Summary
我们报告了一种用于卵巢/附件病变经阴道成像的共同注册超声和光声成像方案。该协议可能对其他转化光声成像研究有价值，特别是那些使用商业超声阵列检测光声信号和标准延迟和波束形成算法进行成像的研究。
Abstract
卵巢癌仍然是所有妇科恶性肿瘤中最致命的，因为缺乏可靠的筛查工具进行早期发现和诊断。光声成像或断层扫描 （PAT） 是一种新兴的成像方式，可以提供卵巢/附件病变的总血红蛋白浓度（相对量表，rHbT）和血氧饱和度 （%sO2），这是癌症诊断的重要参数。结合共同注册超声（美国），PAT在检测卵巢癌和准确诊断卵巢病变方面显示出巨大的潜力，以进行有效的风险评估并减少良性病变的不必要手术。然而，据我们所知，临床应用中的PAT成像方案在不同的研究中有很大差异。在这里，我们报告了一种经阴道卵巢癌成像方案，该方案可能对其他临床研究有益，特别是那些使用商业超声阵列检测光声信号和标准延迟和波束形成算法进行成像的研究。
Introduction
光声成像或断层扫描 （PAT） 是一种混合成像方式，可测量美国分辨率和深度远超组织光学扩散极限 （~1 mm） 的光吸收分布。在PAT中，纳秒激光脉冲用于激发生物组织，由于光学吸收而导致瞬态温升。这导致初始压力上升，由此产生的光声波由美国换能器测量。多光谱PAT涉及使用可调谐激光器或在不同波长下工作的多个激光器来照亮组织，从而能够重建多个波长的光学吸收图。基于近红外（NIR）窗口内氧合和脱氧血红蛋白的差异吸收，多光谱PAT可以计算出氧合和脱氧血红蛋白浓度、总血红蛋白浓度和血氧饱和度的分布，这些都是与肿瘤血管生成和血液氧合消耗或肿瘤代谢相关的功能生物标志物。PAT在许多肿瘤学应用中都取得了成功，例如卵巢癌1，2，乳腺癌3，4，5，皮肤癌6，甲状腺癌7，8，宫颈癌9，前列腺癌10，11和结直肠癌12。
卵巢癌是所有妇科恶性肿瘤中最致命的。只有38%的卵巢癌在早期（局部或区域）阶段被诊断出来，其中5年生存率为74.2%至93.1%。大多数在晚期诊断，其 5 年生存率为 30.8% 或更低13.目前的临床诊断方法，包括经阴道超声检查（TUS）、多普勒超声、血清癌抗原125（CA 125）和人附睾蛋白4（HE4），被证明对早期卵巢癌诊断缺乏敏感性和特异性14，15，16。此外，大部分良性卵巢病变可能难以用当前的成像技术准确诊断，这导致不必要的手术，增加医疗成本和手术并发症。因此，需要更多准确的非侵入性方法来对附件肿块进行风险分层，以优化管理和结果。显然，需要一种对早期卵巢癌敏感和特异性的技术，并且更准确地从良性病变中识别恶性。
我们小组通过结合临床US系统，用于容纳用于光传递的光纤的定制探针鞘和可调谐激光器1，开发了用于卵巢癌诊断的经阴道US和PAT系统（USPAT）。来自USPAT系统的总血红蛋白浓度（相对量表，rHbT）和血氧饱和度（%sO2）已显示出检测早期卵巢癌和准确诊断卵巢病变以进行有效风险评估和减少不必要的良性病变手术的巨大潜力1，2。目前的系统原理图如图1所示，控制框图如图2所示。该策略有可能整合到现有的TUS卵巢癌诊断方案中，同时提供功能参数（rHbT，%sO2）以提高TUS的敏感性和特异性。
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Protocol
所有进行的研究都得到了华盛顿大学机构审查委员会的批准。
1. 系统配置：光学照明（图1）
- 使用 Nd：YAG 激光器泵浦 10 Hz 的脉冲可调谐 （690-890 nm） 钛蓝宝石激光器。
- 通过首先用平凹透镜发散光束，然后用平凸透镜准直光束来扩展激光束。使用两个反射镜将光束引导到分束器上（如下所述）。
- 通过使用偏振分束器将原始光束分成两束，然后用另外两个第二级分束器将两束分开，将扩展的激光束分成四个能量相等的光束。
- 用光纤卡盘安装四根多模光纤。
- 使用四个平凸透镜将四个激光束聚焦到四根光纤中。
- 出于激光安全考虑，请将金属盒下的所有光学元件覆盖，以确保光路不暴露。
- 将四根纤维的另一端连接到经阴道超声探头上，并将探头和纤维包裹在保护鞘中。
注意： 换能器的护套和声学窗口涂有高反射白色油漆，以提高照明均匀性。这种设置，包括使用四种纤维进行光输送，先前已被证明是经阴道应用的最佳选择17。有关详细信息，请参阅讨论。
2.系统配置：超声波检测扫描方案
- 使用可编程的临床美国系统。
注意：可编程系统意味着可以访问原始超声数据，并且可以对自定义数据采集协议和处理算法进行编程。 - 将额外的监视器连接到美国系统以运行 USPAT 显示软件，以实时可视化 rHbT、%sO2 图和其他功能参数。
- 将激光器的内部触发器连接到美国系统的外部触发器。
- 在共注册模式下使用时分复用方法;具体地，对于每个波长，依次获取五个连续的PAT帧和一个共配准的美国帧。平均PAT帧以提高信噪比。四个波长的总数据采集时间约为 15 秒。
3. 系统校准
- 将激光泵浦能量设置为固定水平。
- 对于每个波长（750 nm、780 nm、800 nm 和 830 nm），检查每个光纤尖端的每脉冲能量输出，以确保每个选定波长处计算的能量密度为 表 1 中给出的期望值。
- 如果能量输出低于预期，则通过调整反射镜和分束器角度来微调光学对准。此步骤并不总是必需的。
- 重复步骤3.2-3.4，直到能量令人满意。
- 记录四根光纤在每个波长下的能量输出，并在USPAT显示软件中输入值。
注意：这些值用于校准rHbT的计算。激光能量随时间波动，校准可确保从多光谱PAT数据计算的定量参数尽可能准确。
4.实验程序样本：经阴道USPAT对人卵巢进行成像
- 美国专利商标局成像系统的准备
- 在机构使用标准超声探头清洁规程对腔内US探头和盖鞘进行消毒。
- 打开临床US系统，启动US系统软件，选择正确的US换能器。
- 按照步骤3校准激光系统。
- 将每个波长的总脉冲能量输入 USPAT 显示软件。
- 通过将光纤和探头封闭在探头护套内来组装 USPAT 探头。
- 患者的准备
- 遵循机构特定的方案，以获得知情同意并为患者做好准备。
- 成像
- 使用脉搏超声US定位目标卵巢。
注意：此步骤由研究医生完成，他可以自由调整临床美国机器上的成像参数，例如深度，动态范围和TGC。 - 在 USPAT 控制软件中选择所需的深度。
- 单击控制软件中的 扫描 以启动共同注册的 USPAT B 模式数据采集。观看 USPAT 图像显示软件，实时查看共配准的 US 和 PAT B 模式图像以及重建的功能图。
- 重复步骤4.3.1-4.3.3以获取更多图像和（如有必要）对第二个病变进行成像。
- 使用脉搏超声US定位目标卵巢。
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Representative Results
在这里，我们展示了USPAT成像的恶性和正常卵巢病变的示例。图 3 显示一名 50 岁的绝经前女性，对比增强 CT 显示双侧多囊附件肿块。 图 3A 显示了左侧附件的美国图像，ROI 标记了囊性病变内的可疑实体结节。 图3B 显示了叠加在美国并以红色显示的PAT rHbT图。rHbT在1 cm至5 cm的深度范围内显示出广泛的弥漫性血管分布，水平高达17.1（a.u.）。 图3C 显示了叠加在美国的%sO2分布，水平很低，平均值为46.4%。ROI 中 rHbT 和 %sO2 的直方图显示在 rHbT 和 %sO2 图的右上角。手术病理学显示左右卵巢均有分化良好的子宫内膜样腺癌。
图4显示一名患有双侧囊性病变的46岁女性。 图4A 显示了右卵巢的美国图像，带有最大直径为4.2厘米的简单囊肿。 图4B 显示了叠加在共注册US上的PAT rHbT图，在病变左侧显示散射信号，平均水平低至4.8（a.u）。图 4C 显示了%sO2图，其中显示%sO2含量更高，为67.5%。手术病理显示右卵巢正常，伴有滤泡囊肿。
根据试点数据，与良性病变相比，恶性卵巢病变的rHbT平均高1.9倍，%sO2平均降低9%。这两个具有代表性的例子突出了PAT提供的功能参数在US检测到的病变诊断中的重要性。
| 波长 | 750 纳米 | 780 纳米 | 800 纳米 | 830 纳米 |
| 纤维 1 | 4.79 毫焦耳/厘米2 | 6.16 毫焦耳/厘米2 | 6.59 毫焦耳/厘米2 | 6.33 毫焦耳/厘米2 |
| 光纤 2 | 4.62 毫焦耳/厘米2 | 5.39 毫焦耳/厘米2 | 5.99 毫焦耳/厘米2 | 6.50 毫焦耳/厘米2 |
| 光纤 3 | 4.79 毫焦耳/厘米2 | 6.07 毫焦耳/厘米2 | 6.76 毫焦耳/厘米2 | 6.84 毫焦耳/厘米2 |
| 光纤 4 | 4.70 毫焦耳/厘米2 | 6.07 毫焦耳/厘米2 | 6.67 毫焦耳/厘米2 | 6.50 毫焦耳/厘米2 |
| 总 | 18.90 毫焦耳/厘米2 | 23.69 毫焦耳/厘米2 | 26.01 毫焦耳/厘米2 | 26.17 毫焦耳/厘米2 |
| MPE （ANSI） | 25.2 毫焦耳/厘米2 | 28.9 毫焦耳/厘米2 | 31.7 毫焦耳/厘米2 | 36.4 毫焦耳/厘米2 |
表 1：以 mJ/cm 2 为单位的代表性激光能量密度测量值，耦合到四个波长的四个光纤尖端及其相应的 MPE 值。
图 1：共同注册的 US 和 PAT 系统和探针。 美国系统扩展了另一个用于USPAT显示软件的监视器，它接收激光触发器以同步美国采集。激光束由平凸透镜（L1）扩展，由平凹透镜（L2）准直，通过两级分束器（BS）分成四束，并耦合成具有四个平凸透镜（L3-6）和光纤耦合器（FC1-4）的多模光纤（MMF）。光纤通过定制探头护套连接到腔内超声探头。镜子（M）用于在必要时重定向密闭空间中的光线。未显示控制计算机。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：USPAT 控制软件的框图。控制软件通过改变激光波长、向临床 US 系统发送数据采集命令以及向显示软件发送信号以处理和可视化数据来自动化成像过程。临床US系统直接接收来自激光的触发器，以使激光激发与US检测同步。显示软件从文件系统读取射频数据。请点击此处查看此图的大图。
图 3：一名 50 岁的绝经前女性，双侧多囊附件肿块 ，增强 CT 显示。 （A） 美国左附件图像，ROI 标记囊性病变内的可疑实性结节。（B）PAT rHbT图叠加到美国并以红色显示。rHbT在1 cm至5 cm的深度范围内显示出广泛的弥漫性血管分布，水平高达17.1（a.u.）。（C） %sO2 分布叠加到美国。该水平较低，平均值为46.4%。手术病理学显示左右卵巢均有分化良好的子宫内膜样腺癌。深度标记在B扫描图像的右侧。 请点击此处查看此图的大图。
图4：一名患有双侧囊性病变的46岁女性 。 （A）右卵巢的US，具有最大直径为4.2厘米的简单囊肿。（B）叠加在共注册US上的PAT rHbT图谱显示病变左侧的散射信号，平均水平低至4.8（a.u）。（C）%sO2图显示%sO2含量较高，为67.5%。手术病理显示右卵巢正常，伴有滤泡囊肿。深度标记在B扫描图像的右侧。 请点击此处查看此图的大图。
补充文件1：探针护套。请点击此处下载此文件。
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Discussion
光学照明
使用的光纤数量基于两个因素：光照明均匀性和系统复杂性。在皮肤表面具有均匀的光照明图案以避免热点至关重要。同样重要的是，用最少的光纤保持系统的简单和稳健。以前，使用四根独立的光纤已被证明是在几毫米及以上的深度产生均匀照明的最佳选择。此外，与四根光纤的光耦合相对简单和坚固，符合患者研究的需要。我们之前已经证明，使用四根1 mm芯多模光纤，光纤尖端距离组织约10 mm，安装在高反射探针护套中（请参阅 设计补充文件1 ）是经阴道光声成像的最佳选择17。
美国专利商标局显示软件
我们使用的临床美国系统可以编程为单波长PAT21的实时显示。然而，我们的方法需要对多光谱PAT数据进行自定义后处理以计算功能参数，因此我们选择在C++实施我们自己的USPAT显示软件来计算和可视化功能图和参数。US和PAT B模式图像使用标准延迟和波束形成、对数压缩和动态范围从RF数据计算出来，然后插值成扇形。根据多光谱PAT数据计算的rHbT和%sO2图（参见后面讨论中的“rHbT和%sO2的计算”）显示在共配准图像上，或者可选地显示在用户定义的感兴趣区域（ROI）中。%sO2 和 rHbT 的平均值和最大值显示在屏幕上以供参考。在成像过程中，显示软件在服务器模式下用于侦听来自 USPAT 控制软件的通过 TCP/IP 的远程过程调用 （RPC），以进行在线处理和实时可视化。它还可用于离线处理和可视化。
图像处理算法最好在专用图形硬件（如GPU）上实现，但在这项研究中，我们能够通过优化的CPU实现实现令人满意的性能。最大的性能提升来自于将空间域算法替换为其频域等效算法。利用快速傅立叶变换，我们可以简单地提高空间滤波操作的计算复杂度，这些运算通常具有O（n 2），时间复杂度，到O（n logn），这在实践中非常接近线性时间。此外，对于原始RF数据的滤波，我们使用Overlap-Add方法18实现了快速离散卷积，该方法在有限脉冲响应（FIR）滤波方面表现出色。
rHbT 和 %sO2 的计算
从多光谱PAT数据得出的功能参数的计算在USPAT显示软件中实现，功能参数自动计算并实时可视化。简而言之，我们通过求解非负线性最小二乘问题来计算每个像素处的氧血红蛋白和脱氧血红蛋白（相对尺度，rHbO和rHbR）浓度：
其中g表示四个波长下的测量值，H表示每个波长处氧血红蛋白和脱氧血红蛋白的消光系数矩阵，f表示rHbO和rHbR。rHbT只是rHbO和rHbR的总和，%sO2可以从rHbO：rHbT2的比率计算出来。这些参数的计算在USPAT显示软件中实现，并且是完全自动化的。该系统的这种方法通过测量悬浮在脂质内溶液2中的校准血管模型来验证。
美国专利商标局控制软件
USPAT 控制软件通过与用于波长调整的激光器、用于数据采集的临床 US 系统以及用于数据处理和可视化的 USPAT 显示软件进行通信，使 USPAT 数据采集过程自动化。在图形用户界面 （GUI） 中选择深度后，软件向美国系统发送命令（通过以太网电缆通过 TCP/IP 加载正确的序列文件）。 扫描 按钮开始采集一组共同注册的多光谱 PAT 和美国数据。首先，控制软件按顺序从最低到最高调谐激光波长（通过USB），而美国系统则获取共同注册的PAT和美国帧。最后，控制软件触发USPAT显示软件（通过TCP / IP）计算US和PAT B模式图像，重建功能图，并实时显示它们。同时，激光被调回最低波长。
局限性
目前，USPAT技术存在一些局限性。首先，使用4-10 MHz带宽的商用美国换能器，光声成像只能达到约5厘米的深度。因此，对于深度超过5cm的卵巢，或者当目标病理过程在大附件肿块内距离阴道穹窿超过5cm时，PAT是有限的。其次，美国换能器的视场有限，需要从多个角度扫描较大的病灶，以获得更能代表病灶 rHbT 和 %sO2 对比度的平均值。第三，已经报告了相对总血红蛋白浓度，因为PAT测量是局部通量分布和光吸收曲线的乘积。从 体内 测量中估计光吸收曲线具有挑战性。最近，已经探索了基于神经网络的方法来重建绝对总血红蛋白浓度19，但这些方法仍有待验证。最后，多光谱光声成像的帧速率受到激光调谐其波长的速度的限制。激光器工作在10 Hz并经过机械调谐，四个波长的数据采集大约需要15 s，因此这是提高帧速率的瓶颈。
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Disclosures
作者在手稿中没有相关的经济利益，也没有其他潜在的利益冲突需要披露。
Acknowledgments
这项工作得到了NCI（R01CA151570，R01CA237664）的支持。作者感谢由Mathew Powell博士领导的整个GYN肿瘤学小组帮助招募患者，放射科医生Cary Siegel，William Middleton和Malak Itnai博士帮助美国研究，以及病理学家Ian Hagemann博士帮助病理学解释数据。作者非常感谢Megan Luther和GYN研究协调员在协调研究时间表，确定研究患者和获得知情同意方面所做的努力。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clinical US imaging system | Alpinion Medical Systems | EC-12R | Fully programmable clinical US system |
| Dielectric mirror | Thorlabs | BB1-E03 | Used to reflect light along the optical path |
| Endocavity US transducer | Alpinion Medical Systems | EC3-10 | Transvaginal ultrasound probe |
| Laser power meter | Coherent | LabMax TOP | Used to measure laser energy |
| Multi-mode optical fiber | Thorlabs | FP1000ERT | Couple laser light to the endocavity ultrasound probe |
| Non-polarizing beam splitter plate | Thorlabs | BSW11 | For splitting laser beam into sensors to measure energy |
| Plano-concave lens | Thorlabs | LC1715 | For laser beam expansion |
| Plano-convex lens | Thorlabs | LA1484-B | For laser beam collimation |
| Plano-convex lens | Thorlabs | LA1433-B | Used to focus light into four optical fibers |
| Polarizing beam splitter cube | Thorlabs | PBS252 | For splitting laser beam into four beams |
| Protective probe shealth | Custom 3D printed | Hold and protect the four optical fibers at the tip of the ultrasound probe | |
| Right angle prism mirror | Thorlabs | MRA25-E03 | Used to reflect light along the optical path |
| Tunable laser system | Symphotic TII | LS-2145-LT50PC | Light source for multispectral PAT |
| USPAT control software | Custom developed in C++ | Controls acquisition parameters of the ultrasound machine and the laser wavelength | |
| USPAT image display software | Custom developed in C++ | Displays the US/PAT B-scans and sO2/rHbT maps in real time |
References
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