Summary
即用型冷冻神经元库存是评估突触功能的有力工具。在这里，我们使用96孔板从冷冻原液中引入一种简单的低密度原代培养物。
Abstract
神经元培养是评估突触功能和药物筛选的宝贵系统。特别是，原代海马神经元的低密度培养允许研究单个神经元或亚细胞成分。我们已经使用低密度原代海马培养物通过免疫细胞化学、神经元极性、突触形态及其发育变化显示了神经元内的亚细胞蛋白定位。最近，即用型冷冻神经元库存已经商业化。这些冷冻的神经元库存减少了准备动物实验所需的时间，也有助于减少使用的动物数量。在这里，我们介绍了一种使用96孔板的可重现的低密度原代培养方法。我们使用了来自大鼠胚胎海马体的市售冷冻神经元储备。通过在特定时间点减少神经胶质细胞的生长，神经元可以长期稳定培养，而无需改变培养基。这种使用低密度培养物的高通量测定允许对突触可塑性进行可重复的基于成像的评估。
Introduction
开发一种体外实验系统，可以评估参与学习和记忆的突触功能是很重要的。神经元培养是体外评估突触功能的宝贵系统。神经元培养技术于 1980 年代首次使用，在 1990 年代，开发了原代海马神经元的低密度培养1，2，3 用于研究单个神经元的蛋白质成分亚细胞定位、蛋白质运输、神经元极性、脊柱形态、突触发育和可塑性4，5，6，7，8.然而，这种技术涉及许多步骤：交配动物、解剖胚胎、制备培养容器以及每周更换一次培养基培养细胞 3 周。此外，它需要先进的技术3.
我们已经从大鼠胚胎9，10中开发了分离的海马神经元的冷冻库存。冷冻的神经元储备是即用型的，培养细胞不需要先进的技术11，12。换句话说，从冷冻的原种培养神经元并不取决于实验者的技术。它消除了对动物实验的需要（例如，允许动物实验，安排定时怀孕的动物和解剖大鼠胚胎），从而减少了使用的动物数量。最近，高质量、即用型冷冻神经元库存已经商业化。在这里，我们使用了胚胎日（E）18大鼠海马体13，14，15的市售冷冻储备。从冷冻原液中培养神经元不需要胶质条件培养基或与神经胶质细胞共培养。无需额外血清的普通原代培养基可用于培养细胞;因此，我们可以获取可重复的数据。此外，细胞接种后3周内不需要更换培养基，因为神经胶质细胞的生长减少（图1）。
树突棘是大多数兴奋性突触的突触后隔室。它们含有受体蛋白、突触后支架蛋白和肌动蛋白细胞骨架蛋白。我们专注于肌动蛋白结合蛋白drebrin 5，6，7，16，17，18。Drabrin 在成熟神经元19 的脊柱头部积聚，我们报道了 Drebrin 作为突触状态15，17，20，21，22，23 的标志物。通过使用drebrin作为读数进行高内涵分析，我们最近报道了苯环利定类似物对N-甲基-D-天冬氨酸型谷氨酸受体（NMDARs）的抑制作用10以及天然化合物和生药对突触状态的NMDAR依赖性作用15。
在这里，我们详细介绍了如何以低密度培养冷冻的神经元储备。此外，我们展示了使用96孔板对突触状态进行基于drebrin成像的评估。
Protocol
1. 板材涂层
- 用聚-L-赖氨酸（1 mg / mL，在0.1 M硼酸盐缓冲液[pH：8.5]中稀释;100μL /孔）涂覆96孔微孔板，并在37°C孵育过夜。
注意：仅涂覆需要使用的孔。在这里进行的实验中，使用了中间的60孔。硼酸盐缓冲液通过在灭菌水中混合50mM硼酸和12mM硼酸盐来制备。 - 用灭菌水（250μL/孔）清洗板两次。
- 用不含补充剂的新鲜培养基（250μL/孔）清洗板一次。
- 在干净的工作台上干燥板20分钟。
- 用铝箔包裹板，并保持在4°C直至使用（有效期为1个月）。
2. 细胞接种
- 向包衣板中加入50μL /孔的培养基，并将其保持在37°C，5%CO2 培养箱中30分钟至1小时。用无菌水（200μL/孔）填充外围孔。
注意：通过在神经基础培养基中加入 50x B-27、400x 谷氨酰胺和 100 U/mL 青霉素/链霉素来制备培养基（有关详细信息，请参阅 材料表 ）。 - 从液氮罐中取出神经元冷冻管。这里使用的神经元是DMSO冷冻保存的神经元11。
- 将冷冻管浸入37°C加热块中长达3分钟，并部分解冻内容物。不要将冷冻管加热太久。解冻后立即将内容物转移到 50 mL 管中。
- 使用带宽孔尖端的 1 mL 移液器将神经元冷冻管内容物缓慢滴液 （50 μL/s） 转移到无菌 50 mL 管中。
- 用1mL培养基（室温;RT）。将此 1 mL 培养基从冷冻管中逐滴 （50 μL/s） 转移到含有细胞悬液的 50 mL 管中。
- 将 9 mL 培养基 （RT） 滴加到 50 mL 管中 （0.5 mL/s） 中，并将体积补足至 11 mL。不要重复移液，而是慢慢混合细胞悬液。
- 计数细胞数（使用细胞计数器或血细胞计数器）。
- 将所有细胞悬液转移到储液器中，并使用具有宽孔吸头的多通道移液器（1.0 x 104 个细胞/孔）将细胞悬液分配到96孔板中。为了减少培养基蒸发，用灭菌水填充外围孔（步骤2.1）。
注意：本研究证实，对于没有培养基交换的3周培养物，培养基蒸发量很小。培养基的还原率为3.6%（n = 120孔）。因此，在3周的潜伏期内，渗透压浓度变化不会剧烈。 - 将神经元在37°C，5%CO 2培养箱中孵育1-2 小时。
- 用每孔 100 μL 预热培养基 （37 °C） 替换培养基，并将其放回 37 °C、5% CO2 培养箱中（培养过程中无需更换培养基）。
3. 阿拉-C治疗
- 在4天 体外 （DIV）时，加入胞嘧啶β-D-阿拉伯-呋喃糖苷（Ara-C）至每孔0.2μM的终浓度，以减少神经胶质细胞的生长。
4. 药物治疗
- 在 体外21天，用感兴趣的药物治疗细胞。
- 在药物治疗期间将板的温度保持在37°C。
- 对于阳性对照，在固定前用100μM谷氨酸（每孔终浓度）处理细胞10分钟。
5. 固定
- 固定时，在0.1 M磷酸盐缓冲液（100μL/孔）中使用4%多聚甲醛。
- 固定~20分钟后，用磷酸盐缓冲盐水（PBS;250μL/孔）洗涤孔2次，每次5分钟。
6. 免疫细胞化学
- 用PBS（250μL/孔）洗涤细胞1次5分钟。
- 在PBS中用0.1%Triton X-100（100μL /孔）透化细胞5分钟。
- 用PBS（250μL/孔）洗涤细胞3次，每次5分钟。
- 为了阻断，在室温下在PBS（PBSA;100μL /孔）中使用3%牛血清白蛋白1小时。
- 将细胞与抗德雷布林（1：1）和抗微管相关蛋白2（MAP2）（1：000）抗体（60μL /孔）在4°C孵育过夜。
- 用PBS（250μL/孔）洗涤细胞4次，每次5分钟。
- 将细胞与适当的二抗和4′，6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI; 1：1000）在PBSA（60μL /孔）中在室温下孵育2小时。
- 用PBS（250μL/孔）洗涤细胞4次，每次5分钟。
- 将细胞储存在含有0.1%叠氮化钠（150μL/孔）的PBS中。
7. 图像采集与分析
- 要获取图像，请使用适当的显微镜。
- 要识别神经元的细胞体，请使用MAP2阳性和DAPI阳性区域。
- 为了识别神经元的树突，请使用没有细胞体的MAP2阳性信号。
- 要识别 drebrin 簇，请沿 MAP2 阳性树突使用drebrin 阳性信号。
Representative Results
按照该方案，将神经元在96孔板中培养21天，然后用谷氨酸处理（图1）。神经元在没有交换培养基的情况下正常发育3周（图2）。我们用几种浓度的谷氨酸（1μM，3μM，10μM，30μM和100μM在灭菌水中稀释）处理细胞10分钟并固定它们。进行免疫细胞化学，并使用带有sCMOS相机的自动荧光显微镜获取drebrin和MAP2的荧光图像。如图 3所示，沿着MAP2阳性树突清晰地观察到drebrin阳性树突棘。已经表明，谷氨酸刺激通过NMDAR引起Ca2+ 流入，这导致drebrin从树突棘中流出，导致drebrin簇密度降低5，17。因此，我们观察到drebrin簇密度对谷氨酸刺激的剂量依赖性降低10 （图4）。 如图5所示，如果将drebrin用作突触状态的标志物，则该方法具有高度可重复性。
图 1：方法方案。 将神经元在96孔板中培养21天，然后用谷氨酸处理。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：使用 96 孔板培养神经元的明场图像。 使用共聚焦定量图像细胞仪从每个发育阶段（DIV 1，7，14，21）获得相衬图像。比例尺：50 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图3：免疫染色培养神经元的代表性图像 。 （左）drebrin（绿色）和MAP2（红色）的合并荧光图像。drebrin和MAP2的每个荧光图像分别显示在中间和右侧面板中。白色矩形显示下面放大的区域。比例尺;上面板：50 μm，下面板：20 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：谷氨酸依赖性剂量反应在标准化 drebrin 簇密度的变化。 （A）使用用0μM，10μM和100μM谷氨酸处理的孔中的drebrin（绿色）和MAP2（红色）免疫染色的代表性荧光图像（从左到右）。比例尺：50 μm。 （B）Drabrin 簇密度由对照平均值 （0 μM） 归一化。0μM，N = 58孔;1 μM， N = 46;3 μM， N = 54;10 μM， N = 45;30 μM， N = 54;100μM，N = 55，来自使用不同批次的13个实验。** P < 0.01 与对照组 （0 μM） 相比，通过方差分析后的邓内特多重比较测试。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：drebrin 簇密度的谷氨酸依赖性剂量反应变化。 来自使用不同批次的六个实验的原始数据。每种浓度（0 μM、3 μM、10 μM、30 μM 和 100 μM）N = 4 孔。数值表示为 SEM ±平均值。 请点击此处查看此图的大图。
图6：冷冻神经元储备在电生理实验中的应用 。 （A）使用微电极阵列（MEA）板进行电生理实验的方案。包衣：在电镀细胞前一天，将每个48孔MEA板预先涂上聚乙烯亚胺（PEI：0.1%）溶液，并在37°C下孵育1小时。 然后将MEA板用灭菌水洗涤3次并干燥1h。然后，将MEA板在4°C下保持过夜。高密度培养：将50，000个细胞/孔的神经元接种到48孔MEA板上。细胞接种步骤如上述协议第2节所述进行。层粘连蛋白（20μg/mL）加入培养基（向神经基础培养基中加入2 v/v%B-27、2.5 mM谷氨酰胺和100 μg/mL青霉素/链霉素）用于铺板神经元。此后，将神经元在37°C，5%CO2 的培养基中培养。培养基在DIV 1上与培养基完全交换，直至DIV 3。在DIV 4（最终0.2μM）处加入Ara-C。从DIV 5开始，每周2次，50%的培养基更换为培养基。用MEA系统记录MEA板每个孔上神经元的活性。（B）在37°C下，在5%CO2 气氛下，使用MEA系统在DIV 21处以12.5kHz/通道的采样率获得自发神经元活动。显示井内 16 个通道中的 4 个通道的记录。对于所有录音，都应用了巴特沃斯带通滤波器（200-3，000 Hz）。箭头显示同步连发射击的时间。 请点击此处查看此图的大图。
Discussion
该方法的关键步骤是解冻细胞悬液。在细胞悬液变得太热之前转移细胞悬液非常重要。然而，为避免渗透压的快速变化，请勿一次将细胞悬液转移到大量培养基中。逐滴添加培养基对于避免渗透压的突然变化也至关重要。
神经元可以在其他培养容器中培养：24孔板，8孔室，60 mm培养皿或MED探针。然而，在这些情况下，需要调整最终浓度和添加Ara-C的时间。此外，神经元的密度需要在不同类型的实验中进行优化。例如，电生理实验需要高密度培养，在这种情况下，每周需要两次培养基更换（图6）。因此，低密度培养比高密度培养需要的步骤更少。
低密度神经元培养通常需要先进的技术;但是，使用即用型冷冻库存可以解决此问题。所描述的方法不依赖于实验者的技能。冷冻浆料质量稳定，只要储存在液氮中，避免温度变化长达4年，就可以稳定养殖。
在没有培养基交换的情况下培养细胞3周提出了是否存在显着渗透压变化或培养基蒸发的问题。但是，我们已经确认培养基蒸发量很小（还原率为3.6%）。突触蛋白的定位和神经元的形态在3周后看起来正常。因此，没有培养基交换的3周培养不会引起影响培养神经元条件的较大渗透压变化。在Ara-C处理后将板保持在培养箱中也是最大限度地减少蒸发的重要一点。
冷冻存量神经元的使用没有限制。然而，低密度培养方法存在一些局限性。我们确认低密度培养物可用于神经元的形态学观察、突触功能的评估和GFP转染。然而，我们还没有检查活细胞成像。此外，如上所述，需要进行电生理学的高密度培养。
突触成熟通常需要3周7，我们无法确认培养的神经元是否具有适当的突触，直到最后。如果突触在3周后发育不良，我们将不得不再次培养。通过在开始实验之前了解神经元的质量，我们可以节省这 3 周的时间。因此，为了有效地进行实验，最好提前检查神经元的质量。冷冻库存可以事先检查神经元的质量。每批冷冻库存由一窝老鼠产生，我们可以使用每批中的一种库存进行质量检查。Drebrin是神经元质量检查的良好标志物。如上所述，drebrin积聚在成熟神经元的脊柱头中，并对突触刺激做出反应。因此，我们可以通过使用drebrin作为标记来检查冷冻库存中神经元的质量。
该方法可用于评估药物对突触状态的影响。树突棘的drebrin外流发生在突触可塑性的初始阶段22。因此，通过药物治疗引起的drebrin簇减少的检测表明，该药物刺激突触并引起突触可塑性。此外，为了确定还原是否依赖于NMDAR，使用2-氨基-5-磷酸新钙酸（APV，一种NMDAR拮抗剂）的实验是有用的。使用drebrin作为标记，即使是NMDAR依赖性也可以明确确定10，15。所描述的方法可用于药物筛选、安全药理学研究和突触功能评估。
Disclosures
Tomoaki Shirao是AlzMed，Inc.的首席执行官。该研究由AlzMed，Inc.资助（500，000日元给NK，用于题为“突触功能的高通量分析”的项目）。
Acknowledgments
我们感谢Kazumi Kamiyama和Manami Kawada在实验方面的帮助。这项工作得到了JSPS KAKENHI（N.K.的授权号19K08010）和日本医学研究与发展机构（AMED）（授权号JP19bk0104077和JP22bm0804024）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well plate | Zeon Corporation | Gifted | |
| 96 well plate | greiner | 655986 | |
| Anti-drebrin antibody (M2F6) | MBL | D029-3 | Mouse monoclonal (dilution 1:1) |
| Anti-MAP2 antibody | Millipore | AB5622 | Rabbit (dilution 1:1000) |
| Anti-mouse Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A11031 | Dilution 1: 500 |
| Anti-rabbit Alexa Fluor | Thermo Fisher Scientific | A11008 | Dilution 1: 500 |
| B-27 | Gibco | 17504-044 | 2 v/v% for MEA plates; 50x for normal plates |
| Borax | Sigma | B-9876 | Final concentration 12 mM |
| Boric acid | WAKO | 021-02195 | Final concentration 50 mM |
| Bovine serum albumin | Millipore | 12659-100G | Final concentration: 3% in PBS |
| Confocal quantitative image cytometer CellVoyager CQ1 |
YOKOGAWA | Phase contrast images | |
| Cytosine β-D-arabino-furanoside (Ara-C) | Sigma | C-6645 | Diluted in dH2O (final concentration: 0.2 µM) |
| DAPI | FUJIFILM | 340-07971 | Dilution 1:1000 |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 2.5 mM for MEA plates; 400x for normal plates |
| In Cell Analyzer 2200 | Cytiva | Fluorescence images | |
| Laminin | Sigma | 114956-81-9 | Final concentration: 20 µg/mL |
| Maestro | Axion Biosystems | MEA recordings | |
| MEA plate | Axion Biosystems | M768-tMEA-48W | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| Paraformaldehyde | nacalai tesque | 26126-25 | Final concentration: 4% in PBS |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100 U/mL for normal plates |
| Penicillin/Streptomycin | nacalai tesque | 26253-84 | 100 µg/mL for MEA plates |
| polyethyleimine | Sigma | 9002-98-6 | Final concentration: 0.1% |
| Poly-L-lysine | Sigma | P2636 | Diluted in the borate buffer (final concentration: 1 mg/mL) |
| SKY Neuron | AlzMed , Inc. | ARH001 | 1.0 x 106 cells/tube |
| Sodium azide | FUJIFILM | 195-11092 | 0.1% |
| SodiumL(+)-Glutamate monohydrate | WAKO | 194-02032 | Diluted in dH2O (final concentrations: 1 µM, 3 µM, 10 µM, 30 µM, 100 µM) |
References
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Research. 126 (3), 397-342 (1977).
- Kaech, S., Banker, G.
- Roppongi, R. T., Champagne-Jorgensen, K. P., Siddiqui, T. J. Low-density primary hippocampal neuron culture. Journal of Visualized Experiments. (122), e55000 (2017).
- Mizui, T., et al. Drebrin E is involved in the regulation of axonal growth through actin-myosin interactions. Journal of Neurochemistry. 109 (2), 611-622 (2009).
- Mizui, T., et al. Myosin II ATPase activity mediates the long-term potentiation-induced exodus of stable F-actin bound by drebrin A from dendritic spines. PLoS One. 9 (1), 85367 (2014).
- Takahashi, H., Mizui, T., Shirao, T. Down-regulation of drebrin A expression suppresses synaptic targeting of NMDA receptors in developing hippocampal neurons. Journal of Neurochemistry. 97, 110-115 (2006).
- Takahashi, H., et al. Drebrin-dependent actin clustering in dendritic filopodia governs synaptic targeting of postsynaptic density-95 and dendritic spine morphogenesis. The Journal of Neuroscience. 23 (16), 6586-6595 (2003).
- Yamazaki, H., Sasagawa, Y., Yamamoto, H., Bito, H., Shirao, T. CaMKIIbeta is localized in dendritic spines as both drebrin-dependent and drebrin-independent pools. Journal of Neurochemistry. 146 (2), 145-159 (2018).
- Hanamura, K., et al. High-content imaging analysis for detecting the loss of drebrin clusters along dendrites in cultured hippocampal neurons. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 99, 106607 (2019).
- Mitsuoka, T., et al. Assessment of NMDA receptor inhibition of phencyclidine analogues using a high-throughput drebrin immunocytochemical assay. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 99, 106583 (2019).
- Ishizuka, Y., Bramham, C. R. A simple DMSO-based method for cryopreservation of primary hippocampal and cortical neurons. Journal of Neuroscience Methods. 333, 108578 (2020).
- Pischedda, F., et al. Cryopreservation of primary mouse neurons: The benefit of neurostore cryoprotective medium. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 81 (2018).
- Kobayashi, Y., et al. Impairment of ciliary dynamics in an APP knock-in mouse model of Alzheimer's disease. Biochemical and Biophysical Research Communications. 610, 85-91 (2022).
- Kobayashi, Y., et al. Properties of primary cilia in melanin-concentrating hormone receptor 1-bearing hippocampal neurons in vivo and in vitro. Neurochemistry International. 142, 104902 (2021).
- Koganezawa, N., et al. NMDA receptor-dependent and -independent effects of natural compounds and crude drugs on synaptic states as revealed by drebrin imaging analysis. The European Journal of Neuroscience. 53 (11), 3548-3560 (2021).
- Mizui, T., Takahashi, H., Sekino, Y., Shirao, T. Overexpression of drebrin A in immature neurons induces the accumulation of F-actin and PSD-95 into dendritic filopodia, and the formation of large abnormal protrusions. Molecular and Cellular Neurosciences. 30 (1), 149-157 (2005).
- Sekino, Y., et al. Activation of N-methyl-D-aspartate receptor induces a shift of drebrin distribution: disappearance from dendritic spines and appearance in dendritic shafts. Molecular and Cellular Neurosciences. 31 (3), 493-504 (2006).
- Takahashi, H., Yamazaki, H., Hanamura, K., Sekino, Y., Shirao, T. Activity of the AMPA receptor regulates drebrin stabilization in dendritic spine morphogenesis. Journal of Cell Science. 122, 1211-1219 (2009).
- Aoki, C., et al. Drebrin A is a postsynaptic protein that localizes in vivo to the submembranous surface of dendritic sites forming excitatory synapses. The Journal of Comparative Neurology. 483 (4), 383-402 (2005).
- Koganezawa, N., Hanamura, K., Sekino, Y., Shirao, T.
- Shirao, T., et al.
- Sekino, Y., Koganezawa, N., Mizui, T., Shirao, T.
- Togo, K., et al. Postsynaptic structure formation of human iPS cell-derived neurons takes longer than presynaptic formation during neural differentiation in vitro. Molecular Brain. 14 (1), 149 (2021).
