Summary
المواد العضوية المشتقة من المريض (PDO) هي ثقافة ثلاثية الأبعاد (3D) يمكنها تقليد بيئة الورم في المختبر. في سرطان المبيض المصلي عالي الدرجة ، تمثل PDOs نموذجا لدراسة المؤشرات الحيوية والعلاجات الجديدة.
Abstract
Organoids هي نماذج الورم الديناميكي 3D التي يمكن أن تنمو بنجاح من أنسجة ورم المبيض المشتقة من المريض ، أو الاستسقاء ، أو السائل الجنبي وتساعد في اكتشاف علاجات جديدة ومؤشرات حيوية تنبؤية لسرطان المبيض. تلخص هذه النماذج عدم التجانس النسيلي ، والبيئة المكروية للورم ، وتفاعلات الخلايا الخلوية ومصفوفة الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، فقد ثبت أنها تتطابق مع الورم الرئيسي من الناحية الشكلية والخلوية والكيميائية المناعية ووراثيا. وبالتالي ، فإن المواد العضوية تسهل البحث عن الخلايا السرطانية والبيئة المكروية للورم وتتفوق على خطوط الخلايا. يصف البروتوكول الحالي طرقا متميزة لتوليد عضويات سرطان المبيض المشتقة من المريض من أورام المرضى والاستسقاء وعينات السائل الجنبي بمعدل نجاح أعلى من 97٪. يتم فصل عينات المريض إلى معلقات خلوية عن طريق الهضم الميكانيكي والأنزيمي. ثم يتم طلاء الخلايا باستخدام مستخلص الغشاء القاعدي (BME) ويتم دعمها بوسائط نمو محسنة تحتوي على مكملات خاصة بزراعة سرطان المبيض المصلي عالي الدرجة (HGSOC). بعد تشكيل المواد العضوية الأولية ، يمكن ل PDOs الحفاظ على ثقافة طويلة الأجل ، بما في ذلك المرور للتوسع في التجارب اللاحقة.
Introduction
في عام 2021 ، تم تشخيص ما يقرب من 21,410 امرأة في الولايات المتحدة حديثا بسرطان المبيض الظهاري ، وتوفيت 12,940 امرأة بسبب هذا المرض1. على الرغم من إحراز تقدم كاف في الجراحة والعلاج الكيميائي ، إلا أن أكثر من 70٪ من المرضى الذين يعانون من مرض متقدم يطورون مقاومة العلاج الكيميائي ويموتون في غضون 5 سنوات من التشخيص 2,3. وبالتالي ، هناك حاجة ماسة إلى استراتيجيات جديدة لعلاج هذا المرض الفتاك ونماذج تمثيلية موثوقة للبحوث قبل السريرية.
خطوط الخلايا السرطانية والطعوم الخارجية المشتقة من المريض (PDX) التي تم إنشاؤها من أورام المبيض الأولية هي الأدوات الرئيسية المستخدمة في أبحاث سرطان المبيض. الميزة الرئيسية لخطوط الخلايا السرطانية هي توسعها السريع. ومع ذلك ، فإن ثقافتهم المستمرة تؤدي إلى تغيرات في النمط الظاهري والجيني تتسبب في انحراف خطوط الخلايا السرطانية عن عينة ورم السرطان الأولية الأصلية. نظرا للاختلافات الموجودة بين خط الخلايا السرطانية والورم الرئيسي ، فإن فحوصات الأدوية التي لها تأثيرات إيجابية في خطوط الخلايا تفشل في الحصول على نفس التأثيرات في التجارب السريرية2. للتغلب على هذه القيود ، يتم استخدام نماذج PDX. يتم إنشاء هذه النماذج عن طريق زرع أنسجة سرطان المبيض الطازجة في الفئران التي تعاني من نقص المناعة. كما هي في نماذج الجسم الحي ، فإنها تشبه بدقة الخصائص البيولوجية البشرية ، وبالتالي ، فهي أكثر تنبؤا بنتائج الأدوية. ومع ذلك ، فإن هذه النماذج لها أيضا قيود كبيرة ، بما في ذلك التكلفة والوقت والموارد اللازمة لتوليدها4.
تقدم PDOs نموذجا بديلا للأبحاث قبل السريرية التي تتغلب على قيود كل من خطوط الخلايا السرطانية ونماذج PDX. تلخص PDOs ورم المريض والبيئة المكروية للورم ، وبالتالي توفر نموذجا قابلا للسحب في المختبر مثاليا للبحث قبل السريري2،3،5. تتمتع نماذج 3D هذه بقدرات التنظيم الذاتي التي تصمم الورم الرئيسي ، وهي ميزة لا يمتلكها نظرائهم في خط الخلايا ثنائي الأبعاد (2D). علاوة على ذلك ، فقد ثبت أن هذه النماذج تمثل وراثيا ووظيفيا الأورام الأم ، وبالتالي فهي نماذج موثوقة لدراسة العلاجات الجديدة والعمليات البيولوجية. باختصار ، إنها توفر إمكانات توسع وتخزين طويلة الأجل مماثلة لخطوط الخلايا ولكنها تشمل أيضا البيئة المكروية والتفاعلات بين الخلايا والخلايا المتأصلة في نماذج الماوس 4,6.
يصف البروتوكول الحالي إنشاء PDOs من الأورام المشتقة من المريض ، والاستسقاء ، وعينات السائل الجنبي بمعدل نجاح أعلى من 97٪. يمكن بعد ذلك توسيع مزارع PDO لأجيال متعددة واستخدامها لاختبار حساسية العلاج الدوائي والمؤشرات الحيوية التنبؤية. تمثل هذه الطريقة تقنية يمكن استخدامها لتخصيص العلاجات بناء على الاستجابات العلاجية ل PDOs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم الحصول على جميع عينات الأنسجة البشرية التي تم جمعها للبحث وفقا للبروتوكول المعتمد من مجلس المراجعة المؤسسية (IRB). تم تنفيذ البروتوكولات الموضحة أدناه في بيئة زراعة الأنسجة البشرية المعقمة. تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من البشر. يجب أن يكون لدى المرضى المؤهلين تشخيص أو تشخيص مفترض لسرطان المبيض ، وأن يكونوا مستعدين وقادرين على التوقيع على الموافقة المستنيرة ، وأن يكونوا على الأقل 18 عاما من العمر. تم الحصول على أنسجة الورم (الورم الأولي الخبيث أو المواقع النقيلية) ، والاستسقاء ، والسائل الجنبي من المرضى الموافقين في وقت الإجراء. تم نقل هذه العينات على الفور إلى المختبر ومعالجتها لتوليد المواد العضوية باستخدام الطرق الموضحة أدناه.
1. إعداد وسائل الإعلام
- إعداد كامل للوسائط العضوية
- قم بإعداد الوسط المكيف R-spondin 1 / Noggin بعد تقرير منشور مسبقا7.
ملاحظة: R-spondin-1 / Noggin الوسط المكيف هو بديل أكثر بأسعار معقولة للبروتينات المؤتلفة المتاحة تجاريا. كانت خلايا HEK293T التي تفرز بثبات R-spondin-1 و Noggin عبر التنبيغ بوساطة lentivirus هدية سخية من رون بوس ، كلية الطب بجامعة واشنطن في سانت لويس ، وأنيل روستي ، مركز نيويورك المشيخي / جامعة كولومبيا إيرفينغ الطبي8،9،10. يمكن استخدام الوسط التجاري المكيف كبديل (انظر جدول المواد).
- قم بإعداد الوسط المكيف R-spondin 1 / Noggin بعد تقرير منشور مسبقا7.
- لصنع الوسط العضوي الكامل ، اجمع بين 10٪ R-spondin 1 / Noggin وسط مكيف ، 50 نانوغرام / مل EGF ، 10 نانوغرام / مل FGF-10 ، 10 نانوغرام / مل FGF2 ، 1x B27 ، 10 مليمول / لتر نيكوتيناميد ، 1.25 مليمول / لتر N-أسيتيل سيستئين ، 1 ميكرومول / لتر بروستاجلاندين E2 ، 10 ميكرومول / لتر SB202190 ، 500 نانومول / لتر A83-01 ، ومثبط 10 ميكرومتر ROCK (انظر جدول المواد).
ملاحظة: يمكن تخزين الوسيط في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر. تم تكييف هذه الوسيلة من Hill et al.11. تركيزات ومكونات الوسط هي نفسها ، مع إضافة مثبط ROCK. - تحضير وسط قاعدة عضوي عن طريق الجمع بين 500 مل من تركيبة متقدمة من DMEM / F12 مع 1٪ بنسلين-ستربتومايسين ، 1x ثنائي الببتيد ، L-alanyl-L-glutamine ، و 1x HEPES (10 mM) (انظر جدول المواد).
2. حصاد المواد العضوية من الاستسقاء والسائل الجنبي
ملاحظة: يجب معالجة الاستسقاء والسائل الجنبي في أسرع وقت ممكن للحصول على أفضل عائد من المواد العضوية. تم إذابة الثلج سابقا في المخزن المؤقت لتفاعل BME و DNase I و DNase I (انظر جدول المواد) عن طريق وضعه على الجليد حتى يتم تسييل المحتويات.
- الحصول على الاستسقاء والسائل الجنبي من المرضى الموافقين في وقت جراحات أو إجراءات الرعاية القياسية ، والنقل في درجة حرارة الغرفة في حاوية سفر إلى المختبر.
ملاحظة: يجب إجراء جميع الاستسقاء أو معالجة السوائل الجنبية في بيئة معقمة. - نقل 50 مل من الاستسقاء أو السائل الجنبي إلى 50 مل من الأنابيب المخروطية (يعتمد عدد الأنابيب على حجم الاستسقاء الذي تم الحصول عليه). أجهزة الطرد المركزي عند 1650 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. بعد الطرد المركزي ، استخدم ماصة باستور الزجاجية لشفط المادة الطافية بعناية.
- استمر بإضافة 50 مل من الاستسقاء أو السائل الجنبي إلى الحبيبات التي تم طردها سابقا ، وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى عند 1650 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. استنشق بعناية طاف باستخدام ماصة باستور زجاجية. كرر هذه الخطوة حتى تتم معالجة جميع الاستسقاء أو السائل الجنبي.
- قم بإعداد محلول DNase I 100 ميكروغرام / مل من خلال الجمع بين 1000 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز ، و 100 ميكرولتر من محلول تفاعل DNase I ، و 10 ميكرولتر من DNase I.
ملاحظة: علاج DNase I المطبق كاف لعمل تعليق خلية واحدة بغض النظر عن وجود مجاميع الخلايا في بعض عينات المرضى12. - أعد تعليق كل حبيبة خلية في 1 مل من محلول 100 ميكروغرام / مل DNase I. أضف محلول DNase I برفق بالتنقيط ، واترك الأنبوب يحتضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: أضف ما لا يقل عن 1 مل من محلول DNase I. إذا لم يكن 1 مل كافيا لإزعاج الحبيبات ، أضف 1 مل إضافي. - بعد الحضانة ، أضف 25 مل من الوسط الأساسي العضوي (الخطوة 1.3) إلى الخلايا ، واقلبها برفق للخلط. ثم ، أجهزة الطرد المركزي عند 1650 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. بعد الطرد المركزي ، قم بنضح المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة باستور زجاجية.
- أعد تعليق كريات الخلايا المشكلة حديثا في 5 مل من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء (RBC) الذي تم تسخينه مسبقا (انظر جدول المواد). اضبط الدوامة على 458 × جم ، ودوامة المحاليل في كل أنبوب مخروطي. بمجرد أن تصبح المحاليل متجانسة ، استخدم ماصة مصلية لدمج محتويات جميع الأنابيب المخروطية في أنبوب مخروطي واحد سعة 50 mL.
- احتضان الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على محلول دوامة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. بمجرد اكتمال الحضانة ، يتم استخدام أجهزة الطرد المركزي عند 1650 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
ملاحظة: افحص الحبيبات. تشير الحبيبات الوردية / الحمراء إلى وجود كرات الدم الحمراء ، الأمر الذي يتطلب تكرار خطوة المخزن المؤقت لتحلل كرات الدم الحمراء حتى تختفي الحبيبات باللون الأحمر. - بعد الطرد المركزي ، قم بنضح المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة باستور زجاجية. بعد ذلك ، اغسل الحبيبات ب 10 مل من PBS ، ودوامة المحلول عند 458 × جم ، وأجهزة الطرد المركزي عند 1,650 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- إذا تم تشكيل حبيبات خلية كبيرة ، فقم بشفط PBS باستخدام ماصة باستور زجاجية ، وأضف 1 مل من وسط القاعدة العضوية (الخطوة 1.3) أعلى الحبيبة. دوامة الحل في 458 × غرام ، ونقل 300-400 ميكرولتر إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق. جهاز الطرد المركزي أنبوب الطرد المركزي الدقيق عند 1650 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
ملاحظة: يمكن تجميد جزء الحبيبات الخلوية غير الموضوعة في أنبوب الطرد المركزي الدقيق للاستخدام المستقبلي (500 ميكرولتر من الخلايا إلى 1 مل من 10٪ DMSO في FBS). يمكن تخزين حبيبات الخلايا المجمدة لأسابيع عند -80 درجة مئوية ولسنوات إذا تم وضعها في النيتروجين السائل13. - قم بشفط الوسط الأساسي العضوي بعناية (الخطوة 1.3) باستخدام ماصة باستور زجاجية ، وأعد التعليق في BME (انظر جدول المواد) باستخدام أطراف باردة.
ملاحظة: يعتمد مقدار BME على حجم الحبيبات. يوصى باستخدام 25٪ من الوسط الأساسي العضوي (الخطوة 1.3) مع الخلايا المعاد تعليقها إلى 75٪ BME. - لوحة 40 ميكرولتر من محلول الخلية المعلقة على لوحة 6 آبار. لوحة تصل إلى خمس حصص لكل بئر (الشكل 1).
- ضع اللوحة على الفور في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة للسماح ل BME بالتصلب. بعد الحضانة ، أضف برفق 2 مل من الوسط العضوي الكامل (الخطوة 1.2) في كل بئر.
الشكل 1: طلاء عضويات سرطان المبيض المشتقة من المريض. صورة تمثيلية للطلاء العضوي. يتم طلاء حصص الخليط العضوي بعناية ، مما يضمن عدم تكوين فقاعات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
3. حصاد المواد العضوية من الأنسجة
ملاحظة: يجب معالجة الأنسجة في أقرب وقت ممكن للحصول على أفضل محصول من المواد العضوية.
- جمع ونقل الورم على الجليد في حاوية سفر تحتوي على برنامج تلفزيوني.
- ضع العينة على طبق زراعة الأنسجة بطول 10 سم (الشكل 2). باستخدام مشرط يمكن التخلص منه ، قم بفرم الأنسجة. بعد ذلك ، باستخدام الطرف الباهت لحقنة يمكن التخلص منها ، قم بسحق الأنسجة حتى يتم إنشاء خليط متجانس.
- باستخدام الملقط ، ضع خليط الأنسجة المتجانسة في أنبوب التفكك. لكل 1-2 مل من الأنسجة المتجانسة ، أضف 7-8 مل من محلول كولاجيناز من النوع الثاني 1 مجم / مل (انظر جدول المواد) في وسط القاعدة العضوية (الخطوة 1.3) و 1 مل من محلول DNase I. دوامة الحل في 458 × غرام.
ملاحظة: ستحدد كمية الأنسجة كمية محلول كولاجيناز وعدد الأنابيب اللازمة. - استخدم آلة التفكك (انظر جدول المواد) لتسييل الأنسجة أثناء وجودها في محلول الكولاجيناز. قم بتشغيل البرنامج 37C_h_TDK3 (1 ساعة) حتى يصبح تعليق أحادي الخلية.
ملاحظة: يجب إعادة تشغيل البرنامج إذا كان الخليط الناتج غير متجانس (أي إذا كانت قطع الأنسجة لا تزال موجودة في الخليط). إذا تم هضم الأنسجة ولكن المحلول لزج ، قم بتخفيفه باستخدام وسط قاعدة عضوي (الخطوة 1.3). - انقل الخليط المتجانس إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل ، وأضف 20-40 مل من وسط القاعدة العضوية (الخطوة 1.3). بعد ذلك ، قم بتصفية المحلول من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر في أنبوب مخروطي 50 مل تم تسميته حديثا.
- طرد مركزي الخليط المصفى عند 1650 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. ثم ، استنشق بعناية طاف باستخدام ماصة باستور زجاجية.
- قم بإعداد محلول DNase I 100 ميكروغرام / مل من خلال الجمع بين 1000 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز ، و 100 ميكرولتر من محلول تفاعل DNase I ، و 10 ميكرولتر من DNase I.
ملاحظة: علاج DNase I المطبق كاف لعمل تعليق خلية واحدة بغض النظر عن وجود مجاميع الخلايا في بعض عينات المرضى12. - أعد تعليق الخلايا في 1 مل من محلول 100 ميكروغرام / مل DNase I. أضف محلول DNase I برفق بالتنقيط ، واترك الأنبوب يحتضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- بعد الحضانة ، أضف 25 مل من الوسط الأساسي العضوي (الخطوة 1.3) إلى الخلايا ، واقلبها برفق للخلط. ثم ، أجهزة الطرد المركزي عند 1650 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. بعد الطرد المركزي ، قم بنضح المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة باستور زجاجية.
- أعد تعليق حبيبات الخلية المشكلة حديثا في 5 مل من المخزن المؤقت لتحلل كرات الدم الحمراء 1x المسخن مسبقا. دوامة المحاليل في كل أنبوب مخروطي عند 458 × جم.
- احتضان الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على حبيبات الخلية المعاد تعليقها في محلول تحلل كرات الدم الحمراء لمدة 5 دقائق. بمجرد اكتمال الحضانة ، أجهزة الطرد المركزي عند 1650 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
ملاحظة: افحص الحبيبات. تشير الحبيبات الوردية / الحمراء إلى وجود كرات الدم الحمراء ، الأمر الذي يتطلب تكرار خطوة المخزن المؤقت لتحلل كرات الدم الحمراء حتى تظهر الحبيبات بيضاء. - بعد الطرد المركزي ، قم بنضح المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة باستور زجاجية. بعد ذلك ، اغسل الحبيبات ب 10 مل من PBS ، ودوامة المحلول عند 458 × جم ، وأجهزة الطرد المركزي عند 1,650 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- إذا تم تشكيل حبيبات خلية كبيرة ، فقم بشفط PBS باستخدام ماصة باستور زجاجية ، وأضف 1 مل من وسط القاعدة العضوية (الخطوة 1.3) أعلى الحبيبة. دوامة الحل في 458 × غرام ، ونقل 300-400 ميكرولتر إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق. أجهزة الطرد المركزي عند 1650 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
ملاحظة: يمكن تجميد جزء من حبيبات الخلية غير الموضوعة في أنبوب الطرد المركزي الدقيق للاستخدام المستقبلي (500 ميكرولتر من الخلايا إلى 1 مل من 10٪ DMSO في FBS) (الخطوة 5.1). يمكن تخزين حبيبات الخلايا المجمدة لأسابيع عند -80 درجة مئوية ولسنوات إذا تم وضعها في النيتروجين السائل13. - قم بشفط الوسط الأساسي العضوي بعناية باستخدام ماصة باستور الزجاجية ، وأعد تعليقه في BME باستخدام أطراف باردة.
ملاحظة: يعتمد مقدار BME على حجم الحبيبات. يوصى بإضافة 25٪ من وسط القاعدة العضوية (الخطوة 1.3) مع الخلايا المعاد تعليقها إلى 75٪ BME. - ضع محلول الخلية المعاد تعليقه على صفيحة ذات 6 آبار في حصص 40 ميكرولتر. لوحة تصل إلى خمسة حصص لكل بئر.
- ضع لوحة البئر على الفور في الحاضنة لمدة 20 دقيقة. بعد الحضانة ، أضف برفق 2 مل من الوسط العضوي الكامل (الخطوة 1.2) في كل بئر.
الشكل 2: أنسجة الورم قبل التشريح. صورة تمثيلية لأنسجة الورم التي تم الحصول عليها لتوليد عضوي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
4. تمرير المواد العضوية
ملاحظة: إذا كانت العينة متقاربة ، فيمكن تمرير كل بئر عضوي أسبوعيا إلى بئرين جديدين.
- باستخدام ماصة 1 مل ، أضف 1 مل من الوسط الأساسي العضوي (الخطوة 1.3) إلى كل بئر ، وقم بتحريك الوسائط لأعلى ولأسفل مباشرة على علامات التبويب العضوية لفصلها. اجمع كل الوسط الذي يحتوي على الكريات المعاد تعليقها في أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
- جهاز طرد مركزي أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على الخليط عند 1650 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. ثم ، استنشق بعناية طاف باستخدام ماصة باستور زجاجية.
- أضف 1 مل من الإنزيم المؤتلف الخالي من أصل حيواني (انظر جدول المواد) إلى حبيبات الخلية ، وقم بدامة المحلول عند 458 × جم ، وانقله إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. اترك الأنبوب يحتضن لمدة 15 دقيقة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية.
- بعد الحضانة ، أجهزة الطرد المركزي عند 1650 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. ثم ، استنشق بعناية طاف باستخدام ماصة باستور زجاجية.
- أعد تعليق الحبيبات في BME.
ملاحظة: يعتمد مقدار BME على حجم الحبيبات. يوصى بإضافة 25٪ من وسائط القاعدة العضوية (الخطوة 1.3) مع الخلايا المعاد تعليقها إلى 75٪ من BME. - ضع محلول الخلية المعاد تعليقه في صفيحة ذات 6 آبار في 40 ميكرولتر من القسامة. لوحة تصل إلى خمسة حصص لكل بئر. بمجرد طلاء جميع الحصص ، ضع لوحة البئر على الفور في الحاضنة لمدة 20 دقيقة. بعد الحضانة ، أضف برفق 2 مل من الوسط العضوي الكامل (الخطوة 1.2) في كل بئر.
5. تجميد وذوبان المواد العضوية
- تجميد المواد العضوية
- ابدأ بالخطوات 4.1-4.4.
- أعد تعليق حبيبات الخلية في 0.5-1 مل من وسط تجميد ثقافة خلية الاسترداد (انظر جدول المواد) ، وانقل 1 مل إلى كل كريوفي.
- بعد ذلك ، ضع الكريوفيال في حاوية مملوءة بالإيزوبروبانول عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين قبل نقلها إلى خزان النيتروجين السائل للتخزين طويل الأجل13.
- ذوبان المواد العضوية
- قم بإزالة العينات من خزان النيتروجين السائل ، وقم بإذابة الثلج عند حمام مائي 37 درجة مئوية.
- بمجرد إذابته ، انقله إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل ، وأجهزة طرد مركزي عند 1650 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. بعد الطرد المركزي ، قم بنضح المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة باستور زجاجية.
- أعد تعليق الحبيبات في BME.
ملاحظة: يعتمد مقدار BME على حجم الحبيبات. يوصى بإضافة 25٪ من وسائط القاعدة العضوية (الخطوة 1.3) مع الخلايا المعاد تعليقها إلى 75٪ من BME. - ضع محلول الخلية المعاد تعليقه على صفيحة ذات 6 آبار في حصص 40 ميكرولتر. ضع ما يصل إلى خمسة حصص لكل بئر.
- ضع اللوحة على الفور في الحاضنة لمدة 20 دقيقة. بعد الحضانة ، أضف برفق 2 مل من الوسط العضوي الكامل (الخطوة 1.2) إلى الآبار.
6. تضمين وتوليد شرائح مدمجة بالبارافين مثبتة بالفورمالين (FFPE) لتقييم التركيب العضوي
- بعد زراعة المواد العضوية لمدة 10 أيام على الأقل لضمان الحجم المناسب ، قم بإزالة الوسط العضوي الكامل من الآبار ، وأضف 1 مل من 2٪ بارافورمالدهايد المثبت (PFA). احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5-10 دقائق.
- بعد الحضانة ، اغسل القسمة العضوية المستزرعة 3x لمدة 5 دقائق في كل مرة باستخدام 1 مل من PBS.
- قم بإزالة PBS من كل بئر ، وأضف 1 مل من أجار 2٪ الدافئ في H2O منزوع الأيونات إلى كل بئر. عند إضافة الأجار ، ارفع القسمة العضوية المستزرعة من اللوحة باستخدام ملعقة.
ملاحظة: من المهم عدم ترك الآجار يتصلب قبل رفع الحصص العضوية المستزرعة.- اسمح للأجار بالتصلب في البئر في درجة حرارة الغرفة.
- باستخدام ملعقة صغيرة ، حرر الآجار المتصلب من البئر ، وقم بتخزينه في كاسيت لمدة تصل إلى 48 ساعة (انظر جدول المواد) عند 4 درجات مئوية في 70٪ إيثانول حتى معالجة14.
- قم بتضمين العينات في البارافين 15 ، وقطع الشرائح بسمك 5 ميكرومتر ، وقم بتلطيخ الشرائح بالهيماتوكسيلين ويوزين (H&E ، انظر جدول المواد) باستخدام بروتوكول قياسي15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لتوليد PDOs ، تم هضم العينات ميكانيكيا وإنزيميا في معلقات أحادية الخلية. ثم أعيد تعليق الخلايا في BME واستكملت بوسائط مصممة خصيصا (الشكل 3). عادة ما يتم إنشاء المواد العضوية على مدى إطار زمني مدته 10 أيام ، وبعد ذلك تظهر عضويات منفصلة في الثقافة (الشكل 4).
الشكل 3: رسم تخطيطي لمجموعات المرضى المتكونة في عضويات. يتم هضم أنسجة المريض أو الاستسقاء أو السائل الجنبي ميكانيكيا أو إنزيميا. ثم يتم طلاء التعليق أحادي الخلية في BME ، حيث تتكاثر الثقافة بمساعدة وسائط نمو متخصصة مصممة خصيصا ل HGSOC. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: صور تمثيلية لعضوين فريدين من سرطان المبيض مشتق من المريض بعد 7 أيام من النمو. تم التقاط الصور العضوية بمعدل 40x. شريط مقياس برايت فيلد على الصورة اليسرى هو 100 ميكرومتر وعلى الصورة اليمنى 200 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
من البروتوكول المقدم ، تم إنتاج بنك حيوي مكون من 23 عضويا واستزراعه لأكثر من 5 أشهر مع المرور المنتظم. يتم عرض الخصائص السريرية لأورام المنشأ في الجدول 1. كانت غالبية الأورام في مرحلة متقدمة (100٪) ، وسرطان مصلي عالي الدرجة (92.9٪) ، وعلاج ساذج (85.7٪).
| ن = 23 | |
| العمر (سنوات) | 63.5 ± 9.7 |
| مرحلة فيغو الثالث رابعا المعلقه |
13 (56.5) 9 (39.2) 1 (4.3) |
| علم الأنسجة مصلية عالية الجودة الساركوما السرطانية مصلية منخفضة الدرجة |
21 (92.9) 1 (7.1) 1 (4.3) |
| طفرة BRCA نعم لا |
1 (4.3) 22 (95.7) |
| الخطوط السابقة للعلاج الكيميائي 0 1-5 ≥5 |
20 (85.7) 0 2 (14.2) |
الجدول 1: خصائص البنوك الحيوية لشركة تنمية نفط عمان. يحتوي الجدول على الخصائص المحددة للعضويات المتولدة باستخدام هذا البروتوكول. تشمل هذه الخصائص العمر ، ومرحلة FIGO (الاتحاد الدولي لأمراض النساء والتوليد) ، والأنسجة ، وحالة طفرة BRCA (جين BReast CAncer) ، والخطوط السابقة للعلاج الكيميائي.
يمكن تقييم الثقافات العضوية عن طريق التضمين في الأغاروز والتقييم باستخدام H&E (الشكل 5).
الشكل 5: تلطيخ الهيماتوكسيلين واليوزين ل PDO. صورة تمثيلية لتلطيخ H& E لعضو سرطان المبيض الناتج عن عينة مريضة. تم التقاط الصورة بمعدل 40x ، وشريط المقياس 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
سرطان المبيض مميت للغاية بسبب مرحلته المتقدمة في التشخيص ، فضلا عن التطور الشائع لمقاومة العلاج الكيميائي. تم إحراز العديد من التطورات في أبحاث سرطان المبيض من خلال استخدام خطوط الخلايا السرطانية ونماذج PDX. ومع ذلك ، هناك حاجة واضحة لنموذج أكثر تمثيلا وبأسعار معقولة في المختبر . أثبتت PDOs أنها تمثل بدقة عدم تجانس الورم ، والبيئة المكروية للورم ، والسمات الجينومية والنسخ لأورامها الأولية ، وبالتالي فهي نماذج مثالية قبل السريرية لمناهج البحث المتنوعة ، مثل تنفيذ النماذج العضوية في العلاج الدوائي16.
البروتوكول الموصوف هنا فعال وموثوق للغاية ، كما يتضح من معدل النجاح 97٪. ومن المهم تسليط الضوء على أن هذا البروتوكول يتضمن بالفعل خطوات حاسمة ينبغي إيلاء اهتمام دقيق لها. أولا ، عند حصاد المواد العضوية من الأنسجة ، من الضروري التأكد من أن العينة متجانسة تماما. قد يتطلب ذلك تشغيل برنامج التفكك أكثر من مرة إذا لزم الأمر. إذا لم تكن العينة متجانسة ، فقد تؤثر الأجزاء المتبقية من الأنسجة على نمو الأعضاء للخطر. ثانيا ، نظرا لأن درجة حرارة عمل BME هي 2-8 درجة مئوية ، فمن المهم تنفيذ جميع الخطوات التي تتضمن هذا الكاشف على الجليد لتجنب البلمرة. بالإضافة إلى ذلك ، عند التعليق والطلاء باستخدام BME ، من الضروري تجنب الفقاعات ، لأن هذا يجعل الحصص العضوية المطلية غير مستقرة ، مما يؤدي إلى إزاحتها من اللوحة. أخيرا ، تم إنشاء BME المستخدم في هذا البروتوكول من ورم Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) ، وبالتالي ، لديه القدرة على تكوين غير متسق بين الدفعات. يمكن أن تؤثر هذه الاختلافات على توليد المواد العضوية ونموها. لا توجد طريقة محددة للتغلب على هذا القيد لأن المؤلفين ليسوا على دراية بالخيارات البديلة ل BME17. البحث المستقبلي ضروري لإنشاء مواد بديلة لسقالة BME أو 3D. بالنظر إلى جميع الاعتبارات المذكورة أعلاه ، من المهم التأكيد على أنه ينبغي تكييف هذه الأساليب واختبارها لمختلف إعدادات ومعدات المختبر.
على الرغم من التطورات التي يمكن أن توفرها المواد العضوية لأبحاث سرطان المبيض ، إلا أن هناك قيودا على تنفيذ النماذج العضوية. توليد العضوية وصيانتها هي عمليات طويلة ومكلفة. مقدار الوقت اللازم لنمو العضوية يسمح بإدخال التلوث. علاوة على ذلك ، يتطلب تقلب النمو إشرافا مستمرا للتأكد من أن كمية الوسائط المتاحة كافية لتطوير المواد العضوية وأن التلوث غير موجود. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التركيب الخلوي للعضويات متغير. توجد الخلايا المناعية في البداية ولكنها عادة لا تستمر بعد المقطع الثاني. قد يتم التغلب على هذا مع مكملات السيتوكين في وسائل الإعلام ولكن خارج نطاق عملنا الحالي. يبدو أن الخلايا اللحمية تستمر من خلال المرور ، لكن المكونات تعتمد بشكل كبير على العينة الأولية18,19. من الضروري إجراء مزيد من العمل لفهم المكونات الخلوية الدقيقة لكل نوع من الخلايا واستمرارها بشكل أفضل. يعد توليد المواد العضوية من المرضى الذين يخضعون لعدة خطوط علاج كيميائي أمرا صعبا وإشكاليا. من الضروري إجراء مزيد من الدراسات لفهم تأثير العلاج الكيميائي على توليد المواد العضوية وتطورها. أخيرا ، في تجربتنا ، لا يمكن التنبؤ بعدد الكائنات العضوية المتولدة من كمية محددة من الأنسجة أو الاستسقاء أو السائل الجنبي. على سبيل المثال ، نفس الكمية من الورم أو الاستسقاء أو السائل الجنبي الذي تم جمعه من مريضين مختلفين سيؤدي إلى كميات مختلفة من المواد العضوية. يتم إجراء مزيد من الأبحاث للحصول على نظرة ثاقبة لأفضل أنواع الخلايا لبقاء الكائنات العضوية وقابليتها للحياة.
ومع ذلك ، توفر PDOs فرصا فريدة للبحث قبل السريري مقارنة بخطوط الخلايا ونماذج PDX. في حين تم إحراز تقدم فيما يتعلق بتشخيص وعلاج سرطان المبيض ، لا يزال هناك عمل كبير يتعين القيام به ، و PDOs هي أداة خاصة ضرورية لتطوير أبحاث سرطان المبيض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
نحن ممتنون لتوجيهات رون بوس ، دكتوراه في الطب ، دكتوراه ، ومساعدة باربرا بلاشوت ، دكتوراه في الطب ، في إنشاء هذا البروتوكول. نود أيضا أن نعرب عن تقديرنا لكلية الطب بجامعة واشنطن في قسم أمراض النساء والتوليد في سانت لويس وقسم الأورام النسائية ، وبرنامج الباحث العلمي بجامعة واشنطن ، وبرنامج تطوير علماء الإنجاب لدعمهم لهذا المشروع.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| 1% Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 30002CI | |
| 1.5 mL Eppendorf Tubes | Genesee Scientific | 14125 | |
| 10 cm Tissue Culture Dish | TPP | 93100 | |
| 10 mL Serological Pipet | |||
| 100 µm Cell Filter | MidSci | 100ICS | |
| 15 mL centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 2 mL Cryovial | Simport Scientific | T301-2 | |
| 2% Paraformaldehyde Fixative | Sigma-Aldrich | ||
| 37 °C water bath | NEST | 602052 | |
| 3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media Supplement | Millipore Sigma | SCM104 | |
| 6 well plates | TPP | 92006 | |
| 70% Ethanol | Sigma-Aldrich | R31541GA | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher | 12634028 | |
| Agar | Lamda Biotech | C121 | |
| B-27 | Life Technologies | 17504044 | |
| Centrifuge | |||
| Cultrex Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | basement membrane extract |
| DNase I | New England Bio Labs | M0303S | |
| DNase I Reaction Buffer | New England Bio Labs | M0303S | |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FGF-10 | PeproTech | 100-26 | |
| FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi BioTech | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi BioTech | 130-096-427 | We use the manufacturers protocol. |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | dipeptide, L-alanyl-L-glutamine |
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit | Fisher Scientific | NC1470670 | |
| Histoplast Paraffin Wax | Fisher Scientific | 22900700 | |
| Microcentrifuge | |||
| Mr. Frosty Freezing Container | Fisher Scientific | 07202363S | |
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| p1000 Pipette with Tips | |||
| p200 Pipette with Tips | |||
| Pasteur Pipettes 9" | Fisher Scientific | 1367820D | |
| PBS | Fisher Scientific | MT21031CM | |
| Pipet Controller | |||
| Prostaglandin E2 | R&D Systems | 2296 | |
| Puromycin | ThermoFisher | A1113802 | |
| Recombinant Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Invitrogen | 12648010 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | R&D Systems | 1254/1 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
| T75 Flask | MidSci | TP90076 | |
| Tissue Culture Hood | |||
| Tissue Embedding Cassette | |||
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
| Type II Collagenase | Life Technologies | 17101015 | |
| Vortex |
References
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Drost, J., Clevers, H.
- Pauli, C., et al. Personalized in vitro and in vivo cancer models to guide precision medicine. Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
- Fujii, E., Kato, A., Suzuki, M. Patient-derived xenograft (PDX) models: Characteristics and points to consider for the process of establishment. Journal of Toxicologic Pathology. 33 (3), 153-160 (2020).
- Yang, J., et al. Application of ovarian cancer organoids in precision medicine: Key challenges and current opportunities. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 701429 (2021).
- Yang, H., et al. Patient-derived organoids: A promising model for personalized cancer treatment. Gastroenterology Report. 6 (4), 243-245 (2018).
- Karakasheva, T. A., et al. Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids. Current Protocols in Stem Cell Biology. 53 (1), 109 (2020).
- Madison, B. B., et al. Let-7 represses carcinogenesis and a stem cell phenotype in the intestine via regulation of Hmga2. PLoS Genetics. 11 (8), 1005408 (2015).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Murray, E., et al. HER2 and APC mutations promote altered crypt-villus morphology and marked hyperplasia in the intestinal epithelium. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (3), 1105-1120 (2021).
- Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).
- Passarelli, M. C., et al. Leucyl-tRNA synthetase is a tumour suppressor in breast cancer and regulates codon-dependent translation dynamics. Nature Cell Biology. 24 (3), 307-315 (2022).
- Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106 (2020).
- Stumm, M. M., et al. Validation of a postfixation tissue storage and transport medium to preserve histopathology and molecular pathology analyses (total and phosphoactivated proteins, and FISH). American Journal of Clinical Pathology. 137 (3), 429-436 (2012).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).
- Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L.
- Nanki, Y., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing. Scientific Reports. 10, 12581 (2020).
- Mead, B. E., et al. Screening for modulators of the cellular composition of gut epithelia via organoid models of intestinal stem cell differentiation. Nature Biomedical Engineering. 6 (4), 476-494 (2022).
