Summary
환자 유래 오가노이드(PDO)는 시험관 내에서 종양 환경을 모방할 수 있는 3차원(3D) 배양물입니다. 고급 장액성 난소암에서 PDO는 새로운 바이오마커 및 치료제를 연구하기 위한 모델을 나타냅니다.
Abstract
오가노이드는 환자 유래 난소 종양 조직, 복수 또는 흉수에서 성공적으로 성장할 수 있는 3D 동적 종양 모델이며 난소암에 대한 새로운 치료법 및 예측 바이오마커의 발견을 돕습니다. 이 모델은 클론 이질성, 종양 미세 환경, 세포-세포 및 세포-기질 상호 작용을 요약합니다. 또한, 그들은 형태학적으로, 세포학적으로, 면역조직화학적으로, 유전적으로 원발성 종양과 일치하는 것으로 나타났습니다. 따라서 오가노이드는 종양 세포 및 종양 미세 환경에 대한 연구를 용이하게 하며 세포주보다 우수합니다. 현재 프로토콜은 97% 이상의 성공률로 환자 종양, 복수 및 흉막액 샘플에서 환자 유래 난소암 오가노이드를 생성하는 고유한 방법을 설명합니다. 환자 샘플은 기계적 및 효소 분해에 의해 세포 현탁액으로 분리됩니다. 그런 다음 기저막 추출물(BME)을 사용하여 세포를 도말하고 고급 장액성 난소암(HGSOC)의 배양에 특이적인 보충제를 포함하는 최적화된 성장 배지로 지지합니다. 초기 오가노이드를 형성한 후 PDO는 후속 실험을 위한 확장을 위한 계대배양을 포함하여 장기간 배양을 지속할 수 있습니다.
Introduction
2021년에 미국에서 약 21,410명의 여성이 상피성 난소암 진단을 받았고 12,940명의 여성이 이 질병으로 사망했습니다1. 수술과 화학요법이 충분히 발전했음에도 불구하고, 진행성 질환 환자의 70% 이상이 화학요법 내성이 나타나 진단 후 5년 이내에 사망한다 2,3. 따라서 이 치명적인 질병을 치료하기 위한 새로운 전략과 전임상 연구를 위한 대표적이고 신뢰할 수 있는 모델이 시급히 필요합니다.
원발성 난소 종양에서 생성된 암 세포주와 환자 유래 이종이식(PDX)은 난소암 연구에 사용되는 주요 도구입니다. 암 세포주의 주요 장점은 빠른 확장입니다. 그러나 이들의 지속적인 배양은 암 세포주가 원래의 원발성 암 종양 샘플에서 벗어나게 하는 표현형 및 유전형 변화를 초래합니다. 암 세포주와 원발성 종양 사이의 기존 차이로 인해, 세포주에서 긍정적인 영향을 미치는 약물 분석은 임상 시험에서 동일한 효과를 나타내지 못한다2. 이러한 한계를 극복하기 위해 PDX 모델이 사용됩니다. 이 모델은 신선한 난소암 조직을 면역 결핍 마우스에 이식하여 만들어집니다. 생체 내 모델이기 때문에 인간의 생물학적 특성과 더 정확하게 유사하고 약물 결과를 더 잘 예측할 수 있습니다. 그러나 이러한 모델에는 생성에 필요한 비용, 시간 및 자원을 포함하여 상당한 제한이 있습니다4.
PDO는 암 세포주와 PDX 모델 모두의 한계를 극복하는 전임상 연구를 위한 대안 모델을 제공합니다. PDO는 환자의 종양 및 종양 미세 환경을 요약하여 전임상 연구에 이상적인 시험관 내 다루기 쉬운 모델을 제공합니다 2,3,5. 이러한 3D 모델에는 원발성 종양을 모델링하는 자기 조직화 기능이 있으며, 이는 2차원(2D) 세포주에는 없는 기능입니다. 또한, 이러한 모델은 유전적으로 및 기능적으로 모 종양을 나타내는 것으로 나타났으며, 따라서 새로운 치료법 및 생물학적 과정을 연구하기 위한 신뢰할 수 있는 모델입니다. 요컨대, 이들은 세포주와 유사한 장기 확장 및 저장 기능을 제공할 뿐만 아니라 마우스 모델 4,6에 내재된 미세 환경 및 세포-세포 상호 작용도 포함합니다.
본 프로토콜은 97% 이상의 성공률로 환자 유래 종양, 복수 및 흉막액 샘플로부터 PDO의 생성을 설명합니다. 그런 다음 PDO 배양을 여러 세대에 걸쳐 확장하여 약물 요법 감수성 및 예측 바이오마커를 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 PDO의 치료 반응에 기초하여 치료를 개인화하는 데 사용될 수 있는 기술을 나타낸다.
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Protocol
연구를 위해 수집된 모든 인체 조직 표본은 IRB(Institutional Review Board) 승인 프로토콜에 따라 획득되었습니다. 아래에 요약된 프로토콜은 멸균 인체 조직 배양 환경에서 수행되었습니다. 정보에 입각한 서면 동의는 인간 피험자로부터 얻었습니다. 적격 환자는 난소암 진단 또는 추정 진단을 받았고, 정보에 입각한 동의서에 서명할 의지와 능력이 있어야 하며, 18세 이상이어야 했습니다. 종양 조직(악성 원발성 종양 또는 전이 부위), 복수 및 흉막액은 시술 당시 동의한 환자로부터 얻었습니다. 이 표본은 즉시 실험실로 운반되어 아래에 설명된 방법을 사용하여 오가노이드 생성을 위해 처리되었습니다.
1. 매체 준비
- 완벽한 오가노이드 배지 준비
- 이전에 발표된 보고서7에 따라 R-spondin 1/Noggin 조절 배지를 준비합니다.
참고: R-spondin-1/Noggin 조절 배지는 상업적으로 이용 가능한 재조합 단백질에 대한 보다 저렴한 대안입니다. 렌티바이러스 매개 형질도입을 통해 R-스폰딘-1 및 노긴을 안정적으로 분비하는 HEK293T 세포는 세인트루이스에 있는 워싱턴 대학교 의과대학의 Ron Bose와 뉴욕-장로교/컬럼비아 대학교 어빙 메디컬 센터 8,9,10의 Anil Rustgi로부터 관대한 선물이었습니다. 상업적으로 조절된 매체는 대체물로 사용될 수 있습니다(재료 표 참조).
- 이전에 발표된 보고서7에 따라 R-spondin 1/Noggin 조절 배지를 준비합니다.
- 완전한 오가노이드 배지를 만들려면 10% R-스폰딘 1/노긴 조절 배지, 50ng/mL EGF, 10ng/mL FGF-10, 10ng/mL FGF2, 1x B27, 10mmol/L 니코틴아미드, 1.25mmol/L N-아세틸시스테인, 1μmol/L 프로스타글란딘 E2, 10μmol/L SB202190, 500nmol/L A83-01 및 10μM ROCK 억제제를 결합합니다(재료 표 참조).
알림: 배지는 최대 4개월 동안 3°C에서 보관할 수 있습니다. 이 배지는 Hill et al.11에서 채택되었습니다. 배지의 농도와 성분은 ROCK 억제제가 첨가되어 동일합니다. - 500mL의 DMEM/F12의 고급 제형을 1% 페니실린-스트렙토마이신, 1x 디펩타이드, L-알라닐-L-글루타민 및 1x HEPES(10mM)와 결합하여 오가노이드 염기 배지를 준비합니다( 재료 표 참조).
2. 복수 및 흉막액에서 오가노이드 채취
참고: 복수와 흉막액은 오가노이드의 최상의 수율을 위해 가능한 한 빨리 처리해야 합니다. 내용물이 액화될 때까지 얼음 위에 놓아 이전에 분주된 BME, DNase I 및 DNase I 반응 완충액( 재료 표 참조)을 해동합니다.
- 표준 치료 수술 또는 시술 시 동의한 환자로부터 복수 및 흉수를 채취하여 실온에서 여행 용기에 담아 실험실로 운송합니다.
참고: 모든 복수 또는 흉수 처리는 무균 환경에서 수행해야 합니다. - 50mL의 복수 또는 흉막을 50mL의 원추형 튜브로 옮깁니다(튜브 수는 얻은 복수의 부피에 따라 다름). 4°C에서 5분 동안 1,650 x g 로 원심분리합니다. 원심분리 후 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 흡인합니다.
- 이전에 원심분리된 펠릿에 복수 또는 흉막액 50mL를 첨가하고 4°C에서 5분 동안 1,650 x g 에서 다시 원심분리하여 계속합니다. 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 상청액을 조심스럽게 흡인합니다. 모든 복수 또는 흉막액이 처리될 때까지 이 단계를 반복합니다.
- 1,000 μL의 뉴클레아제가 없는 물, 100 μL의 DNase I 반응 완충액 및 10 μL의 DNase I을 조합하여 100 μg/mL DNase I 용액을 준비합니다.
참고: 적용된 DNase I 처리는 일부 환자 샘플에서 세포 응집체의 존재 여부와 관계없이 단일 세포 현탁액을 만들기에 충분하다(12). - 각 세포 펠릿을 100μg/mL DNase I 용액 1mL에 재현탁합니다. DNase I 용액을 부드럽게 적가하고 튜브를 실온에서 15분 동안 배양합니다.
알림: 최소 1mL의 DNase I 용액을 추가합니다. 1mL가 펠릿을 방해하기에 충분하지 않은 경우 1mL를 더 추가합니다. - 배양 후 25mL의 오가노이드 염기 배지(단계 1.3)를 세포에 넣고 부드럽게 뒤집어 혼합합니다. 이어서, 4°C에서 5분 동안 1,650 x g 로 원심분리한다. 원심분리 후, 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 흡인한다.
- 새로 형성된 세포 펠릿을 미리 예열된 5mL의 1x 적혈구(RBC) 용해 완충액에 재현탁합니다( 재료 표 참조). 와류를 458 x g로 설정하고 각 원뿔형 튜브의 용액을 소용돌이합니다. 용액이 균질해지면 혈청학적 피펫을 사용하여 모든 원뿔형 튜브의 내용물을 단일 50mL 원뿔형 튜브로 결합합니다.
- 와동된 용액이 들어 있는 원뿔형 튜브를 실온에서 5분 동안 배양합니다. 배양이 완료되면 4°C에서 5분 동안 1,650 x g 로 원심분리합니다.
알림: 펠릿을 검사합니다. 분홍색/빨간색 펠릿은 적혈구의 존재를 나타내며, 펠릿이 더 이상 빨간색이 아닐 때까지 RBC 용해 완충 단계를 반복해야 합니다. - 원심분리 후, 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 흡인한다. 이어서, 펠릿을 10 mL의 PBS로 세척하고, 용액을 458 x g에서 와동시키고, 4°C에서 5분 동안 1,650 x g에서 원심분리한다.
- 큰 세포 펠릿이 형성되면 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 PBS를 흡인하고 펠릿 위에 오가노이드 기본 배지 1mL(단계 1.3)를 추가합니다. 용액을 458 x g에서 소용돌이치고, 300-400 μL를 미세원심분리 튜브로 옮긴다. 마이크로 원심분리기 튜브를 1,650 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
참고: 미세 원심분리기 튜브에 넣지 않은 세포 펠릿 부분은 향후 사용을 위해 동결할 수 있습니다(FBS에서 500% DMSO 1mL에 세포 10μL). 냉동 세포 펠릿은 -80°C에서 몇 주 동안 보관할 수 있으며 액체 질소에 넣으면 몇 년 동안 보관할 수 있습니다13. - 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 오가노이드 기본 배지(단계 1.3)를 조심스럽게 흡인하고 콜드 팁을 사용하여 BME( 재료 표 참조)에 재현탁합니다.
알림: BME의 양은 펠릿의 크기를 기준으로 합니다. 25% 오가노이드 염기 배지(단계 1.3)를 75% BME로 재현탁된 세포와 함께 사용하는 것이 좋습니다. - 재현탁된 세포 용액의 분취액 40 μL를 6-웰 플레이트 상에 플레이트한다. 웰당 최대 5개의 분취량을 플레이트합니다(그림 1).
- 즉시 플레이트를 37°C 인큐베이터에 20분 동안 두어 BME가 응고되도록 합니다. 배양 후 2mL의 완전 오가노이드 배지(단계 1.2)를 각 웰에 부드럽게 추가합니다.
그림 1: 환자 유래 난소암 오가노이드의 도금. 오가노이드 도금의 대표 이미지. 오가노이드 혼합물의 분취량은 기포가 형성되지 않도록 조심스럽게 도금됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
3. 조직에서 오가노이드 채취
참고: 오가노이드의 최상의 수율을 위해 조직을 가능한 한 빨리 처리해야 합니다.
- PBS가 들어 있는 여행 용기에 얼음 위에서 종양을 수집하고 운반합니다.
- 샘플을 10cm 조직 배양 접시에 놓습니다(그림 2). 일회용 메스를 사용하여 티슈를 다듬습니다. 다음으로, 일회용 주사기의 둔한 끝을 사용하여 균질 한 혼합물이 생성 될 때까지 조직을 분쇄합니다.
- 집게를 사용하여 균질 조직 혼합물을 해리 튜브에 넣습니다. 균질화된 조직 1-2mL마다 오가노이드 기본 배지(1.3단계)에 1mg/mL 유형 II 콜라게나제 용액( 재료 표 참조) 7-8mL와 DNase I 용액 1mL를 추가합니다. 용액을 458 x g에서 소용돌이칩니다.
참고: 조직의 양에 따라 콜라게나제 용액의 양과 필요한 튜브 수가 결정됩니다. - 해리 기계( 재료 표 참조)를 사용하여 콜라게나제 용액에 있는 동안 조직을 액화합니다. 단일 세포 현탁액이 될 때까지 프로그램 37C_h_TDK3(1시간)를 실행합니다.
알림: 결과 혼합물이 균질하지 않은 경우(즉, 조직 조각이 혼합물에 여전히 존재하는 경우) 프로그램을 다시 실행해야 합니다. 조직이 소화되었지만 용액이 점성이 있는 경우 오가노이드 기본 배지를 사용하여 희석합니다(단계 1.3). - 균질화된 혼합물을 새로운 50mL 원뿔형 튜브로 옮기고 20-40mL의 오가노이드 기본 배지를 추가합니다(단계 1.3). 그런 다음 100μm 셀 스트레이너를 통해 용액을 새로 라벨이 붙은 50mL 원뿔형 튜브로 여과합니다.
- 여과된 혼합물을 4°C에서 5분 동안 1,650 x g 로 원심분리한다. 그런 다음 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 흡인합니다.
- 1,000 μL의 뉴클레아제가 없는 물, 100 μL의 DNase I 반응 완충액 및 10 μL의 DNase I을 조합하여 100 μg/mL DNase I 용액을 준비합니다.
참고: 적용된 DNase I 처리는 일부 환자 샘플에서 세포 응집체의 존재 여부와 관계없이 단일 세포 현탁액을 만들기에 충분하다(12). - 100ug/mL DNase I 용액 1mL에 세포를 재현탁합니다. DNase I 용액을 부드럽게 적가하고 튜브를 실온에서 15분 동안 배양합니다.
- 배양 후 25mL의 오가노이드 염기 배지(단계 1.3)를 세포에 넣고 부드럽게 뒤집어 혼합합니다. 이어서, 4°C에서 5분 동안 1,650 x g 로 원심분리한다. 원심분리 후, 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 흡인한다.
- 새로 형성된 세포 펠릿을 미리 예열된 5x RBC 용해 완충액의 1mL에 재현탁합니다. 각 원뿔형 튜브의 용액을 458 x g로 소용돌이칩니다.
- 세포 펠렛이 들어 있는 원뿔형 튜브를 RBC 용해 완충액에 재현탁하여 5분 동안 배양한다. 배양이 완료되면 4°C에서 5분 동안 1,650 x g 로 원심분리합니다.
알림: 펠릿을 검사합니다. 분홍색/빨간색 펠릿은 적혈구의 존재를 나타내며, 이는 펠릿이 흰색으로 나타날 때까지 RBC 용해 완충 단계를 반복해야 합니다. - 원심분리 후, 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 흡인한다. 이어서, 펠릿을 10 mL의 PBS로 세척하고, 용액을 458 x g에서 와동시키고, 4°C에서 5분 동안 1,650 x g에서 원심분리한다.
- 큰 세포 펠릿이 형성되면 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 PBS를 흡인하고 펠릿 위에 오가노이드 기본 배지 1mL(단계 1.3)를 추가합니다. 용액을 458 x g에서 소용돌이치고, 300-400 μL를 미세원심분리 튜브로 옮긴다. 4°C에서 5분 동안 1,650 x g 로 원심분리합니다.
참고: 미세 원심분리기 튜브에 넣지 않은 세포 펠릿 부분은 향후 사용을 위해 동결할 수 있습니다(FBS에서 500% DMSO 1mL에 세포 10μL)(5.1단계). 냉동 세포 펠릿은 -80°C에서 몇 주 동안 보관할 수 있으며 액체 질소에 넣으면 몇 년 동안 보관할 수 있습니다13. - 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 오가노이드 베이스 배지를 조심스럽게 흡인하고 콜드 팁을 사용하여 BME에서 재현탁합니다.
알림: BME의 양은 펠릿의 크기를 기준으로 합니다. 25% 오가노이드 염기 배지(단계 1.3)를 75% BME에 재현탁된 세포와 함께 추가하는 것이 좋습니다. - 재현탁된 세포 용액을 40μL 분취액의 6웰 플레이트에 플레이트합니다. 웰 당 최대 5 개의 부분 표본을 플레이트합니다.
- 즉시 웰 플레이트를 인큐베이터에 20 분 동안 놓습니다. 배양 후 2mL의 완전 오가노이드 배지(단계 1.2)를 각 웰에 부드럽게 추가합니다.
그림 2: 해부 전의 종양 조직. 오가노이드 생성을 위해 얻은 종양 조직의 대표 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
4. 오가노이드의 패시징
참고: 샘플이 합류하는 경우 각 오가노이드 웰을 매주 두 개의 새 웰로 통과시킬 수 있습니다.
- 1mL 피펫을 사용하여 1mL의 오가노이드 기본 배지(단계 1.3)를 각 웰에 추가하고 배지를 오가노이드 탭에 직접 위아래로 피펫팅하여 해리합니다. 15mL 원뿔형 튜브에 재현탁된 펠릿이 들어 있는 모든 배지를 수집합니다.
- 혼합물이 들어 있는 15 mL 원뿔형 튜브를 4°C에서 5분 동안 1,650 x g 로 원심분리한다. 그런 다음 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 흡인합니다.
- 동물 유래가 없는 재조합 효소 1mL( 재료 표 참조)를 세포 펠릿에 넣고 용액을 458 x g에서 소용돌이치고 1.5mL 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다. 튜브를 37°C 수조에서 15분 동안 배양합니다.
- 인큐베이션 후, 4°C에서 5분 동안 1,650 x g 로 원심분리한다. 그런 다음 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 흡인합니다.
- BME에서 펠릿을 다시 일시 중단합니다.
알림: BME의 양은 펠릿의 크기를 기준으로 합니다. 25% BME에 재현탁된 세포와 함께 1.3% 오가노이드 기본 배지(75단계)를 추가하는 것이 좋습니다. - 재현탁된 세포 용액을 40 μL 분취액의 6-웰 플레이트에 플레이트한다. 웰 당 최대 5 개의 부분 표본을 플레이트합니다. 모든 분취액이 도말되면 즉시 웰 플레이트를 인큐베이터에 20분 동안 놓습니다. 배양 후 2mL의 완전 오가노이드 배지(단계 1.2)를 각 웰에 부드럽게 추가합니다.
5. 오가노이드의 동결 및 해동
- 오가노이드의 동결
- 4.1-4.4단계부터 시작합니다.
- 세포 펠릿을 0.5-1 mL의 회수 세포 배양 동결 배지( 재료 표 참조)에 재현탁하고 1mL를 각 극저온 저온 배지로 옮깁니다.
- 그런 다음 -80°C의 이소프로판올로 채워진 용기에 극저온 혼합물을 최대 2주 동안 넣은 후 장기 보관을 위해 액체 질소 탱크로 옮깁니다13.
- 오가노이드의 해동
- 액체 질소 탱크로부터 샘플을 제거하고, 37°C 수조에서 해동한다.
- 해동되면 15mL 원뿔형 튜브로 옮기고 4°C에서 5분 동안 1,650 x g 로 원심분리합니다. 원심분리 후, 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 흡인한다.
- BME에서 펠릿을 다시 일시 중단합니다.
알림: BME의 양은 펠릿의 크기를 기준으로 합니다. 25% BME에 재현탁된 세포와 함께 1.3% 오가노이드 기본 배지(75단계)를 추가하는 것이 좋습니다. - 재현탁된 세포 용액을 40μL 분취액의 6웰 플레이트에 플레이트합니다. 웰 당 최대 5 개의 부분 표본을 배치하십시오.
- 즉시 플레이트를 인큐베이터에 20 분 동안 놓습니다. 배양 후 2mL의 완전 오가노이드 배지(단계 1.2)를 웰에 부드럽게 추가합니다.
6. 오가노이드 조성을 평가하기 위한 FFPE(formalin-fixed paraffin-embeded) 슬라이드 내장 및 생성
- 적절한 크기를 보장하기 위해 최소 10일 동안 오가노이드를 배양한 후 웰에서 완전한 오가노이드 배지를 제거하고 2% 파라포름알데히드 고정제(PFA) 1mL를 추가합니다. 실온에서 5-10분 동안 배양합니다.
- 배양 후, 배양된 오가노이드 분취액을 PBS 1 mL로 매번 5분 동안 3x 세척하였다.
- 각 웰로부터 PBS를 제거하고, 탈이온화된H2O중의 따뜻한 2% 한천 1 mL를 각 웰에 첨가하였다. 한천을 첨가할 때, 배양된 오가노이드 분취액을 주걱을 사용하여 플레이트로부터 들어 올린다.
참고: 배양된 오가노이드 분취량을 들어 올리기 전에 한천이 굳지 않도록 하는 것이 중요합니다.- 한천이 실온에서 우물에서 굳어지도록 합니다.
- 작은 주걱을 사용하여, 응고된 한천을 웰로부터 분리하고, 프로세싱할 때까지 70% 에탄올 중에서 4°C에서 최대 48시간 동안 카세트에 저장한다(재료 표 참조).
- 샘플을 파라핀 15에 매립시키고, 슬라이드를 5 μm의 두께로 절단하고, 표준 프로토콜15를 사용하여 헤마톡실린 및 에오신 (H&E, 재료 표 참조) 염색으로 슬라이드를 염색하였다.
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Representative Results
PDO를 생성하기 위해, 샘플을 기계적 및 효소적으로 단일 세포 현탁액으로 분해하였다. 그런 다음 세포를 BME에 재현탁하고 특별히 조작된 배지로 보충했습니다(그림 3). 오가노이드는 일반적으로 10일의 기간 동안 확립되며, 그 후 배양에서 개별 오가노이드를 입증합니다(그림 4).
그림 3: 오가노이드로 형성된 환자 컬렉션의 개략도. 환자 조직, 복수 또는 흉막액은 기계적 또는 효소적으로 소화됩니다. 그런 다음 단일 세포 현탁액을 BME에 도금하여 HGSOC에 맞춤화된 특수 성장 배지의 도움으로 배양이 증식합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 성장 7일 후 두 개의 독특한 환자 유래 난소암 오가노이드의 대표 이미지. 오가노이드 이미지는 40x에서 촬영되었습니다. 왼쪽 이미지의 명시야 스케일 바는 100μm이고 오른쪽 이미지의 눈금 막대는 200μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
제시된 프로토콜에서 23개의 오가노이드로 구성된 바이오뱅크가 생산되고 정기적인 계대배양으로 5개월 이상 배양되었습니다. 기원 종양의 임상적 특징은 표 1에 제시되어 있다. 종양의 대부분은 진행기(100%), 고급 장액성 암종(92.9%), 치료 경험이 없는(85.7%)이었습니다.
| N = 23 | |
| 나이 (년) | 63.5 ± 9.7 |
| FIGO 스테이지 3세 증권 시세 표시기 보류 중인 |
13 (56.5) 9 (39.2) 1 (4.3) |
| 조직학 고급 장액 암육종 저급 장액 |
21 (92.9) 1 (7.1) 1 (4.3) |
| BRCA 돌연변이 예 아니요 |
1 (4.3) 22 (95.7) |
| 화학 요법의 이전 라인 0 1-5 ≥5 |
20 (85.7) 0 2 (14.2) |
표 1: PDO 바이오뱅크 특성. 표에는 본 프로토콜을 사용하여 생성된 오가노이드의 특정 특성이 포함되어 있습니다. 이러한 특성에는 연령, FIGO(International Federation of Gynecology and Obstetrics) 병기, 조직학, BRCA(BReast CAncer 유전자) 돌연변이 상태 및 이전 화학 요법 라인이 포함됩니다.
오가노이드 배양은 아가로스에 포매하고 H&E로 평가하여 평가할 수 있습니다(그림 5).
도 5: PDO의 헤마톡실린 및 에오신 염색. 환자 샘플로부터 생성된 난소암 오가노이드의 H&E 염색의 대표 이미지. 이미지는 40x에서 촬영되었으며 스케일 바는 50μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
난소암은 진단 시 진행 단계와 화학 요법 내성의 일반적인 발달로 인해 매우 치명적입니다. 난소암 연구의 많은 발전은 암 세포주와 PDX 모델을 활용하여 이루어졌습니다. 그러나 보다 대표적이고 저렴한 시험관 내 모델에 대한 분명한 필요성이 있습니다. PDO는 원발성 종양의 종양 이질성, 종양 미세환경, 게놈 및 전사체적 특징을 정확하게 나타내는 것으로 입증되었으며, 따라서 약물 요법에서 오가노이드 모델의 구현과 같은 다양한 연구 접근법을 위한 이상적인 전임상 모델이다16.
여기에 설명된 프로토콜은 97%의 성공률로 알 수 있듯이 매우 효과적이고 신뢰할 수 있습니다. 현재 프로토콜에는 세심한 주의를 기울여야 하는 중요한 단계가 있음을 강조하는 것이 중요합니다. 첫째, 조직에서 오가노이드를 채취할 때 샘플이 완전히 균질화되었는지 확인하는 것이 중요합니다. 필요한 경우 해리 프로그램을 두 번 이상 실행해야 할 수 있습니다. 샘플이 균질하지 않으면 나머지 조직 조각이 오가노이드 성장을 손상시킬 수 있습니다. 둘째, BME의 작동 온도가 2-8 °C이기 때문에 중합을 피하기 위해 얼음 위에서이 시약과 관련된 모든 단계를 수행하는 것이 중요합니다. 또한 BME로 재현탁 및 도금할 때 기포를 피하는 것이 중요한데, 이는 도금된 오가노이드 분취액을 불안정하게 만들어 플레이트에서 이탈하게 하기 때문입니다. 마지막으로, 이 프로토콜에 사용된 BME는 Engelbreth-Holm-Swarm(EHS) 종양에서 생성되었으므로 배치 간에 구성이 일관되지 않을 가능성이 있습니다. 이러한 차이는 오가노이드 생성 및 성장에 영향을 미칠 수 있습니다. 저자가 대체 BME 옵션17을 알지 못하기 때문에 이러한 한계를 극복할 수 있는 구체적인 방법은 없다. BME 또는 3D 스캐폴드의 대체 재료를 확립하기 위해서는 향후 연구가 필요합니다. 위의 모든 고려 사항을 감안할 때 이러한 방법은 다양한 실험실 설정 및 장비에 맞게 조정되고 테스트되어야 함을 강조하는 것이 중요합니다.
오가노이드가 난소암 연구에 제공할 수 있는 발전에도 불구하고 오가노이드 모델에 대한 구현에는 한계가 있습니다. 오가노이드 생성 및 유지 관리는 모두 길고 비용이 많이 드는 프로세스입니다. 오가노이드 성장에 필요한 시간은 오염의 도입을 허용합니다. 또한, 성장 가변성은 사용 가능한 배지의 양이 오가노이드 발달에 충분하고 오염이 존재하지 않는지 확인하기 위해 지속적인 감독이 필요합니다. 또한, 오가노이드의 세포 조성은 가변적이다. 면역 세포는 처음에는 존재하지만 일반적으로 두 번째 통로를 지나 지속되지 않습니다. 이것은 미디어에서 사이토카인 보충으로 극복할 수 있지만 현재 연구의 범위를 벗어납니다. 기질 세포는 계대배양을 통해 지속되는 것으로 보이지만, 성분은 초기 샘플에 크게 의존한다18,19. 각 세포 유형의 정확한 세포 구성 요소와 지속성을 더 잘 이해하려면 추가 작업이 필요합니다. 여러 화학 요법 라인을 받는 환자로부터 오가노이드를 생성하는 것은 어렵고 문제가 있습니다. 오가노이드 생성 및 발달에 대한 화학 요법의 영향을 이해하려면 추가 연구가 필요합니다. 마지막으로, 우리의 경험에 따르면 지정된 양의 조직, 복수 또는 흉막액에서 생성되는 오가노이드의 수는 예측할 수 없습니다. 예를 들어, 두 명의 다른 환자로부터 동일한 양의 종양, 복수 또는 흉막액을 수집하면 다른 양의 오가노이드가 생성됩니다. 오가노이드 생존 및 생존력에 가장 적합한 세포 유형에 대한 통찰력을 얻기 위해 추가 연구가 수행되고 있습니다.
그럼에도 불구하고 PDO는 세포주 및 PDX 모델에 비해 전임상 연구를 위한 고유한 기회를 제공합니다. 난소암의 진단 및 치료와 관련하여 진전이 있었지만 여전히 수행해야 할 중요한 작업이 있으며 PDO는 난소암 연구를 발전시키는 데 필요한 특별한 도구입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 프로토콜을 수립하는 데 있어 Ron Bose, MD, PhD의 지도와 Barbara Blachut, MD의 도움에 감사드립니다. 또한 이 프로젝트를 지원해 주신 세인트루이스 산부인과 및 부인과 종양학과에 있는 워싱턴 대학교 의과대학, 워싱턴 대학교 학장 장학생 프로그램 및 생식 과학자 개발 프로그램에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| 1% Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 30002CI | |
| 1.5 mL Eppendorf Tubes | Genesee Scientific | 14125 | |
| 10 cm Tissue Culture Dish | TPP | 93100 | |
| 10 mL Serological Pipet | |||
| 100 µm Cell Filter | MidSci | 100ICS | |
| 15 mL centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 2 mL Cryovial | Simport Scientific | T301-2 | |
| 2% Paraformaldehyde Fixative | Sigma-Aldrich | ||
| 37 °C water bath | NEST | 602052 | |
| 3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media Supplement | Millipore Sigma | SCM104 | |
| 6 well plates | TPP | 92006 | |
| 70% Ethanol | Sigma-Aldrich | R31541GA | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher | 12634028 | |
| Agar | Lamda Biotech | C121 | |
| B-27 | Life Technologies | 17504044 | |
| Centrifuge | |||
| Cultrex Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | basement membrane extract |
| DNase I | New England Bio Labs | M0303S | |
| DNase I Reaction Buffer | New England Bio Labs | M0303S | |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FGF-10 | PeproTech | 100-26 | |
| FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi BioTech | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi BioTech | 130-096-427 | We use the manufacturers protocol. |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | dipeptide, L-alanyl-L-glutamine |
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit | Fisher Scientific | NC1470670 | |
| Histoplast Paraffin Wax | Fisher Scientific | 22900700 | |
| Microcentrifuge | |||
| Mr. Frosty Freezing Container | Fisher Scientific | 07202363S | |
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| p1000 Pipette with Tips | |||
| p200 Pipette with Tips | |||
| Pasteur Pipettes 9" | Fisher Scientific | 1367820D | |
| PBS | Fisher Scientific | MT21031CM | |
| Pipet Controller | |||
| Prostaglandin E2 | R&D Systems | 2296 | |
| Puromycin | ThermoFisher | A1113802 | |
| Recombinant Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Invitrogen | 12648010 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | R&D Systems | 1254/1 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
| T75 Flask | MidSci | TP90076 | |
| Tissue Culture Hood | |||
| Tissue Embedding Cassette | |||
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
| Type II Collagenase | Life Technologies | 17101015 | |
| Vortex |
References
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