Summary
אורגנואידים שמקורם בחולה (PDO) הם תרבית תלת ממדית (3D) שיכולה לחקות את סביבת הגידול במבחנה. בסרטן שחלות סרוסי בדרגה גבוהה, PDOs מייצגים מודל לחקר סמנים ביולוגיים וטיפולים חדשים.
Abstract
אורגנואידים הם מודלים תלת-ממדיים של גידולים דינמיים שניתן לגדל בהצלחה מרקמת גידול שחלה שמקורה במטופלת, מיימת או נוזל פלאורלי ולסייע בגילוי טיפולים חדשניים וסמנים ביולוגיים מנבאים לסרטן השחלות. מודלים אלה משחזרים הטרוגניות שבטית (clonal heterogeneity), את המיקרו-סביבה של הגידול (tumor microenvironment) ואת האינטראקציות בין תאים לתאים ולמטריצות תאים. בנוסף, הם הוכחו כמתאימים לגידול הראשוני מבחינה מורפולוגית, ציטולוגית, אימונוהיסטוכימית וגנטית. לפיכך, אורגנואידים מאפשרים מחקר על תאי הגידול ועל המיקרו-סביבה של הגידול והם עדיפים על קווי תאים. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטות שונות ליצירת אורגנואידים של סרטן השחלות שמקורם במטופלות מגידולים, מיימת ודגימות נוזל פלאורלי עם שיעור הצלחה גבוה מ-97%. דגימות המטופל מופרדות לתרחיפים תאיים על ידי עיכול מכני ואנזימטי כאחד. לאחר מכן התאים מצופים באמצעות תמצית קרום מרתף (BME) ונתמכים במצע גדילה אופטימלי המכיל תוספים ספציפיים לגידול סרטן שחלות סרוסי בדרגה גבוהה (HGSOC). לאחר יצירת אורגנואידים ראשוניים, PDOs יכולים לקיים תרבית ארוכת טווח, כולל מעבר להרחבה לניסויים הבאים.
Introduction
בשנת 2021, כ-21,410 נשים בארה"ב אובחנו לאחרונה עם סרטן שחלות אפיתל, ו-12,940 נשים נפטרו ממחלה זו1. למרות התקדמות מספקת נעשו בניתוחים וכימותרפיה, מעל 70% מהחולים עם מחלה מתקדמת לפתח עמידות כימותרפית למות בתוך 5 שנים של אבחנה 2,3. לפיכך, יש צורך דחוף באסטרטגיות חדשות לטיפול במחלה קטלנית זו ובמודלים מייצגים ואמינים למחקר פרה-קליני.
קווי תאים סרטניים וקסנוגרפטים שמקורם במטופלות (PDX) שנוצרו מגידולים ראשוניים בשחלות הם המכשירים העיקריים המשמשים במחקר סרטן השחלות. יתרון מרכזי של קווי תאים סרטניים הוא ההתרחבות המהירה שלהם. עם זאת, התרבית המתמשכת שלהם גורמת לשינויים פנוטיפיים וגנוטיפיים הגורמים לקווי התאים הסרטניים לסטות מדגימת הגידול הסרטני הראשונית המקורית. בשל ההבדלים הקיימים בין קו התאים הסרטניים לבין הגידול הראשוני, בדיקות תרופות שיש להן השפעות חיוביות בשורות תאים אינן מצליחות להשיג את אותן השפעות בניסויים קליניים2. כדי להתגבר על מגבלות אלה, מודלים PDX משמשים. מודלים אלה נוצרים על ידי השתלת רקמת סרטן שחלה טרייה בעכברים מדוכאי חיסון. מכיוון שהם מודלים in vivo , הם דומים יותר למאפיינים ביולוגיים אנושיים, ובתורם, מנבאים יותר את תוצאות התרופות. עם זאת, למודלים אלה יש גם מגבלות משמעותיות, כולל העלות, הזמן והמשאבים הדרושים כדי לייצר אותם4.
PDOs מציעים מודל חלופי למחקר פרה-קליני המתגבר על המגבלות של קווי תאים סרטניים ומודלים של PDX. PDOs משחזרים את הגידול ואת המיקרו-סביבה של המטופל, ובכך מספקים מודל טרקטיבי במבחנה אידיאלי למחקר פרה-קליני 2,3,5. למודלים תלת-ממדיים אלה יש יכולות ארגון עצמי המדמים את הגידול הראשוני, תכונה שאין לעמיתיהם בקו התא הדו-ממדי (2D). יתר על כן, מודלים אלה הוכחו כמייצגים גנטית ותפקודית את גידולי האב שלהם, ולכן הם מודלים אמינים לחקר טיפולים חדשניים ותהליכים ביולוגיים. בקיצור, הם מציעים יכולות הרחבה ואחסון ארוכות טווח הדומות לקווי תאים, אך גם מקיפות את המיקרו-סביבה ואת אינטראקציות התא-תא הטבועות בדגמי עכברים 4,6.
הפרוטוקול הנוכחי מתאר את היצירה של PDOs מגידולים, מיימת ודגימות נוזל פלאורלי שמקורם במטופל עם שיעור הצלחה גבוה מ-97%. לאחר מכן ניתן להרחיב את תרביות ה-PDO למשך דורות רבים ולהשתמש בהן לבדיקת רגישות לטיפול תרופתי וסמנים ביולוגיים מנבאים. שיטה זו מייצגת טכניקה שניתן להשתמש בה כדי להתאים אישית טיפולים המבוססים על התגובות הטיפוליות של PDOs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל דגימות הרקמה האנושית שנאספו למחקר התקבלו על פי פרוטוקול שאושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית (IRB). הפרוטוקולים המתוארים להלן בוצעו בסביבת תרבית רקמה אנושית סטרילית. הסכמה מדעת בכתב התקבלה מנבדקים אנושיים. מטופלות זכאיות היו צריכות לקבל אבחנה או אבחנה משוערת של סרטן השחלות, להיות מוכנות ומסוגלות לחתום על הסכמה מדעת, ולהיות בנות 18 לפחות. רקמת הגידול (גידול ראשוני ממאיר או אתרים גרורתיים), מיימת ונוזל פלאורלי התקבלו מחולים בהסכמה בזמן ההליך. דגימות אלה הועברו מיד למעבדה ועובדו לייצור אורגנואידים בשיטות המתוארות להלן.
1. הכנת מדיה
- הכנת מדיה אורגנואידית מלאה
- הכינו מדיום מותנה R-spondin 1/Noggin בעקבות דו"ח שפורסם בעבר7.
הערה: מדיום מותנה R-spondin-1/Noggin הוא חלופה זולה יותר לחלבונים רקומביננטיים הזמינים מסחרית. תאי HEK293T המפרישים ביציבות R-ספונדין-1 ונוגין באמצעות התמרה בתיווך לנטיוירוס היו מתנה נדיבה מרון בוס, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס, ואניל רוסטגי, המרכז הרפואי אירווינג של אוניברסיטת ניו יורק-פרסביטריאן/קולומביה 8,9,10. מדיום מסחרי מותנה יכול לשמש כתחליף (ראה טבלת חומרים).
- הכינו מדיום מותנה R-spondin 1/Noggin בעקבות דו"ח שפורסם בעבר7.
- כדי ליצור את מדיום האורגנואיד השלם, יש לשלב 10% R-spondin 1/Noggin מותנה בינוני, 50 ng/mL EGF, 10 ng/mL FGF-10, 10 ng/mL FGF2, 1x B27, 10 mmol / L nicotinamide, 1.25 mmol / L N-אצטיל-ציסטאין, 1 μmol / L פרוסטגלנדין E2, 10 μmol / L SB202190, 500 nmol / L A83-01 ומעכב ROCK 10 μM (ראה טבלת חומרים).
הערה: ניתן לאחסן את המדיום בטמפרטורה של 4°C למשך עד 3 חודשים. מדיום זה הותאם מ-Hill et al.11. הריכוזים והמרכיבים של המדיום זהים, בתוספת מעכב ROCK. - הכן בסיס אורגנואיד בינוני על ידי שילוב של 500 מ"ל של נוסחה מתקדמת של DMEM/F12 עם 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 1x דיפפטיד, L-alanyl-L-גלוטמין, 1x HEPES (10 mM) (ראה טבלה של חומרים).
2. קצירת אורגנואידים מיימת ונוזל פלאורלי
הערה: מיימת ונוזל פלאורלי חייבים להיות מעובדים בהקדם האפשרי לקבלת התשואה הטובה ביותר של אורגנואידים. הפשרה השתמשה בעבר ב-BME, DNase I ובמאגר התגובה DNase I (ראו טבלת חומרים) על ידי הנחתו על קרח עד לנוזלי התכולה.
- יש להשיג מיימת ונוזל פלאורלי ממטופלים שהסכימו לכך בזמן ניתוחים או הליכים סטנדרטיים, ולשנע בטמפרטורת החדר במיכל נסיעות למעבדה.
הערה: כל מיימת או עיבוד נוזל pleural צריך להתבצע בסביבה סטרילית. - העברת 50 מ"ל של מיימת או נוזל pleural ל 50 מ"ל צינורות חרוטי (מספר צינורות תלוי בנפח מיימת המתקבל). צנטריפוגה ב-1,650 x גרם למשך 5 דקות ב-4°C. לאחר הצנטריפוגה, השתמש פיפטה פסטר זכוכית כדי לשאוף בזהירות את supernatant.
- המשך על ידי הוספת 50 מ"ל של מיימת או נוזל pleural לגלולה צנטריפוגה בעבר, וצנטריפוגה שוב ב 1,650 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. שאפו בזהירות את הסופרנטנט בעזרת פיפטה מזכוכית. חזור על שלב זה עד שכל מיימת או נוזל pleural עובדו.
- הכינו תמיסת DNase I של 100 מיקרוגרם/מ"ל על ידי שילוב של 1,000 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז, 100 מיקרוליטר של מאגר התגובה של DNase I ו-10 מיקרוליטר של DNase I.
הערה: הטיפול ב- DNase I המיושם מספיק כדי לבצע השעיה של תא בודד ללא קשר לנוכחות של צברי תאים בחלק מדגימות החולים12. - השהה מחדש כל כדור תא ב- 1 מ"ל של תמיסת DNase I של 100 מיקרוגרם/מ"ל. הוסיפו בעדינות את תמיסת DNase I טיפתית, ואפשרו לצינורית לדגור במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: הוסף לפחות 1 מ"ל של תמיסת DNase I. אם 1 מ"ל אינו מספיק כדי להפריע לכדור, הוסף 1 מ"ל נוספים. - לאחר הדגירה, מוסיפים 25 מ"ל של מדיום בסיס אורגנואיד (שלב 1.3) לתאים, והופכים בעדינות כדי לערבב. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 1,650 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. לאחר הצנטריפוגה, שאפו בזהירות את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה פסטר זכוכית.
- יש להשהות מחדש את כדורי התא החדשים שנוצרו ב-5 מ"ל שחוממו מראש של חיץ ליזה של 1x תאי דם אדומים (RBC) (ראו טבלת חומרים). הגדר את המערבולת ל 458 x g, ומערבל את התמיסות בכל צינור חרוט. ברגע שהתמיסות הומוגניות, השתמש בצינור סרולוגי כדי לשלב את התוכן של כל הצינורות החרוטיים לצינור חרוטי יחיד של 50 מ"ל.
- דוגרים על הצינור החרוטי המכיל את התמיסה המערבולת בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. לאחר השלמת הדגירה, צנטריפוגה ב 1,650 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
הערה: בדוק את הכדור. גלולה ורודה/אדומה מציינת את נוכחותם של RBCs, מה שידרוש חזרה על שלב חיץ הליזה של RBC עד שהגלולה כבר לא תהיה אדומה. - לאחר הצנטריפוגה, שאפו בזהירות את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה פסטר זכוכית. לאחר מכן, לשטוף את הגלולה עם 10 מ"ל של PBS, מערבל את התמיסה ב 458 x גרם, וצנטריפוגה ב 1,650 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
- אם נוצרת גלולת תא גדולה, שאפו את PBS באמצעות פיפטת פסטר זכוכית, והוסיפו 1 מ"ל של מדיום בסיס אורגנואיד (שלב 1.3) על גבי הכדורית. מערבלים את התמיסה ב 458 x גרם, ומעבירים 300-400 μL לצינור מיקרוצנטריפוגה. צנטריפוגה צינור microcentrifuge ב 1,650 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
הערה: ניתן להקפיא את החלק של גלולת התא שאינו ממוקם בצינור המיקרוצנטריפוגה לשימוש עתידי (500 מיקרוליטר תאים עד 1 מ"ל של 10% DMSO ב- FBS). את גלולת התא הקפואה ניתן לאחסן במשך שבועות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס ובמשך שנים אם מניחים אותה בחנקן נוזלי13. - יש לשאוף בזהירות את מדיום בסיס האורגנואיד (שלב 1.3) באמצעות פיפטה מזכוכית, ולהשהות מחדש ב-BME (ראו טבלת חומרים) בעזרת קצוות קרים.
הערה: כמות BME מבוססת על גודל הכדור. מומלץ להשתמש 25% בסיס אורגנואיד בינוני (שלב 1.3) עם תאים מרחפים ל 75% BME. - צלחת 40 μL aliquots של תמיסת התא resuspended על צלחת 6 באר. צלחת עד חמישה aliquots לכל באר (איור 1).
- הניחו מיד את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כדי לאפשר ל-BME להתמצק. לאחר הדגירה, מוסיפים בעדינות 2 מ"ל של מדיום אורגנואיד שלם (שלב 1.2) לכל באר.
איור 1: ציפוי אורגנואידים של סרטן השחלות שמקורם במטופלות. תמונה מייצגת של ציפוי האורגנואידים. Aliquots של תערובת אורגנואיד מצופים בקפידה, להבטיח לא בועות נוצרו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
3. קצירת אורגנואידים מרקמה
הערה: יש לעבד רקמות בהקדם האפשרי לקבלת התשואה הטובה ביותר של אורגנואידים.
- לאסוף ולשנע את הגידול על קרח במיכל נסיעות המכיל PBS.
- הניחו את הדגימה על צלחת תרבית רקמה בקוטר 10 ס"מ (איור 2). בעזרת אזמל חד פעמי, טוחנים את הרקמה. לאחר מכן, באמצעות קצה עמום של מזרק חד פעמי, למחוץ את הרקמה עד תערובת הומוגנית נוצר.
- בעזרת מלקחיים, מניחים את תערובת הרקמה ההומוגנית לתוך צינור דיסוציאציה. עבור כל 1-2 מ"ל של רקמה הומוגנית, הוסף 7-8 מ"ל של תמיסת קולגנאז מסוג II של 1 מ"ג/מ"ל (ראה טבלת חומרים) בתווך בסיס אורגנואיד (שלב 1.3) ו-1 מ"ל של תמיסת DNase I. מערבולת את הפתרון ב 458 x גרם.
הערה: כמות הרקמה תקבע את כמות תמיסת הקולגנאז ואת מספר הצינורות הדרושים. - השתמש במכונת הדיסוציאציה (ראה טבלת חומרים) כדי לנזול את הרקמה בזמן שהיא בתמיסת הקולגנאז. הפעל את התוכנית 37C_h_TDK3 (1 שעות) עד שהיא תשעה של תא יחיד.
הערה: יהיה צורך להפעיל מחדש את התוכנית אם התערובת המתקבלת אינה הומוגנית (כלומר, אם חתיכות רקמה עדיין קיימות בתערובת). אם הרקמה מתעכלת אך התמיסה צמיגה, מדללים באמצעות תווך בסיס אורגנואיד (שלב 1.3). - מעבירים את התערובת ההומוגנית לצינור חרוטי חדש של 50 מ"ל, ומוסיפים 20-40 מ"ל של מדיום בסיס אורגנואיד (שלב 1.3). לאחר מכן, סנן את התמיסה דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי חדש של 50 מ"ל.
- צנטריפוגה את התערובת המסוננת ב 1,650 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. לאחר מכן, שאפו בזהירות את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה מזכוכית.
- הכינו תמיסת DNase I של 100 מיקרוגרם/מ"ל על ידי שילוב של 1,000 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז, 100 מיקרוליטר של מאגר התגובה של DNase I ו-10 מיקרוליטר של DNase I.
הערה: הטיפול ב- DNase I המיושם מספיק כדי לבצע השעיה של תא בודד ללא קשר לנוכחות של צברי תאים בחלק מדגימות החולים12. - להשעות מחדש את התאים ב 1 מ"ל של 100 ug / mL DNase פתרון I. הוסיפו בעדינות את תמיסת DNase I טיפתית, ואפשרו לצינורית לדגור במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
- לאחר הדגירה, מוסיפים 25 מ"ל של מדיום בסיס אורגנואיד (שלב 1.3) לתאים, והופכים בעדינות כדי לערבב. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 1,650 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. לאחר הצנטריפוגה, שאפו בזהירות את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה פסטר זכוכית.
- השהה מחדש את גלולת התא החדשה שנוצרה ב -5 מ"ל של חיץ ליזיס 1x RBC שחומם מראש. מערבול את התמיסות בכל צינור חרוטי ב 458 x גרם.
- דגרו על הצינור החרוטי המכיל את גלולת התא התלויה מחדש במאגר הליזה של RBC למשך 5 דקות. לאחר השלמת הדגירה, צנטריפוגה ב 1,650 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
הערה: בדוק את הכדור. גלולה ורודה/אדומה מציינת נוכחות של RBC, מה שיחייב חזרה על שלב חיץ הליזיס של RBC עד שהגלולה נראית לבנה. - לאחר הצנטריפוגה, שאפו בזהירות את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה פסטר זכוכית. לאחר מכן, לשטוף את הגלולה עם 10 מ"ל של PBS, מערבל את התמיסה ב 458 x גרם, וצנטריפוגה ב 1,650 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
- אם נוצרת גלולת תא גדולה, שאפו את PBS באמצעות פיפטת פסטר זכוכית, והוסיפו 1 מ"ל של מדיום בסיס אורגנואיד (שלב 1.3) על גבי הכדורית. מערבלים את התמיסה ב 458 x גרם, ומעבירים 300-400 μL לצינור מיקרוצנטריפוגה. צנטריפוגה ב-1,650 x גרם למשך 5 דקות ב-4°C.
הערה: ניתן להקפיא את החלק של גלולת התא שאינו ממוקם בצינור המיקרוצנטריפוגה לשימוש עתידי (500 מיקרוליטר תאים עד 1 מ"ל של 10% DMSO ב- FBS) (שלב 5.1). את גלולת התא הקפואה ניתן לאחסן במשך שבועות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס ובמשך שנים אם מניחים אותה בחנקן נוזלי13. - שאפו בזהירות את מדיום הבסיס האורגנואידי באמצעות פיפטה פסטר זכוכית, והשהו מחדש ב- BME באמצעות קצוות קרים.
הערה: כמות BME מבוססת על גודל הכדור. מומלץ להוסיף 25% מדיום בסיס אורגנואיד (שלב 1.3) עם תאים מרחפים ל-75% BME. - לוחית את תמיסת התא המרחף מחדש על צלחת 6 בארות ב 40 μL aliquots. צלחת עד חמישה aliquots לכל באר.
- מניחים מיד את צלחת הבאר באינקובטור למשך 20 דקות. לאחר הדגירה, מוסיפים בעדינות 2 מ"ל של מדיום אורגנואיד שלם (שלב 1.2) לכל באר.
איור 2: רקמת הגידול לפני נתיחה. תמונה מייצגת של רקמת הגידול המתקבלת לייצור אורגנואידים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
4. מעבר של אורגנואידים
הערה: אם הדגימה היא חופפת, כל באר אורגנואידים יכולה לעבור מדי שבוע לשתי בארות חדשות.
- באמצעות פיפטה של 1 מ"ל, הוסף 1 מ"ל של מדיום בסיס אורגנואיד (שלב 1.3) לכל באר, ופיפטה את המדיה למעלה ולמטה ישירות על לשוניות האורגנואידים כדי לנתק אותה. לאסוף את כל המדיום המכיל את כדורי resuspended בצינור חרוטי 15 מ"ל.
- צנטריפוגה את הצינור החרוטי 15 מ"ל המכיל את התערובת ב 1,650 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. לאחר מכן, שאפו בזהירות את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה מזכוכית.
- הוסף 1 מ"ל של אנזים רקומביננטי ללא מקור מן החי (ראה טבלת חומרים) לכדורית התא, מערבל את התמיסה ב 458 x גרם, ומעביר לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל. אפשר לצינור לדגור במשך 15 דקות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
- לאחר הדגירה, צנטריפוגה ב 1,650 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. לאחר מכן, שאפו בזהירות את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה מזכוכית.
- השהה מחדש את הגלולה ב- BME.
הערה: כמות BME מבוססת על גודל הכדור. מומלץ להוסיף 25% מדיה בסיסית אורגנואידית (שלב 1.3) עם תאים מרחפים ל-75% BME. - צלחת את תמיסת התא resuspended לתוך צלחת 6 באר ב 40 μL aliquots. צלחת עד חמישה aliquots לכל באר. לאחר שכל aliquots כבר מצופה, מיד מניחים את צלחת הבאר באינקובטור במשך 20 דקות. לאחר הדגירה, מוסיפים בעדינות 2 מ"ל של מדיום אורגנואיד שלם (שלב 1.2) לכל באר.
5. הקפאה והפשרה של אורגנואידים
- הקפאת אורגנואידים
- התחל בשלבים 4.1-4.4.
- יש להשהות מחדש את כדורית התא ב-0.5-1 מ"ל של תרבית תאי התאוששות בהקפאה (ראו טבלת חומרים), ולהעביר 1 מ"ל לכל קריוביאלי.
- לאחר מכן, הניחו את הקריובלים במיכל מלא איזופרופנול בטמפרטורה של -80°C למשך עד שבועיים לפני העברתם למיכל חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך13.
- הפשרת אורגנואידים
- הסר את הדגימות ממיכל החנקן הנוזלי, והפשיר באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
- לאחר ההפשרה, להעביר צינור חרוטי 15 מ"ל, צנטריפוגה ב 1,650 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. לאחר הצנטריפוגה, שאפו בזהירות את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה פסטר זכוכית.
- השהה מחדש את הגלולה ב- BME.
הערה: כמות BME מבוססת על גודל הכדור. מומלץ להוסיף 25% מדיה בסיסית אורגנואידית (שלב 1.3) עם תאים מרחפים ל-75% BME. - לוחית את תמיסת התא המרחף מחדש על צלחת 6 בארות ב 40 μL aliquots. מניחים עד חמישה aliquots לכל באר.
- מניחים מיד את הצלחת באינקובטור למשך 20 דקות. לאחר הדגירה, להוסיף בעדינות 2 מ"ל של מדיום אורגנואיד מלא (שלב 1.2) לבארות.
6. הטבעה ויצירה של שקופיות משובצות פרפין קבועות פורמלין (FFPE) להערכת הרכב האורגנואידים
- לאחר גידול אורגנואידים במשך 10 ימים לפחות כדי להבטיח גודל נאות, להסיר את המדיום אורגנואיד מלא מן הבארות, ולהוסיף 1 מ"ל של 2% paraformaldehyde fixative (PFA). יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 5-10 דקות.
- לאחר הדגירה, לשטוף את aliquots אורגנואיד תרבית 3 פעמים במשך 5 דקות בכל פעם עם 1 מ"ל של PBS.
- מוציאים את PBS מכל באר, ומוסיפים 1 מ"ל של אגר חם 2% ב H2O נטול יונים. בעת הוספת האגר, הרימו את עלי האורגנואיד המתורבת מהצלחת באמצעות מרית.
הערה: חשוב לא לתת לאגר להתקשות לפני הרמת האליציטוטים האורגנואידים המתורבתים.- מניחים לאגר להתמצק בבאר בטמפרטורת החדר.
- בעזרת מרית קטנה, שחררו את האגר המוצק מהבאר, ואחסנו אותו בקלטת עד 48 שעות (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורה של 4°C באתנול 70% עד לעיבוד14.
- הטמיעו את הדגימות בפרפין 15, חתכו את השקופיות לעובי של 5 מיקרומטר, וצבעו את השקופיות בצביעה של המטוקסילין ואאוזין (H&E, ראו טבלת חומרים) באמצעות פרוטוקול סטנדרטי15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי ליצור PDOs, הדגימות עוכלו באופן מכני ואנזימטי לתרחיפים חד-תאיים. התאים הושעו מחדש ב-BME ונוספו להם מדיה מהונדסת במיוחד (איור 3). אורגנואידים נוצרים בדרך כלל על פני מסגרת זמן של 10 ימים, שלאחריה הם מדגימים אורגנואידים נפרדים בתרבית (איור 4).
איור 3: סכמטיות של אוספי מטופלים שנוצרו לאורגנואידים. רקמת המטופל, מיימת או נוזל פלאורלי מתעכלים באופן מכני או אנזימטי. המתלה החד-תאי מצופה לאחר מכן לתוך BME, שם התרבות מתרבה בעזרת מדיה צמיחה מיוחדת המותאמת HGSOC. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תמונות מייצגות של שני אורגנואידים ייחודיים של סרטן השחלות שמקורם במטופלת לאחר 7 ימי גדילה. תמונות האורגנואיד צולמו במהירות של פי 40. סרגל קנה המידה של שדה בהיר בתמונה השמאלית הוא 100 מיקרומטר ובתמונה הימנית הוא 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
מהפרוטוקול שהוצג, ביובנק של 23 אורגנואידים הופק ותורבת במשך למעלה מ-5 חודשים עם מעבר קבוע. המאפיינים הקליניים של גידולי המקור מוצגים בטבלה 1. רוב הגידולים היו בשלב מתקדם (100%), קרצינומה סרוטית בדרגה גבוהה (92.9%) וטיפול נאיבי (85.7%).
| N = 23 | |
| גיל (שנים) | 102.2 ± 9.7 |
| פיגו סטייג' השלישי הרביעי ממתינים |
13 (56.5) 9 (39.2) 1 (4.3) |
| היסטולוגיה סרוסי ברמה גבוהה קרצינוסרקומה סרוס ברמה נמוכה |
21 (92.9) 1 (7.1) 1 (4.3) |
| מוטציה בגן BRCA כן לא |
1 (4.3) 22 (95.7) |
| קווים קודמים של כימותרפיה 0 1-5 ≥5 |
20 (85.7) 0 2 (14.2) |
טבלה 1: מאפייני הבנק הביולוגי של PDO. הטבלה מכילה את המאפיינים הספציפיים של האורגנואידים שנוצרו באמצעות הפרוטוקול הנוכחי. מאפיינים אלה כוללים גיל, שלב FIGO (הפדרציה הבינלאומית לגינקולוגיה ומיילדות), היסטולוגיה, מצב מוטציה בגן BRCA (BReast CAncer) וקווים קודמים של כימותרפיה.
ניתן להעריך תרביות אורגנואידים על-ידי הטבעה באגרוז והערכה באמצעות H&E (איור 5).
איור 5: צביעת המטוקסילין ואאוזין של PDO. תמונה מייצגת של צביעת H&E של אורגנואיד סרטן השחלות שנוצר מדגימת מטופלת. התמונה צולמה במהירות של 40x, וסרגל קנה המידה הוא 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
סרטן השחלות קטלני ביותר בשל השלב המתקדם שלו באבחון, כמו גם ההתפתחות הנפוצה של עמידות לכימותרפיה. התקדמות רבה במחקר סרטן השחלות נעשתה על ידי שימוש בקווי תאים סרטניים ומודלים PDX; עם זאת, יש צורך ברור במודל ייצוגי יותר ובמחיר סביר יותר במבחנה . PDOs הוכיחו שהם מייצגים במדויק את ההטרוגניות של הגידול, את המיקרו-סביבה של הגידול ואת התכונות הגנומיות והשעתוק של הגידולים העיקריים שלהם, ולכן הם מודלים פרה-קליניים אידיאליים לגישות מחקר מגוונות, כגון יישום מודלים אורגנואידים בטיפול תרופתי16.
הפרוטוקול המתואר כאן הוא יעיל ואמין מאוד, כפי שעולה משיעור ההצלחה של 97%. חשוב להדגיש כי בפרוטוקול הנוכחי יש צעדים קריטיים שיש להקדיש להם תשומת לב זהירה. ראשית, בעת קצירת אורגנואידים מרקמות, חיוני לוודא כי הדגימה הומוגנית לחלוטין. זה עשוי לדרוש הפעלת תוכנית הדיסוציאציה יותר מפעם אחת במידת הצורך. אם הדגימה אינה הומוגנית, פיסות הרקמה הנותרות עלולות לפגוע בצמיחת אורגנואידים. שנית, מכיוון שטמפרטורת העבודה של BME היא 2-8 מעלות צלזיוס, חשוב לבצע את כל השלבים הכרוכים בריאגנט זה על קרח כדי למנוע פילמור. בנוסף, בעת השעיה מחדש וציפוי עם BME, חיוני להימנע מבועות, שכן זה הופך את aliquots אורגנואיד מצופה יציב, גורם להם לעקור מן הצלחת. לבסוף, ה-BME המשמש בפרוטוקול זה נוצר מהגידול Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), ולכן יש לו פוטנציאל להרכב לא עקבי בין אצוות. הבדלים אלה יכולים להשפיע על ייצור אורגנואידים וצמיחה. אין דרך ספציפית להתגבר על מגבלה זו מכיוון שהמחברים אינם מודעים לאפשרויות BME חלופיות17. מחקר עתידי נחוץ כדי לבסס חומרים חלופיים עבור BME או פיגומים 3D. לאור כל השיקולים הנ"ל, חשוב להדגיש כי יש להתאים ולבדוק שיטות אלו לסביבות מעבדה וציוד שונים.
למרות ההתקדמות שאורגנואידים יכולים לספק לחקר סרטן השחלות, ישנן מגבלות ליישום מודלים אורגנואידים. ייצור ותחזוקה של אורגנואידים הם תהליכים ארוכים ויקרים. משך הזמן הדרוש לגידול אורגנואידים מאפשר הכנסת זיהום. יתר על כן, השתנות הגידול דורשת פיקוח מתמיד כדי להבטיח כי כמות המדיה הזמינה מספיקה להתפתחות אורגנואידים וכי זיהום אינו קיים. בנוסף, ההרכב התאי של האורגנואידים משתנה. תאי מערכת החיסון נמצאים בהתחלה, אך בדרך כלל אינם נמשכים מעבר למעבר השני. ניתן להתגבר על כך באמצעות תוספי ציטוקינים בתקשורת, אך הוא מחוץ לתחום העבודה הנוכחי שלנו. נראה כי תאי סטרומה ממשיכים להתקיים באמצעות מעבר, אך המרכיבים תלויים מאוד במדגם הראשוני18,19. עבודה נוספת נחוצה כדי להבין טוב יותר את המרכיבים התאיים המדויקים של כל סוג תא ואת ההתמדה. הפקת אורגנואידים מחולים שעוברים מספר קווי כימותרפיה היא מאתגרת ובעייתית. מחקרים נוספים נחוצים כדי להבין את ההשפעה של כימותרפיה על ייצור והתפתחות אורגנואידים. לבסוף, מניסיוננו, מספר האורגנואידים הנוצרים מכמות מסוימת של רקמות, מיימת או נוזל פלאורלי הוא בלתי צפוי. לדוגמה, אותה כמות של גידול, מיימת או נוזל פלאורלי שנאסף משני חולים שונים יגרום לכמויות שונות של אורגנואידים. מחקר נוסף מתבצע כדי לקבל תובנה לגבי סוגי התאים הטובים ביותר להישרדות אורגנואידים ולכדאיות.
עם זאת, PDOs מציעים הזדמנויות ייחודיות למחקר פרה-קליני בהשוואה לקווי תאים ומודלים של PDX. אמנם חלה התקדמות בכל הנוגע לאבחון וטיפול בסרטן השחלות, אך עדיין יש עבודה משמעותית לעשות, ו- PDOs הם כלי מיוחד הנחוץ לקידום מחקר סרטן השחלות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו אסירי תודה על הדרכתו של רון בוס, MD, PhD, ועל עזרתה של ברברה בלאחוט, MD, בביסוס פרוטוקול זה. ברצוננו גם להודות לבית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון במחלקה למיילדות וגינקולוגיה בסנט לואיס ולמחלקה לאונקולוגיה גינקולוגית, לתוכנית מלגות הדיקן של אוניברסיטת וושינגטון ולתוכנית לפיתוח מדעני פוריות על תמיכתם בפרויקט זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| 1% Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 30002CI | |
| 1.5 mL Eppendorf Tubes | Genesee Scientific | 14125 | |
| 10 cm Tissue Culture Dish | TPP | 93100 | |
| 10 mL Serological Pipet | |||
| 100 µm Cell Filter | MidSci | 100ICS | |
| 15 mL centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 2 mL Cryovial | Simport Scientific | T301-2 | |
| 2% Paraformaldehyde Fixative | Sigma-Aldrich | ||
| 37 °C water bath | NEST | 602052 | |
| 3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media Supplement | Millipore Sigma | SCM104 | |
| 6 well plates | TPP | 92006 | |
| 70% Ethanol | Sigma-Aldrich | R31541GA | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher | 12634028 | |
| Agar | Lamda Biotech | C121 | |
| B-27 | Life Technologies | 17504044 | |
| Centrifuge | |||
| Cultrex Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | basement membrane extract |
| DNase I | New England Bio Labs | M0303S | |
| DNase I Reaction Buffer | New England Bio Labs | M0303S | |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FGF-10 | PeproTech | 100-26 | |
| FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi BioTech | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi BioTech | 130-096-427 | We use the manufacturers protocol. |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | dipeptide, L-alanyl-L-glutamine |
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit | Fisher Scientific | NC1470670 | |
| Histoplast Paraffin Wax | Fisher Scientific | 22900700 | |
| Microcentrifuge | |||
| Mr. Frosty Freezing Container | Fisher Scientific | 07202363S | |
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| p1000 Pipette with Tips | |||
| p200 Pipette with Tips | |||
| Pasteur Pipettes 9" | Fisher Scientific | 1367820D | |
| PBS | Fisher Scientific | MT21031CM | |
| Pipet Controller | |||
| Prostaglandin E2 | R&D Systems | 2296 | |
| Puromycin | ThermoFisher | A1113802 | |
| Recombinant Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Invitrogen | 12648010 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | R&D Systems | 1254/1 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
| T75 Flask | MidSci | TP90076 | |
| Tissue Culture Hood | |||
| Tissue Embedding Cassette | |||
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
| Type II Collagenase | Life Technologies | 17101015 | |
| Vortex |
References
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Drost, J., Clevers, H.
- Pauli, C., et al. Personalized in vitro and in vivo cancer models to guide precision medicine. Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
- Fujii, E., Kato, A., Suzuki, M. Patient-derived xenograft (PDX) models: Characteristics and points to consider for the process of establishment. Journal of Toxicologic Pathology. 33 (3), 153-160 (2020).
- Yang, J., et al. Application of ovarian cancer organoids in precision medicine: Key challenges and current opportunities. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 701429 (2021).
- Yang, H., et al. Patient-derived organoids: A promising model for personalized cancer treatment. Gastroenterology Report. 6 (4), 243-245 (2018).
- Karakasheva, T. A., et al. Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids. Current Protocols in Stem Cell Biology. 53 (1), 109 (2020).
- Madison, B. B., et al. Let-7 represses carcinogenesis and a stem cell phenotype in the intestine via regulation of Hmga2. PLoS Genetics. 11 (8), 1005408 (2015).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Murray, E., et al. HER2 and APC mutations promote altered crypt-villus morphology and marked hyperplasia in the intestinal epithelium. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (3), 1105-1120 (2021).
- Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).
- Passarelli, M. C., et al. Leucyl-tRNA synthetase is a tumour suppressor in breast cancer and regulates codon-dependent translation dynamics. Nature Cell Biology. 24 (3), 307-315 (2022).
- Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106 (2020).
- Stumm, M. M., et al. Validation of a postfixation tissue storage and transport medium to preserve histopathology and molecular pathology analyses (total and phosphoactivated proteins, and FISH). American Journal of Clinical Pathology. 137 (3), 429-436 (2012).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).
- Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L.
- Nanki, Y., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing. Scientific Reports. 10, 12581 (2020).
- Mead, B. E., et al. Screening for modulators of the cellular composition of gut epithelia via organoid models of intestinal stem cell differentiation. Nature Biomedical Engineering. 6 (4), 476-494 (2022).
