Summary
रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स (पीडीओ) एक त्रि-आयामी (3 डी) संस्कृति है जो विट्रो में ट्यूमर के वातावरण की नकल कर सकती है। उच्च श्रेणी के सीरस डिम्बग्रंथि के कैंसर में, पीडीओ नए बायोमाकर्स और चिकित्सीय का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल का प्रतिनिधित्व करते हैं।
Abstract
ऑर्गेनोइड्स 3 डी गतिशील ट्यूमर मॉडल हैं जिन्हें रोगी-व्युत्पन्न डिम्बग्रंथि ट्यूमर ऊतक, जलोदर, या फुफ्फुस द्रव से सफलतापूर्वक उगाया जा सकता है और डिम्बग्रंथि के कैंसर के लिए नए चिकित्सीय और भविष्य कहनेवाला बायोमार्कर की खोज में सहायता करता है। ये मॉडल क्लोनल विषमता, ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट, और सेल-सेल और सेल-मैट्रिक्स इंटरैक्शन को पुन: परिभाषित करते हैं। इसके अतिरिक्त, उन्हें प्राथमिक ट्यूमर को रूपात्मक, साइटोलॉजिकल, इम्यूनोहिस्टोकेमिकल और आनुवंशिक रूप से मेल खाने के लिए दिखाया गया है। इस प्रकार, ऑर्गेनोइड ट्यूमर कोशिकाओं और ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट पर शोध की सुविधा प्रदान करते हैं और सेल लाइनों से बेहतर होते हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल 97% से अधिक सफलता दर के साथ रोगी ट्यूमर, जलोदर और फुफ्फुस द्रव के नमूनों से रोगी-व्युत्पन्न डिम्बग्रंथि के कैंसर ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने के लिए अलग-अलग तरीकों का वर्णन करता है। रोगी के नमूने यांत्रिक और एंजाइमेटिक पाचन दोनों द्वारा सेलुलर निलंबन में अलग किए जाते हैं। कोशिकाओं को तब एक तहखाने झिल्ली निकालने (बीएमई) का उपयोग करके चढ़ाया जाता है और उच्च श्रेणी के सीरस डिम्बग्रंथि के कैंसर (एचजीएसओसी) के संवर्धन के लिए विशिष्ट पूरक युक्त अनुकूलित विकास मीडिया के साथ समर्थित किया जाता है। प्रारंभिक ऑर्गेनोइडबनाने के बाद, पीडीओ दीर्घकालिक संस्कृति को बनाए रख सकते हैं, जिसमें बाद के प्रयोगों के लिए विस्तार के लिए पासिंग शामिल है।
Introduction
2021 में, संयुक्त राज्य अमेरिका में लगभग 21,410 महिलाओं को उपकला डिम्बग्रंथि के कैंसर का निदान किया गया था, और 12,940 महिलाओं कीइस बीमारी से मृत्यु हो गई थी। यद्यपि सर्जरी और कीमोथेरेपी में पर्याप्त प्रगति हुई है, उन्नत बीमारी वाले 70% से अधिक रोगी कीमोथेरेपी प्रतिरोध विकसित करते हैं और निदान2,3 के 5 साल के भीतर मर जाते हैं। इस प्रकार, इस घातक बीमारी के इलाज के लिए नई रणनीतियों और प्रीक्लिनिकल अनुसंधान के लिए प्रतिनिधि, विश्वसनीय मॉडल की तत्काल आवश्यकता है।
प्राथमिक डिम्बग्रंथि ट्यूमर से निर्मित कैंसर सेल लाइनें और रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट्स (पीडीएक्स) डिम्बग्रंथि के कैंसर अनुसंधान में उपयोग किए जाने वाले मुख्य उपकरण हैं। कैंसर सेल लाइनों का एक प्रमुख लाभ उनका तेजी से विस्तार है। हालांकि, उनकी निरंतर संस्कृति के परिणामस्वरूप फेनोटाइपिक और जीनोटाइपिक परिवर्तन होते हैं जो कैंसर सेल लाइनों को मूल प्राथमिक कैंसर ट्यूमर नमूने से विचलित करने का कारण बनते हैं। कैंसर सेल लाइन और प्राथमिक ट्यूमर के बीच मौजूदा अंतर के कारण, सेल लाइनों में सकारात्मक प्रभाव डालने वाली दवा परखनैदानिक परीक्षणों में इन समान प्रभावों को रखने में विफल रहती है। इन सीमाओं को दूर करने के लिए, पीडीएक्स मॉडल का उपयोग किया जाता है। ये मॉडल इम्यूनोडेफिशिएंसी चूहों में ताजा डिम्बग्रंथि के कैंसर के ऊतकों को प्रत्यारोपित करके बनाए जाते हैं। जैसा कि वे विवो मॉडल में हैं, वे अधिक सटीक रूप से मानव जैविक विशेषताओं से मिलते जुलते हैं और बदले में, दवा के परिणामों की अधिक भविष्यवाणी करते हैं। हालांकि, इन मॉडलों में महत्वपूर्ण सीमाएं भी हैं, जिनमें उन्हें उत्पन्न करने के लिए आवश्यक लागत, समय और संसाधन शामिलहैं।
पीडीओ प्रीक्लिनिकल अनुसंधान के लिए एक वैकल्पिक मॉडल प्रदान करते हैं जो कैंसर सेल लाइनों और पीडीएक्स मॉडल दोनों की सीमाओं को दूर करता है। पीडीओ एक रोगी के ट्यूमर और ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट को पुन: उत्पन्न करते हैं और इस प्रकार, प्रीक्लिनिकल अनुसंधान 2,3,5 के लिए आदर्श इन विट्रो ट्रैक्टेबल मॉडल प्रदान करते हैं। इन 3 डी मॉडलों में स्व-संगठन क्षमताएं होती हैं जो प्राथमिक ट्यूमर को मॉडल करती हैं, जो एक ऐसी विशेषता है जो उनके दो-आयामी (2 डी) सेल लाइन समकक्षों के पास नहीं है। इसके अलावा, इन मॉडलों को आनुवंशिक और कार्यात्मक रूप से उनके मूल ट्यूमर का प्रतिनिधित्व करने के लिए दिखाया गया है और इस प्रकार, नए चिकित्सीय और जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए विश्वसनीय मॉडल हैं। संक्षेप में, वे सेल लाइनों के समान दीर्घकालिक विस्तार और भंडारण क्षमताओं की पेशकश करते हैं, लेकिन माउस मॉडल 4,6 में निहित माइक्रोएन्वायरमेंट और सेल-सेल इंटरैक्शन को भी शामिल करते हैं।
वर्तमान प्रोटोकॉल 97% से अधिक सफलता दर के साथ रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर, जलोदर और फुफ्फुस द्रव नमूनों से पीडीओ के निर्माण का वर्णन करता है। पीडीओ संस्कृतियों को तब कई पीढ़ियों के लिए विस्तारित किया जा सकता है और दवा चिकित्सा संवेदनशीलता और भविष्य कहनेवाला बायोमार्कर का परीक्षण करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। यह विधि एक ऐसी तकनीक का प्रतिनिधित्व करती है जिसका उपयोग पीडीओ की चिकित्सीय प्रतिक्रियाओं के आधार पर उपचार को निजीकृत करने के लिए किया जा सकता है।
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Protocol
अनुसंधान के लिए एकत्र किए गए सभी मानव ऊतक नमूने संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) -अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार प्राप्त किए गए थे। नीचे उल्लिखित प्रोटोकॉल एक बाँझ मानव ऊतक संस्कृति वातावरण में किए गए थे। मानव विषयों से सूचित लिखित सहमति प्राप्त की गई थी। योग्य रोगियों को डिम्बग्रंथि के कैंसर का निदान या अनुमानित निदान होना चाहिए, सूचित सहमति पर हस्ताक्षर करने के लिए तैयार और सक्षम होना चाहिए, और कम से कम 18 वर्ष की आयु होनी चाहिए। ट्यूमर ऊतक (घातक प्राथमिक ट्यूमर या मेटास्टैटिक साइटें), जलोदर, और फुफ्फुस द्रव उनकी प्रक्रिया के समय सहमति से रोगियों से प्राप्त किए गए थे। इन नमूनों को तुरंत प्रयोगशाला में ले जाया गया और नीचे उल्लिखित तरीकों का उपयोग करके ऑर्गेनॉइड पीढ़ी के लिए संसाधित किया गया।
1. मीडिया की तैयारी
- पूर्ण ऑर्गेनॉइड मीडिया तैयारी
- पहले प्रकाशित रिपोर्ट7 के बाद आर-स्पोंडिन 1/नोगिन वातानुकूलित माध्यम तैयार करें।
नोट: आर-स्पोंडिन -1 / नोगिन वातानुकूलित माध्यम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पुनः संयोजक प्रोटीन के लिए एक अधिक किफायती विकल्प है। एचईके 293 टी कोशिकाएं लेंटीवायरस-मध्यस्थता पारगमन के माध्यम से आर-स्पोंडिन -1 और नोगिन को स्थिर रूप से स्रावित करती हैं, जो सेंट लुइस में वाशिंगटन यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन और अनिल रुस्तगी, न्यूयॉर्क-प्रेस्बिटेरियन / कोलंबिया यूनिवर्सिटी इरविंग मेडिकल सेंटर 8,9,10 से एक उदार उपहार थीं। वाणिज्यिक वातानुकूलित माध्यम को विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है (सामग्री की तालिका देखें)।
- पहले प्रकाशित रिपोर्ट7 के बाद आर-स्पोंडिन 1/नोगिन वातानुकूलित माध्यम तैयार करें।
- पूर्ण ऑर्गेनॉइड माध्यम बनाने के लिए, 10% आर-स्पोंडिन 1/नोगिन वातानुकूलित माध्यम, 50 एनजी/एमएल ईजीएफ, 10 एनजी/एमएल एफजीएफ-10, 10 एनजी/एमएल एफजीएफ-10, 10 एममोल/एल निकोटिनामाइड, 1.25 mmol/L N-एसिटाइलसिस्टीन, 1 μmol/L प्रोस्टाग्लैंडीन E2, 10 μmol/L SB202190, 500 nmol/L SB202190, 500 nmol/L SB202190, 500 nmol/l SB202190, 10 nmol/l SB202190, 10 nmol/l SB202190, 10 ng/mL FGF2, 10 ng/mL FGF2, 1x B27, 10 mmol/L निकोटिनामाइड, 1.25 mmol/L N-एसिटाइलसिस्टीन, 10 mmol/L Prostallandin E2, 10 μmol/L SB202190, 500 nmol/L SB202190, 50 nmol/l SB202190, 50 nmol/l SB202190, 50 nmol/l SB202190, 10 ng/mL FGF-10, 10 ng/mL FGF2, 1x B27, 10 mmol/L निकोटिनामाइड, 1.25 mmol/L N-एसिटाइलसिस्टीन, 1 μmol/L Prostallandin E2, 10 μmol/L SB202190, 50 nmol/l SB202190, 50 nmol/l SB202190, 50 nmol/l L SB20
नोट: माध्यम को 3 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। इस माध्यम को हिल एट अल.11 से अनुकूलित किया गया था। रॉक अवरोधक के अतिरिक्त माध्यम की सांद्रता और सामग्री समान हैं। - 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, 1एक्स डाइपेप्टाइड, एल-एलेनिल-एल-ग्लूटामाइन, और 1 एक्स एचईपीईएस (10 एमएम) के साथ डीएमईएम / एफ 12 के उन्नत फॉर्मूलेशन के 500 एमएल के संयोजन से ऑर्गेनॉइड बेस माध्यम तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
2. जलोदर और फुफ्फुस द्रव से ऑर्गेनोइड्स की कटाई
नोट: ऑर्गेनोइड्स की सर्वोत्तम उपज के लिए जलोदर और फुफ्फुस द्रव को जल्द से जल्द संसाधित किया जाना चाहिए। पहले बीएमई, डीनेस आई, और डीनेस आई प्रतिक्रिया बफर ( सामग्री की तालिका देखें) को बर्फ पर रखकर तब तक पिघलें जब तक कि सामग्री तरलीकृत न हो जाए।
- मानक देखभाल सर्जरी या प्रक्रियाओं के समय सहमति से रोगियों से जलोदर और फुफ्फुस द्रव प्राप्त करें, और प्रयोगशाला में यात्रा कंटेनर में कमरे के तापमान पर परिवहन करें।
नोट: सभी जलोदर या फुफ्फुस द्रव प्रसंस्करण एक बाँझ वातावरण में किया जाना चाहिए। - जलोदर या फुफ्फुस द्रव के 50 एमएल को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में स्थानांतरित करें (ट्यूबों की संख्या प्राप्त जलोदर की मात्रा पर निर्भर करती है)। सेंट्रीफ्यूज 1,650 x g पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सुपरनैटेंट को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करने के लिए ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करें।
- पहले सेंट्रीफ्यूज्ड गोली में 50 एमएल जलोदर या फुफ्फुस द्रव जोड़कर जारी रखें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 1,650 x g पर फिर से सेंट्रीफ्यूज करें। ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करके सुपरनैटेंट को सावधानीपूर्वक तैयार करें। इस चरण को तब तक दोहराएं जब तक कि सभी जलोदर या फुफ्फुस द्रव संसाधित न हो जाएं।
- 1,000 μL न्यूक्लियस-मुक्त पानी, DNase I प्रतिक्रिया बफर के 100 μL और DNase I के 10 μL के संयोजन से 100 μg/mL DNase I समाधान तैयार करें।
नोट: लागू DNase I उपचार कुछ रोगी नमूनोंमें सेल समुच्चय की उपस्थिति की परवाह किए बिना एकल-सेल निलंबन बनाने के लिए पर्याप्त है। - प्रत्येक सेल गोली को 100 μg / mL DNase I समाधान के 1 एमएल में पुन: निलंबित करें। धीरे से DNase I समाधान ड्रॉपवाइज जोड़ें, और ट्यूब को कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करने की अनुमति दें।
नोट: DNase I समाधान के न्यूनतम 1 एमएल जोड़ें। यदि 1 एमएल गोली को परेशान करने के लिए पर्याप्त नहीं है, तो अतिरिक्त 1 एमएल जोड़ें। - इनक्यूबेशन के बाद, कोशिकाओं में 25 एमएल ऑर्गेनॉइड बेस मीडियम (चरण 1.3) जोड़ें, और धीरे से मिश्रण करने के लिए उलटा करें। फिर, सेंट्रीफ्यूज 1,650 x g पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करके सतह पर तैरने वाले को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें।
- 1x लाल रक्त कोशिका (RBC) लाइसिस बफर के पूर्व-गर्म 5 एमएल में नवगठित सेल छर्रों को पुन: निलंबित करें ( सामग्री की तालिका देखें)। भंवर को 458 x g पर सेट करें, और भंवर प्रत्येक शंक्वाकार ट्यूब में समाधान। एक बार जब समाधान समरूप हो जाते हैं, तो सभी शंक्वाकार ट्यूबों की सामग्री को एकल 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में संयोजित करने के लिए एक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करें।
- 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर भंवर घोल युक्त शंक्वाकार ट्यूब को इनक्यूबेट करें। एक बार इनक्यूबेशन पूरा हो जाने के बाद, सेंट्रीफ्यूज 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 1,650 x g पर।
नोट: गोली की जांच करें। एक गुलाबी / लाल गोली आरबीसी की उपस्थिति को इंगित करती है, जिसके लिए आरबीसी लाइसिस बफर चरण को दोहराने की आवश्यकता होगी जब तक कि गोली अब लाल न हो। - सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करके सतह पर तैरने वाले को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें। फिर, पेलेट को 10 एमएल पीबीएस के साथ धोएं, भंवर 458 x g पर घोल, और सेंट्रीफ्यूज को 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 1,650 x g पर धोएं।
- यदि एक बड़ी सेल गोली बनती है, तो ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करके पीबीएस को एस्पिरेट करें, और गोली के शीर्ष पर 1 एमएल ऑर्गेनॉइड बेस मीडियम (चरण 1.3) जोड़ें। भंवर 458 x g पर समाधान है, और एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 300-400 μL स्थानांतरित करता है। माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब को 1,650 x g पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें।
नोट: माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में नहीं रखे गए सेल पेलेट के हिस्से को भविष्य के उपयोग के लिए फ्रीज किया जा सकता है (एफबीएस में 10% डीएमएसओ के 1 एमएल के लिए 500 μL कोशिकाएं)। जमे हुए सेल गोली को -80 डिग्री सेल्सियस पर हफ्तों तक और तरल नाइट्रोजन13 में रखे जाने पर वर्षों तक संग्रहीत किया जा सकता है। - ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करके ऑर्गेनॉइड बेस माध्यम (चरण 1.3) को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें, और ठंडे सुझावों का उपयोग करके बीएमई ( सामग्री की तालिका देखें) में पुन: निलंबित करें।
नोट: बीएमई की मात्रा गोली के आकार पर आधारित है। 75% बीएमई पर पुनर्निलंबित कोशिकाओं के साथ 25% ऑर्गेनॉइड बेस माध्यम (चरण 1.3) का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। - 6-वेल प्लेट पर पुन: निलंबित सेल समाधान के प्लेट 40 μL एलिकोट। प्रति कुएं पांच एलिकोट तक प्लेट (चित्रा 1)।
- बीएमई को ठोस बनाने की अनुमति देने के लिए प्लेट को तुरंत 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें। इनक्यूबेशन के बाद, धीरे से प्रत्येक कुएं में 2 एमएल पूर्ण ऑर्गेनॉइड माध्यम (चरण 1.2) जोड़ें।
चित्रा 1: रोगी-व्युत्पन्न डिम्बग्रंथि के कैंसर ऑर्गेनोइड्स की चढ़ाना। ऑर्गेनॉइड प्लेटिंग की प्रतिनिधि छवि। ऑर्गेनॉइड मिश्रण के एलिकोट को सावधानीपूर्वक चढ़ाया जाता है, यह सुनिश्चित करते हुए कि कोई बुलबुले नहीं बनते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
3. ऊतक से ऑर्गेनोइड्स की कटाई
नोट: ऑर्गेनोइड्स की सर्वोत्तम उपज के लिए ऊतक को जल्द से जल्द संसाधित किया जाना चाहिए।
- पीबीएस युक्त एक यात्रा कंटेनर में बर्फ पर ट्यूमर एकत्र करें और परिवहन करें।
- नमूने को 10 सेमी ऊतक संस्कृति डिश (चित्रा 2) पर रखें। डिस्पोजेबल स्केलपेल का उपयोग करके, ऊतक को छोटा करें। इसके बाद, एक डिस्पोजेबल सिरिंज के सुस्त छोर का उपयोग करके, ऊतक को तब तक कुचल दें जब तक कि एक समरूप मिश्रण नहीं बनाया जाता है।
- फोर्सेस का उपयोग करके, समरूप ऊतक मिश्रण को एक पृथक्करण ट्यूब में रखें। होमोजिनाइज्ड ऊतक के प्रत्येक 1-2 एमएल के लिए, ऑर्गेनॉइड बेस माध्यम (चरण 1.3) में 7-8 एमएल 1 मिलीग्राम / एमएल टाइप II कोलेजनेज समाधान ( सामग्री की तालिका देखें) और डीनेस आई समाधान के 1 एमएल जोड़ें। भंवर 458 x g पर समाधान है।
नोट: ऊतक की मात्रा कोलेजनेज समाधान की मात्रा और आवश्यक ट्यूबों की संख्या निर्धारित करेगी। - कोलेजनेज समाधान में ऊतक को द्रवित करने के लिए पृथक्करण मशीन ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें। प्रोग्राम को 37C_h_TDK3 (1 घंटे) तब तक चलाएं जब तक कि यह एकल-सेल निलंबन न हो।
नोट: यदि परिणामी मिश्रण समरूप नहीं है (यानी, यदि ऊतक के टुकड़े अभी भी मिश्रण में मौजूद हैं) तो कार्यक्रम को फिर से चलाने की आवश्यकता होगी। यदि ऊतक पच जाता है लेकिन समाधान चिपचिपा है, तो ऑर्गेनॉइड बेस माध्यम (चरण 1.3) का उपयोग करके पतला करें। - समरूप मिश्रण को एक नए 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें, और 20-40 एमएल ऑर्गेनॉइड बेस माध्यम (चरण 1.3) जोड़ें। फिर, एक नए लेबल वाले 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 100 μm सेल छन्नी के माध्यम से समाधान को फ़िल्टर करें।
- फ़िल्टर किए गए मिश्रण को 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 1,650 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। फिर, ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करके सुपरनैटेंट को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें।
- 1,000 μL न्यूक्लियस-मुक्त पानी, DNase I प्रतिक्रिया बफर के 100 μL और DNase I के 10 μL के संयोजन से 100 μg/mL DNase I समाधान तैयार करें।
नोट: लागू DNase I उपचार कुछ रोगी नमूनोंमें सेल समुच्चय की उपस्थिति की परवाह किए बिना एकल-सेल निलंबन बनाने के लिए पर्याप्त है। - कोशिकाओं को 100 यूजी /एमएल डीनेस आई समाधान के 1 एमएल में पुन: निलंबित करें। धीरे से DNase I समाधान ड्रॉपवाइज जोड़ें, और ट्यूब को कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करने की अनुमति दें।
- इनक्यूबेशन के बाद, कोशिकाओं में 25 एमएल ऑर्गेनॉइड बेस मीडियम (चरण 1.3) जोड़ें, और धीरे से मिश्रण करने के लिए उलटा करें। फिर, सेंट्रीफ्यूज 1,650 x g पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करके सतह पर तैरने वाले को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें।
- पूर्व-गर्म 1x RBC लाइसिस बफर के 5 एमएल में नवगठित सेल पेलेट को फिर से निलंबित करें। 458 x g पर प्रत्येक शंक्वाकार ट्यूब में समाधान।
- सेल पेलेट युक्त शंक्वाकार ट्यूब को 5 मिनट के लिए आरबीसी लाइसिस बफर में पुन: निलंबित करें। एक बार इनक्यूबेशन पूरा हो जाने के बाद, सेंट्रीफ्यूज 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 1,650 x g पर।
नोट: गोली की जांच करें। एक गुलाबी / लाल गोली आरबीसी की उपस्थिति को इंगित करती है, जिसके लिए आरबीसी लाइसिस बफर चरण को तब तक दोहराने की आवश्यकता होगी जब तक कि गोली सफेद दिखाई न दे। - सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करके सतह पर तैरने वाले को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें। फिर, पेलेट को 10 एमएल पीबीएस के साथ धोएं, भंवर 458 x g पर घोल, और सेंट्रीफ्यूज को 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 1,650 x g पर धोएं।
- यदि एक बड़ी सेल गोली बनती है, तो ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करके पीबीएस को एस्पिरेट करें, और गोली के शीर्ष पर 1 एमएल ऑर्गेनॉइड बेस मीडियम (चरण 1.3) जोड़ें। भंवर 458 x g पर समाधान है, और एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 300-400 μL स्थानांतरित करता है। सेंट्रीफ्यूज 1,650 x g पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर।
नोट: माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में नहीं रखे गए सेल पेलेट के हिस्से को भविष्य के उपयोग के लिए फ्रीज किया जा सकता है (एफबीएस में 10% डीएमएसओ के 1 एमएल के लिए कोशिकाओं के 500 μL) (चरण 5.1)। जमे हुए सेल गोली को -80 डिग्री सेल्सियस पर हफ्तों तक और तरल नाइट्रोजन13 में रखे जाने पर वर्षों तक संग्रहीत किया जा सकता है। - ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करके ऑर्गेनॉइड बेस माध्यम को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें, और ठंडे टिप्स का उपयोग करके बीएमई में पुन: निलंबित करें।
नोट: बीएमई की मात्रा गोली के आकार पर आधारित है। 75% बीएमई में पुन: निलंबित कोशिकाओं के साथ 25% ऑर्गेनॉइड बेस माध्यम (चरण 1.3) जोड़ने की सिफारिश की जाती है। - पुन: निलंबित सेल समाधान को 40 μL एलिकोट में 6-वेल प्लेट पर प्लेट करें। प्रति अच्छी तरह से पांच एलिकोट तक प्लेट करें।
- तुरंत कुएं की प्लेट को 20 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में रखें। इनक्यूबेशन के बाद, धीरे से प्रत्येक कुएं में 2 एमएल पूर्ण ऑर्गेनॉइड माध्यम (चरण 1.2) जोड़ें।
चित्रा 2: विच्छेदन से पहले ट्यूमर ऊतक। ऑर्गेनॉइड पीढ़ी के लिए प्राप्त ट्यूमर ऊतक की प्रतिनिधि छवि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
4. ऑर्गेनोइड्स को पास करना
नोट: यदि नमूना कॉन्फ्लुएंट है, तो प्रत्येक ऑर्गेनॉइड वेल को साप्ताहिक रूप से दो नए कुओं में पारित किया जा सकता है।
- 1 एमएल पिपेट का उपयोग करके, प्रत्येक कुएं में 1 एमएल ऑर्गेनॉइड बेस मीडियम (चरण 1.3) जोड़ें, और इसे अलग करने के लिए मीडिया को सीधे ऑर्गेनॉइड टैब पर ऊपर और नीचे करें। 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में पुन: निलंबित छर्रों वाले सभी माध्यमों को इकट्ठा करें।
- 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें जिसमें मिश्रण 1,650 x g पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर होता है। फिर, ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करके सुपरनैटेंट को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें।
- सेल पेलेट में 1 एमएल पशु मूल-मुक्त, पुनः संयोजक एंजाइम ( सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें, 458 x g पर घोल भंवर, और 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। ट्यूब को 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करने दें।
- इनक्यूबेशन के बाद, सेंट्रीफ्यूज 1,650 x g पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर। फिर, ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करके सुपरनैटेंट को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें।
- बीएमई में गोली को फिर से निलंबित करें।
नोट: बीएमई की मात्रा गोली के आकार पर आधारित है। 25% ऑर्गेनॉइड बेस मीडिया (चरण 1.3) को पुन: निलंबित कोशिकाओं के साथ 75% बीएमई में जोड़ने की सिफारिश की जाती है। - पुन: निलंबित सेल समाधान को 40 μL एलिकोट में 6-वेल प्लेट में प्लेट करें। प्रति अच्छी तरह से पांच एलिकोट तक प्लेट करें। एक बार जब सभी एलिकोट चढ़ा दिए जाते हैं, तो तुरंत 20 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में वेल प्लेट रखें। इनक्यूबेशन के बाद, धीरे से प्रत्येक कुएं में 2 एमएल पूर्ण ऑर्गेनॉइड माध्यम (चरण 1.2) जोड़ें।
5. ऑर्गेनोइड्स का फ्रीजिंग और पिघलना
- ऑर्गेनोइड्स का जमना
- चरण 4.1-4.4 से शुरू करें।
- सेल पेलेट को रिकवरी सेल कल्चर फ्रीजिंग माध्यम के 0.5-1 एमएल में पुन: निलंबित करें ( सामग्री की तालिका देखें), और प्रत्येक क्रायोवियल में 1 एमएल स्थानांतरित करें।
- फिर, क्रायोवियल्स को लंबे समयतक भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन टैंक में स्थानांतरित करने से पहले 2 सप्ताह तक -80 डिग्री सेल्सियस पर एक आइसोप्रोपेनोल से भरे कंटेनर में रखें।
- ऑर्गेनोइड्स का पिघलना
- तरल नाइट्रोजन टैंक से नमूने निकालें, और 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान पर पिघल जाएं।
- एक बार पिघलने के बाद, 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 1,650 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करके सतह पर तैरने वाले को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें।
- बीएमई में गोली को फिर से निलंबित करें।
नोट: बीएमई की मात्रा गोली के आकार पर आधारित है। 25% ऑर्गेनॉइड बेस मीडिया (चरण 1.3) को पुन: निलंबित कोशिकाओं के साथ 75% बीएमई में जोड़ने की सिफारिश की जाती है। - पुन: निलंबित सेल समाधान को 40 μL एलिकोट में 6-वेल प्लेट पर प्लेट करें। प्रति अच्छी तरह से पांच एलिकोट तक रखें।
- प्लेट को तुरंत 20 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में रखें। इनक्यूबेशन के बाद, धीरे से कुओं में 2 एमएल पूर्ण ऑर्गेनॉइड माध्यम (चरण 1.2) जोड़ें।
6. ऑर्गेनोइड संरचना का मूल्यांकन करने के लिए फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड (एफएफपीई) स्लाइड को एम्बेड करना और उत्पन्न करना
- पर्याप्त आकार सुनिश्चित करने के लिए कम से कम 10 दिनों के लिए ऑर्गेनोइड्स की खेती करने के बाद, कुओं से पूर्ण ऑर्गेनॉइड माध्यम को हटा दें, और 2% पैराफॉर्मलडिहाइड फिक्सेटिव (पीएफए) के 1 एमएल जोड़ें। 5-10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
- इनक्यूबेशन के बाद, सुसंस्कृत ऑर्गेनॉइड एलिकोट को 1 एमएल पीबीएस के साथ हर बार 5 मिनट के लिए 3x धो लें।
- प्रत्येक कुएं से पीबीएस को हटा दें, और प्रत्येक कुएं में विआयनीकृत एच 2 ओ में 1 एमएल गर्म2% आगर जोड़ें। आगर जोड़ते समय, स्पैटुला का उपयोग करके प्लेट से सुसंस्कृत ऑर्गेनॉइड एलिकोट उठाएं।
नोट: सुसंस्कृत ऑर्गेनॉइड एलिकोट को उठाने से पहले आगर को कठोर नहीं होने देना महत्वपूर्ण है।- कमरे के तापमान पर एगर को कुएं में जमने दें।
- एक छोटे स्पैटुला का उपयोग करके, ठोस एगर को कुएं से मुक्त करें, और इसे 48 घंटे तक कैसेट में 48 घंटे तक स्टोर करें ( सामग्री की तालिका देखें) 70% इथेनॉल में 4 डिग्री सेल्सियस परप्रसंस्करण 14 तक।
- नमूनों को पैराफिन15 में एम्बेड करें, स्लाइड्स को 5 μm की मोटाई तक काटें, और एक मानक प्रोटोकॉल15 का उपयोग करके स्लाइड्स को हेमेटॉक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई, सामग्री की तालिका देखें) धुंधला करने के साथ दाग दें।
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Representative Results
पीडीओ उत्पन्न करने के लिए, नमूनों को यांत्रिक रूप से और एंजाइमेटिक रूप से एकल-सेल निलंबन में पचाया गया था। कोशिकाओं को तब बीएमई में फिर से निलंबित किया गया और विशेष रूप से इंजीनियर मीडिया (चित्रा 3) के साथ पूरक किया गया। ऑर्गेनोइड्स आमतौर पर 10 दिनों की समय सीमा में स्थापित होते हैं, जिसके बाद वे संस्कृति में असतत ऑर्गेनोइड्स का प्रदर्शन करते हैं (चित्रा 4)।
चित्रा 3: ऑर्गेनोइड्स में गठित रोगी संग्रह का योजनाबद्ध। रोगी ऊतक, जलोदर, या फुफ्फुस द्रव यांत्रिक या एंजाइमेटिक रूप से पच जाते हैं। एकल-सेल निलंबन को तब बीएमई में चढ़ाया जाता है, जहां संस्कृति एचजीएसओसी के अनुरूप विशेष विकास मीडिया की मदद से बढ़ती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: विकास के 7 दिनों के बाद दो अद्वितीय रोगी-व्युत्पन्न डिम्बग्रंथि के कैंसर ऑर्गेनोइड्स की प्रतिनिधि छवियां। ऑर्गेनॉइड छवियों को 40x पर लिया गया था। बाईं छवि पर ब्राइटफील्ड स्केल बार 100 μm है और दाईं छवि पर 200 μm है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
प्रस्तुत प्रोटोकॉल से, 23 ऑर्गेनोइड्स का एक बायोबैंक नियमित पासिंग के साथ 5 महीने से अधिक समय तक उत्पादित और सुसंस्कृत किया गया था। उत्पत्ति के ट्यूमर की नैदानिक विशेषताओं को तालिका 1 में प्रस्तुत किया गया है। अधिकांश ट्यूमर उन्नत चरण (100%), उच्च श्रेणी के सीरस कार्सिनोमा (92.9%), और उपचार भोले (85.7%) थे।
| N = 23 | |
| आयु (वर्ष) | 63.5 ± 9.7 |
| FIGO स्टेज III IV विचाराधीन |
13 (56.5) 9 (39.2) 1 (4.3) |
| प्रोटोकॉल उच्च श्रेणी के सीरस कार्सिनोसारकोमा निम्न श्रेणी के सीरस |
21 (92.9) 1 (7.1) 1 (4.3) |
| बीआरसीए म्यूटेशन हाँ नहीं |
1 (4.3) 22 (95.7) |
| कीमोथेरेपी की पूर्व लाइनें 0 1-5 ≥5 |
20 (85.7) 0 2 (14.2) |
तालिका 1: पीडीओ बायोबैंक विशेषताएं। तालिका में वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग करके उत्पन्न ऑर्गेनोइड्स की विशिष्ट विशेषताएं शामिल हैं। इन विशेषताओं में उम्र, एफआईजीओ (इंटरनेशनल फेडरेशन ऑफ गायनकोलॉजी एंड ऑब्स्टेट्रिक्स) चरण, हिस्टोलॉजी, बीआरसीए (बीआरआईस्ट कैंसर जीन) उत्परिवर्तन स्थिति और कीमोथेरेपी की पूर्व लाइनें शामिल हैं।
ऑर्गेनोइड संस्कृतियों का मूल्यांकन अगारोस में एम्बेड करके और एच एंड ई (चित्रा 5) के साथ मूल्यांकन करके किया जा सकता है।
चित्रा 5: पीडीओ के हेमेटॉक्सिलिन और ईओसिन धुंधला। एक रोगी के नमूने से उत्पन्न डिम्बग्रंथि के कैंसर ऑर्गेनॉइड के एच एंड ई धुंधला होने की प्रतिनिधि छवि। छवि 40x पर ली गई थी, और स्केल बार 50 μm है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
डिम्बग्रंथि का कैंसर निदान में अपने उन्नत चरण के साथ-साथ कीमोथेरेपी प्रतिरोध के सामान्य विकास के कारण बेहद घातक है। कैंसर सेल लाइनों और पीडीएक्स मॉडल का उपयोग करके डिम्बग्रंथि के कैंसर अनुसंधान में कई प्रगति की गई है; हालांकि, एक अधिक प्रतिनिधि और सस्ती इन विट्रो मॉडल की स्पष्ट आवश्यकता है। पीडीओ ने ट्यूमर विषमता, ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट, और उनके प्राथमिक ट्यूमर की जीनोमिक और ट्रांसक्रिप्टोमिक विशेषताओं का सटीक प्रतिनिधित्व करने के लिए साबित किया है और इस प्रकार, विभिन्न शोध दृष्टिकोणों के लिए आदर्श प्रीक्लिनिकल मॉडल हैं, जैसे कि ड्रग थेरेपी16 में ऑर्गेनॉइड मॉडल का कार्यान्वयन।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल बहुत प्रभावी और विश्वसनीय है, जैसा कि 97% सफलता दर से संकेत मिलता है। यह उजागर करना महत्वपूर्ण है कि वर्तमान प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम हैं जिन पर सावधानीपूर्वक ध्यान दिया जाना चाहिए। सबसे पहले, ऊतक से ऑर्गेनोइड्स की कटाई करते समय, यह सुनिश्चित करना आवश्यक है कि नमूना पूरी तरह से समरूप है। यदि आवश्यक हो तो इसके लिए पृथक्करण कार्यक्रम को एक से अधिक बार चलाने की आवश्यकता हो सकती है। यदि नमूना समरूप नहीं है, तो ऊतक के शेष टुकड़े ऑर्गेनॉइड विकास से समझौता कर सकते हैं। दूसरा, चूंकि बीएमई का कामकाजी तापमान 2-8 डिग्री सेल्सियस है, इसलिए पोलीमराइजेशन से बचने के लिए बर्फ पर इस अभिकर्मक को शामिल करने वाले सभी चरणों को करना महत्वपूर्ण है। इसके अतिरिक्त, बीएमई के साथ पुन: निलंबन और चढ़ाना, बुलबुले से बचना महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह प्लेटेड ऑर्गेनॉइड एलिकोट को अस्थिर बनाता है, जिससे वे प्लेट से हट जाते हैं। अंत में, इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाने वाला बीएमई एंगेलब्रेथ-होल्म-स्वार्म (ईएचएस) ट्यूमर से उत्पन्न हुआ था और इसलिए, बैचों के बीच असंगत संरचना की क्षमता है। ये अंतर ऑर्गेनॉइड पीढ़ी और विकास को प्रभावित कर सकते हैं। इस सीमा को दूर करने का कोई विशिष्ट तरीका नहीं है क्योंकि लेखक वैकल्पिक बीएमई विकल्प17 से अनजान हैं। बीएमई या 3 डी पाड़ के लिए वैकल्पिक सामग्री स्थापित करने के लिए भविष्य के शोध आवश्यक हैं। उपरोक्त सभी विचारों को देखते हुए, इस बात पर जोर देना महत्वपूर्ण है कि इन विधियों को विभिन्न प्रयोगशाला सेटिंग्स और उपकरणों के लिए अनुकूलित और परीक्षण किया जाना चाहिए।
प्रगति के बावजूद जो ऑर्गेनोइड डिम्बग्रंथि के कैंसर अनुसंधान को प्रदान कर सकते हैं, ऑर्गेनॉइड मॉडल के कार्यान्वयन की सीमाएं हैं। ऑर्गेनॉइड उत्पादन और रखरखाव दोनों लंबी और महंगी प्रक्रियाएं हैं। ऑर्गेनॉइड विकास के लिए आवश्यक समय की मात्रा संदूषण की शुरूआत के लिए अनुमति देती है। इसके अलावा, विकास परिवर्तनशीलता को यह सुनिश्चित करने के लिए निरंतर पर्यवेक्षण की आवश्यकता होती है कि उपलब्ध मीडिया की मात्रा ऑर्गेनोइड विकास के लिए पर्याप्त है और संदूषण मौजूद नहीं है। इसके अतिरिक्त, ऑर्गेनोइड्स की सेलुलर संरचना परिवर्तनशील है। प्रतिरक्षा कोशिकाएं शुरू में मौजूद होती हैं लेकिन आमतौर पर दूसरे मार्ग से आगे नहीं बढ़ती हैं। यह मीडिया में साइटोकिन पूरकता के साथ दूर किया जा सकता है लेकिन हमारे वर्तमान काम के दायरे से बाहर है। स्ट्रोमल कोशिकाएं पासिंग के माध्यम से बनी रहती हैं, लेकिन घटक प्रारंभिक नमूने18,19 पर अत्यधिक निर्भर करते हैं। प्रत्येक सेल प्रकार के सटीक सेलुलर घटकों और दृढ़ता को बेहतर ढंग से समझने के लिए आगे का काम आवश्यक है। कई कीमोथेरेपी लाइनों से गुजरने वाले रोगियों से ऑर्गेनोइड उत्पन्न करना चुनौतीपूर्ण और समस्याग्रस्त है। ऑर्गेनॉइड पीढ़ी और विकास पर कीमोथेरेपी के प्रभाव को समझने के लिए आगे के अध्ययन आवश्यक हैं। अंत में, हमारे अनुभव में, ऊतक, जलोदर, या फुफ्फुस द्रव की एक निर्दिष्ट मात्रा से उत्पन्न ऑर्गेनोइड्स की संख्या अप्रत्याशित है। उदाहरण के लिए, दो अलग-अलग रोगियों से एकत्र किए गए ट्यूमर, जलोदर, या फुफ्फुस द्रव की समान मात्रा के परिणामस्वरूप अलग-अलग मात्रा में ऑर्गेनोइड्स होंगे। ऑर्गेनॉइड अस्तित्व और व्यवहार्यता के लिए सर्वोत्तम सेल प्रकारों में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए आगे के शोध किए जा रहे हैं।
बहरहाल, पीडीओ सेल लाइनों और पीडीएक्स मॉडल की तुलना में प्रीक्लिनिकल अनुसंधान के लिए अद्वितीय अवसर प्रदान करते हैं। जबकि डिम्बग्रंथि के कैंसर के निदान और उपचार के बारे में प्रगति हुई है, अभी भी महत्वपूर्ण काम किया जाना बाकी है, और पीडीओ डिम्बग्रंथि के कैंसर अनुसंधान को आगे बढ़ाने के लिए आवश्यक एक विशेष उपकरण है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
हम इस प्रोटोकॉल को स्थापित करने में एमडी, पीएचडी रॉन बोस के मार्गदर्शन और बारबरा ब्लाचट, एमडी की सहायता के लिए आभारी हैं। हम इस परियोजना के समर्थन के लिए सेंट लुइस के प्रसूति और स्त्री रोग विभाग और स्त्री रोग संबंधी ऑन्कोलॉजी विभाग, वाशिंगटन विश्वविद्यालय के डीन स्कॉलर प्रोग्राम और प्रजनन वैज्ञानिक विकास कार्यक्रम में वाशिंगटन विश्वविद्यालय के स्कूल ऑफ मेडिसिन को भी स्वीकार करना चाहते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| 1% Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 30002CI | |
| 1.5 mL Eppendorf Tubes | Genesee Scientific | 14125 | |
| 10 cm Tissue Culture Dish | TPP | 93100 | |
| 10 mL Serological Pipet | |||
| 100 µm Cell Filter | MidSci | 100ICS | |
| 15 mL centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 2 mL Cryovial | Simport Scientific | T301-2 | |
| 2% Paraformaldehyde Fixative | Sigma-Aldrich | ||
| 37 °C water bath | NEST | 602052 | |
| 3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media Supplement | Millipore Sigma | SCM104 | |
| 6 well plates | TPP | 92006 | |
| 70% Ethanol | Sigma-Aldrich | R31541GA | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher | 12634028 | |
| Agar | Lamda Biotech | C121 | |
| B-27 | Life Technologies | 17504044 | |
| Centrifuge | |||
| Cultrex Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | basement membrane extract |
| DNase I | New England Bio Labs | M0303S | |
| DNase I Reaction Buffer | New England Bio Labs | M0303S | |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FGF-10 | PeproTech | 100-26 | |
| FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi BioTech | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi BioTech | 130-096-427 | We use the manufacturers protocol. |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | dipeptide, L-alanyl-L-glutamine |
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit | Fisher Scientific | NC1470670 | |
| Histoplast Paraffin Wax | Fisher Scientific | 22900700 | |
| Microcentrifuge | |||
| Mr. Frosty Freezing Container | Fisher Scientific | 07202363S | |
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| p1000 Pipette with Tips | |||
| p200 Pipette with Tips | |||
| Pasteur Pipettes 9" | Fisher Scientific | 1367820D | |
| PBS | Fisher Scientific | MT21031CM | |
| Pipet Controller | |||
| Prostaglandin E2 | R&D Systems | 2296 | |
| Puromycin | ThermoFisher | A1113802 | |
| Recombinant Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Invitrogen | 12648010 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | R&D Systems | 1254/1 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
| T75 Flask | MidSci | TP90076 | |
| Tissue Culture Hood | |||
| Tissue Embedding Cassette | |||
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
| Type II Collagenase | Life Technologies | 17101015 | |
| Vortex |
References
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