base
DMEM Gibco 12800-017 Powder, high glucose, pyruvate
FBS - Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions Gibco 12657-029
Ham's F-12 Nutrient Mix, powder Gibco 21700026 Powder
HEPES (1 M) Gibco 15630080
Leibovitz's L-15 Medium Gibco 41300021 Powder
Neutral red  Sigma-Aldrich N4638 Powder, BioReagent, suitable for cell culture
Orbital shaker  Warmnest KLD-350-BI 22 mm rotation diameter
Dulbeccos PBS (10X) with calcium and magnesium Invitrogen 14080055
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122
Resazurin sodium salt  Sigma-Aldrich R7017 Powder, BioReagent, suitable for cell culture
RPMI 1640 Medium Gibco 31800-014 Powder
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 Powder,  bioreagent for molecular biology
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide  98% Sigma-Aldrich M2128
Trypan blue stain (0.4%) Gibco 15250-061
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red Gibco 15400054
ZEM2S cell line ATCC CRL-2147 This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J.
Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA)
ZFL cell line BCRJ 256

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Scienze ambientali numero 191
Saggi di citotossicità con linee cellulari di zebrafish
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